Summary
셀-무료 식 시스템은 높은 처리량 합성과 중요 한 단백질의 심사에 대 한 강력 하 고 비용 효율적인 도구입니다. 여기, 우리는 플라스 미드 DNA, 선형 DNA, mRNA 서식 파일을 사용 하 여 급속 한 단백질 생산에 대 한 비 브리 오 natriegens 를 사용 하 여 셀 무료 단백질 식 시스템의 준비를 설명 합니다.
Abstract
해양 박테리아 비 브리 오 natriegens 그것의 빠른 성장 속도 때문에 생명 공학에 대 한 새로운 미생물 호스트로 상당한 관심을 얻고 있다. 일반적인 프로토콜은 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여 원유 셀 추출 natriegens 대 의 준비에 대 한 설명 합니다. 이 높은 저조한 프로토콜은 특별히 되었습니다 사용자 액세스에 대 한 최적화 및 비용 감소. 셀 무료 단백질 합성 (CFPS) 작은 규모 10 μ 배치 반응 96 또는 384 잘 형식에서에서 실행 될 수 있습니다 그리고 reproducibly 전반적 > 260 μ g/mL 슈퍼 GFP (sfGFP) 내의 폴더 3 헤의 농도 산출, 원유 셀 추출 준비 및 CFPS 단일 사용자에 의해 1−2 일에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 바이오 생산 및 합성 생물학 응용 프로그램을 촉진 하기 위해 기존 단백질 합성 파이프라인에 쉽게 통합할 수 있습니다.
Introduction
셀 무료 단백질 합성은 귀중 한 단백질 또는 펩 티 드1,2,,34의 표현에 대 한 다양 하 고 비용 효율적인 방법입니다. 역사적으로, 셀 무료 단백질 합성 수행 된 대장균 식 시스템을 사용 하 여 그러나, 거기를 사용 하 여 대체, 비 모델 생물 소설 속성 섀시로 셀 자유 식5,6,7,,89 으로 최근 급등이 하고있다 , 10 , 11 , 12. 생물 고유의 대사 프로필은 주요한 후보자 대장균 세포-무료 시스템 대안. 예를 들어 비 브리 오 natriegens 는 관찰 된 모든 알려진된 생물의 급성장은 해양 박테리아1310 분 미만의 시간을 두 배로. 이 대 한 연구와 생명 공학14,15,,1617,18신흥 미생물 호스트 natriegens V. 상당한 관심을 얻고 있다. Natriegens 대 의 급속 한 성장 속도 그 단백질 합성과 대사 효율19,20,21, 셀-무료에 대 한 그것의 세포질 기계 활용의 높은 속도에 연결 되어있다 합성 크게 빠른 단백질 생산 및 높은 처리량 검열에 대 한 도구 키트를 확장 수 있습니다.
최근, 한 셀-무료 식 시스템 natriegens V. T7 발기인93 h에서 > 260 μ g/mL의 농도에서 슈퍼 폴더 GFP (sfGFP) 생산 능력은 입증 되었습니다. 이 방법을 개발의 전반적인 목표는 시간의 짧은 금액에 일반 실험실 장비를 사용 하 여 준비 될 수 있다 매우 액세스할 수, 비용 효율, 재현성, 및 높은 저조한 셀 무료 단백질 표정 시스템 사용자를 제공 했다. 이 프로토콜에 쉐이크 플라스 크 1 L 문화, 펄스 쥡니다, 및 병렬화 및 심사 처리량을 최대화 하기 위해 96 또는 384 잘 형태로 소규모 일괄 처리 반응에 의해 세포 세포의 용 해를 사용 합니다. 긴, 지속적인 단백질 표정은 가능 하 게 3 phosphoglyceric 산 (3-PGA)의 보충에 의해 에너지 소스8,,2223으로. 이 프로토콜을 성공적으로 완료 되 면 사용자는 원하는 단백질을 표현 하는 능력 있을 것 이다 또는 natriegens 대 원유 셀을 사용 하 여 셀 무료 형태로 단백질의 집합 추출.
조 셀 추출 물 natriegens 대 600에서 광학 밀도에서 수확 하는 세포에서 준비가 글리세롤 재고에서 시작 해 서, 1.0 nm (OD600). 1 L 문화 25% 원유 세포 추출 물에서 800 개 이상의 셀 무료 반응에 대 한 충분 한 추출 물의 약 2−3 mL를 얻을 것입니다. 단백질은 플라스 미드 DNA, 선형 DNA 나 mRNA 템플릿;를 사용 하 여 표현 될 수 있다 그러나, 내 생 nucleases에 의해 선형 DNA 템플릿 저하 야생 타입 natriegens V. 셀-무료 시스템9를 사용 하 여 주요 단점은 남아 있습니다. Natriegens 대 문화에서 시작 해 서, 단백질 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 유용한 얻을 수 있습니다 단일 사용자에 의해 1−2 전체 일에서.
Protocol
1. natriegens 대 원유 셀 추출-세균성 문화의 준비
- Natriegens 대 세균 성장 미디어 파운드-v 2 표 1에 따라 준비 합니다. 압력가 마로 소독 하 여 성장 매체를 소독. 미디어 실 온 (RT)에 도달 하실 수 있습니다. 실시간에서 초과 미디어 저장
주의: 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 하 고 때 압력솥 연구소 특정 지침을 참조 하십시오. - Natriegens 대 야생 타입의 글리세롤 재고를 사용 하 여 파운드 V2 미디어의 3 mL 접종 하. 하룻밤 30 ° C에 225 rpm에서 떨고 있는 동안 성장 한다.
- 결과 펠 렛을 방해 하지 않고 1 분 Aspirate는 상쾌한 대 벤치탑 분리기에 10600 x g 에서 원심 분리 하 여 1 mL의 숙박 문화를 세척 하 고 신선한 파운드-V2 미디어의 1 mL에 resuspend.
- 압력가 4 L 살 균 커버, 당황 하 고 삼각 플라스 크 1 L 신선한 파운드-V2 성장 매체의 추가. 씻어 하룻밤 문화 (1:1, 000 희석 비율) 1 mL를 사용 하 여 접종. 225 rpm에서 떨고 있는 동안 30 ° C에서 문화를 성장.
참고: 문화 동 natriegens 1:1,000 희석 비율을 유지 하면서 위 또는 아래로 확장할 수 있습니다. 예를 들어 250 μ L 2에 신선한 파운드-V2 성장 매체의 250 mL을 씻어 하룻밤 문화의 멸 균 커버 삼각 플라스 크를 당황 하 게 추가 합니다. - 문화권의 OD600 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 모니터링 합니다. 문화에 세600 를 도달 하는 때 = 1.0 ± 0.2, 4 ° c.에 20 분 동안 3500 x g 에서 원심 분리를 통해 수확 문화 얼음에 펠 릿을 놓습니다.
