Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Boş hücre Protein ifade kullanarak hızla büyüyen bakteri Vibrio natriegens

Published: March 14, 2019 doi: 10.3791/59495
Automatic Translation
1,2, 1, *1, *1,2
1Department of Genetics, Harvard Medical School, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering
* These authors contributed equally

Summary

İfade boş hücre sistemleri yüksek üretilen iş sentezi ve önemli protein testi ile taranması için maliyet-etkin ve güçlü araçlardır. Burada, Vibrio natriegens plazmid DNA, doğrusal DNA ve mRNA şablonunu kullanarak hızlı protein üretimi için kullanılan boş hücre proteini ifade sistemin hazırlanması açıklayın.

Abstract

Vibrio natriegens deniz bakteri için biyoteknoloji, hızlı büyüme hızı nedeniyle ortaya çıkan bir mikrobiyal konağı olarak büyük ilgi topladı vardır. Genel bir protokol natriegens V. ham hücre özleri ortak labaratuar donanımları kullanarak hazırlanması için tanımlanır. Bu yüksek verimli iletişim kuralı özellikle oldu kullanıcı erişilebilirlik için en iyi duruma getirilmiş ve düşük maliyeti. Boş hücre protein sentezi (CFPS) küçük ölçekli 10 μL toplu tepkiler bir 96 - veya 384-iyi biçimde yapılabilir ve tekrarlanarak > 260 μg/mL süper klasör GFP (sfGFP) 3 h. içinde konsantrasyonları genel olarak verimleri, ham hücre ayıklamak hazırlık ve CFPS 1−2 tam gün içinde tek bir kullanıcı tarafından elde edilebilir. Bu iletişim kuralı gelişmeler biyo-üretim ve sentetik Biyoloji uygulamaları kolaylaştırmak için protein sentezi boru hatları mevcut kolayca bütünleştirilebilir.

Introduction

Boş hücre protein sentezi değerli proteinler veya peptidler1,2,3,4bir ifade için çok yönlü ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Tarihsel olarak, boş hücre protein sentezi Escherichia coli ifade sistemleri kullanılarak yapılmıştır; Ancak, ortada bir son dalgalanma alternatif, Sigara model organizmalar yeni özelliklere sahip kasa ifade boş hücre5için,6,7,8,9 kullanarak , 10 , 11 , 12. benzersiz metabolik profilleri ile organizmalar E. coli boş hücre sistemleri alternatif olarak Başbakan adayları vardır. Örneğin, en hızlı büyüyen bir gözlenen ile tüm bilinen organizmaların Vibrio natriegens olduğunu deniz bakteri saat 10 dk13az iki katına. Bu araştırma ve biyoteknoloji14,15,16,17,18için gelişmekte olan bir mikrobiyal konağı olarak natriegens V. büyük ilgi topladı vardır. Natriegens hızlı büyüme oranına sahip verilen bu protein sentezi ve boş hücre için onun hücresel makine harnessing metabolik verimliliği19,20,21, yüksek oranda bağlantılı olmuştur sentez toolkit hızlı protein üretimi ve yüksek üretilen iş tarama için önemli ölçüde genişleyebilir.

Son zamanlarda, bir-boş hücre V. natriegens ifade sistem gösterdi süper klasör GFP (sfGFP) olarak T7 organizatörü93 h > 260 μg/mL konsantrasyonlarda üretme yeteneğine sahip olan. Bu yöntem geliştirme genel amacı ortak laboratuar ekipmanları zaman kısa bir miktarda kullanılarak hazırlanan son derece erişilebilir, maliyet-etkin, tekrarlanabilir ve yüksek verimli boş hücre proteini ifade sistem sunmak için yapıldı. Bu iletişim kuralını kullanan sallamak şişeler 1 L kültürlerde, hücre lizis darbe sonication ve küçük ölçekli toplu tepkileri parallelization ve filtreleme verimi en üst düzeye çıkarmak için bir 96 - veya 384-da biçiminde tarafından. Uzun, sürekli protein ifade tarafından 3-phosphoglyceric asit (3-PGA) takviyesi bir enerji kaynağı8,22,23mümkün olmaktadır. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlayan, üzerine bir kullanıcı istenen bir protein hızlı yeteneğine sahip veya proteinlerin natriegens V. ham hücre kullanarak boş hücre biçiminde ayıklayabilirsiniz.

Gliserol stoktan başlayarak, V. natriegens ham hücre özleri 600 optik bir yoğunluk, hasat hücrelerden hazırlanır nm (OD600) 1.0. 1 L kültür yaklaşık 2−3 mL % 25 ham hücre özü itibariyle 800'den fazla boş hücre reaksiyonları için yeterlidir ekstresinin ortaya çıkarır. Proteinler plazmid DNA, doğrusal DNA veya mRNA şablonu kullanarak ifade edilebilir; Ancak, doğrusal DNA şablon bozulması endojen enzimler tarafından vahşi tip natriegens V. -boş hücre sistemi9kullanırken büyük bir dezavantaj kalır. Natriegens kültürler başlayarak, protein aşağı akım uygulamalarda kullanılabilir tek bir kullanıcı tarafından 1−2 tam gün içinde elde edilebilir.

Protocol

1. hazırlanması natriegens V. ham hücre özleri-bakteri kültürü

  1. Natriegens Bakteriyel büyüme medya LB-V2 Tablo 1göre hazırlayın. Büyüme medya tarafından ısıyla sterilize. Medya oda sıcaklığında (RT) ulaşmak izin. Mağaza fazla medya RT.
    Uyarı: Uygun bireysel koruma araçları (PPE) giymek ve bir otoklav çalışırken laboratuar belirli yönergeler başvurun.
  2. Vahşi türü natriegens V. gliserol stokunun 3 mL LB-V2 medya aşılamak için kullanın. Bir gecede 30 ° C'de 225 rpm'de sallayarak süre büyümek.
  3. Gecede kültür 1 mL aralıklarla 10.600 x g benchtop santrifüj 1 dk. aspiratı süpernatant üzerinde de tarafından elde edilen Pelet bozmadan yıkama ve 1 mL taze LB-V2 medya resuspend.
  4. Bir autoclaved 4 ● şaşkın Erlenmeyer flask steril kapaklı 1 L taze LB-V2 büyüme ortamının ekleyin. 1 mL yıkanmış gecede kültür (1:1, 000 seyreltme oranı) kullanarak aşılamak. Kültür 30 ° C'de 225 rpm'de sallayarak süre büyümek.
    Not: Natriegens kültürler yukarı veya aşağı 1:1,000 seyreltme oranını koruyarak ölçeklendirilebilir. Örneğin, 250 μL yıkanmış gecede kültür bir 2 L taze LB-V2 büyüme ortamının 250 ml steril kapaklı Erlenmeyer flask şaşkın ekleyin.
  5. Kültürün OD600 bir Spektrofotometre kullanarak izleyin. Kültür'e ulaştığında OD600 = 1.0 ± 0.2, hasat kültür yoluyla Santrifüjü 3.500 x g 4 ° C'de 20 dk için de Pelet Buza koyun.
    Not: Bu nedenle yakın kültürünü izlenmesi gerekli olan V. natriegens hızla, yetişir. Büyüme OD600 = 1.0 1:1,000 seyreltme oranı yaklaşık 1.5−2 s almalı.
  6. Süpernatant Aspire edin ve hemen sonuç bakteriyel Pelet-80 ° C'de depolayın veya doğrudan hücre lizis 2 bölümünde açıklanan geçin.
    Not: Bu adımı iyi durdurma noktasıdır; Ancak, bu Pelet hemen veya 1−2 gün en iyi sonuç için işlenmesi tavsiye edilir.

