Summary
Systèmes d’expression acellulaires sont des outils puissants et rentables pour la synthèse de haut débit et la présélection des protéines importantes. Nous décrivons ici la préparation du système d’expression de protéine acellulaire à l’aide de Vibrio natriegens pour la production de protéine rapide à l’aide de l’ADN plasmidique, ADN linéaire et messagère.
Abstract
La bactérie marine Vibrio natriegens a suscité une attention considérable comme un hôte microbien émergent de biotechnologie en raison de son taux de croissance rapide. Un protocole général est décrit pour la préparation des extraits du V. natriegens cellulaire brut à l’aide d’équipement de laboratoire commun. Ce protocole à rendement élevé a été spécifiquement optimisé pour l’accessibilité de l’utilisateur et à un coût réduit. La synthèse des protéines acellulaire (CFPS) peut être effectuée à petite échelle 10 μL lot réactions selon un format de 96 ou 384 puits et reproductible des rendements des concentrations de 260 > dossier super μg/mL GFP (sfGFP) au sein de 3 h. Globalement, cellulaire brut extrait préparation et PFC est possible 1−2 jours complets à un seul utilisateur. Ce protocole peut être facilement intégré dans des conduites de synthèse de protéines existantes afin de faciliter les progrès de la bio-production et applications de la biologie synthétique.
Introduction
La synthèse protéique acellulaire est une méthode souple et rentable pour l’expression de précieuses protéines ou de peptides1,2,3,4. Historiquement, la synthèse protéique acellulaire a été réalisée à l’aide de systèmes d’expression Escherichia coli ; Cependant, il y a eu une montée subite récente dans l’utilisation des organismes alternatifs, non-modèle avec nouvelles propriétés comme châssis pour expression acellulaire5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. les organismes avec des profils métaboliques uniques sont les candidats principaux comme alternatives aux systèmes acellulaires d’e. coli . Par exemple, la bactérie marine que Vibrio natriegens est la plus forte croissance de tous les organismes connus avec un observé doublement durée inférieure à 10 min13. Il a recueilli V. natriegens une attention considérable comme un hôte microbien émergent pour la recherche et la biotechnologie14,15,16,17,18. Étant donné que le taux de croissance rapide de V. natriegens a été liée à des taux élevés de la synthèse des protéines et de l’efficacité métabolique19,20,21, exploiter sa machinerie cellulaire pour acellulaire la synthèse peut élargir considérablement l’outil pour la production de protéines rapides et criblage à haut débit.
Récemment, un acellulaire V. natriegens système d’expression a été démontrée, qui est capable de produire des super dossier GFP (sfGFP) à des concentrations de 260 > μg/mL en 3 h avec un T7 promoteur9. L’objectif général de mettre au point cette méthode était de fournir aux utilisateurs un système d’expression très accessibles, rentables, reproductible et à rendement élevé de protéine acellulaire qui peut être préparé à l’aide de matériel de laboratoire commun dans un court laps de temps. Ce protocole utilise les cultures 1 L en flacons agitateurs, lyse cellulaire par sonication impulsion et réactions de lot à petite échelle dans un format de 96 ou 384 puits afin de maximiser la parallélisation et débit de dépistage. Une expression de la protéine longue et soutenue est rendue possible par la supplémentation d’acide 3-phosphoglycérique (3-PGA) comme une énergie source8,22,23. Après avoir réussi ce protocole, un utilisateur aura la capacité d’exprimer une protéine désirée ou d’un ensemble de protéines sous forme acellulaire utilisant V. natriegens cellulaire brut extrait.
À partir d’un stock de glycérol, V. natriegens des extraits cellulaires bruts sont préparés à partir de cellules prélevées sur une densité optique à 600 nm (OD600) de 1,0. Une culture de L 1 produira environ 2−3 mL d’extrait, qui est suffisante pour plus de 800 acellulaire des réactions à l’extrait cellulaire brut de 25 %. Les protéines peuvent être exprimées à l’aide de l’ADN plasmidique, l’ADN linéaire ou messagère ; dégradation de modèle ADN linéaire par les nucléases endogènes reste cependant un inconvénient majeur lors de l’utilisation de système de type sauvage, V. natriegens acellulaire9. À partir de cultures de V. natriegens , protéines utilisables pour les applications en aval est possible par un seul utilisateur 1−2 jours complets.
Protocol
1. préparation du V. natriegens bruts extraits cellulaires – Culture bactérienne
- Préparer les V. natriegens milieux de croissance bactérienne LB-V2, conformément au tableau 1. Stériliser le milieu de culture à l’autoclave. Permettre aux médias atteindre à la température ambiante (RT). Entreposer le milieu excédentaire à température ambiante.
Mise en garde : Porter des équipements appropriés de protection individuelle (EPI) et consulter les instructions spécifiques de laboratoire lors de l’utilisation d’un autoclave. - Utiliser un stock de glycérol de type sauvage V. natriegens pour ensemencer 3 mL de médias LB-V2. Croître durant la nuit à 30 ° C en agitant à 225 t/mn.
- Laver 1 mL de la culture au jour le jour par centrifugation à 10 600 x g sur une centrifugeuse de paillasse pendant 1 min. aspirer le surnageant sans déranger le culot qui en résulte et remettre en suspension dans 1 mL de supports LB-V2 neufs.
- Dans un autoclave 4 L dérouté fiole d’Erlenmeyer avec housse stérile, ajouter 1 L de milieux de culture fraîche LB-V2. Ensemencer en utilisant 1 mL de la culture nuitée lavée (1:1, 000 rapport de dilution). Cultiver la culture à 30 ° C en agitant à 225 t/mn.
Remarque : V. natriegens cultures peuvent évoluer vers le haut ou vers le bas tout en maintenant le coefficient de dilution de 1 : 1 000. Par exemple, ajouter 250 μL de lavé culture nuitée à 250 mL de milieux de culture LB-V2 fraîches dans un 2 L dérouté fiole d’Erlenmeyer avec housse stérile. - Surveiller la culture OD600 à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque la culture atteint OD600 = 1,0 ± 0,2, récolte culture par centrifugation à 3 500 x g pendant 20 min à 4 ° C. Placez sur la glace.
Remarque : V. natriegens croît rapidement, donc une surveillance étroite de la culture est nécessaire. Croissance à OD600 = 1.0 devrait prendre environ 1.5−2 h au taux de dilution de 1 : 1 000. - Aspirer le surnageant et stocker immédiatement le culot bactérien qui en résultent à-80 ° C ou directement passer à visées à l’article 2 de la lyse des cellules.