참고: Natriegens 대 자 랍니다, 그래서 문화의 가까운 모니터링 하는 것이 필요. OD600 성장 = 1.0 1:1,000 희석 비율에 약 1.5−2 h를 취해야 한다. - 상쾌한 발음 즉시-80 ° C에서 결과 세균성 펠 릿 저장 하거나 2 절에서 설명 하는 세포를 세포를 직접 진행 합니다.
참고: 이 단계는 좋은 멈추는 포인트; 그러나, 펠 릿 또는 최상의 결과 위해 1−2 일 이내 즉시 처리할 수 하는 것이 좋습니다.
2. natriegens 대 원유 셀 추출-세포 세포의 용 해의 준비
- S 30 표 1 살 균 이온된 (DI) 수에 따라 세포의 용 해 버퍼를 준비 하 고 pH 7.7 빙 초 산을 사용 하 여를 조정 합니다.
주의: 빙하 아세트산 pH를 조정할 때 적절 한 보호구와 함께 처리 되어야 합니다. - 약 4 ℃ 냉장고에서 또는 세포 세포의 용 해 절차를 시작 하기 전에 얼음에 멋진 S30 세포의 용 해 버퍼입니다.
참고: 빠른 쿨 다운, 세포의 용 해 버퍼는-20 ° c.에 배치 될 수 있습니다. 고정 버퍼를 허용 하지 않습니다. - 10−20 분 또는 완전히 해 동 때까지 얼음에 셀 펠 릿을 놓습니다. 차가운 S30 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 사용 하 여 동일한 1 L 문화에서 발생 하는 모든 펠 릿 resuspend 다음 현 탁 액 50 mL 튜브에 전송 합니다. 펠 릿-80 ° c 단계 1.6에서에서 냉장고에서 동결 되지는 경우 물의 resuspension 직접 진행 합니다.
참고: S30 세포의 용 해 버퍼 처음 필요에 따라 펠 릿을 resuspend 하는 데 사용의 볼륨을 증가. - 3500 x g 4 ° c.에서 10 분 원심 분리기 정지 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. 워시 펠 릿 찬 S30 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 사용 하 여 두 번째 시간. 얼음에 펠 릿을 놓습니다.
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추운 방에 찬 S30 세포의 용 해 버퍼의 500 μ 50 mL 튜브에 펠 릿을 추가 합니다. 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여, 펠 릿 resuspend 하 고 신중 하 게 전체 펠 릿 현 탁 액 2 mL 튜브에 전송.
참고: 넓은 구멍 피 펫은 사용할 수 없습니다, 증가 펠 릿 전송 위한 구멍을 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라가 위를 사용 하 여.- 볼륨; 크게 증가 하지 않고 최대한 많은 펠 릿을 전송 그러나 균질 성 현 탁 액 2 mL 튜브에 의해 표시 된 대로, 펠 릿 sonicated 수에 충분 한 액체 resuspended 한다. 2 mL 튜브를 넣 하지 마십시오. 현 탁 액 1.5 mL;을 초과 해서는 안 필요한 경우 여러 개의 튜브로 분할.
- 얼음에 셀 펠 릿을 유지 하 고 추운 실내에서. 얼음으로 600 mL 비 커를 얼음. 위에 2 mL 튜브 홀더를 배치
참고: 펠 릿 정지 쥡니다 진행 상황을 모니터링할 얼음에서 볼 수 있도록, 비 커의 측면 근처 튜브 홀더를 도움이 된다 ( 그림 1참조). - 소용돌이 셀 균질에 짧게 2 mL 튜브에 펠 릿을 중단, 영화 튜브, 뚜껑의 하단에 있는 세포를 제거 하 고 모자와 튜브 홀더를 엽니다. 그것은 액체 표면 바로 아래 서 스 펜 션으로 낮은 sonicator 팁.
- ⅛ 인치 팁 직경 sonicator 및 프로브를 사용 하 여 그림 2 에서처럼 쥡니다 설치를 준비 합니다. Sonicator 컨트롤에 다음과 같은 설정을 입력: 20 kHz 주파수 및 50% 진폭, 펄스 시간: 10 s, 펄스 OFF 시간: 60 s.
- 3 사이클 펄스 쥡니다 프로토콜을 실행 합니다. 펠 렛 서 스 펜 션의 총 볼륨 > 500 μ 인 경우 펄스 쥡니다 프로토콜 6 번을 실행 합니다.
참고: 일반적으로, 3−6 펄스는 natriegens 대 펠 릿; lyse 충분 추가 펄스 sonicator 따라 필요할 수 있습니다. 쥡니다, 동안 조정 손잡이 플랫폼을 사용 하 여 프로브 튜브의 바닥에 침전 할 수 있습니다 어떤 펠 릿을 lyse를 아래로 이동. 튜브 홀더 고에서 짧게 vortexed 다시 펄스 사이 정지 균질을 제거할 수 있습니다. Sonicated 셀의 원하는 일관성에 대 한 토론 아래 참조.
주의: Sonicator 활성화 될 때 적절 한 청력 보호를 착용 하십시오. - 쥡니다, 다음 원심 분리기 조 세포 30−45 분 또는 lysate 그림 3에서처럼 어떤 세포질 파편 든 지 무료입니다 때까지 4 ° C에서 16000 x g 에서 추출 합니다.
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차가운 방에서 새로운 2 mL 튜브에 펠 렛을 방해 하지 않고 결과 supernatants의 aliquot 50 μ.
참고: 새로운 2 mL 튜브에 실수로 전송 되는 어떤 파편 든 지 크게 높은 저조한 단백질 합성에 대 한 추출의 용량을 줄일 것입니다.- 필요한 경우, 설정 옆으로 별도 2 mL에 후 세포 단백질 정량화에 대 한 셀의 10 μ 추출 튜브 (단계 아래 2.13 참조).
- 플래시 튜브 홀더에 찍기 문자열 그림4에서와 같이 연결 된 튜브를 배치 하 여 원유 셀 추출 물을 동결. 액체 질소를 포함 하는 Dewar에 튜브를 잠수함을 즉시 사용까지-80 ° C에서 냉동 실에 두십시오.
주의: 얼굴 방패, 제 앞치마와 장갑, 안전 안경, 연구실 코트를 포함 하 여 액체 질소를 처리 하기 위한 적절 한 보호구를 사용 합니다. - 필요에 따라 계량 lysate 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에서 샘플 1: 100 희석 Bradford 분석 실험, bicinchoninic 산 같은 모든 표준 총 단백질 정량화 분석 결과 사용 하 여 단계 2.11.1 제외 설정 10 μ를 사용 하 여 셀의 총 단백질 분석 결과 (BCA), 등입니다.
3. 셀 무료 반응 구성 요소 준비
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일반적인 반응의 구성 요소
- 각각 100 m m와 2000 m m의 농도에서 살 균 디 물 50 mL 튜브에 Mg-조미료 및 K-조미료 일 주식을 준비 합니다.