2. hazırlanması natriegens V. ham hücre özleri-hücre lizis

  1. S30 lizis arabellek Tablo 1 steril deiyonize (DI) suda göre hazırlamak ve pH buzul Asetik asit kullanarak 7,7 için ayarlayın.
    Uyarı: Buzul Asetik asit ile uygun KKE pH ayarlarken ele alınmalıdır.
  2. Yaklaşık olarak 4 ° C bir buzdolabında veya buz üzerinde S30 lizis arabelleğe hücre lizis yordama başlamadan önce serin.
    Not: Hızlı serin aşağı, lizis için arabellek-20 ° C'de yerleştirilebilir Dondurma için tampon izin vermez.
  3. Hücre granül 10−20 min ya da tamamen çözdürülen kadar Buza koyun. 10 mL soğuk S30 lizis arabellek kullanarak 1 L kültüründen kaynaklanan tüm parçaları resuspend sonra süspansiyon 50 mL tüp aktarmak. Granül dondurucu içinde adım 1.6-80 ° C'de donmuş değil, doğrudan resuspension için devam edin.
    Not: Başlangıçta gerektiği gibi granül resuspend için kullanılan S30 lizis arabellek hacmi artırın.
  4. Santrifüj süspansiyon 3.500 x g 4 ° C'de 10 dk de Süpernatant Pelet bozmadan Aspire edin. Pelet 10 mL soğuk S30 lizis arabellek kullanarak ikinci kez yıkayın. Pelet Buza koyun.
  5. Soğuk bir odada 50 mL tüp Pelet soğuk S30 lizis arabelleği 500 μL ekleyin. Wide-geçişli pipet ucu kullanarak, pelet resuspend ve dikkatle tüm Pelet süspansiyon 2 mL tüp aktarın.
    Not: Geniş bir delik Eğer pipet mevcut değil, pelet transfer için geçişli artırmak için 1 mL pipet ucu sonu kesmek için bir makas kullanın.
    1. Kadar Pelet mümkün olduğunca birimin önemli ölçüde artırmadan transfer; Ancak, pelet sonicated için yeterli sıvı 2 mL tüp içinde homojen bir süspansiyon tarafından belirtildiği şekilde resuspended. 2 mL tüp bantlayın değil. Süspansiyon 1,5 mL aşmaması gerekir; birden çok tüpler içine bölme eğer gerekli.
  6. Hücre Pelet buz üzerinde tutun ve soğuk bir odada çalışmak. 600 mL kabı buz ile doldurun ve buz. üstünde tepe-in yer 2 mL tüp tutucu
    Not: Pelet süspansiyon sonication ilerlemesini izlemek için buzun içinde görünür olur, böylece boru tutucu kabı, yan yerleştirmek yararlıdır (bkz. şekil 1).
  7. Girdap Pelet kısaca hücreleri homojenize için 2 mL tüp içinde askıya, flick tüplere herhangi bir hücre alt kapak kaldırma ve kapaklı tüp tutucusuna yer açın. Böylece sadece sıvı yüzeyinin altında sonicator uç süspansiyon indirin.
  8. Sonication set-up bir sonicator ve sonda ⅛-inç uç çapı ile kullanarak Şekil 2 tasvir hazırlayın. Giriş sonicator denetimin içine aşağıdaki ayarları: 20 kHz frekans ve genlik % 50, nabız zamanında: 10 s, darbe OFF Zamanı: 60 s.
  9. Pulse sonication protokolü için üç döngüleri çalıştırın. Pelet süspansiyon hacmi > 500 μL pulse sonication Protokolü altı kez çalıştırın.
    Not: Genel olarak, 3−6 bakliyat V. natriegens granül lyse yeterlidir; ek bakliyat sonicator bağlı olarak gerekli olabilir. Sonication sırasında ayarlama düğmesi platform yukarı ve aşağı tüp altına yerleşmiş herhangi bir Pelet lyse sonda taşımak için kullanın. Tüp tutucu ve kısaca vortexed süspansiyon bakliyat arasında yeniden homojenize için kaldırılabilir. Aşağıda için istenilen kıvama sonicated hücre bkz.
    Uyarı: Sonicator etkin olduğunda uygun işitme koruma giymek.
  10. Santrifüj ham hücre sonication ayıklamak 16.000 x g 30−45 min 4 ° C'de veya lysate şekil 3' te gösterildiği gibi herhangi bir hücresel enkaz serbest olduğundan kadar için de.
  11. Soğuk bir odada, pelet bozmadan yeni 2 mL tüpler için elde edilen supernatants aliquot 50 μL.
    Not:     yanlışlıkla yeni 2 mL tüpler içine aktarılır herhangi bir enkaz özü'nın kapasite yüksek verimli protein sentezi için önemli ölçüde azaltacaktır.
    1. İsteğe bağlı olarak, hücre 10 μL ayıklamak için ayrı bir 2 ml sonrası lizis protein miktar kenara (bkz. Adım 2,13 aşağıda) tüp.
  12. Flaş tüpler bir tüp tutucu şekil 4' te gösterildiği gibi bağlı bir daldırma dize yerleştirerek ham hücre özleri dondur. Tüpler sıvı azot içeren bir Dewar daldırın ve hemen kadar kullanmak bir dondurucu-80 ° C'de yer.
    Uyarı: Uygun KKE sıvı azot laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük, yüz kalkan, cryogen önlük ve eldiven gibi işlemek için kullanın.
  13. İsteğe bağlı olarak, hücre 10 μL Örnek 1: 100, 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x sulandrarak ve herhangi bir standart toplam protein miktar tahlil Bradford tahlil, bicinchoninic asit gibi kullanarak adım kenara 2.11.1 set kullanarak lysate toplam protein ölçmek tahlil (BCA), vs.