Remarque : Cette étape est un point d’arrêt bon ; Toutefois, il est recommandé que le culot traitées immédiatement ou dans les jours 1−2 pour de meilleurs résultats.
2. préparation du V. natriegens bruts extraits cellulaires – lyse cellulaire
- Préparer le tampon de lyse S30 conformément au tableau 1 dans l’eau désionisée stérile de (DI) et ajuster le pH à 7.7 à l’aide d’acide acétique glacial.
Mise en garde : Acide acétique glacial doit être manipulé avec les EPI approprié lorsque vous ajustez le pH. - Tampon de lyse S30 cool à environ 4 ° C dans un réfrigérateur ou sur la glace avant de commencer la procédure de la lyse cellulaire.
Remarque : Pour une refroidissement rapide, lyse tampon peut être placé à-20 ° C. Ne pas laisser le tampon de geler. - Placez boulettes de cellule sur glace 10−20 min ou jusqu'à ce que complètement décongelée. Remettre en suspension les pellets toutes de la même culture de 1 L à l’aide de 10 mL de tampon de lyse S30 froid, puis transférer la suspension dans un tube de 50 mL. Si les boulettes sont non congelés dans le congélateur à-80 ° C à l’étape 1.6, passez directement à la remise en suspension.
Remarque : Augmenter le volume de tampon de lyse S30 utilisé pour remettre en suspension au départ de granules au besoin. - Suspension de centrifuger à 3 500 x g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant sans déranger le culot. Laver le culot une seconde fois à l’aide de 10 mL de tampon de lyse S30 froid. Placez sur la glace.
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Dans une chambre froide, ajouter 500 μl de tampon de lyse S30 froid au culot dans le tube de 50 mL. À l’aide d’une échelle-alésage de pipette, resuspendre le culot et transvaser avec soin la suspension de toute pellet dans un tube de 2 mL.
Remarque : Si un grand alésage pipette n’est pas disponible, utiliser une paire de ciseaux pour couper l’extrémité d’une pointe de pipette 1 mL d’augmenter l’alésage pour le transfert de granulés.- Transférer autant pellet que possible sans augmenter significativement le volume ; Cependant, le culot doit être resuspendu dans suffisamment de liquide pour être sonication, comme en témoigne une suspension homogène dans le tube 2 mL. Ne pas trop remplir le tube de 2 mL. La suspension ne doit pas dépasser 1,5 mL ; divisé en plusieurs tubes si nécessaire.
- Garder le culot cellulaire sur la glace et travailler dans une chambre froide. Remplir un bécher de 600 mL de glace et placez un support de tube 2 mL sur le dessus de la glace.
Remarque : Il est utile de placer le porte-tube près du côté du bécher, donc la suspension de granulés seront visible dans la glace pour suivre les progrès de la sonication (voir Figure 1). - Vortex suspendu pellet en tube 2 mL brièvement à homogénéiser les cellules, tubes flick pour enlever toutes les cellules sur le fond de la PAC et placer dans le porte-tube avec bouchon ouvert. Extrémité inférieure de sonicateur dans la suspension de sorte qu’il est juste sous la surface du liquide.
- Préparer la mise en place de sonication, comme illustré à la Figure 2 en utilisant un sonicateur et sonde d’un diamètre de pointe de ⅛ pouce. Entrez les paramètres suivants dans le contrôle sonicateur : 20 kHz de fréquence et d’amplitude de 50 %, d’impulsions à l’heure : 10 s, les temps d’arrêt de pouls : 60 s.
- Exécuter le protocole de sonication pouls pendant trois cycles. Si le volume total de la suspension du pellet est > 500 μL, exécutez le protocole de sonication impulsion six fois.
Remarque : Généralement, 3−6 impulsions suffisent à lyser V. natriegens pellets ; impulsions supplémentaires peuvent être exigées selon le sonicateur. Au cours de la sonication, utilisez la plate-forme de bouton de réglage pour déplacer la sonde de haut en bas pour lyser les granulés qui peuvent se déposent au fond du tube. Le tube peut être supprimé de la titulaire et brièvement mixés à re-homogénéiser la suspension entre les impulsions. Voir la discussion ci-dessous pour la consistance désirée de cellules aux ultrasons.
Mise en garde : Porter une protection auditive appropriée lorsque sonicateur est actif. - Suite à la sonication, cellulaire brut centrifugeuse extrait à 16 000 x g pendant 30−45 min à 4 ° C ou jusqu'à ce que le lysat est libre de tout débris cellulaires, comme illustré à la Figure 3.
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Dans une chambre froide, aliquote 50 μL de surnageants résultants dans de nouveaux tubes de 2 mL sans déranger le culot.
Remarque : les saletés qui sont transférées accidentellement dans les nouveaux tubes de 2 mL réduira considérablement la capacité de l’extrait de la synthèse des protéines à rendement élevé.- Éventuellement, mis de côté 10 μL de cellule extrait pour la quantification des protéines après lyse dans un séparé 2 mL de tube (voir étape ci-dessous 2.13).
- Flash gel cellulaire brut extraits en plaçant les tubes dans un porte-tube avec un fil à pendage relié tel que représenté dans la Figure 4. Plonger les tubes dans un Dewar contenant de l’azote liquide et placer immédiatement dans un congélateur à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
Mise en garde : Utiliser des EPI approprié pour azote liquide y compris blouse, lunettes de protection, écran facial, tablier cryogène et des gants de manutention. - Éventuellement, quantifier les protéines totales de la cellule lysate en utilisant 10 μL, mis à part l’étape 2.11.1 en diluer l’échantillon au 1/100 à 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et en utilisant n’importe quel dosage de quantification protéines totales standard telles que l’analyse de Bradford, l’acide bicinchoninic dosage (BCA), etc.
3. préparation des éléments de réaction acellulaire
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Composants de réaction générale
- Préparer des stocks de travail de Mg-glutamate et K-glutamate en tubes de 50 mL avec de l’eau DI stérile à des concentrations de 100 mM et 2000 mM, respectivement.
- Préparation d’un stock de travail de 50 % (p/v) de polyéthylène glycol (PEG)-8000 en ajoutant 100 mL stérile di l’eau dans un Becher de 250 mL. Placer un petit agitateur magnétique dans le bécher. Peser 50 g de PEG-8000 et ajouter à 100 mL d’eau dans le bécher.