- 250 mL 비 커에 물 100 mL의 멸 균 디를 추가 하 여 50% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)-8000의 작업 주식을 준비 합니다. 비 커에 작은 자력을 놓습니다. 그리고 말뚝-8000의 50 g으로 무게 비 커에 물 100 mL에 추가.
- 100 ° C로가 열된 볶음 판 설정에는 비 커를 놓고 못-8000은 솔루션에까지 250 rpm에서 저 어. 나무 못 8000 50 mL 튜브에 전송 하기 전에 냉각 액체 혼합물을 허용 한다.
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에너지 솔루션 마스터 믹스
- 살 균 디 물 500 mL에 코 펠 릿의 140 g를 추가 하 여 코의 5 M 솔루션을 준비 합니다.
주의: 화학 후드에이 솔루션을 준비 하 고 강력한 베이스를 처리할 때 보호구 착용. 그래서 병 뚜껑 압력 형성을 방지 하는 느슨한 해야 솔루션 뜨거운 될 것 이다. 사용 하기 전에 RT 도달 코 솔루션을 허용 합니다. - 100 mL 병 HEPES 20.85 g를 추가 하 여 1750 mM HEPES 코 버퍼를 준비 합니다. 볼륨 40 mL에 도달할 때까지 천천히 살 균 디 물을 추가 합니다. 소용돌이 HEPES 해산 병. 5 M 코 솔루션을 사용 하 여 pH 8.0에 조정 하 고 다음 솔루션 볼륨 50 mL를가지고.
주의: 코는 pH를 조정할 때 적절 한 보호구와 함께 처리 되어야 합니다. - 에너지 마스터 혼합 살 균 디 물에 표 2 에 표시 된 농도에서 주식 구성 요소 x 나머지 10을 준비 하 고 얼음에 각 주식을 배치. RT와 얼음에 장소에서 100 m m ATP와 GTP, CTP, UTP 주식 녹여
참고: 37 ° C를 350 rpm 설정 thermomixer 필요한 경우 솔루션에 시 약을 해산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 과열 하거나 시간의 연장된 기간에 대 한 시 약은 thermomixer에 떠나 마십시오. - 15 mL 튜브에 순서 및 표 2에 지정 된 볼륨에 사용에 따라 각 에너지 솔루션 마스터 믹스 구성 요소를 추가 합니다. 각 구성 요소를 추가한 후 솔루션 소용돌이입니다. 이 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10의 5 mL을 만들 것입니다.
- 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 200 μ aliquots 2 mL 튜브에 나눕니다. 플래시 동결 각 약 수 단계 2.12에서에서 수행 합니다. 즉시 사용까지-80 ° C 냉동 실에 배치 합니다.
- 살 균 디 물 500 mL에 코 펠 릿의 140 g를 추가 하 여 코의 5 M 솔루션을 준비 합니다.
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아미노산 마스터 믹스
- 신선한 4x 아미노산 마스터 믹스를 준비, 각 아미노산 재고 RT에서 녹고 고 다음 얼음에 각각 배치 하 여 시작 합니다. 소용돌이 / 37 ° C 350 rpm에서 설정 하는 thermomixer를 사용 하 여 모든 아미노산 주식은 완전히 용 해 되도록.
참고: 시스테인 완전히 분해 되지 않을 수 있습니다; 그것은 정지로 아미노산 마스터 믹스에 추가할 수 있습니다. 과열 하거나 시간의 연장된 기간에 대 한 시 약은 thermomixer에 떠나 마십시오. - 15 mL 튜브에 적절 한 볼륨 아미노산을 추가 살 균 디 물 각각의 최종 농도 다음 순서에 따라 8 mM: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, 그의 IIE, 리스, 메트로, 페, 프로, 백 산, 목, 발, TRP, TYR 레이, 그리고 CYS. 각 아미노산을 추가한 후 소용돌이 마스터 솔루션을 혼합. 표 2 에 나열 된 볼륨 아미노산 마스터 믹스의 2.4 mL를 만들 것입니다.
- 4 아미노산 마스터 믹스 x 2 mL 튜브에 200 μ aliquots 나눕니다. 플래시 동결 각 약 수 단계 2.12에서에서 수행 합니다. 즉시 사용까지-80 ° C에서 냉동 실에 넣으십시오.
- 신선한 4x 아미노산 마스터 믹스를 준비, 각 아미노산 재고 RT에서 녹고 고 다음 얼음에 각각 배치 하 여 시작 합니다. 소용돌이 / 37 ° C 350 rpm에서 설정 하는 thermomixer를 사용 하 여 모든 아미노산 주식은 완전히 용 해 되도록.
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반응 준비 플라스 미드 DNA 템플렛의 생산
참고: 이 시스템에서 셀 무료 단백질 표정은 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (GFP) 식 벡터 T7-pJL1-sfGFP (테이블의 재료)를 사용 하 여 최적화 되었습니다. 셀 무료 반응 효율성과 복제 및 다른 단백질 시퀀스의 표현에 대 한 pJL1 백본 컨트롤로이 플라스 미드를 사용 하는 것이 좋습니다. 다른 플라스 미드 DNA 템플릿은 사용할 수 있습니다; 그러나, 그것은 중요 전사 T7 발기인 순서 및 T7 RNA 중 합 효소의 존재에 의해 제어 됩니다. 어떤 플라스 미드 DNA 템플렛 변형된 대장균 에서 대규모 생산에 대 한 간단한 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다.- 제조 업체의 지시 (자료 테이블)에 의하여 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 원하는 벡터를 정화.
참고: 가능한 플라스 미드 DNA 템플렛을 집중 셀 무료 반응의 꽉 볼륨 제약에 맞게 것이 좋습니다. 일반적으로, 750−1500 ng/μ 일 재고에 대 한 목표.
- 제조 업체의 지시 (자료 테이블)에 의하여 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 원하는 벡터를 정화.
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반응 준비 mRNA 서식 파일의 생산
참고: 이 섹션은 선택 사항입니다. 단백질 표정 mRNA 템플릿이 나열된 T7 RNA 중 합 효소 (자료 테이블)에 의해 플라스 미드 T7-pJL1-sfGFP의 생체 외 녹음에서 생성 된 사용 하 여 테스트 되었습니다.- 플라스 미드 표 3에서 생체 외 녹음 방송 반응 구성 요소를 사용 하 여 관심사의 단백질을 암호화 하는 DNA에서에서 mRNA 템플릿을 준비 합니다. 품 어는 thermocycler에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 반응.
참고: 충분 한 자료를 생성 하는 동시에 이러한 반응의 8−10x를 수행 하는 것이 좋습니다. - 모든 녹음 방송 반응 풀. 제조 업체의 지시 (자료 테이블)에 의하여 mRNA 정화와 집중 장치 키트를 사용 하 여 정화. 살 균 디 물으로 mRNA 템플릿을 elute. 사용까지-80 ° C에서 mRNA 서식 파일을 저장 합니다.