3. hücre-Alerjik reaksiyon bileşenleri hazırlanması

  1. Genel reaksiyon bileşenleri
    1. Mg-Glutamat ve K-Glutamat çalışma hisselerinde 50 mL tüpler ile steril DI su, 100 mM ve 2000 mM, konsantrasyonları sırasıyla hazırlayın.
    2. % 50 (w/v) polietilen glikol (PEG)-8000 çalışma stokunun 100 mL steril DI ekleyerek su 250 mL kabı için hazırlayın. Küçük bir manyetik karıştırıcı kabı yerleştirin. PEG-8000 50 gr ağırlığında ve 100 mL su kabı içinde ekleyin.
    3. Kabı 100 ° C ısıtılmış heyecan plaka kümesine yerleştirin ve PEG-8000 çözümde olana 250 devir / dakikada ilave edin. 50 mL tüpler aktarmadan önce soğumasını PEG-8000 sıvı karışım izin verin.
  2. Enerji çözüm master mix
    1. KOH pellet 140 g 500 mL steril DI su ekleyerek 5 M KOH çözeltisi hazırlamak.
      Uyarı: Bu çözüm bir kimyasal başlıklı hazırlamak ve güçlü üsleri ele alırken KKE giymek. Şişe kapağı basınç birikmesi önlemek için gevşek olmalı ki çözüm sıcak olacak. KOH çözüm RT kullanmadan önce ulaşmak izin verin.
    2. 1750 mM HEPES-KOH arabellek 100 mL şişe HEPES 20.85 g ekleyerek hazırlayın. Birimin 40 mL ulaşıncaya kadar yavaş steril DI su ekleyin. Girdap şişe HEPES geçiyoruz. 5 M KOH çözüm 8,0 pH ayarlama ve çözüm cilt 50 mL getirmek için kullanın.
      Uyarı: KOH ile uygun KKE pH ayarlarken ele alınmalıdır.
    3. Kalan 10 x enerji ana mix hisse senedi bileşenleri Tablo 2 steril DI su içinde belirtilen konsantrasyonlarda hazırlamak ve her hissenin Buza koyun. 100 mM ATP, GTP, CTP ve UTP hisse senetleri RT ve yerde buz çözme.
      Not: Bir thermomixer 37 ° C ve 350 rpm için ayarla reaktifler gerekirse çözümde dağıtmak için kullanılabilir. Aşırı ısınma ya da reaktifler thermomixer üzerinde uzun bir süre için bırakın değil.
    4. Bir 15 mL tüp sipariş ve Tablo 2' de belirtilen birim uygun olarak her enerji çözüm ana mix bileşenini ekleyin. Girdap her bileşen eklendikten sonra çözüm. Bu 10 enerji çözüm ana mix x 5 mL yapacaktır.
    5. 10 enerji çözüm ana mix x 200 μL aliquots 2 mL tüpler bölün. Flaş 2.12 adımda gerçekleştirilen gibi her aliquot dondur. Hemen onları kadar kullanmak-80 ° C dondurucu içine yerleştirin.
  3. Amino asit master mix
    1. Taze 4 x amino asit ana karışım hazırlamak her amino asit hissenin RT, çözülme ve sonra her buz üzerinde yerleştirerek başlar. Bir girdap ve/veya 37 ° C, gerekse 350 d/d thermomixer tüm amino asit stok tamamen çözülür emin olmak için kullanın.
      Not: Sistein tamamen erimesi değil; bir süspansiyon amino asit ana karışıma eklenebilir. Aşırı ısınma ya da reaktifler thermomixer üzerinde uzun bir süre için bırakın değil.
    2. Böylece her son konsantrasyonu aşağıdaki sırada 8 mM 15 mL tüp içinde uygun birim amino asitler steril DI su ekleyin: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, onun, yalan, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEYİ ve CYS. Her amino asit ekledikten sonra girdap asıl çözüm mix. Tablo 2 ' de listelenen birimlerden amino asit ana mix 2.4 mL kadar yapacaktır.
    3. 4 ana amino asit karışımı x 200 μL aliquots 2 mL tüpler bölün. Flaş 2.12 adımda gerçekleştirilen gibi her aliquot dondur. Hemen bir dondurucu-80 ° c kadar kullanmak yerleştirin.
  4. Reaksiyon hazır plazmid DNA şablon üretimi
    Not: Boş hücre proteini ifade Bu sistemdeki süper klasör yeşil flüoresan protein (GFP) ifade vektör T7-pJL1-sfGFP (Malzeme tablo) kullanarak optimize edilmiştir. Bu plazmid hücre-Alerjik reaksiyon verimlilik ve klonlama ve diğer protein sıralarının ifade için pJL1 omurga için bir denetim olarak kullanmak için tavsiye edilir. Diğer plazmid DNA şablonları kullanılabilir; Ancak, transkripsiyon T7 organizatörü sırası ve T7 RNA polimerazın varlığı tarafından kontrol edilir unutmamak gerekir. Herhangi bir plazmid DNA şablondan dönüştürülmüş E. coli büyük ölçekli üretim için basit bir protokol aşağıda açıklanmıştır.
    1. Plazmid arıtma seti üreticisinin yönerge (Tablo reçetesi) göre kullanarak istenen vektör arındırmak.
      Not: plazmid DNA şablonu mümkün olduğu kadar konsantre hücre-Alerjik reaksiyon sıkı cilt kısıtlamaları karşılamak için önerilir. Genel olarak, bir 750−1500 ng/μL çalışma hisse senedi için nişan al.
  5. Reaksiyon hazır mRNA şablon üretimi
    Not: Bu bölümde isteğe bağlı. Protein ifade plazmid T7-pJL1-sfGFP tüp bebek transkripsiyon (Tablo reçetesi) listelenen T7 RNA polimeraz tarafından oluşturulan mRNA şablonunu kullanarak test edilmiştir.
    1. Plazmid DNA Tablo 3' te tüp bebek transkripsiyon reaksiyon bileşenleri kullanarak ilgi protein kodlama şablondan mRNA hazırlayın. Bir thermocycler olarak 37 ° C'de 1 h tepkilerini kuluçkaya.
      Not: Bu 8−10x Bu reaksiyonların yeterli malzeme üretmek için paralel olarak gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
    2. Tüm transkripsiyon reaksiyonlar havuz. Bir mRNA arıtma ve yoğunlaştırıcı seti üreticisinin yönerge (Tablo reçetesi) göre kullanarak arındırmak. MRNA şablon steril DI suya elute. -80 ° C'de mRNA şablon kullanmak kadar saklamak.