- Placer le bécher sur un ensemble de plaque de remous chauffée à 100 ° C et mélanger à 250 tr/min, jusqu'à ce que le PEG-8000 est en solution. Laissez le mélange liquide PEG-8000 refroidir avant de les transférer aux tubes de 50 mL.
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Mix master de solution énergétique
- Préparer une solution de 5 M de KOH en ajoutant des 140 g de pastilles de KOH dans 500 mL d’eau stérile de DI.
Mise en garde : Préparer cette solution dans une hotte chimique et porter des EPI pour manipuler les bases fortes. La solution s’échauffent le bouchon de la bouteille doit donc être lâche pour éviter toute accumulation de pression. Laisser la solution KOH à atteindre RT avant d’utiliser. - Préparer un tampon HEPES-KOH de 1750 mM en ajoutant 20,85 g de HEPES à un flacon de 100 mL. Ajouter lentement l’eau DI stérile jusqu'à ce que le volume s’élève à 40 mL. Bouteille de vortex pour dissoudre l’HEPES. Utiliser la solution KOH de 5 M pour ajuster le pH à 8,0 et ensuite porter le volume de solution à 50 mL.
Mise en garde : KOH doit être manipulé avec les EPI approprié lorsque vous ajustez le pH. - Préparer les 10 restantes de composants en stock master mix énergétique aux concentrations indiquées au tableau 2 de l’eau stérile de DI et placer chaque stock sur la glace. Décongeler les stocks de ATP, GTP, CTP et UTP 100 mM à RT et le déposer sur la glace.
Remarque : Un thermomixer défini à 37 ° C et 350 tr/min peut être utilisé pour dissoudre des réactifs en solution si nécessaire. Ne pas surchauffer ou laisser des réactifs sur la thermomixer pendant une période prolongée de temps. - Dans un tube de 15 mL, ajouter chaque composant de mélange maître de solution énergétique conformément à l’ordre et le volume spécifié dans le tableau 2. Vortex la solution après que chaque composant est ajouté. Cela va faire 5 mL de 10 x mélange maître de solution énergétique.
- Diviser le 10 x mélange maître de solution énergétique en 200 parties aliquotes μL en tubes de 2 mL. Flash gel chaque aliquote interprété à l’étape 2.12. Immédiatement, placez-les dans le congélateur à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Préparer une solution de 5 M de KOH en ajoutant des 140 g de pastilles de KOH dans 500 mL d’eau stérile de DI.
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Acides aminés mélange maître
- Pour préparer fraîches 4 x mélange principal acide aminé, commencez par décongélation chaque acide aminé des stocks au RT et puis placer chacun sur la glace. Utiliser un vortex et/ou thermomixer fixé à 37 ° C et 350 tr/min pour s’assurer que tous les stocks d’acides aminés sont entièrement dissous.
Remarque : Cystéine ne peut pas dissoudre entièrement ; Il peut être ajouté au mélange maître d’acides aminés sous forme de suspension. Ne pas surchauffer ou laisser des réactifs sur la thermomixer pendant une période prolongée de temps. - Dans un tube de 15 mL, ajouter les acides aminés de volume approprié à l’eau DI stérile afin que la concentration finale de chacune est de 8 mM dans l’ordre suivant : ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, sien, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU et CYS. Après avoir ajouté chaque acide aminé, vortex le master mix solution. Les volumes indiqués dans le tableau 2 composeront 2,4 mL de mélange principal acide aminé.
- Diviser les 4 acides aminés mélange maître en 200 parties aliquotes μL en tubes de 2 mL. Flash gel chaque aliquote interprété à l’étape 2.12. Placer immédiatement dans un congélateur à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Pour préparer fraîches 4 x mélange principal acide aminé, commencez par décongélation chaque acide aminé des stocks au RT et puis placer chacun sur la glace. Utiliser un vortex et/ou thermomixer fixé à 37 ° C et 350 tr/min pour s’assurer que tous les stocks d’acides aminés sont entièrement dissous.
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Production de la matrice d’ADN de plasmide prête à réaction
Remarque : Expression de la protéine acellulaire dans ce système a été optimisée en utilisant le vecteur d’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) dossier super T7-pJL1-sfGFP (Table des matières). Il est recommandé d’utiliser ce plasmide comme un contrôle d’efficacité de réaction acellulaire et l’épine dorsale de pJL1 pour le clonage et l’expression d’autres séquences de protéines. Autres modèles d’ADN de plasmide peuvent être utilisés ; Cependant, il est important de noter que la transcription est contrôlée par une séquence promotrice de T7 et la présence d’ARN polymérase T7. Un protocole simple pour la production massive de n’importe quel modèle d’ADN de plasmide de transformé e. coli est décrite ci-dessous.- Purifier le vecteur désirée à l’aide d’un kit de purification de plasmide selon les instructions du fabricant (Table des matières).
NOTE : Concentrer la matrice d’ADN de plasmide autant que possible est recommandée pour répondre aux contraintes de volume serré de la réaction acellulaire. En général, visent un stock de travail 750−1500 ng/μL.
- Purifier le vecteur désirée à l’aide d’un kit de purification de plasmide selon les instructions du fabricant (Table des matières).
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Production d’ADN messagère prête à réaction
Remarque : Cette section est facultative. Expression de la protéine a été testée à l’aide d’ADN messagère générée à partir de la transcription in vitro du plasmide T7-pJL1-sfGFP par la liste ARN polymérase T7 (Table des matières).- Préparation d’ADN messagère du plasmide ADN codant la protéine d’intérêt en utilisant les composants de réaction de transcription in vitro dans le tableau 3. Incuber les réactions pendant 1 h à 37 ° C dans un thermocycleur.
Remarque : Il est recommandé d’effectuer des 8−10x de ces réactions en parallèle pour générer suffisamment de matériel. - Mettre en commun toutes les réactions de la transcription. Purifier à l’aide d’un kit de purification et de concentrateur d’ARNm selon les instructions du fabricant (Table des matières). Éluer messagère en eau DI stérile. Magasin d’ADN messagère à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Préparation d’ADN messagère du plasmide ADN codant la protéine d’intérêt en utilisant les composants de réaction de transcription in vitro dans le tableau 3. Incuber les réactions pendant 1 h à 37 ° C dans un thermocycleur.