- 플라스 미드 표 3에서 생체 외 녹음 방송 반응 구성 요소를 사용 하 여 관심사의 단백질을 암호화 하는 DNA에서에서 mRNA 템플릿을 준비 합니다. 품 어는 thermocycler에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 반응.
4. 수행 셀 무료 단백질 Eexpression 반응 사용 하 여 natriegens 대 원유 추출
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플라스 미드 또는 선형 DNA 템플렛을 사용 하 여 셀 무료 단백질 표정
- -80 ° C 냉동 고에서 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 및 아미노산 마스터 믹스 aliquots x 4 제거 RT에서 해 동 하 고 얼음에. -20 ° C 냉동 고에서 T7 RNA 중 합 효소, RNase 억제제 주식을 제거 하 고 얼음에. DNA 템플렛 RT와 얼음에 녹여
- 얼음에 2 mL 튜브에 다음과 같은 순서로 각 구성 요소를 추가 하 여 표 4 에 의하여 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비: 아미노산 마스터 믹스, 에너지 솔루션 마스터 믹스, Mg-조미료, K-조미료, DNA, 페그-8000, T7 RNA 중 합 효소, 템플릿과 RNase 억제제입니다. 부드럽게 마스터 믹스에 각 추가 후에 튜브를 터치 합니다.
참고: 선형 서식 파일 셀 무료 단백질 식에 사용할 경우 단백질의 플라스 미드를 감지할 서식 파일에 비해 더 많은 자료를 생성 하는 5−10x를 추가 합니다. - Natriegens 대 원유 세포 lysate 10−20 분 해 동 때까지 준비 단계-80 ° C 냉동 고 및 장소에서 2.12 얼음에에서 제거 합니다. 적절 한 볼륨 원유 셀 표 4 에 의하여 셀 무료 반응 마스터 혼합 추출 하 고 부드럽게 flicking 또는 아래로 pipetting 믹스를 추가 합니다.
- Thermocycler를 사용 하 여 끝점 셀 무료 단백질 표정
- 10 μ 96 또는 384 잘 PCR 접시의 바닥에 셀 무료 반응 마스터 믹스의 플라스틱 사이 PCR 접시에 각 전송 튜브를 부드럽게 터치 하 여 마스터 믹스 믹스.
참고: 셀 무료 반응 마스터 혼합 반응 재현성 및 모든 샘플에 단백질 세포 자유로운 표현의 극대화를 항상 잘 혼합 한다.
- 10 μ 96 또는 384 잘 PCR 접시의 바닥에 셀 무료 반응 마스터 믹스의 플라스틱 사이 PCR 접시에 각 전송 튜브를 부드럽게 터치 하 여 마스터 믹스 믹스.
- 짧게 1000 x g 10에서 격판덮개 원심 우물의 측에 갇혀 될 수 있습니다 어떤 마스터 믹스 수영장 s. 증발을 방지 하 고 다음 PCR 플레이트 thermocycler 105 ° c.에서 설정 온수 뚜껑 26 ° C에서 설정에 접시 접착제로 우물을 봉인
참고: 열 배급 조차와 thermocycler의 온수 뚜껑 크게 단백질 식 수율을 향상 시킵니다. - 3 h의 최소 셀 무료 반응을 품 어. 부 화, 후 표현한 단백질 정화, 계량, 고 다운스트림 프로세스에 대 한 사용.
참고: 표현한 단백질 사용자의 선택의 방법을 사용 하 여 셀 무료 반응에서 직접 측정할 수 있습니다. 예를 들어 외부 표준 곡선을 사용 하 여 형광 단백질을 측정할 수 있습니다 또는 셀 무료 반응에 방사선된 아미노산을 사용 하는 경우 방사능 측정 될 수 있다. 자외선 보이는 분광학 또는 총 단백질 분석 실험은 일반적으로 권장 되지 않습니다 직접 초기 정화 없이 셀 무료 반응에서 단백질 생산을 측정. - 또는, 플레이트 리더를 사용 하 여 셀 무료 단백질 식 활동을 모니터링 합니다.
- 투명 유리 바닥으로 검은 384-잘 분석 결과 접시의 바닥에 셀 무료 반응 마스터 믹스의 10 μ 플라스틱 얼음에 분석 결과 접시를 유지 또는 전체 운동 프로 파일을 얻을 수 있도록 마스터 믹스를 추가 하는 동안 추운 방에 작동. 증발을 방지 하 고 다음 시험 접시 26 ° c.에 설정 플레이트 리더를 분명 플레이트 접착제로 우물을 봉인
- 표현한 단백질에 해당 하는 적절 한 형광 여기/방출 파장을 모니터링 하는 동안 h 3−6에 대 한 셀 무료 반응을 품 어. 예를 들어 모니터에 전 / Em 485 nm/528 nm sfGFP에 대 한 =.
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MRNA의 서식 파일을 사용 하 여 셀 무료 단백질 표정
- 해 동 mRNA 템플릿 단계 3.5.2 RT와 얼음에 장소에서에서 준비.
- 수행 단계 4.1.1 4.1.6 이전에 지정 된 선형 또는 표 4 를 사용 하 여 mRNA 서식 파일에 대 한 대체 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비 하는 플라스 미드 DNA 템플렛.
5. sfGFP와 natriegens V. 셀-무료 반응의 교정
참고: 이 섹션은 선택 사항입니다. 최적의 셀 무료 반응 이온 농도 세포 세포의 용 해에 대 한 사용 조건에 따라 각 원유 추출 준비를 위해 약간 달라질 수 있습니다. 옵션 셀 무료 반응 이온 교정 프로토콜 반응 수율은 예상 보다 훨씬 낮은 경우에 sfGFP를 사용 하 여 아래 설명 된 (농도 < 1.0 μ g/mL)를 수행 하십시오.
- Mg2 + 및 멸 균 디 물 100 mM Mg 조미료 및 2000 m m에서 표 5 에 지정 된 대로 K+ 이온 보정 솔루션 단계 3.1.1에서 K-조미료 주식 준비. 필요할 때까지 얼음에 교정 솔루션을 배치 합니다.
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표 6에서 교정 지도 따라 384-잘 PCR 접시에 적절 한 우물에 Mg-조미료의 1 μ와 K-조미료 이온 보정 솔루션의 2 μ 플라스틱.
- 이 단계의 작업 순서는 다음과 같습니다: 피펫으로 Mg-조미료 이온 보정 솔루션 각각의 하단에 잘 이어서 잘의 측에 K-조미료 이온 보정 솔루션 우물에 이미 있는 액체를 건드리지 않고.
- 교정 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비 하는 동안 증발을 방지 하기 위해 플레이트 위에 접착제를 배치 하 여 우물을 봉인. 부드럽게 혼합 Mg과 K 조미료 교정 솔루션 384-잘 접시를 누릅니다.
참고: 리피터 피 펫이 reproducibly 하 고 신속 하 게이 단계를 완료에 대 한 좋습니다.
- 표 5 2 mL 튜브에 T7-pJL1-sfGFP 플라스 미드 DNA 템플렛을 사용 하 여 지정 된 대로 보정 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비 합니다. 믹스 마스터를 다음과 같은 순서로 각 구성 요소를 추가: 아미노산 마스터 믹스, 에너지 솔루션 마스터 믹스, T7-pJL1-sfGFP DNA 템플렛, 페그-8000, T7 RNA 중 합 효소, 그리고 RNase 억제제. 부드럽게 터치 하는 각 구성 요소 추가 후 혼합 튜브.
참고: Mg을 추가 하지 마십시오2 + 또는 K+ 를 보정 셀 프리 믹스 마스터. - 접시에서 접착제를 제거 합니다. 신중 하 게 우물에 이미 있는 혼합된 이온 보정 솔루션을 건드리지 않고 우물의 측면에 교정 셀 무료 반응 마스터 믹스의 7 μ 플라스틱. 접착제와 우물을 봉인 하 고 부드럽게 이온 보정 솔루션 마스터 셀 프리 믹스를 섞어 384-잘 PCR 접시를 누릅니다.
참고: 리피터 피 펫이 reproducibly 하 고 신속 하 게이 단계를 완료에 대 한 좋습니다. - 짧게 원심 판 1000 x g 10에 대 한 s 우물의 측에 갇혀 될 수 있습니다 어떤 순수한 액체 수영장. 105 ° c.에서 설정 온수 뚜껑 26 ° C에서 설정 thermocycler 384-잘 접시를 넣습니다
- 3 h에 대 한 셀 무료 반응을 품 어. 부 화, 후 각의 내용을 멀티 채널 피 펫으로 유리 바닥으로 검은 384-잘 시험 접시에 전송과 읽기에서 sfGFP의 형광 전 / Em = 485 nm/528 nm 플레이트 리더를 사용 하 여 이온 농도 조합을 결정 하는 단백질의 높은 금액을 생성합니다.
Representative Results
Natriegens 대 식 세포-무료 시스템을 사용 하 여 단백질 생산에 대 한 설명된 프로토콜 단백질 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있는 문화의 접종에서 시작 하는 단일 사용자에 의해 1−2 일에 실행할 수 있습니다. 이 시간;의 상당 부분을 구성 하는 원유 셀 추출 물과 마스터 믹스 주식의 준비 그러나, 일단 준비, 대부분 벌크 시 약 저장된 장기 (표 7) 될 수 있으며, 필요에 따라 사용 시간을 단축 프로토콜을 완료 하는 데 필요 합니다.
설명 식 시스템 플라스 미드 DNA 템플렛 또는 mRNA 녹음 방송 생체 외에서 반응에 의해 생성 된 가장 사용 됩니다. 선형 DNA 단백질 생산을 위한 서식 파일로 사용할 수 있습니다, 하는 동안 그것은 상당히 낮은 양의 단백질 생성 합니다. 예를 들어 26 °C에서 최적의 반응 조건에서 단일 10 μ 셀 무료 반응을 생산할 수 > 260 μ g/mL 플라스 미드 DNA 템플렛의 0.3 pmol를 사용 하 여 3 시간에 sfGFP의 또는 mRNA 사본 (그림 5A의 14 pmol를 사용 하 여 sfGFP의 비교 > 125 μ g/mL B). 그러나, 선형 DNA의 0.3 pmol 훨씬 적은 단백질 (< 20 μ g/mL)을 생산할 예정 이다. 각 서식 파일 유형에 대 한 단백질의 대부분 1−1.5 h;에서 생산 됩니다. 그러나, 반응 3 시간 최소 실행 하는 것이 좋습니다. SfGFP의 셀 무료 반응 농도에 형광 측정 순화 sfGFP 표준 곡선을 사용 하 여 선형 회귀를 통해 결정 했다 전 / Em 485 nm/528 nm =.
단백질 생산의 수율은 칼륨과 마그네슘 이온의 농도 의해 영향을 크게 (+ K와 Mg2 +, 각각). 최적화 된 조건 하에서 최적의 마그네슘2 + 그리고 K+ 이온 농도 된다는 것 3.5 m m와 80 mM, 각각 발견 됐다 (그림 6A, B). 최적의 이온 농도에서 편차 감소 용량 감지할 수익률 단백질을 생산 하기 위해 셀 무료 식 시스템을 발생할 수 있습니다. 추가 교정 반응 수율은 예상 보다 훨씬 낮은 경우에 필요할 수 있습니다. 이온 보정에 대 한 선택적 프로토콜 섹션 5에에서 설명 되어 있습니다. 개별 세포 세포의 용 해 장비 및 조건에서 발생 한 원유 셀 추출 가변성에 대 한 보상에 일부 유연성에 대 한 수 있습니다.
그림 1: 쥡니다 플랫폼에 비 커와 튜브 홀더의 클로즈업 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 쥡니다 장비 설치 원유 셀의 준비에 대 한 추출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 쥡니다와 원심 분리 후 펠 릿의 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 플래시 추출 저장에 대 한 딥 동결. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 다른 서식 파일 형식을 사용 하 여 셀 무료 단백질 합성 natriegens 대 대표 결과. SfGFP 생산 mRNA 서식 파일의 농도 증가 뿐만 아니라 플라스 미드와 선형 DNA 템플렛 (0.3 pmol)의 아데닌 농도 사용 하 여의 (A) 끝점 시험 셀-무료 sfGFP 농도 정화 sfGFP의 표준 곡선을 사용 하 여 결정 했다 전에서 측정 / Em 10 μ 볼륨에 최적의 반응 조건에서 26 ° C에 외피의 180 분 후 485 nm/528 nm =. (B) sfGFP 생산 플라스 미드와 선형 DNA 템플렛의 아데닌 농도 사용 하 여 뿐만 아니라 서식 파일 mRNA의 농도 증가의 운동 분석 결과. sfGFP 측정에서 3 분 마다 찍은 전 / EM = 485 nm/528 nm 10 μ 볼륨에 최적의 반응 조건에서 총 보육 시간 180 분 이상. 끝점 및 운동 분석 실험에 대 한 샘플 했다 빈 셀 없는 반응 서식 파일 제외한 모든 구성 요소와 함께 보충을 사용 하 여 수정. 평균 및 표준 편차 표시 됩니다 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 대표 이온 농도 보정 결과. (A) natriegens 대 셀 무료 반응 Mg2 + 의 농도 증가 함께 보충 되었고 26 ° C에서 10 μ 반응에서 180 분 동안 incubated. K+ 의 총 농도 모든 Mg2 + 농도 대 한 160 m m 이었다. 셀-무료 sfGFP 농도 정화 sfGFP의 표준 곡선을 사용 하 여 결정 했다 전에서 측정 / Em 485 nm/528 nm =. (B) natriegens 대 셀 무료 반응 했다 K+ 의 농도 증가 함께 보충 및 10 μ 반응에서 180 분 동안 26 ° C에서 알을 품. Mg2 + 의 총 농도 모든 K+ 농도 대 한 3.5 m m 이었다. 두 교정에 대 한 샘플 했다 빈 셀 없는 반응 서식 파일 제외한 모든 구성 요소와 함께 보충을 사용 하 여 수정. 평균 및 표준 편차 표시 됩니다 (n = 3). 이 그림은 Wiegand 외.9에서 수정 되었습니다. Wiegand에서 허가로 증 쇄 디제이, 리, H.H., 오 스트로브, 명, 교회, G.M. 셀 무료 비 브리 오 natriegens 식 시스템을 구축. ACS 합성 생물학. 7 (10), 2475−2479 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 테이블 1 A | 파운드-V2 세균성 성장 매체의 준비 | ||
| 구성 요소 | 수량 (g) | 최종 농도 (mM) | 마지막 볼륨 (L) |
| 국물 LB (밀러) | 25 | 1 | |
| NaCl | 11.69 | 200 | |
| MgCl2 | 2.20 | 23.1 | |
| KCl | 0.31 | 4.2 | |
| 테이블 다룹니다 | S30A 세포의 용 해 버퍼의 준비 | ||
| 구성 요소 | 수량 (g) | 최종 농도 (mM) | 마지막 볼륨 (L) |
| 트리 스 솔루션 (pH 8.0)-1m (mL) * | 25 | 50 | 0.5 |
| Mg-조미료 | 2.72 | 14 | |
| K-조미료 | 6.10 | 60 | |
| Dithiothreitol (DTT)-1m (mL) * | 1 | 2 | |
표 1: 파운드-V2 세균성 성장 매체의 1 리터와 S30A 세포 세포의 용 해 버퍼의 0.5 L의 준비에 대 한 시 약. Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10의 준비 | ||||
| 구성 요소 | 사진 농도 (mM) | 최종 농도 (mM) | 수량 (µ L) | 마지막 볼륨 (µ L) |
| HEPES 코 pH 8 | 1750 | 500 | 1428.57 | 5000 |
| ATP | 100 | 15 | 750.00 | |
| GTP | 100 | 15 | 750.00 | |
| CTP | 100 | 9 | 450.00 | |
| UTP | 100 | 9 | 450.00 | |
| 대장균 MRE 600에서에서 tRNA (mg/mL) * | 100 | 2 | 100.00 | |
| 코엔자임 A 하이드 레이트 | 200 | 2.6 | 65.00 | |
| 나드 | 200 | 3.3 | 82.50 | |
| 캠프 | 650 | 7.5 | 57.69 | |
| Folinic 산 | 100 | 0.7 | 35.00 | |
| Spermidine | 1600 | 10 | 31.25 | |
| 3-PGA | 2000 | 300 | 750.00 | |
| 살 균 이온된 수 | 49.99 | |||
| 아미노산 마스터 믹스 x 4의 준비 | ||||
| 구성 요소 | 사진 농도 (mM) | 최종 농도 (mM) | 수량 (µ L) | 마지막 볼륨 (µ L) |
| ALA | 168 | 8 | 114.3 | 2400 |
| ARG | 168 | 8 | 114.3 | |
| ASN | 168 | 8 | 114.3 | |
| ASP | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLN | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLU | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLY | 168 | 8 | 114.3 | |
| 그의 | 168 | 8 | 114.3 | |
| 교육원 | 168 | 8 | 114.3 | |
| 리스 | 168 | 8 | 114.3 | |
| 만난 | 168 | 8 | 114.3 | |
| 페 | 168 | 8 | 114.3 | |
| 프로 | 168 | 8 | 114.3 | |
| SER | 168 | 8 | 114.3 | |
| THR | 168 | 8 | 114.3 | |
| 발 | 168 | 8 | 114.3 | |
| TRP | 168 | 8 | 114.3 | |
| 티 르 | 168 | 8 | 114.3 | |
| 레이 | 140 | 8 | 137.1 | |
| CYS | 168 | 8 | 114.3 | |
| 살 균 이온된 수 | 91.4 | |||
표 2: 에너지 솔루션 x 10의 5 mL의 준비에 대 한 시 약 마스터 믹스 및 아미노산 마스터 믹스 x 4의 2.4 mL. Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 생체 외 녹음 방송 반응에서 T7 RNA 중 합 효소 | ||||
| 구성 요소 | 주식 (mM) | 최종 농도 (mM) | 수량 (µ L) 1x 반응 | 수량 (µ L) 50 x 반응 |
| RNAPol 반응 버퍼 x 10 | 1.00 | 50 | ||
| ATP | 100 | 0.5 | 0.10 | 5 |
| GTP | 100 | 0.5 | 0.10 | 5 |
| CTP | 100 | 0.5 | 0.10 | 5 |
| UTP | 100 | 0.5 | 0.10 | 5 |
| DNA 템플렛 (ng / µ L) * | 1000 | 500 | 0.50 | 25 |
| T7 RNA 중 합 효소 | 200 | 2.6 | 2.00 | 100 |
| Rnase 억제제, Murine | 200 | 3.3 | 0.50 | 25 |
| 살 균 이온된 수 | 15.60 | 780 | ||
| 반응 볼륨 (µ L): | 20 | |||
표 3: 생체 외 녹음 구성 요소: mRNA 세대. Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 셀-무료 반응 마스터 믹스 | ||||
| 구성 요소 | 사진 농도 (mM) | 최종 농도 (mM) | 수량 (µ L) 1x 반응 | 수량 (µ L) 50 x 반응 |
| 추출 (%) * | 25 | 2.50 | 125.00 | |
| Mg-조미료 | 100 | 3.5 | 0.35 | 17.50 |
| K-조미료 | 2000 | 80 | 0.40 | 20.00 |
| 아미노산 마스터 믹스 x 4 | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 |
| 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 | 1.00 | 50.00 | ||
| 플라스 미드 DNA (ng / µ L) * | 1000 | 500 | 0.50 | 25.00 |
| 50% 말뚝-8000 (%) * | 50 | 2 | 0.40 | 20.00 |
| T7 RNA 중 합 효소 | 1.00 | 50.00 | ||
| RNase 억제제, Murine | 0.10 | 5.00 | ||
| 살 균 이온된 수 | 1.25 | 62.50 | ||
| 반응 볼륨 (µ L): | 10 | |||
| 대체 셀 무료 반응 마스터 믹스 mRNA 서식 파일에 대 한 | ||||
| 구성 요소 | 사진 농도 (mM) | 최종 농도 (mM) | 수량 (µ L) 1x 반응 | 수량 (µ L) 50 x 반응 |
| 추출 (%) * | 25 | 2.50 | 125.00 | |
| Mg-조미료 | 100 | 3.5 | 0.35 | 17.50 |
| K-조미료 | 2000 | 80 | 0.40 | 20.00 |
| 아미노산 마스터 믹스 x 4 | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 |
| 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 | 1.00 | 50.00 | ||
| mRNA 템플릿 (ng / µ L) * | 2000 | 4000 | 2.00 | 100.00 |
| 50% 말뚝-8000 (%) * | 50 | 2 | 0.40 | 20.00 |
| RNase 억제제, Murine | 0.10 | 5.00 | ||
| 살 균 이온된 수 | 0.75 | 37.50 | ||
| 반응 볼륨 (µ L): | 10 | |||
표 4: 최적화 된 natriegens 대 의 구성 요소 셀-무료 DNA 템플렛과 mRNA 서식 파일에 대 한 반응 마스터 믹스. Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| Mg 2 + 교정 | 수량 (µ L) 1x 반응 | 수량 (µ L) 1x 반응 | 수량 (µ L) 100 x 반응 | 수량 (µ L) 100 x 반응 | |
| 최종 (mM) | 주식 | 100 m m Mg-Glu | diH 2 0 | 100 m m Mg-Glu | 이온된 H2O |
| 2.5 | 0 | 0.00 | 1.00 | 0 | 100 |
| 3.5 | 1 | 0.10 | 0.90 | 10 | 90 |
| 4.5 | 2 | 0.20 | 0.80 | 20 | 80 |
| 5.5 | 3 | 0.30 | 0.70 | 30 | 70 |
| 반응 볼륨 (µ L): | 10 | ||||
| K + 교정 | 수량 (µ L) 1x 반응 | 수량 (µ L) 1x 반응 | 수량 (µ L) 100 x 반응 | 수량 (µ L) 100 x 반응 | |
| 최종 (mM) | 주식 | 2000 m m K-Glu | diH 2 0 | 2000 m m K-Glu | 이온된 H2O |
| 40 | 30 | 0.15 | 1.85 | 12 | 148 |
| 80 | 70 | 0.35 | 1.65 | 28 | 132 |
| 160 | 150 | 0.75 | 1.25 | 60 | 100 |
| 320 | 310 | 1.55 | 0.45 | 124 | 36 |
| 반응 볼륨 (µ L): | 10 | ||||
| 이온 보정 셀 무료 반응 마스터 믹스 | |||||
| 구성 요소 | 사진 농도 (mM) | 최종 농도 (mM) | 수량 (µ L) 1x 반응 | 수량 (µ L) 50 x 반응 | |
| 추출 (%) * | 25 | 2.50 | 125.00 | ||
| Mg-조미료 | 변수 | 변수 | 1.00 | 50.00 | |
| K-조미료 | 변수 | 변수 | 2.00 | 100.00 | |
| 아미노산 마스터 믹스 x 4 | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 | |
| 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 | 1.00 | 50.00 | |||
| 플라스 미드 DNA (ng / µ L) * | 1000 | 250 | 0.25 | 12.50 | |
| 50% 말뚝-8000 (%) * | 50 | 2 | 0.40 | 20.00 | |
| T7 RNA 중 합 효소 | 1.00 | 50.00 | |||
| RNase 억제제, Murine | 0.10 | 5.00 | |||
| 살 균 이온된 수 | 0.00 | 0.00 | |||
| 반응 볼륨 (µ L): | 10 | ||||
표 5: 이온 농도 보정 마스터 믹스. Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| CF 이온 교정 지도 | 40mm K+ | 80mm K+ | 160mm K+ | 320 m m K+ | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| 2.5 m m Mg2 + | A | ||||||||||||
| 3.5 m m Mg2 + | B | ||||||||||||
| 4.5 m m Mg2 + | C | ||||||||||||
| 5.5 m m Mg2 + | D | ||||||||||||
표 6: 이온 교정 지도. Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 보관 조건 및 선반 삶의 CF 구성 요소 | ||
| 구성 요소 | 저장 위치 | 수명 |
| 살 균 파운드-V2 성장 미디어 | 4 ° C | 3-6 개월 |
| Natriegens 대 원유 셀 추출 | -80 ° C | 1-3 주 |
| 100 m m Mg-조미료 | 방 온도 | 6 개월 |
| 2000 m m K-조미료 | 방 온도 | 6 개월 |
| 50% 말뚝-8000 | 방 온도 | 6 개월 |
| 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 | -80 ° C | 3-6 개월 |
| 아미노산 마스터 믹스 x 4 | -80 ° C | 3-6 개월 |
| 플라스 미드/선형 DNA 템플렛 | -20 ° C | 6-12 개월 |
| mRNA 템플릿 | -80 ° C | 3-4 주 |
표 7: 셀 무료 저장 조건 및 선반 생활. Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 야생-타입 natriegens 대 와 세균성 성장 미디어 파운드 V2 소금 (자료 테이블)와 보완의 구성에 대 한 최적화 되었습니다. Natriegens 대 의 다른 긴장 마찬가지로 원유 셀 추출 셀 무료 반응;에 대 한 생성 하 경작 될 수 있습니다. 그러나, 그들의 사용이이 프로토콜의 추가 최적화를 해야합니다. 또한,이 셀 무료 단백질 표정 시스템 기본 에너지 재생 소스로 3 phosphoglyceric 산 (3-PGA)를 사용 하 여 최적화 되었습니다. 다른 재생 에너지를 사용할 수 있습니다; 그러나, 시 약 및 교정의 최적화 높은 저조한 단백질 식10,11를 얻을 필요가 있을 것 이다.
이 프로토콜의 몇 가지 중요 한 단계에 특정 관심 높은 저조한에 대 한 최대한 추출 생산성을 보장 것입니다 셀-무료 단백질 생산. 첫째, 원유 세포 추출 물 세포 배양 natriegens 대 성장;의 중간 지 수 단계에서 수확에서 준비 해야 합니다 문화 도달 OD600 단백질 수확량은 최대 1.0 ± 0.2 =. 광학 밀도의 범위에서 수확 하는 셀에서 셀 무료 단백질 생산 가능한 동안, 우리는 이전 발견 세포의 성장 지 수 상태에서 수확 훨씬 더 많은 단백질9항복. 조 셀 추출 성능에 광학 밀도의 관찰 된 효과 그 배치 문화 조건1에서 성장 하는 세포에서 파생 된 다른 셀 무료 식 시스템에 대 한 보고와 일치. Natriegens 대 는 빠른 속도로 성장 하기 때문에 그것은 밀접 하 게 모니터 문화 광학 밀도 중요입니다. 일반적으로, 그것은 natriegens 대 문화 reproducibly 1−1.5 h;이 프로토콜을 사용 하 여 내 1.0의 OD600 를 도달 해야 예상 그러나,의 사용과 같은 개별 성장 조건 대 비 당황 플라스 크, 어떤 영향을 미치는 폭 기, 또는 물 외피, 속도 안정성의 외피 온도 영향을 미치는, 대 공기 성장 시간을 변경할 수 있습니다 당황. 또한, 그것은 적어도 250 mL natriegens 대 1 L 당황 하 고 플라스 크에서 쉽게 조작 및 전송에 대 한 수확에 큰 셀 펠 릿을 위해 문화 일반적으로 것이 좋습니다. 이 원유 셀 추출 물 준비는 펠 릿에서 추출의 총 볼륨 생산 증가의 성공을 크게 향상 시킵니다. 작은 규모의 준비를 사용 하 여, 문화 및 시 약 조정할 수 있습니다 적절 하 게. 대규모 발효에 대 한 추가 문화 조건의 최적화 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 높은 단백질 수율을 보장 하기 위해, 그것은 중요 한 셀 펠 릿, 수확 직후 또는-80 ° c.에 저장의 1−2 일 이내 처리 됩니다.
펄스 쥡니다에 의해 셀 펠 릿의 적절 한 세포 단백질 세포 자유로운 식의 성공에 중요 한 이며 종종 새로운 사용자를 위해이 프로토콜의 가장 어려운 부분입니다. 일반적으로, 잘 lysed 펠 릿 하 파편의 액체 추출의 중요 한 볼륨을 얻을 것입니다. 추출 물은 약간 점성 해야 하지만 저장소에 aliquoting 플래시 액체 질소에서 동결 전에 튜브 때 쉽게 pipetted. 그림 3 게시물 세포 원심 분리 단계 후 저조한 lysed 펠 릿 (그림 3B)에 비해 잘 lysed 펠 릿 (그림 3A)의 표현을 보여 줍니다. 완전 한 세포 세포의 용 해의 주요 표시 원유 셀 추출 총 단백질 농도 > 20 mg/mL 총계 단백질 분석 결과 (단계 2.13)에 의해 결정 되는. -쥡니다 또는 원유 셀 추출의 과도 한 난방 셀 무료 반응 하지 않고 확인할 수 없는 세포 기계를 손상 됩니다. 따라서, 다운스트림 단백질 식 응용 프로그램을 상당한 시간과 노력을 할애 하기 전에 제어 반응 추출 효율 테스트에 매우 유리 하다. 추가 최적화 다른 쥡니다 장비에 필요한 있을 수 있습니다, 하는 동안 설명 하는 펄스 쥡니다 단계 높은 우리 손에 재현 되었습니다.
선형 DNA 템플렛 PCR 증폭, 금지 효소 소화, 또는 상업적 유전자 합성에서 파생 된를 사용 하 여 크게 셀 무료 식 시스템24높은 처리량 및 빠른 단백질 생산을 위한 수 용량을 증가할 수 있다. PCR 증폭 선형 템플릿에서 단백질 생산 입증 되었습니다,이 반응의 수확량은 약 13.5-fold 낮은 아데닌 비율9서식 파일 DNA 플라스 미드를 사용 하 여 반응에 비해. 이것은 주로 생 nucleases 원유 세포 추출 물 natriegens 대 에 의해 저하 가능성이 있는 선형 DNA 템플렛의 불안정성. 람다 파지 단백질 GamS는 이전에 사용 된 선형 DNA 템플릿24,25를 보호 하기 위해, 하는 동안 natriegens 대 와 호환 되도록 추출9발견 했다. 또한, 선형 DNA 템플렛의 농도 증가 더 높은 단백질 생산량에 대 한 수 있습니다, 반면 원유 세포 추출 물에 그것의 빠른 저하 여전히 주요 문제 것입니다.
선형 DNA 템플릿 저하를 극복 하는 솔루션 선형 DNA의 생체 외 녹음에서 생성 된 mRNA 서식 파일 셀 무료 반응을 보충 될 수 있습니다. 다른 한편으로, RNase 억제제를 사용 하 여 mRNA 사본 저하에 대 한 중요 한 보호를 제공 하 고 감지할 수 단백질 수율 10 μ 셀 무료 반응 형식 (그림 5AB)에서 구할 수 있습니다. TA 결 찰을 통해 원형 템플릿으로 선형 DNA의 복제, 템플릿 저하 회피 TOPO 클로닝, 골든 게이트 어셈블리 또는 다른 재조합 방법을 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 더 접근 nuclease 활동의 저해에 대 한 선형 DNA 템플렛을 사용 하 여 효율적인 단백질 표정에 필요한 있을 것입니다.
날짜 하려면, 몇 가지 다른 방법은 셀 무료 단백질 식9,10,,1126원유 추출의 준비에 대 한 제안 되었습니다. 이 프로토콜을 개발, 우리 사용자 접근성을 극대화, 전반적인 비용을 삭감 하 고 시간이 많이 걸리는 단계를 최소화 하고자 했다. 예를 들어 높은 단백질 수율 간단한 2 단계 쥡니다 원심 분리 과정을 사용 하 여 달성 되 고 셀 균질, 긴 투 석 단계 또는 실행 반응 필요 하지 않습니다. 그것은 시간의 짧은 기간에 실행을 간단 하 고 실험실 전문성의 높은 레벨을 필요로 하지 않습니다. 따라서, 그것은 변환 학술 연구 및 산업 공정 설계에 대 한 표준으로 셀 자유 식 용이 하 게 도울 수 있다.
이 프로토콜은 조사 및 natriegens 대, 독특한 생물 학적 특성을 가진 비 모델 생물의 유틸리티에 사용할 수 있는 도구 키트를 확장합니다. 높은 단백질 수율 세미-또는 완전히-연속 셀 무료 반응, 에너지 재생 허용을 사용 하 여 달성 될 수 있다 아미노산, 그리고 폐기물3,,527의 제거의 재공급. 또한, 야생-타입 natriegens V. DNAse 불충분 또는 RNAse 한 종자를 생산 하기 위해의 공학, 해로운과 경쟁 변화 통로의 제거 및 추가 tRNAs 표현의 크게 향상 시킬 수 있는 단백질의 생산 이 시스템28,29. 우리가 그것의 급속 한 성장 기본 생물학 해명, natriegens V. 셀 무료 시스템의 추가 개발 수 있습니다 bioproduction 기능을 촉진과 치료 펩 티 드, 작은 분자, 및 합성의 강력한 표현 사용 재료입니다.
Disclosures
DJW, 아니, GMC이이 작품에 관련 된 특허를 신청 했 고.
Acknowledgments
이 작품은 일반 의료 과학의 국립 연구소 1U01GM110714-01 부의 에너지 드-FG02-02ER63445에 의해 투자 되었다. 저자 박사 리처드 Kohman, 닥터 제니 탐, 및 박사 에드거 Goluch이이 원고에 대 한 프로토콜 섹션을 생성에 도움이 되는 조언에 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
| 2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| 384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
| 384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
| 50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
| 96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
| Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
| Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
| Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
| Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
| Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
| Dewar Flask - 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
| DL-Dithiothreitol solution - 1 M | Sigma | 42816 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
| Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
| Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
| Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip | Qsonica | 4422 | |
| RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
| RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
| Tris Solution (pH 8.0) - 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
| tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
| Uridine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |
References
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