4. boş hücre Protein Eexpression reaksiyonlar natriegens V. ham hulâsa istimal gerçekleştirme

  1. Boş hücre proteini ifade plazmid veya doğrusal DNA şablonu kullanarak
    1. 10 enerji çözüm ana mix x ve 4 x amino asit ana mix aliquots-80 ° C dondurucudan kaldırmak çözülme RT ve Buza koyun. T7 RNA polimeraz ve RNase inhibitörü stokları-20 ° C dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde yerleştirin. DNA şablon RT ve yerde buz çözme.
    2. Her bileşen aşağıdaki sırada bir 2 mL tüp buz üzerinde ekleyerek Tablo 4 göre bir boş hücre tepki ana karışım hazırlamak: amino asit ana mix, enerji çözüm ana mix, Mg-Glutamat, K-Glutamat, DNA şablon, PEG-8000, T7 RNA polimeraz ve RNase inhibitörü. Yavaşça tüp ana karıştırmak için her eklenmesinden sonra hafifçe vur.
      Not: Doğrusal şablon boş hücre proteini ifade için kullanılacak ise kayda değer elde etmek için plazmid şablonu ile karşılaştırıldığında daha fazla malzeme verir 5−10x protein ekleyin.
    3. Natriegens ham hücre lysate adım 2.12-80 ° C Dondurucular ve yer buz çözdürülen kadar 10−20 min için hazırlanan kaldırın. Ham hücre Tablo 4 başı olarak hücre-Alerjik reaksiyon ana karışıma hulâsa ve karışımı yavaşça flicking veya yukarı ve aşağı pipetting uygun birim ekleme.
    4. Son nokta boş hücre proteini ifade thermocycler kullanarak
      1. 96 - veya 384-da PCR plaka altına boş hücre tepki ana karışımı 10 μL pipet. Arasında her transfer PCR plakasına tüpü yavaşça flicking tarafından ana mix karıştırın.
        Not: Boş hücre tepki ana mix iyi tepki tekrarlanabilirlik ve boş hücre proteini ifade tüm örneklerinde en üst düzeye çıkarmak için her zaman karışık.
    5. Kısaca 1000 x g 10 plaka santrifüj kapasitesi havuzu kuyuları iki tarafında kalmış olur ana herhangi bir karışım için s. Wells buharlaşma önlemek ve daha sonra ayarla 105 ° C'de ısıtılmış bir kapak ile 26 ° C'de ayarla bir thermocycler içine PCR plaka yer bir levha yapıştırıcı ile mühür
      Not: Bile ısı dağılımı ve bir thermocycler ısıtmalı kapak büyük protein ifade verimi artırır.
    6. 3 h en az boş hücre reaksiyonları kuluçkaya. Kuluçka sonra ifade proteinler getirilebilir saf, sayılabilir ve aşağı akım işlemleri için kullanılan.
      Not: İfade proteinler doğrudan kullanıcının seçtiğiniz yöntemi kullanarak boş hücre tepki olarak sayısal. Örneğin, floresan proteinler bir dış standart eğri kullanarak sayısal veya radyoaktivite radiolabeled bir amino asit hücre-Alerjik reaksiyon kullanıyorsanız ölçülebilir. UV-görünür spektroskopisi veya toplam protein deneyleri genellikle doğrudan protein üretim ilk bir arıtma olmadan boş hücre reaksiyonlarda ölçmek için tavsiye edilmez.
    7. Alternatif olarak, boş hücre proteini ifade Kinetik bir plaka okuyucu kullanarak izleyin.
      1. Siyah 384-iyi tahlil plaka altına açık cam dipleri ile hücre-Alerjik reaksiyon ana karışımı 10 μL pipet. Tahlil plaka buz üzerinde tutmak veya soğuk bir odada tam Kinetik profil elde emin olmak için ana karışımını eklerken iş. Wells buharlaşma önlemek ve daha sonra 26 ° C'de ayarla bir plaka okuyucu içine tahlil plaka yer açık levha yapıştırıcı ile mühür
    8. Boş hücre reaksiyonları 3−6 süre için ifade protein karşılık gelen uygun floresan uyarma/emisyon dalga boylarında izleme s için kuluçkaya. Örneğin, adlı izlemek Ex / Em sfGFP için 485 nm/528 nm =.
  2. Boş hücre proteini ifade mRNA şablonu kullanarak
    1. Tezcan mRNA şablon adım 3.5.2 RT ve yerde buz üzerinde hazırlanan.
    2. Adım adım 4.1.6 için daha önce belirtilen 4.1.1 gerçekleştirmek doğrusal veya mRNA şablonu için bir alternatif hücre-Alerjik reaksiyon ana karışım hazırlamak için Tablo 4 kullanarak plazmid DNA şablonu.

5. natriegens hücre-alerjik reaksiyonlar sfGFP ile kalibrasyonu

Not: Bu bölümde isteğe bağlı. Optimum hücre-Alerjik reaksiyon iyonu konsantrasyonu hücre lizis için kullanılan koşullara göre her ham özü hazırlık için biraz değişebilir. Eğer reaksiyon verimleri beklenenden daha düşük sfGFP kullanarak aşağıda açıklanan isteğe bağlı hücre-Alerjik reaksiyon iyon kalibrasyon Protokolü (konsantrasyonları < 1.0 μg/mL) gerçekleştirmeyi dikkate alın.

  1. Mg2 + ve K+ iyon kalibrasyon çözüm Tablo 5 ' te steril DI su 100 mM Mg-Glutamat ve 2.000 mM belirtildiği gibi K-Glutamat stokları 3.1.1. adımda hazırlanan hazırlayın. Kalibrasyon çözüm gerekinceye kadar Buza koyun.
  2. Tablo 6 kalibrasyon eşlemede bir 384-şey PCR plaka uygun kuyu içine 1 μL Mg-Glutamat ve K-Glutamat iyon kalibrasyon çözüm 2 μL pipette.
    1. Bu adımın işlem sırası aşağıdaki gibidir: pipet Mg-Glutamat iyon kalibrasyon çözüm her dibine de tarafından takip K-Glutamat iyon kalibrasyon çözüm iyi tarafı üzerine sıvı wells zaten mevcut dokunmadan.
    2. Wells bir yapıştırıcı ana mix kalibrasyon hücre-Alerjik reaksiyon hazırlanırken buharlaşma önlemek için plaka üstüne koyarak kapatın. 384-şey Mg ve K Glutamat kalibrasyon çözüm mix kalıbı hafifçe dokunun.
      Not: Tekrarlayıcı pipet tekrarlanarak ve hızlı bir şekilde bu adımı tamamlamak için önerilir.
  3. Ana mix 2 mL tüp içinde T7-pJL1-sfGFP plazmid DNA şablonu kullanarak Tablo 5 ' te belirtilen kalibrasyon hücre-Alerjik reaksiyon hazırlayın. Her bileşen aşağıdaki sıraya göre ana karışıma ekleyin: amino asit ana mix, enerji çözüm ana mix, T7-pJL1-sfGFP DNA şablon, PEG-8000, T7 RNA polimeraz ve RNase inhibitörü. Yavaşça tüp her bileşen eklenmesinden sonra karışımı hafifçe vur.
    Not: MG eklemek değil2 + veya boş hücre-ana mix K+ kalibrasyon için.
  4. Yapışkan plaka kaldırın. Dikkatle kalibrasyon hücre-Alerjik reaksiyon ana Mix wells tarafına üzerine 7 μL pipet karışık iyon kalibrasyon çözüm wells zaten mevcut dokunmadan. Wells yapıştırıcı ile yeniden mühürlemek ve boş hücre ana mix iyon kalibrasyon çözümü ile karıştırmak için 384-şey PCR plaka hafifçe dokunun.
    Not: Tekrarlayıcı pipet tekrarlanarak ve hızlı bir şekilde bu adımı tamamlamak için önerilir.
  5. Kısaca 10 plaka 1000 x g santrifüj kapasitesi kuyuları iki tarafında kalmış olur karışmamış herhangi bir sıvı havuzu için s. 26 ° C'de ısıtılmış kapaklı 105 ° C'de ayarla ayarla thermocycler 384-şey tabak yerleştirin
  6. Boş hücre reaksiyonları 3 h için kuluçkaya. Kuluçka sonra cam dipleri çok kanallı pipet ile siyah 384-iyi tahlil plakalı her şey içeriğini aktarmak ve sfGFP Floresans okumak Ex / Em iyon konsantrasyonu bileşimini belirlemek için bir plaka okuyucu kullanarak 485 nm/528 nm = o protein yüksek miktarda verir.