4. effectuer à l’aide de protéines Eexpression réactions V. natriegens brut extrait acellulaire
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Expression de la protéine sans cellule à l’aide de plasmides ou la matrice d’ADN linéaire
- Retirer du congélateur à-80 ° C, 10 x mélange maître de solution énergétique et 4 x acides aminés mélange maître aliquotes décongeler à ta et mettre sur la glace. Retirez l’ARN polymérase T7 et les stocks d’inhibiteur de RNase du congélateur-20 ° C et sur glace. Décongeler la matrice d’ADN à RT et le déposer sur la glace.
- Préparer un mélange de réaction acellulaire de maître selon le tableau 4 en ajoutant chaque composant dans l’ordre suivant à un tube de 2 mL sur la glace : acide aminé master mix, mix master de solution énergétique, Mg-glutamate, K-glutamate, matrice d’ADN, PEG-8000, ARN polymérase T7 et RNase inhibiteur de la. Effleurez doucement le tube après chaque addition pour master mix.
Remarque : Si le modèle linéaire doit être utilisé pour l’expression de la protéine acellulaire, ajouter 5−10x donne plus de matière par rapport au modèle de plasmide d’obtenir appréciable de protéines. - Enlever V. natriegens brut lysat cellulaire préparée à l’étape 2.12 de la congélateurs-80 ° C et le déposer sur la glace pendant 10−20 min jusqu'à ce que décongelés. Ajouter le volume approprié cellulaire brut extrait au mélange maître acellulaire réaction selon le tableau 4 et mélanger doucement en effleurant ou pipetage de haut en bas.
- Expression de protéine acellulaire de point final à l’aide de thermocycleur
- Distribuer 10 μL de master mix acellulaire réaction au fond d’une plaque PCR 96 ou 384 puits. Entre chaque transfert sur la plaque PCR, mélanger master mix en effleurant le tube doucement.
Remarque : Mélange de réaction acellulaire de maître doit être bien mélangé à tout moment afin de maximiser la reproductibilité de la réaction et l’expression de la protéine acellulaire dans tous les échantillons.
- Distribuer 10 μL de master mix acellulaire réaction au fond d’une plaque PCR 96 ou 384 puits. Entre chaque transfert sur la plaque PCR, mélanger master mix en effleurant le tube doucement.
- Centrifuger brièvement la plaque à 1 000 x g pendant 10 s à n’importe quel mélange maître qui se bloquent sur les côtés des puits en commun. Sceller les puits avec un adhésif plaque pour éviter l’évaporation et ensuite placer la plaque PCR dans un thermocycleur fixé à 26 ° C avec un couvercle chauffé à 105 ° C.
Remarque : La répartition égale de la chaleur et le couvercle chauffant d’un thermocycleur améliore considérablement les rendements d’expression protéique. - Incuber les réactions acellulaire pour un minimum de 3 h. Après incubation, protéines exprimées peuvent être purifiées, quantifiés et utilisés pour les processus en aval.
Remarque : Protéines exprimées peuvent être mesurés directement lors de la réaction sans cellule en utilisant une méthode de choix de l’utilisateur. Par exemple, les protéines fluorescentes peuvent être quantifiées à l’aide d’une courbe d’étalonnage externe ou radioactivité mesurable si vous utilisez un acide aminé radioactif dans la réaction acellulaire. Spectroscopie UV-visible ou dosages des protéines totales ne sont généralement pas recommandés pour mesurer directement la production de protéines dans les réactions acellulaire sans une première purification. - Vous pouvez également surveiller cinétique d’expression protéique acellulaire en utilisant un lecteur de plaque.
- Distribuer 10 μL de master mix acellulaire réaction au fond d’une plaque noire dosage 384 puits à fond de verre clair. Maintenir la plaque de test sur la glace ou de travailler dans une chambre froide tout en ajoutant le mélange maître pour s’assurer que le profil cinétique complète est obtenu. Sceller les puits avec un adhésif plaque claire pour éviter l’évaporation et placez ensuite la plaque de test dans un lecteur de plaque à 26 ° C.
- Incuber les réactions acellulaire pour 3−6 h tout en surveillant les longueurs d’onde d’émission/excitation fluorescente appropriés correspondant à la protéine exprimée. Par exemple, surveiller à Ex / Em = 485 nm/528 nm pour sfGFP.
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Expression de la protéine acellulaire utilisant messagère
- Dégel d’ADN messagère préparée à l’étape 3.5.2 à RT et le déposer sur la glace.
- Effectuez les étapes 4.1.1 à 4.1.6 précédemment spécifiée pour linéaire ou matrice d’ADN de plasmide en utilisant le tableau 4 pour préparer un mélange maître alternative acellulaire réaction d’ADN messagère.
5. Etalonnage du V. natriegens acellulaire réactions avec sfGFP
Remarque : Cette section est facultative. La concentration en ions optimales de réaction acellulaire peut varier légèrement pour chaque préparation d’extrait brut basée sur les conditions d’utilisation pour la lyse cellulaire. Envisager d’effectuer le protocole d’étalonnage de l’ion facultatif acellulaire réaction décrit ci-dessous à l’aide de sfGFP si les rendements de réaction sont nettement inférieures aux prévisions (concentration < 1,0 µg/mL).
- Préparer les Mg2 + et les solutions d’étalonnage ion K+ tel que spécifié dans le tableau 5 en eau DI stérile de le 100 Mg-glutamate et 2 000 mM K-glutamate stocks préparées à l’étape 3.1.1. Placer les solutions d’étalonnage sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
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Suivant la carte de calibrage au tableau 6, pipetter 1 μL de la Mg-glutamate et 2 μL des solutions d’étalonnage ion K-glutamate dans les puits appropriés dans une plaque 384 puits à PCR.
- L’ordre des opérations de cette étape est la suivante : solution d’étalonnage ion Pipette le Mg-glutamate dans le fond de chaque bien suivie par la solution d’étalonnage ion K-glutamate sur le côté du puits sans toucher le liquide déjà présent dans les puits.
- Sceller les puits en plaçant un adhésif sur le dessus de la plaque pour éviter une évaporation tout en préparant le master mix acellulaire réaction d’étalonnage. Tapoter légèrement la plaque 384 puits pour mélanger les solutions d’étalonnage de Mg - et K-glutamate.
Remarque : Une pipette de répéteur est fortement recommandée pour l’achèvement de cette étape rapidement et de façon reproductible.
- Préparer le calibrage acellulaire réaction master mix comme spécifié dans le tableau 5 en utilisant la matrice d’ADN plasmidique T7-pJL1-sfGFP dans un tube de 2 mL. Ajouter chacun des composants dans l’ordre suivant au master mix : acides aminés master mix, mix master de solution énergétique, matrice d’ADN de T7-pJL1-sfGFP, PEG-8000, ARN polymérase T7 et inhibiteur de RNase. Doucement effleurer le tube de mélanger après chaque ajout de composant.
Remarque : N’ajoutez pas de Mg2 + ou K+ pour la calibration acellulaire mélange principal. - Retirer l’adhésif de la plaque. Pipetter soigneusement 7 μL d’étalonnage acellulaire réaction master mix sur les côtés des puits sans toucher la solution d’étalonnage ion mixte déjà présente dans les puits. Refermer les puits avec la colle et tapoter légèrement la plaque 384 puits PCR pour mélanger acellulaire master mix avec la solution d’étalonnage ion.
Remarque : Une pipette de répéteur est fortement recommandée pour l’achèvement de cette étape rapidement et de façon reproductible. - Centrifuger brièvement la plaque x 1 000 g pendant 10 s pour mettre en commun tout liquide non mélangé qui se bloquent sur les côtés des puits. Placer la plaque 384 puits dans un thermocycleur fixé à 26 ° C avec un couvercle chauffé à 105 ° C.
- Incuber les réactions acellulaire pendant 3 h. Après incubation, transférer le contenu de chaque puits d’une plaque noire dosage 384 puits à fond de verre avec une pipette multi-canaux et lire la fluorescence de la sfGFP à Ex / Em = 485 nm/528 nm à l’aide d’un lecteur pour déterminer la combinaison de concentration des ions qui donne le montant le plus élevé de protéine.
Representative Results
Le protocole décrit la production de protéines System.* V. natriegens expression acellulaire peut être exécuté en 1−2 jours par un seul utilisateur, à partir de l’inoculation de la culture à la protéine disponible pour les applications en aval. Préparation des extraits cellulaires bruts et mélange maître stocks constituent une partie importante de cette époque ; Cependant, une fois préparée, la plupart en vrac les réactifs peuvent être stockées à long terme (tableau 7) et utilisées selon les besoins, raccourcir le temps nécessaire pour compléter le protocole.
Le système d’expression décrit est mieux utilisé avec la matrice d’ADN de plasmide ou ARNm générée par des réactions de transcription in vitro. Alors que l’ADN linéaire peut également servir de modèle pour la production de protéines, on obtient beaucoup plus faible quantité de protéines. Par exemple, dans des conditions optimales de réactions à 26 °C, une réaction simple 10 μL d’acellulaire peut produire > 260 µg/mL de sfGFP en 3 heures à l’aide de 0,3 pmol de matrice d’ADN de plasmide ou un comparable > 125 μg/mL de sfGFP à l’aide de 14 pmol de transcription de l’ARNm (Figure 5 a B). Cependant, 0,3 pmol d’ADN linéaire produiront beaucoup moins protéine (< 20 μg/mL). Pour chaque type de modèle, la majorité de la protéine se produiront au sein de la 1−1.5 h ; Toutefois, il est recommandé que la réaction est exécutée par un minimum de 3 heures. Concentrations de réaction acellulaire de sfGFP ont été déterminées par régression linéaire à l’aide d’une courbe d’étalonnage purifiée sfGFP mesure de fluorescence à Ex / Em = 485 nm/528 nm.
Le rendement de la production de protéines est significativement affecté par la concentration des ions de potassium et de magnésium (K+ et Mg2 +, respectivement). Dans des conditions optimisées, on a constaté que l’optimal Mg2 + et concentrations d’ions de K+ seront 3,5 mM et 80 mM, respectivement (Figure 6 a, B). Écarts par rapport à la concentration de l’ion optimale peuvent entraîner une capacité réduite pour le système d’expression acellulaire produire des protéines avec des rendements appréciables. Réglage supplémentaire peut être nécessaire si les rendements de réaction sont nettement inférieures aux prévisions. Un protocole facultatif pour l’étalonnage de l’ion est décrite à l’article 5. Cela permet une certaine souplesse à compenser la variabilité extrait cellulaire brut découlant de conditions et d’Equipement de lysis de cellules individuelles.
Figure 1 : une vue rapprochée du porte-gobelet et le tube sur la plate-forme de sonication. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : configuration matériel Sonication pour la préparation de cellulaire brut extrait. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : vue de la pastille après sonication et centrifugation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Flash gel dip pour le stockage de l’extrait. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résultats de représentant pour V. natriegens acellulaire la synthèse des protéines à l’aide de types de modèles différents de. Dosage de point de terminaison (A) de la production de sfGFP en utilisant des concentrations équimolaires de plasmide et matrice d’ADN linéaire (0,3 pmol) ainsi que l’augmentation des concentrations d’ADN messagère. Concentration de sfGFP acellulaire a été déterminée à l’aide d’une courbe standard de sfGFP purifié mesurée à Ex / Em = 485 nm/528 nm après 180 minutes d’incubation à 26 ° C dans des conditions optimales de réaction en 10 volumes μL. (B) analyse cinétique de la production de sfGFP en utilisant des concentrations équimolaires de plasmide et matrice d’ADN linéaire ainsi que l’augmentation des concentrations d’ADN messagère. sfGFP on a mesuré toutes les 3 minutes à Ex / EM = 485 nm/528 nm plus de 180 minutes de temps d’incubation totale aux conditions de la réaction optimale en 10 volumes μL. Pour point de terminaison et analyses cinétiques, échantillons étaient vides corrigées à l’aide de réactions acellulaire additionnées tous les composants sauf modèle. La moyenne et l’écart-type sont affichés (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : représentant les résultats d’étalonnage de concentration ionique. (A) V. natriegens acellulaire réactions ont été complétées avec des concentrations croissantes de Mg2 + et incubées à 26 ° C pendant 180 minutes en 10 réactions μL. La concentration totale de K+ était de 160 mM pour toutes les concentrations de Mg2 + . Concentration de sfGFP acellulaire a été déterminée à l’aide d’une courbe standard de sfGFP purifié mesurée à Ex / Em = 485 nm/528 nm. (B) V. natriegens acellulaire réactions ont été complétées avec des concentrations croissantes de K+ et incubées à 26 ° C pendant 180 minutes en 10 réactions μL. La concentration totale de Mg2 + était de 3,5 mM pour toutes les concentrations de K+ . Pour les deux étalonnages, les échantillons ont été vides corrigées à l’aide de réactions acellulaire additionnées tous les composants sauf modèle. La moyenne et l’écart-type sont affichés (n = 3). Ce chiffre a été modifié par Wiegand et al.,9. Réimprimé avec la permission de Wiegand, D.J., Lee, H.H., Ostrov, N., église, G.M. établissant un acellulaire Vibrio natriegens système d’Expression. La biologie synthétique de l’ACS. 7 (10), 2475−2479 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Tableau 1 | Préparation des milieux de culture bactérienne de LB-V2 | ||
| Composant | Quantité (g) | Concentration finale (mM) | Volume final (L) |
| Bouillon LB (Miller) | 25 | 1 | |
| NaCl | 11,69 | 200 | |
| MgCl2 | 2.20 | 23.1 | |
| KCl | 0,31 | 4.2 | |
| Tableau 1 | Préparation du tampon de lyse S30A | ||
| Composant | Quantité (g) | Concentration finale (mM) | Volume final (L) |
| Solution de tris (pH 8,0) - 1 M (mL) * | 25 | 50 | 0,5 |
| Mg-glutamate | 2.72 | 14 | |
| K-glutamate | 6.10 | 60 | |
| Le Dithiothréitol (DTT) - 1 M (mL) * | 1 | 2 | |
Tableau 1 : les réactifs pour la préparation de 1 L de milieux de culture bactérienne de LB-V2 et 0,5 L de tampon de lyse cellulaire S30A. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier dans Excel.