Representative Results

Natriegens ifade boş hücre sistemiyle protein üretiminde açıklanan protokol 1−2 gün içinde protein aşağı akım uygulamaları için kullanılabilecek kültür aşı başlayan tek bir kullanıcı tarafından çalıştırılabilir. Bu sefer önemli bir bölümünü oluşturan ham hücre özleri ve ana mix stokları hazırlanması; Ancak, hazırlanan, saklı uzun vadeli (Tablo 7) olabilir ve gerektiğinde, kullanılan reaktifler çoğu toplu bir kez zaman kısaltma protokol tamamlamak için gerekli.

Tanımlanan ifade sistemini en iyi plazmid DNA şablonu veya tüp bebek transkripsiyon reaksiyonlar tarafından oluşturulan mRNA ile kullanılır. Doğrusal DNA da şablon olarak protein üretimi için kullanılabilir süre önemli ölçüde daha düşük protein miktarı verir. Örneğin, en uygun tepkiler koşulları 26 °C, boş hücre bir tek 10 μL tepki > 260 μg/mL 3 saat plazmid DNA şablonunun 0.3 pmol kullanarak sfGFP veya bir karşılaştırılabilir > 125 μg/mL mRNA transkript (şekil 5A 14 pmol kullanarak sfGFP üretebilir B). Ancak, doğrusal DNA'ın 0.3 pmol önemli ölçüde daha az protein (< 20 μg/mL) üretecek. Her şablon türü için protein çoğunluğu içinde 1−1.5 h imal edilecektir; Ancak, bu tepki en az 3 saat için çalıştırmanız tavsiye edilir. Boş hücre tepki konsantrasyonları sfGFP saf sfGFP standart eğri Floresan, ölçüm kullanarak doğrusal regresyon yoluyla tespit Ex / Em 485 nm/528 nm =.

Protein üretim verimini önemli ölçüde potasyum ve magnezyum iyonları konsantrasyonu tarafından etkilenir (K+ ve Mg2 +, sırasıyla). En iyi duruma getirilmiş koşullarda en iyi Mg2 + ve K+ iyon konsantrasyonlarının 3,5 mM ile 80 mM, sırasıyla olacaktır bulundu (şekil 6A, B). En uygun iyon konsantrasyonlarının sapmalar azalmış kapasite kayda değer verimleri proteini üretmek ifade boş hücre sistemi için neden olabilir. Ek kalibrasyon tepki verimleri beklenenden daha düşük ise gerekli olabilir. İyon kalibrasyon için isteğe bağlı bir protokol 5 bölümünde anlatılan. Bu ham hücre özü değişkenliği bireysel hücre lizis ekipman ve koşullar sonucunda oluşan tekniker bazı esneklik sağlar.

Figure 1
Şekil 1: kabı ve tüp sahibi yakından görmek sonication platformda. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Sonication ekipman kurulumu ham hücre hazırlanması için ayıklamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Resim 3: bir görünümünü sonra sonication ve Santrifüjü Pelet. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Flash özü Muhafazası için dalış dondurma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Temsilcisi sonuçları farklı şablon türleri'ni kullanma natriegens V. boş hücre protein sentezi için. (A)bitiş noktası tahlil ekimolar konsantrasyonları Plazmid ve doğrusal DNA şablonu (0.3 pmol) kullanarak yanı sıra mRNA şablon konsantrasyonları artan sfGFP üretim. Boş hücre sfGFP konsantrasyon arıtılmış sfGFP standart bir eğri kullanarak kararlı ölçülen, Ex / Em kuluçka 26 ° c en uygun reaksiyon koşullarında 10 μL birimleri, 180 dakika sonra 485 nm/528 nm =. (B) Kinetik tahlil ekimolar konsantrasyonları Plazmid ve doğrusal DNA şablonu kullanarak yanı sıra mRNA şablon konsantrasyonları artan sfGFP üretim. sfGFP ölçümler, her 3 dakikada alınmıştır Ex / EM en uygun reaksiyon koşulları 10 μL cilt olarak toplam kuluçka zaman 180 dakika içinde 485 nm/528 nm =. Bitiş noktası ve Kinetik deneyleri için şablon dışında tüm bileşenleri ile takıma boş hücre reaksiyonları kullanarak düzeltildi boş örnekleri vardı. Ortalama ve standart sapmalar gösterilir (n = 3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: temsilcisi sonuçları için iyon konsantrasyonu kalibrasyon. (A) natriegens V. boş hücre reaksiyonları Mg2 + konsantrasyonları artan ile desteklenmiş ve 180 dakika 10 μL reaksiyonlarda 26 ° C'de inkübe. K+ toplam konsantrasyonu 160 mM tüm Mg2 + konsantrasyonları için yapıldı. Boş hücre sfGFP konsantrasyon arıtılmış sfGFP standart bir eğri kullanarak kararlı ölçülen, Ex / Em 485 nm/528 nm =. (B) natriegens V. boş hücre reaksiyonları K+ konsantrasyonları artan ile desteklenmiş ve 10 μL reaksiyonlarda 180 dk 26 ° C'de inkübe. Toplam konsantrasyonu Mg2 + tüm K+ konsantrasyonları için 3.5 mM olduğunu. Her iki kalibrasyonlar için örnekleri boş boş hücre reaksiyonları şablon dışında tüm bileşenleri ile takıma kullanarak düzeltildi. Ortalama ve standart sapmalar gösterilir (n = 3). Bu rakam Wiegand vd.9' dan değiştirildi. Wiegand, izni ile yayımlanmaktadır DJ, Lee, H.H., Ostrov, N., kilise, bir boş hücre Vibrio natriegens ifade sistemi kurulması G.M.. ACS sentetik Biyoloji. 7 (10), 2475−2479 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1 A LB-V2 Bakteriyel büyüme medya hazırlanması
Bileşen Miktar (g) Son konsantrasyonu (mM) Son hacim (L)
LB suyu (Miller) 25 1
NaCl 11,69 200
MgCl2 2.20 23,1
KCl 0.31 4.2
Tablo 1 B S30A lizis arabellek hazırlanması
Bileşen Miktar (g) Son konsantrasyonu (mM) Son hacim (L)
Tris çözüm (pH 8.0) - 1 M (mL) * 25 50 0,5
MG-Glutamat 2.72 14
K-Glutamat 6.10 60
Dithiothreitol (DTT) - 1 M (mL) * 1 2

Tablo 1: LB-V2 Bakteriyel büyüme ortamının 1 L ve S30A hücre lizis arabelleği 0,5 L hazırlanması Kimyasalları. Excel bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. 

10 x enerji çözüm Master Mix hazırlanması
Bileşen Hisse senedi toplama (mM) Son konsantrasyonu (mM) Miktar (µL) Son hacim (µL)
HEPES-KOH pH 8 1750 500 1428.57 5000
ATP 100 15 750,00
GTP 100 15 750,00
CTP 100 9 450,00
UTP 100 9 450,00
tRNA E. coli MRE 600 üzerinden (mg/mL) * 100 2 100,00
Koenzim A hidrat 200 2.6 65,00
NAD 200 3.3 82,50
Kampı 650 7.5 57.69
Folinic asit 100 0,7 35,00
Spermidine 1600 10 31,25
3-PGA 2000 300 750,00
Steril deiyonize su 49.99
4 x Amino asit Master Mix hazırlanması
Bileşen Hisse senedi toplama (mM) Son konsantrasyonu (mM) Miktar (µL) Son hacim (µL)
ALA 168 8 114.3 2400
ARG 168 8 114.3
ASN 168 8 114.3
ASP 168 8 114.3
GLN 168 8 114.3
GLU 168 8 114.3
GLY 168 8 114.3
ONUN 168 8 114.3
YALAN 168 8 114.3
LYS 168 8 114.3
BİR ARAYA GELDİ 168 8 114.3
PHE 168 8 114.3
PRO 168 8 114.3
SER 168 8 114.3
THR 168 8 114.3
VAL 168 8 114.3
TRP 168 8 114.3
TYR 168 8 114.3
LEYİ 140 8 137.1
CYS 168 8 114.3
Steril deiyonize su 91.4

Tablo 2: 10 enerji çözüm x 5 mL hazırlanması Kimyasalları master mix ve 4 ana amino asit karışımı x 2.4 mL.    Bu dosyayı Excel'de indirmek için buraya tıklayınız.

T7 RNA polimeraz Vitro transkripsiyon reaksiyonlarda
Bileşen Hisse senedi (mM) Son konsantrasyonu (mM) Miktar (µL) 1 x reaksiyon Miktar (µL) 50 x tepkiler
RNAPol reaksiyon arabellek x 10 1,00 50
ATP 100 0,5 0,10 5
GTP 100 0,5 0,10 5
CTP 100 0,5 0,10 5
UTP 100 0,5 0,10 5
DNA şablonu (ng/µL) * 1000 500 0,50 25
T7 RNA polimeraz 200 2.6 2,00 100
Rnase inhibitörü, fare 200 3.3 0,50 25
Steril deiyonize su 15,60 780
Reaksiyon cilt (µL): 20

Tablo 3: In vitro transkripsiyon bileşenleri mRNA üretimi için.    Bu dosyayı Excel'de indirmek için buraya tıklayınız.

Boş hücre tepki Master Mix
Bileşen Hisse senedi toplama (mM) Son konsantrasyonu (mM) Miktar (µL) 1 x reaksiyon Miktar (µL) 50 x tepkiler
Özü (%) * 25 2,50 125,00
MG-Glutamat 100 3.5 0,35 17,50
K-Glutamat 2000 80 0,40 20,00
4 x Amino asit Master Mix 8.0 2 2,50 125,00
10 x enerji çözüm Master Mix 1,00 50,00
Plazmid DNA (ng/µL) * 1000 500 0,50 25,00
% 50 PEG-8000 (%) * 50 2 0,40 20,00
T7 RNA polimeraz 1,00 50,00
RNase inhibitörü, fare 0,10 5,00
Steril deiyonize su 1,25 62,50
Reaksiyon cilt (µL): 10
Alternatif hücre-Alerjik reaksiyon Master Mix mRNA şablonu için
Bileşen Hisse senedi toplama (mM) Son konsantrasyonu (mM) Miktar (µL) 1 x reaksiyon Miktar (µL) 50 x tepkiler
Özü (%) * 25 2,50 125,00
MG-Glutamat 100 3.5 0,35 17,50
K-Glutamat 2000 80 0,40 20,00
4 x Amino asit Master Mix 8.0 2 2,50 125,00
10 x enerji çözüm Master Mix 1,00 50,00
mRNA şablonu (ng/µL) * 2000 4000 2,00 100,00
% 50 PEG-8000 (%) * 50 2 0,40 20,00
RNase inhibitörü, fare 0,10 5,00
Steril deiyonize su 0,75 37,50
Reaksiyon cilt (µL): 10

Tablo 4: En iyi duruma getirilmiş natriegens V. bileşenleri-boş hücre DNA şablonu ve mRNA şablonu için ana karışımı tepki.    Bu dosyayı Excel'de indirmek için buraya tıklayınız.

Mg 2 + Kalibrasyon Miktar (µL) 1 x reaksiyon Miktar (µL) 1 x reaksiyon Miktar (µL) 100 x tepkiler Miktar (µL) 100 x tepkiler
Final (mM) Hisse senedi 100 mM Mg-Glu diH 2 0 100 mM Mg-Glu Deiyonize H2O
2.5 0 0,00 1,00 0 100
3.5 1 0,10 0,90 10 90
4.5 2 0,20 0,80 20 80
5.5 3 0,30 0.70 30 70
Reaksiyon cilt (µL): 10
K + Kalibrasyon Miktar (µL) 1 x reaksiyon Miktar (µL) 1 x reaksiyon Miktar (µL) 100 x tepkiler Miktar (µL) 100 x tepkiler
Final (mM) Hisse senedi 2000 mM K-Glu diH 2 0 2000 mM K-Glu Deiyonize H2O
40 30 0,15 1.85 12 148
80 70 0,35 1.65 28 132
160 150 0,75 1,25 60 100
320 310 1,55 0,45 124 36
Reaksiyon cilt (µL): 10
İyon kalibrasyon hücre-Alerjik reaksiyon Master Mix
Bileşen Hisse senedi toplama (mM) Son konsantrasyonu (mM) Miktar (µL) 1 x reaksiyon Miktar (µL) 50 x tepkiler
Özü (%) * 25 2,50 125,00
MG-Glutamat Değişken Değişken 1,00 50,00
K-Glutamat Değişken Değişken 2,00 100,00
4 x Amino asit Master Mix 8.0 2 2,50 125,00
10 x enerji çözüm Master Mix 1,00 50,00
Plazmid DNA (ng/µL) * 1000 250 0,25 12,50
% 50 PEG-8000 (%) * 50 2 0,40 20,00
T7 RNA polimeraz 1,00 50,00
RNase inhibitörü, fare 0,10 5,00
Steril deiyonize su 0,00 0,00
Reaksiyon cilt (µL): 10

Tablo 5: İyon konsantrasyonu kalibrasyon ana karışımları.    Bu dosyayı Excel'de indirmek için buraya tıklayınız.