| Préparation de 10 x énergie Solution Master Mix | ||||
| Composant | Concentration en stock (mM) | Concentration finale (mM) | Quantité (µL) | Dernier Volume (µL) |
| PH HEPES-KOH 8 | 1750 | 500 | 1428.57 | 5000 |
| ATP | 100 | 15 | 750.00 | |
| GTP | 100 | 15 | 750.00 | |
| CTP | 100 | 9 | 450.00 | |
| UTP | 100 | 9 | 450.00 | |
| tRNA de e. coli MRE 600 (mg/mL) * | 100 | 2 | 100,00 | |
| Hydrate de la coenzyme A | 200 | 2.6 | 65,00 | |
| NAD | 200 | 3.3 | 82,50 | |
| cAMP de | 650 | 7.5 | 57.69 | |
| Acide folinique | 100 | 0,7 | 35,00 | |
| Spermidine | 1600 | 10 | 31,25 | |
| 3-PGA | 2000 | 300 | 750.00 | |
| Eau désionisée stérile | 49.99 | |||
| Préparation de 4 x acide aminé Master Mix | ||||
| Composant | Concentration en stock (mM) | Concentration finale (mM) | Quantité (µL) | Dernier Volume (µL) |
| ALA | 168 | 8 | 114.3 | 2400 |
| ARG | 168 | 8 | 114.3 | |
| ASN | 168 | 8 | 114.3 | |
| ASP. | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLN | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLU | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLY | 168 | 8 | 114.3 | |
| SA | 168 | 8 | 114.3 | |
| IIE | 168 | 8 | 114.3 | |
| LYS | 168 | 8 | 114.3 | |
| S’EST RÉUNI | 168 | 8 | 114.3 | |
| PHE | 168 | 8 | 114.3 | |
| PRO | 168 | 8 | 114.3 | |
| SER | 168 | 8 | 114.3 | |
| THR | 168 | 8 | 114.3 | |
| VAL | 168 | 8 | 114.3 | |
| TRP | 168 | 8 | 114.3 | |
| TYR | 168 | 8 | 114.3 | |
| LEU | 140 | 8 | 137.1 | |
| CYS | 168 | 8 | 114.3 | |
| Eau désionisée stérile | 91,4 | |||
Tableau 2 : Réactifs pour la préparation de 5 mL de 10 x la solution énergétique master mix et 2,4 mL 4 x acides aminés mélange principal. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier dans Excel.
| T7 l’ARN polymérase dans les réactions de Transcription in Vitro | ||||
| Composant | Stock (mM) | Concentration finale (mM) | Réaction 1 x quantité (µL) | Quantité (µL) x 50 réactions |
| 10 x RNAPol tampon de réaction | 1,00 | 50 | ||
| ATP | 100 | 0,5 | 0,10 | 5 |
| GTP | 100 | 0,5 | 0,10 | 5 |
| CTP | 100 | 0,5 | 0,10 | 5 |
| UTP | 100 | 0,5 | 0,10 | 5 |
| Matrice d’ADN (ng/µL) * | 1000 | 500 | 0,50 | 25 |
| T7 l’ARN polymérase | 200 | 2.6 | 2.00 | 100 |
| Inhibiteur de RNase, murin | 200 | 3.3 | 0,50 | 25 |
| Eau désionisée stérile | 15.60 | 780 | ||
| Volume (µL) de réaction : | 20 | |||
Tableau 3 : éléments de transcription In vitro pour la production d’ARNm. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier dans Excel.
| Acellulaire mélange réactionnel de la réaction | ||||
| Composant | Concentration en stock (mM) | Concentration finale (mM) | Réaction 1 x quantité (µL) | Quantité (µL) x 50 réactions |
| Extrait (%) * | 25 | 2,50 | 125.00 | |
| Mg-glutamate | 100 | 3.5 | 0,35 | 17.50 |
| K-glutamate | 2000 | 80 | 0.40 | 20 h 00 |
| 4 x acide aminé Master Mix | 8.0 | 2 | 2,50 | 125.00 |
| 10 x énergie Solution Master Mix | 1,00 | 50,00 | ||
| Plasmide ADN (ng/µL) * | 1000 | 500 | 0,50 | 25,00 |
| 50 % PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0.40 | 20 h 00 |
| T7 l’ARN polymérase | 1,00 | 50,00 | ||
| Inhibiteur de RNase, murin | 0,10 | 5,00 | ||
| Eau désionisée stérile | 1.25 | 62.50 | ||
| Volume (µL) de réaction : | 10 | |||
| Mix Master réaction acellulaire alternative pour messagère | ||||
| Composant | Concentration en stock (mM) | Concentration finale (mM) | Réaction 1 x quantité (µL) | Quantité (µL) x 50 réactions |
| Extrait (%) * | 25 | 2,50 | 125.00 | |
| Mg-glutamate | 100 | 3.5 | 0,35 | 17.50 |
| K-glutamate | 2000 | 80 | 0.40 | 20 h 00 |
| 4 x acide aminé Master Mix | 8.0 | 2 | 2,50 | 125.00 |
| 10 x énergie Solution Master Mix | 1,00 | 50,00 | ||
| Messagère (ng/µL) * | 2000 | 4000 | 2.00 | 100,00 |
| 50 % PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0.40 | 20 h 00 |
| Inhibiteur de RNase, murin | 0,10 | 5,00 | ||
| Eau désionisée stérile | 0,75 | 37.50 | ||
| Volume (µL) de réaction : | 10 | |||
Tableau 4 : Éléments d’optimisé V. natriegens acellulaire mélange maître de réaction pour la matrice d’ADN et ADN messagère. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier dans Excel.