CF iyon kalibrasyon harita 40 mM K+ 80 mM K+ 160 mM K+ 320 mM K+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2.5 mM Mg2 + A
3.5 mM Mg2 + B
4.5 mM Mg2 + C
5.5 mM Mg2 + D

Tablo 6: İyon kalibrasyon harita.    Bu dosyayı Excel'de indirmek için buraya tıklayınız.

Saklama koşulları ve CF bileşenleri raf yaşamlarını
Bileşen Depolama konumu Raf ömrü
Steril LB-V2 büyüme medya 4 ° C 3-6 ay
Natriegens ham hücre ayıklamak -80 ° C 1-3 hafta
100 mM Mg-Glutamat Oda sıcaklığında 6 ay
2000 mM K-Glutamat Oda sıcaklığında 6 ay
% 50 PEG-8000 Oda sıcaklığında 6 ay
10 x enerji çözüm Master Mix -80 ° C 3-6 ay
4 x Amino asit Master Mix -80 ° C 3-6 ay
Plazmid/doğrusal DNA şablonu -20 ° C 6-12 ay
mRNA şablonu -80 ° C 3-4 hafta

Tablo 7: Boş hücre saklama koşulları ve raf yaşıyor.    Bu dosyayı Excel'de indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu iletişim kuralı, vahşi tipli natriegens V. ve V2 tuzları (Malzemeler tablo) ile desteklenmiş LB oluşan Bakteriyel büyüme medya için en iyi duruma getirilmiş. Natriegens V. diğer suşların ham hücre özleri hücre-alerjik reaksiyonlar için oluşturmak için benzer şekilde kültürlü; Ancak, bunların kullanımı bu protokol ek optimizasyonu gerektirir. Ayrıca, bu boş hücre proteini ifade sistem 3-phosphoglyceric asit (3-PGA) birincil enerji rejenerasyon kaynağı olarak kullanarak optimize edilmiştir. Diğer enerji yenilenme kaynakları kullanılabilir; Ancak, reaktifler ve Kalibrasyon duruma getirilmesi büyük olasılıkla yüksek verimli protein ifade10,11almak için gerekli olacaktır.

Bu iletişim kuralı birkaç kritik adım belirli dikkat maksimal özü verimlilik için yüksek verimli sağlayacak cep-Alerjik protein üretim. İlk olarak, ham hücre özü natriegens V. hücre kültürleri-üstel büyüme; aşamasında hasat üzerinden hazırlanan gerekir protein verimidir maksimal kültürler bir OD600 ulaştığınızda = 1.0 ± 0.2. Boş hücre protein üretim optik yoğunlukları bir mesafeden hasat hücrelerden mümkün olmakla birlikte, daha önce bir üstel büyüme durumda hasat hücreleri önemli ölçüde daha fazla protein9verim bulduk. Ham hücre özü performans gözlenen optik yoğunluk etkilerini formüllerdekilerle tutarlı toplu kültür koşulları1' yetiştirilen hücrelerden elde edilen diğer ifade boş hücre sistemleri bildirdi. Natriegens hızlı bir oranda yetişir çünkü kültürler optik yoğunluğunu yakından izlemek için önemlidir. Genel olarak, bu natriegens V. kültürler tekrarlanarak 1.0 bu iletişim kuralını kullanan 1−1.5 h içinde bir OD600 ulaştırılması gerekmektedir bekleniyor; Ancak, kullanımı gibi bireysel büyüme koşullarına karşı şişeler sigara şaşkın hangi etkiler havalandırma veya hava hızı ve istikrar, kuluçka sıcaklık etkiler, su kuluçka karşı büyüme zaman değiştirebilir, şaşkın. Ayrıca, genellikle büyük hücreli Pelet hasat kolayca idare ve transferi, emin olmak için natriegens bir 1 L şaşkın şişesi içinde en az 250 mL kültür için önerilir. Bu ham hücre özü hazırlık hem de özü hacmi bir Pelet üretilen artar başarısı büyük ölçüde artırır. Daha küçük ölçekli hazırlık kullanırken, kültür koşulları ve Kimyasalları uygun şekilde ayarlanabilir. Büyük ölçekli fermantasyon için daha fazla kültür koşulları duruma getirilmesi gerekli olabilir. Son olarak, yüksek protein verim sağlamak için bu hücre topakları hemen sonra hasat veya-80 ° C'de saklama 1−2 gün içinde işlenir önemlidir

Hücre Pelet darbe sonication tarafından uygun lizis boş hücre proteini ifade başarısı için çok önemlidir ve sık sık yeni kullanıcılar için bu protokolü en zor olanıdır. Genellikle, bir de lysed Pelet enkaz serbest olduğundan sıvı ekstresinin önemli bir cilt ortaya çıkarır. Özü biraz yapışkan olmalı ama ne zaman daha önce sıvı azot içinde buz gibi flaş depolama içine aliquoting Tüpler kolayca pipetted. Şekil 3 de lysed Pelet (şekil 3A) gösterimi sonrası lizis Santrifüjü adımdan sonra bir kötü lysed Pelet (şekil 3B) ile karşılaştırıldığında gösteriyor. Bir büyük tam hücre lizis ham hücre ayıklamak toplam protein konsantrasyonu > 20 mg / toplam protein tahlil (Adım 2.13) tarafından belirlenen mL göstergesidir. Aşırı sonication ya da aşırı ısınma ham hücre ekstresinin bir boş hücre tepki gerçekleştirmeden belirlenemiyor hücresel makine zarar verir. Böylece, özü verimlilik aşağı akım protein ifade uygulamaları için önemli ölçüde zaman ve çaba ithaf önce bir denetim tepki ile test etmek son derece faydalıdır. Ek optimizasyon farklı sonication ekipmanları için gerekli olsa da, darbe sonication merdiven tanımlamak son derece bizim ellerimizde tekrarlanabilir olmuştur.