| Mg 2 + Calibration | Réaction 1 x quantité (µL) | Réaction 1 x quantité (µL) | Quantité (µL) x 100 réactions | Quantité (µL) x 100 réactions | |
| Finale (mM) | Stock | 100 mM Mg-Glu | diH 2 0 | 100 mM Mg-Glu | Désionisée H2O |
| 2.5 | 0 | 0.00 | 1,00 | 0 | 100 |
| 3.5 | 1 | 0,10 | 0.90 | 10 | 90 |
| 4.5 | 2 | 0.20 | 0.80 | 20 | 80 |
| 5.5 | 3 | 0.30 | 0,70 | 30 | 70 |
| Volume (µL) de réaction : | 10 | ||||
| K + Calibration | Réaction 1 x quantité (µL) | Réaction 1 x quantité (µL) | Quantité (µL) x 100 réactions | Quantité (µL) x 100 réactions | |
| Finale (mM) | Stock | 2000 mM K-Glu | diH 2 0 | 2000 mM K-Glu | Désionisée H2O |
| 40 | 30 | 0,15 | 1,85 | 12 | 148 |
| 80 | 70 | 0,35 | 1,65 | 28 | 132 |
| 160 | 150 | 0,75 | 1.25 | 60 | 100 |
| 320 | 310 | 1.55 | 0,45 | 124 | 36 |
| Volume (µL) de réaction : | 10 | ||||
| Ion d’étalonnage acellulaire réaction Master Mix | |||||
| Composant | Concentration en stock (mM) | Concentration finale (mM) | Réaction 1 x quantité (µL) | Quantité (µL) x 50 réactions | |
| Extrait (%) * | 25 | 2,50 | 125.00 | ||
| Mg-glutamate | Variable | Variable | 1,00 | 50,00 | |
| K-glutamate | Variable | Variable | 2.00 | 100,00 | |
| 4 x acide aminé Master Mix | 8.0 | 2 | 2,50 | 125.00 | |
| 10 x énergie Solution Master Mix | 1,00 | 50,00 | |||
| Plasmide ADN (ng/µL) * | 1000 | 250 | 0.25 | 12,50 | |
| 50 % PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0.40 | 20 h 00 | |
| T7 l’ARN polymérase | 1,00 | 50,00 | |||
| Inhibiteur de RNase, murin | 0,10 | 5,00 | |||
| Eau désionisée stérile | 0.00 | 0.00 | |||
| Volume (µL) de réaction : | 10 | ||||
Tableau 5 : Mélanges maîtres de d’étalonnage de concentration de l’Ion. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier dans Excel.
| Carte de calibrage CF Ion | 40 mM K+ | 80 mM K+ | 160 mM K+ | 320 mM K+ | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| 2,5 Mg2 + | A | ||||||||||||
| 3.5 mM Mg2 + | B | ||||||||||||
| 4. 5 mM Mg2 + | C | ||||||||||||
| 5. 5 mM Mg2 + | D | ||||||||||||
Tableau 6 : Carte de calibrage Ion. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier dans Excel.
| Conditions d’entreposage et de durées de conservation des composants CF | ||
| Composant | Emplacement de stockage | Durée de vie |
| Milieux de culture stériles LB-V2 | 4 ° C | 3-6 mois |
| V. natriegens brut extrait de cellule | -80 ° C | 1-3 semaines |
| 100 mM Mg-Glutamate | Température ambiante | 6 mois |
| 2000 mM K-Glutamate | Température ambiante | 6 mois |
| 50 % PEG-8000 | Température ambiante | 6 mois |
| 10 x énergie Solution Master Mix | -80 ° C | 3-6 mois |
| 4 x acide aminé Master Mix | -80 ° C | 3-6 mois |
| Matrice d’ADN plasmidique/linéaire | -20 ° C | 6-12 mois |
| ARNm modèle | -80 ° C | 3-4 semaines |
Tableau 7 : Conditions de stockage acellulaire et durées de conservation. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier dans Excel.
Discussion
Ce protocole a été optimisé pour sauvage V. natriegens et milieux de culture bactérienne composée de LB additionné de sels V2 (Table des matières). Autres souches de V. natriegens peuvent être cultivées de la même façon pour générer cellulaire brut extraits des réactions acellulaire ; Toutefois, leur utilisation nécessite une optimisation supplémentaire du présent protocole. En outre, ce système d’expression de protéine acellulaire a été optimisé à l’aide de l’acide 3-phosphoglycérique (3-PGA) comme la source de régénération d’énergie primaire. Autres sources de régénération d’énergie peuvent être utilisés ; Cependant, optimisation de réactifs et l’étalonnage sera probablement obligée d’obtenir haut rendement protéines expression10,11.
Une attention particulière à plusieurs étapes cruciales dans ce protocole assurera la productivité maximale extrait pour haut rendement acellulaire la production de protéines. Tout d’abord, extrait cellulaire brut doit être préparé à partir V. natriegens cell cultures récoltées dans une phase de milieu-exponentielle de croissance ; rendement de protéine est maximale quand cultures atteignent une OD600 = 1,0 ± 0,2. La production de protéines acellulaire est possible à partir de cellules prélevées à différentes densités optiques, nous avons constaté précédemment que cellules récoltées dans un état exponentiels de croissance donnent beaucoup plus de protéines9. Les effets observés de la densité optique sur performance extrait cellulaire brut concordent avec ceux rapportés pour d’autres systèmes acellulaires expression dérivées de cellules cultivées dans des conditions de culture lot1. Parce que V. natriegens croît à un rythme rapid, il est essentiel de suivre de près les densités optiques des cultures. En général, il est prévu que V. natriegens cultures devraient atteindre reproductible un OD600 de 1,0 dans les 1−1.5 h utilisant ce protocole ; Toutefois, des conditions de croissance individuels tels que l’utilisation de dérouté par rapport aux flacons non-déconcerté, qui affecte l’aération, ou l’air contre l’incubation de l’eau, qui influe sur le taux et la stabilité de la température d’incubation, peuvent modifier les temps de croissance. En outre, il est généralement recommandé d’au moins 250 mL de V. natriegens dans un ballon jaugé de 1 L dérouté afin d’assurer une boulette de grandes cellules à la récolte pour une manipulation facile et le transfert de la culture. Cela améliore grandement le succès de la préparation d’extrait cellulaire brut ainsi que des augmentations le volume total d’extrait issu une boulette. Lorsque vous utilisez la plus petite préparation d’échelle, les réactifs et les conditions de culture peuvent être ajustés correctement. Pour la fermentation à grande échelle, outre l’optimisation des conditions de culture peut être nécessaire. Enfin, afin d’assurer un rendement de haute teneur en protéines, il est primordial que les granules cellulaires soient traités immédiatement après la récolte, ou 1−2 jours de stockage à-80 ° C.
Provoquer la lyse adéquate dans le culot cellulaire par sonication impulsion est essentielle à la réussite de l’expression protéique acellulaire et est souvent l’aspect le plus difficile du présent protocole pour les nouveaux utilisateurs. En règle générale, une boulette bien lysée produira un volume important d’extrait liquide exempt de débris. L’extrait doit être légèrement visqueux, mais peut être facilement distribué lorsque aliquotage en stock tubes avant congélation dans l’azote liquide flash. La figure 3 illustre une représentation d’une pastille bien lysée (Figure 3 a) en comparaison avec une boulette de mal lysée (Figure 3 b) après l’étape de centrifugation de lyse post. Une indication majeure de la lyse cellulaire complet est un cellulaire brut extrait de protéine totale concentration > 20 mg / mL, tel que déterminé par un dosage des protéines totales (étape 2.13). Sonication excessive ou un réchauffement excessif de l’extrait cellulaire brut risquent d’endommager la machinerie cellulaire, qui ne peut être déterminée sans effectuer une réaction acellulaire. Ainsi, il est très bénéfique pour tester l’efficacité d’extrait avec une réaction de contrôle avant de consacrer beaucoup de temps et d’efforts aux applications expression de protéine en aval. Une optimisation supplémentaire peut être nécessaire pour l’équipement de sonication différents, les étapes de sonication impulsions décrites ont été hautement reproductibles dans nos mains.
L’utilisation de la matrice d’ADN linéaire provenant de PCR amplification, digest de l’enzyme de restriction ou synthèse de gène commerciales peut augmenter considérablement la capacité de production de la protéine rapide et à haut débit à l’expression acellulaire systèmes24. Alors que la production de protéines du modèle linéaire amplification PCR a été démontrée, le rendement de ces réactions sont environ 13.5-fold inférieur par rapport aux réactions à l’aide de plasmide matrice d’ADN à des taux équimolaires9. C’est principalement en raison de l’instabilité de la matrice d’ADN linéaire qui est probablement dégradé par les nucléases endogènes présents dans V. natriegens cellulaire brut extrait. Tandis que phage lambda protéine GamS a été précédemment utilisé pour protéger l’ADN linéaire modèle24,25, il a été constaté incompatible avec V. natriegens extraits9. En outre, alors que l’augmentation de la concentration de la matrice d’ADN linéaire peut permettre un rendement plus élevé de protéine, sa dégradation rapide dans l’extrait cellulaire brut sera toujours un problème majeur.
Une solution pour surmonter la dégradation de l’ADN linéaire pour modèle peut-être compléter acellulaire réactions avec messagère généré par transcription in vitro de l’ADN linéaire. En revanche, l’utilisation d’un inhibiteur de RNase offre une protection significative contre la dégradation des ARNm transcription et peuvent obtenir des rendements de protéines appréciable dans le format de réaction acellulaire 10 μL (Figure 5 aB). Clonage d’ADN linéaire dans un modèle circulaire par ligature TA, TOPO clonage, un assemblage de Golden Gate ou autres méthodes de recombinaison peuvent servir à contourner la dégradation du modèle. Néanmoins, outre des approches pour l’inhibition de l’activité nucléasique sera nécessaires pour l’expression de la protéine efficace à l’aide de la matrice d’ADN linéaire.
A ce jour, plusieurs approches différentes ont été proposées pour la préparation d’extrait brut de proteines acellulaires expression9,10,11,26. Dans l’élaboration de ce protocole, nous avons cherché à maximiser l’accessibilité de l’utilisateur, réduire le coût global et minimiser les étapes fastidieuses. Par exemple, un rendement de haute teneur en protéines est obtenu grâce à un processus de sonication-centrifugation simple en deux étapes et ne nécessite pas d’homogénéisateurs de cellule, marches de dialyse longue ou réaction de ruissellement. Il est simple à exécuter dans un court laps de temps et ne nécessite pas de haut niveau d’expertise de laboratoire. Ainsi, il peut aider à faciliter l’expression sans cellule comme un standard pour la recherche translationnelle et conception des procédés industriels.
Ce protocole s’étend de la boîte à outils disponible pour l’enquête et l’utilité du V. natriegens, un organisme non-modèle avec des propriétés biologiques uniques. Rendement plus élevé de protéine peut être réalisé en employant les réactions acellulaire semi - ou entièrement-continu, afin de permettre la régénération de l’énergie, pour ravitailler des acides aminés et l’élimination des déchets produits3,5,27. En outre, l’ingénierie de type sauvage V. natriegens pour produire des souches de DNAse - ou RNAse-deficient, enlèvement des voies métaboliques délétères qui se font concurrence et l’expression des Arnt supplémentaires pourraient améliorer considérablement la production de protéines dans ce système28,29. Comme nous démêler la biologie qui sous-tendent sa croissance rapide, poursuite de V. natriegens systèmes acellulaires peut-être accélérer les capacités de bioproduction et activer l’expression robuste de peptides thérapeutiques, de petites molécules et synthétique matériaux.
Disclosures
FILY, NO, et GMC ont déposé un brevet lié à ce travail.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 et le ministère de l’énergie DE-FG02-02ER63445. Les auteurs aimeraient remercier Dr. Richard Kohman, Dre Jenny Tam et Dr Edgar Goluch pour obtenir des conseils utiles sur la construction de la section protocole de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
| 2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| 384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
| 384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
| 50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
| 96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
| Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
| Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
| Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
| Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
| Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
| Dewar Flask - 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
| DL-Dithiothreitol solution - 1 M | Sigma | 42816 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
| Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
| Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
| Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip | Qsonica | 4422 | |
| RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
| RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
| Tris Solution (pH 8.0) - 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
| tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
| Uridine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |
References
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