PCR güçlendirme, restriksiyon enzimi Özet veya ticari gen sentez türetilmiş doğrusal DNA şablon kullanımı için boş hücre ifade sistemleri24yüksek üretilen iş ve hızlı protein üretim kapasitesi önemli ölçüde artırabilir. Protein üretim PCR güçlendirilmiş doğrusal şablondan göstermiştir, bu tepkiler verim iken yaklaşık 13.5-fold alt plazmid kullanarak tepkiler DNA şablon ekimolar oranları9ile karşılaştırıldığında. Bu öncelikle endojen nükleaz V. natriegens ham hücre hulâsa içinde mevcut tarafından bozulmuş olma ihtimali olan doğrusal DNA şablonu istikrarsızlık kaynaklanmaktadır. Protein GamS daha önce doğrusal DNA şablon24,25korumak için kullanılmıştır lambda fajının V. natriegens ile uyumlu olmadığı için9ayıklar bulundu. Ayrıca, doğrusal DNA şablonu konsantrasyonunu artırmak için daha yüksek bir protein verim izin iken, onun hızlı bozulma ham hücre özü hala büyük bir sorun olacak.

Doğrusal DNA şablon bozulması üstesinden gelmek için bir çözüm boş hücre reaksiyonları ile tüp bebek doğrusal DNA transkripsiyon oluşturulan mRNA şablonunu ek olarak olabilir. Öte yandan, bir RNase inhibitörü kullanımı mRNA transkript düşmesine karşı önemli koruma sağlar ve kayda değer protein verimleri 10 μL boş hücre tepki biçimi (5A rakamB) elde edilebilir. Döngüsel şablonda TA ligasyonu ile doğrusal DNA'sı klonlama, TOPO klonlama, Golden Gate derleme veya diğer rekombinasyon yöntemleri şablon bozulması aşmak için kullanılabilir. Yine de, daha fazla yaklaşımlar nükleaz aktivitesinin inhibisyonu için doğrusal DNA şablonu kullanarak verimli protein ifade için gerekli olacaktır.

Bugüne kadar birkaç farklı yaklaşım boş hücre proteini ifade9,10,11,26için ham özü hazırlanması için önerilmiştir. Bu iletişim kuralı geliştirirken, kullanıcı erişilebilirlik en üst düzeye çıkarmak, toplam maliyeti azaltmak ve zaman alıcı adımlar en aza indirmek için çalıştı. Örneğin, bir yüksek protein verim bir basit işlemdir sonication Santrifüjü kullanarak elde edilir ve hücre homogenizers, uzun diyaliz adımları veya axım tepki gerektirmez. Kısa bir süre içinde yürütmek basit ve yüksek düzey laboratuvar uzmanlık gerektirmez. Böylece, boş hücre ifade translasyonel akademik araştırma ve endüstriyel süreç tasarımı için bir standart olarak kolaylaştıracak yardımcı olabilir.

Bu iletişim kuralı alet elde edilebilir için soruşturma ve natriegens V., benzersiz biyolojik özelliklere sahip bir model olmayan organizma yarar genişletir. Yüksek protein verim elde enerji rejenerasyon için izin vermek için yarı - veya tamamen-sürekli boş hücre reaksiyonları istihdam ederek amino asitler ve atık ürünlerin3,5,27kaldırılması resupplying. Ayrıca, Dnaz veya RNAse eksik suşları üretmek için vahşi tipli natriegens V. mühendislik, zararlı ve rakip metabolik yollar kaldırılması ve ek tRNA ifade büyük proteinlerin üretimini geliştirmek Bu sistem28,29. Biz hızlı büyümesini temel Biyoloji çözmek gibi daha fazla natriegens V. boş hücre sistemlerinin geliştirilmesi bioproduction yetenekleri hızlandırmak ve tedavi peptidler, küçük moleküller ve sentetik sağlam ifade etkinleştirmek malzemeler.

Disclosures

DJW, Hayır, ve GMC bu işle ilgili bir patent Filed under.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Enstitüsü genel tıbbi Bilimler 1U01GM110714-01 ve bölümü enerji DE-FG02-02ER63445 tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam ve Dr. Edgar Goluch bu el yazması Protokolü bölümünde inşa üzerinde faydalı tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Tubes Corning 352196
2 mL Tubes Eppendorf 22363352
384-well Black Assay Plates Corning 3544
384-well PCR Plates Eppendorf 951020702
50 mL Tubes Corning 352070
96-well PCR Plates Eppendorf 30129300
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate Sigma A6885
Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler ThermoFisher 4388444
Assay Plate Adhesives BioRad MSB1001
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) Sigma/Roche 10127965001
Coenzyme A hydrate Sigma C4283
Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) Sigma P8877
Dewar Flask - 4L ThermoScientific 10-194-100C
DL-Dithiothreitol solution - 1 M Sigma 42816
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma 47612
Glacial Acetic Acid Sigma A6283
Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
HEPES Sigma H3375
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate Sigma 49605
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma G1149
LB Broth (Miller) Sigma L3522
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Plasmid pJL1-sfGFP Addgene 69496
Plasmid Plus Maxi kit Qiagen 12963
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 Sigma 89510
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333
Potassium hydroxide Pellets Sigma/Roche 1050121000
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip Qsonica 4422
RNA Clean and Concentrator Kit Zymo R1013
RNase Inhibitor, Murine NEB M0314
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride (NaCl) Sigma S7653
Spermidine Sigma S0266
T7 RNA Polymerase NEB M0251
Tris Solution (pH 8.0) - 1 M Invitrogen AM9856
tRNA from E. coli MRE 600 Sigma/Roche 10109541001
Uridine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock ATCC 14048

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  2. Schoborg, J. A., et al. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Henrich, E., Hein, C., Dötsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  5. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. Establishing a high yielding streptomyces‐based cell‐free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  6. Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).
  7. Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements. Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).
  8. Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements. Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).
  9. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System. ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).
  10. Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).
  11. Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens. Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).
  12. Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).
  13. Eagon, R. G. Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes. Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).
  14. Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology. Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).
  15. Lee, H. H., et al. Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse. bioRxiv. , 058487 (2016).
  16. Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. Recombineering in Vibrio natriegens. bioRxiv. , 130088 (2017).
  17. Schleicher, L., et al. Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes. Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).
  18. Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E., Carmona, M. Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory. Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).
  19. Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).
  20. Hoffart, E., et al. High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology. Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).
  21. Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis. Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).
  22. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  23. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  24. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  25. Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation. Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).
  27. Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors. Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).
  28. Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).
  29. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).

Tags

Biyomühendislik sayı: 145 Vibrio natriegens ham hücre özü boş hücre sistemi TX-TL in-vitro protein sentezi yüksek üretilen iş ekran
Boş hücre Protein ifade kullanarak hızla büyüyen bakteri <em>Vibrio natriegens</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov,… More

Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (145), e59495, doi:10.3791/59495 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter