Summary
Cel-vrije expressiesystemen zijn krachtige en kosten-efficiënte hulpmiddelen voor de synthese van hoog-productie en de screening van belangrijke eiwitten. Hier beschrijven we de voorbereiding van cel-vrije eiwit expressie systeem met behulp van Vibrio natriegens voor de productie van de snelle eiwitten met behulp van de plasmide DNA, lineaire DNA en mRNA sjabloon.
Abstract
De marine bacterie Vibrio natriegens oogstte veel aandacht als een opkomende microbiële gastheer voor de biotechnologie als gevolg van de snelle groei. Een algemeen protocol wordt beschreven voor de bereiding van V. natriegens ruwe cel extracten met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Dit hoge opbrengst protocol is speciaal geoptimaliseerd voor gebruiker toegankelijkheid en lagere kosten. Cel-vrije eiwitsynthese (GVB) kan worden uitgevoerd in kleine schaal 10 μL batch reacties in beide een 96 - of 384-well-indelingen en reproducibly levert concentraties van > 260 μg/mL super map GFP (sfGFP) binnen 3 h. over het geheel genomen, ruwe cel extract voorbereiding en GVB kan worden bereikt in 1−2 volle dagen door één gebruiker. Dit protocol kan gemakkelijk geïntegreerd worden in bestaande eiwit synthese pijpleidingen om vooruitgang in de bio-productie en synthetische biologie toepassingen.
Introduction
Cel-vrije eiwitsynthese is een veelzijdig en kosteneffectieve methode voor de expressie van waardevolle eiwitten of peptiden1,,2,,3,4. Historisch, is cel-vrije eiwitsynthese uitgevoerd met behulp van Escherichia coli expressiesystemen; echter is er een recente toename in het gebruik van alternatieve, niet-model organismen met nieuwe eigenschappen als chassis voor cel-vrije expressie5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismen met unieke metabolische profielen zijn voornaamste kandidaten als alternatieven voor E. coli cel-vrije systemen. Bijvoorbeeld, verdubbeling de mariene bacterie die Vibrio natriegens is de snelst groeiende van alle bekende organismen met een waargenomen tijd van minder dan 10 min13. Dit oogstte V. natriegens aanzienlijke aandacht als een opkomende microbiële gastheer voor onderzoek en biotechnologie14,15,16,17,18. Gezien het feit dat de snelle groei van V. natriegens gekoppeld aan hoge tarieven voor eiwitsynthese en metabole efficiëntie19,20,21, gebruik te maken van haar mobiele machines voor cel-vrij synthese kan beduidend meer voor de toolkit voor snelle eiwitproductie en high-throughput screening.
Onlangs, een cel-vrij V. natriegens expressie systeem heeft aangetoond dat is geschikt voor het produceren van super map GFP (sfGFP) bij concentraties van > 260 μg/mL in 3 h met een T7 promotor9. Het algemene doel van de ontwikkeling van deze methode was om de gebruikers te voorzien van een zeer toegankelijk, kosten-efficiënte reproduceerbaar en hoge opbrengst van de cel-vrije eiwit expressie systeem dat kan worden bereid met behulp van gemeenschappelijke lab apparatuur in een korte hoeveelheid tijd. Dit protocol maakt gebruik van 1 L culturen in shake kolven, lysis van de cel door puls ultrasoonapparaat en kleinschalige batch reacties in de indeling van een 96 - of 384-goed om paralellisatie en screening van doorvoer te maximaliseren. Een lange, aanhoudende eiwit expressie wordt mogelijk gemaakt door suppletie van 3-phosphoglyceric zuur (3-PGA) als een energie bron8,22,23. Na het succesvol voltooien van dit protocol, een gebruiker zal hebben de mogelijkheid om uit te drukken een gewenste eiwit of set van eiwitten in een cel-vrij formaat met behulp van V. natriegens ruwe cel extraheren.
Vanaf een voorraad van glycerol, V. natriegens ruwe cel extracten bereid zijn uit cellen geoogst op een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) voor 1.0. Een 1 L-cultuur zal opleveren ongeveer 2−3 mL extract, die voldoende is voor meer dan 800 cel-vrije reacties op 25% ruwe cel extract. Eiwitten kunnen worden uitgedrukt met behulp van de plasmide DNA, lineaire DNA of mRNA de sjabloon; lineaire DNA sjabloon afbraak door endogene nucleasen blijft echter een groot nadeel bij het gebruik van wild type V. natriegens de cel-vrij systeem9. Vanaf V. natriegens culturen, kan eiwit bruikbaar voor downstream toepassingen worden bereikt door een enkele gebruiker in 1−2 volle dagen.
Protocol
1. bereiding van de V. natriegens ruwe cel extracten – bacteriecultuur
- V. natriegens bacteriegroei media LB-V2 volgens tabel 1voor te bereiden. De media van de groei in autoclaaf steriliseren. Het toestaan van media te bereiken tot kamertemperatuur (RT). De overtollige media winkel op RT.
Let op: Dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) en lab specifieke instructies te raadplegen wanneer een autoclaaf. - Gebruik een glycerol voorraad van wild type V. natriegens om te enten van 3 mL LB-V2 media. 'S nachts groeien bij 30 ° C terwijl het schudden bij 225 t/min.
- 1 mL van de overnachting cultuur door middel van centrifugeren op 10.600 x g op een benchtop centrifuge voor 1 min. Aspirate het supernatant wassen zonder verstoring van de resulterende pellet en resuspendeer in 1 mL verse LB-V2 media.
- In een gesteriliseerde met autoclaaf 4 L toevoegen verbijsterd conische kolf met steriele deksel, 1 L van verse LB-V2 groei media. Enten met behulp van 1 mL gewassen overnachting cultuurcomponenten (1:1, 000 verdunningsverhouding). Cultuur bij 30 ° C stijgen, terwijl schudden bij 225 t/min.
Opmerking: V. natriegens culturen kunnen omhoog of omlaag terwijl het handhaven van de verdunningsverhouding 1:1,000 worden aangepast. Bijvoorbeeld, voeg 250 μL van gewassen overnachting cultuur aan 250 mL verse LB-V2 groei media in een 2 L verbijsterd conische kolf met steriele cover. - Bewaken van de cultuur OD600 met een spectrofotometer. Wanneer cultuur bereikt OD600 = 1,0 ± 0,2, oogst cultuur via centrifugeren bij 3500 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Plaats pellet op ijs.
Opmerking: V. natriegens groeit snel, nauwlettend toezicht op de cultuur is dus nodig. Groei OD600 = 1.0 ongeveer 1.5−2 h bij de verdunningsverhouding 1:1,000 moet worden. - De bovendrijvende substantie gecombineerd en onmiddellijk het opslaan van de resulterende bacteriële pellet-80 ° c of direct doorgaan naar cel lysis beschreven in sectie 2.
Opmerking: Deze stap is een goede stopplaats; het wordt echter aanbevolen dat de pellet onmiddellijk of binnen enkele dagen van de 1−2 voor de beste resultaten worden verwerkt.
2. voorbereiding van de V. natriegens ruwe cel extracten – Lysis van de cel
- Bereiden S30 lysis-buffermengsel volgens tabel 1 in steriel gedeïoniseerd water van de (DI) en breng de pH aan 7.7 met behulp van ijsazijn.
Let op: Ijsazijn moeten worden behandeld met goede PPE bij het aanpassen van de pH. - Cool S30 lysis-buffermengsel tot ongeveer 4 ° C in een koelkast of op ijs voordat u begint met de procedure van de lysis van de cel.
Opmerking: Voor een snelle cool down, lysis kan buffer geplaatst worden bij-20 ° C. Laat niet de buffer te bevriezen. - Plaats cel pellets op ijs gedurende 10−20 minuten of totdat volledig ontdooid. Resuspendeer alle pellets die voortvloeien uit de dezelfde 1 L cultuur met behulp van 10 mL koude S30 lysis-buffermengsel, dan schorsing naar een tube van 50 mL. Als pellets niet in de diepvries bij-80 ° C in stap 1.6 bevroren zijn, gaat u rechtstreeks naar resuspensie.
Opmerking: Verhoog het volume van S30 lysis-buffermengsel gewend aanvankelijk resuspendeer pellets zo nodig. - Centrifuge schorsing bij 3500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet gecombineerd. Wassen van de pellet een tweede keer met behulp van 10 mL koude S30 lysis-buffermengsel. Plaats pellet op ijs.
-
In een koude kamer, voeg toe 500 μL van koude S30 lysis-buffermengsel aan de pellet in de tube van 50 mL. Gebruik een wide-boring Pipetteer tip, resuspendeer de pellet en de opschorting van de hele pellet zorgvuldig overbrengen in een tube van 2 mL.
Opmerking: Als een breed droeg Pipet is niet beschikbaar, gebruik van een paar van schaar te snijden het einde van een 1 mL pipet tip te verhogen van de boring voor de overdracht van de pellet.- Overdracht van zoveel pellet mogelijk zonder aanzienlijk verhogen van het volume; echter, de pellet moet worden resuspended in genoeg vloeistof om te worden sonicated, zoals aangegeven door een homogene suspensie in de tube 2 mL. Niet overvol de tube 2 mL. De opschorting mag niet hoger zijn dan 1,5 mL; opgesplitst in meerdere buizen indien nodig.
- Houd de cel pellet op ijs en werken in een koude kamer. Vul een bekerglas van 600 mL met ijs en plaats een 2 mL tube houder op de top van het ijs.
Opmerking: Het is nuttig om de plaats van de houder van de buis in de buurt van de kant van het bekerglas, zodat de pellet opschorting zal worden zichtbaar in het ijs ultrasoonapparaat voortgang (Zie Figuur 1). - Vortex opgehangen pellet in 2 mL tube kort aan het homogeniseren van de cellen, flick buizen te verwijderen van alle cellen in de bodem van het GLB, en in buis houder met dop open. Lager ultrasoonapparaat tip in de opschorting, zodat het net onder het vloeistofoppervlak is.
- Bereiden de ultrasoonapparaat set-up als afgebeeld in Figuur 2 met behulp van een ultrasoonapparaat en sonde met een ⅛-duim tip diameter. Ingang van de volgende instellingen in het besturingselement ultrasoonapparaat: 20 kHz frequentie en amplitude van de 50%, pulse op tijd: 10 s, pulse OFF tijd: 60 s.
- De pulse ultrasoonapparaat protocol voor drie cycli worden uitgevoerd. Als het totale volume van het pellet schorsing > 500 μL is, protocol worden uitgevoerd door de puls ultrasoonapparaat zes keer.
Opmerking: In het algemeen volstaan 3−6 pulsen lyse V. natriegens pellets; extra impulsen kunnen worden verlangd afhankelijk van ultrasoonapparaat. Tijdens ultrasoonapparaat, door het aanpassing knop platform te gebruiken voor het verplaatsen van de sonde op en neer naar lyse een pellet die kan hebben afgewikkeld naar de onderkant van de buis. De buis kan worden verwijderd uit de houder met kort vortexed opnieuw Meng de schorsing tussen pulsen. Zie bespreking hieronder voor de gewenste consistentie van sonicated cellen.
Let op: Draag passende gehoorbescherming bij ultrasoonapparaat actief is. - Na ultrasoonapparaat, centrifuge ruwe cel pak bij 16.000 x g gedurende 30−45 min bij 4 ° C of totdat lysate vrij van elke cellulaire vuil is zoals afgebeeld in Figuur 3.
-
In een koude kamer, aliquoot 50 μl van de resulterende supernatant nieuwe 2 mL buizen zonder de pellet te verstoren.
Opmerking: puin dat per ongeluk wordt omgezet in de nieuwe 2 mL buizen zal uittreksel van capaciteit voor hoge opbrengst eiwitsynthese drastisch verminderen.- Optioneel gereserveerd 10 μL van cel extraheren voor lysis van de post eiwit kwantificering in een aparte 2 mL tube (zie stap 2.13 hieronder).
- Flash bevriezen ruwe cel extracten door het plaatsen van de buizen in een tube-houder met een onderdompelende string aangesloten zoals afgebeeld in Figuur 4. Buizen onderdompelen in een Dewar met vloeibare stikstof en onmiddellijk plaats in een diepvriezer op-80 ° C tot gebruik.
Let op: Gebruik juiste PPE voor de behandeling van de vloeibare stikstof, met inbegrip van laboratoriumjas, veiligheidsbril, gelaatsscherm, cryogen schort en handschoenen. - Optioneel, het kwantificeren van de totale proteïne van de cel lysate met behulp van 10 μL instellen naast stap 2.11.1 door verdunnen monster 1:100 in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en het gebruik van een standaard totaal eiwit kwantificering assay zoals analyse van Bradford, bicinchoninic zuur assay (BCA), enz.
3. voorbereiding van de cel-vrije reactie onderdelen
-
Algemene reactie onderdelen
- Bereiden werken voorraden Mg-glutamaat en K-glutamaat in 50 mL buisjes met steriele DI water bij concentraties van 100 mM tot 2000 mM, respectievelijk.
- Voorbereiden van een werkende voorraad van 50% (m/v) polyethyleenglycol (PEG)-8000 door toevoeging van 100 mL steriele DI water in een bekerglas van 250 mL. Plaats een kleine magneetroerder af in het bekerglas. Weeg 50 g van PEG-8000 en toevoegen aan de 100 mL water in het bekerglas.
- Plaats het bekerglas op een verwarmde roer plaat ingesteld op 100 ° C en roer bij 250 tpm tot PEG-8000 in oplossing is. Het toestaan van PEG-8000 vloeibare mengsel afkoelen voordat het overzetten naar 50 mL tubes.
-
Energiemix oplossing master
- Bereid een 5 M-oplossing van KOH door 140 g KOH pellets aan 500 mL steriele DI water toe te voegen.
Let op: Bereid deze oplossing in een chemische kap en draag PPE bij hantering van de sterke basen. De oplossing zal heet worden dus de kroonkurk los moet om te voorkomen dat druk opbouw. Laat de KOH-oplossing te bereiken van RT alvorens te gebruiken. - Bereid een 1750 mM HEPES-KOH buffer door 20.85 g voor HEPES toe te voegen aan een fles van 100 mL. Voeg langzaam steriel DI water totdat het volume 40 mL tot. Vortex fles te ontbinden de HEPES. Gebruik de 5 M KOH-oplossing Breng de pH op 8.0 en breng het volume van de oplossing tot 50 mL.
Let op: KOH moet worden behandeld met goede PPE bij het aanpassen van de pH. - De resterende 10 x energie master mix voorraad onderdelen bij de concentraties aangegeven in tabel 2 in steriele DI water bereiden en plaatst u elk bestand op ijs. Ontdooi de 100 mM ATP, GTP, CTP en UTP voorraden op RT en plaats op het ijs.
Opmerking: Een thermomixer ingesteld op 37 ° C en 350 rpm kan worden gebruikt om te ontbinden reagentia in oplossing indien nodig. Niet oververhit raken of verlaten van de reagentia op de thermomixer voor een langere periode van tijd. - In een tube van 15 mL, wil elke energiecomponent oplossing master mix in overeenstemming met de bestelling en het volume in tabel 2aangegeven. Vortex de oplossing nadat elke component is toegevoegd. Dit zal 5 mL 10 x energiemix oplossing meester maken.
- Verdeel de 10 x energiemix oplossing master in 200 μl aliquots in 2 mL tubes. Flash bevriezen elk aliquot zoals uitgevoerd in stap 2.12. Onmiddellijk plaats ze in de vriezer-80 ° C tot gebruik.
- Bereid een 5 M-oplossing van KOH door 140 g KOH pellets aan 500 mL steriele DI water toe te voegen.
-
Aminozuur master mix
- Om voor te bereiden verse 4 x aminozuur master mix, allereerst ontdooien van elk aminozuur voorraad bij RT en dan het plaatsen van elk op ijs. Een vortex en/of de thermomixer vastgesteld op 37 ° C en 350 rpm gebruiken om ervoor te zorgen dat alle aminozuur voorraden volledig zijn opgelost.
Opmerking: Cysteïne kan niet volledig oplossen; worden kunnen toegevoegd aan de basispagina mix van aminozuur als een schorsing. Niet oververhit raken of verlaten van de reagentia op de thermomixer voor een langere periode van tijd. - In een tube van 15 mL, voegt u de juiste volume-aminozuren aan steriel DI water zodat eindconcentratie van elk 8 mM in de volgende volgorde is: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, Glycine, zijn, IIE, LYS, MARKTGERICHT, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU en CYS. Na het toevoegen van elk aminozuur, meng de master vortex oplossing. De volumes die zijn vermeld in tabel 2 zullen make-up 2.4 mL voor aminozuur master mix.
- Verdeel de 4 x aminozuur master mix in 200 μl aliquots in 2 mL tubes. Flash bevriezen elk aliquot zoals uitgevoerd in stap 2.12. Onmiddellijk plaats in een diepvriezer op-80 ° C tot gebruik.
- Om voor te bereiden verse 4 x aminozuur master mix, allereerst ontdooien van elk aminozuur voorraad bij RT en dan het plaatsen van elk op ijs. Een vortex en/of de thermomixer vastgesteld op 37 ° C en 350 rpm gebruiken om ervoor te zorgen dat alle aminozuur voorraden volledig zijn opgelost.
-
Productie van reactie-klaar plasmide DNA sjabloon
Opmerking: Cel-vrije eiwituitdrukking in dit systeem is geoptimaliseerd met behulp van de super map groen fluorescente proteïne (GFP) expressie vector T7-pJL1-sfGFP (Tabel van materialen). Het is aanbevolen om deze plasmide gebruiken als besturingselement voor cel-vrije reactie efficiëntie en de ruggengraat van de pJL1 van de klonen en expressie van andere proteïne sequenties. Andere plasmide DNA-sjablonen kunnen worden gebruikt; het is echter belangrijk op te merken dat transcriptie wordt bestuurd door een opeenvolging van de promotor T7 en de aanwezigheid van T7 RNA-polymerase. Een eenvoudig protocol voor de grootschalige productie van een plasmide DNA sjabloon uit getransformeerde E. coli wordt hieronder beschreven.- Zuiveren van gewenste vector met behulp van een plasmide zuivering kit vanaf fabrikant instructie (Tabel van materialen).
Opmerking: De plasmide DNA sjabloon zoveel mogelijk concentreren wordt aanbevolen om te voldoen aan de beperkingen van de strakke volume van de reactie van cel-vrij. In het algemeen streven naar een 750−1500 ng/μL werken voorraad.
- Zuiveren van gewenste vector met behulp van een plasmide zuivering kit vanaf fabrikant instructie (Tabel van materialen).
-
Productie van reactie-klaar mRNA sjabloon
Opmerking: Deze sectie is optioneel. Eiwit expressie is getest met behulp van mRNA sjabloon gegenereerd op basis van de in vitro transcriptie van de plasmide T7-pJL1-sfGFP door de genoemde T7 RNA-polymerase (Tabel van materialen).- Bereiden van mRNA sjabloon van plasmide DNA codering van de proteïne van belang met behulp van de in vitro transcriptie reactie componenten in tabel 3. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een thermocycler reacties.
Opmerking: Het is raadzaam voor het uitvoeren van 8−10x van deze reacties parallel aan het genereren van genoeg materiaal. - Het zwembad van alle reacties van de transcriptie. Zuiveren met behulp van een mRNA zuivering en concentrator kit vanaf fabrikant instructie (Tabel van materialen). Elueer mRNA sjabloon in steriele DI water. MRNA sjabloon bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
- Bereiden van mRNA sjabloon van plasmide DNA codering van de proteïne van belang met behulp van de in vitro transcriptie reactie componenten in tabel 3. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een thermocycler reacties.
4. uitvoeren van cel-vrij gebruik van proteïne Eexpression reacties V. natriegens ruwe Extract
-
Cel-vrije eiwit expressie met behulp van de plasmide of lineaire DNA sjabloon
- 10 x energiemix oplossing master en 4 x aminozuur master mix aliquots verwijderen uit de diepvries-80 ° C, ontdooien op RT en plaats op ijs. Verwijder de T7 RNA polymerase en RNase remmer voorraden uit de diepvries van-20 ° C en plaats op het ijs. Ontdooi DNA sjabloon op RT en plaats op het ijs.
- Voorbereiding van een master mix van cel-vrije reactie per tabel 4 door elk onderdeel in de onderstaande volgorde toe te voegen aan een 2 mL-buis op ijs: aminozuur master mix, energiemix oplossing master Mg-glutamaat, K-glutamaat, DNA sjabloon, PEG-8000, T7 RNA polymerase en RNase remmer. Zachtjes flick de buis na elke toevoeging aan de master mix.
Opmerking: Als lineaire sjabloon gebruikt voor cel-vrije eiwit expressie wordt, toevoegen 5−10x meer materiaal ten opzichte van de plasmide sjabloon om aanzienlijke opbrengsten van eiwit. - Verwijder V. natriegens ruwe cel lysate voorbereid 10−20 min tot ontdooid in stap 2.12 van de diepvriezers-80 ° C en de plaats op het ijs. Voeg het juiste volume ruwe cel uitpakken naar de cel-vrije reactie master mix per tabel 4 en zachtjes Meng door flicking of pipetteren omhoog en omlaag.
- Eindpunt cel-vrije eiwit expressie met behulp van thermocycler
- Pipetteer 10 μL van de master mix van cel-vrije reactie naar de onderkant van een plaat van de PCR 96 - of 384-well. Tussen elke overdracht aan de PCR-plaat, meng de master mix door flicking de tube zachtjes.
Opmerking: Cel-vrije reactie master mix moet goed worden gemengd te allen tijde om reactie reproduceerbaarheid en cel-vrije eiwituitdrukking in alle monsters te maximaliseren.
- Pipetteer 10 μL van de master mix van cel-vrije reactie naar de onderkant van een plaat van de PCR 96 - of 384-well. Tussen elke overdracht aan de PCR-plaat, meng de master mix door flicking de tube zachtjes.
- Kort centrifugeren de plaat bij 1.000 x g gedurende 10 s voor het bundelen van een master mix die kan hebben op de zijkanten van de putten worden geplakt. Zegel van de putjes met een plaat lijm ter voorkoming van verdamping en plaats dan de PCR-plaat in een thermocycler ingesteld op 26 ° C met een verwarmde deksel vastgesteld op 105 ° C.
Opmerking: De gelijkmatige warmteverdeling en verwarmde deksel van een thermocycler verbetert sterk eiwit expressie opbrengsten. - Incubeer de cel-vrije reacties voor een minimum van 3 h. Na incubatie kunnen uitgedrukte proteïnen worden gezuiverd, gekwantificeerd en gebruikt voor downstream processen.
Opmerking: Uitgedrukte proteïnen kunnen rechtstreeks in de cel-vrije reactie met behulp van een methode van keuze van de gebruiker worden gekwantificeerd. Bijvoorbeeld, fluorescente proteïnen kunnen worden gekwantificeerd aan de hand van een externe standaard curve of radioactiviteit kan worden gemeten als met behulp van een radiolabeled aminozuren in de cel zonder reactie. UV-zichtbaar spectroscopie of totale proteïne-testen zijn over het algemeen niet aanbevolen voor eiwitproductie in cel-vrije reacties zonder een aanvankelijke zuivering rechtstreeks te meten. - U kunt ook controleren cel-vrije eiwit expressie kinetiek met behulp van een afleesapparaat.
- Pipetteer 10 μL van de master mix van cel-vrije reactie naar de onderkant van een plaat met zwarte 384-well assay met helder glazen bodem. Houd de assay plaat op ijs of werken in een koude kamer terwijl het toevoegen van de master mix om ervoor te zorgen dat het volledige kinetische profiel wordt verkregen. Zegel van de putjes met een duidelijke plaat lijm ter voorkoming van verdamping en plaats dan de assay-plaat in een afleesapparaat vastgesteldop 26 ° C.
- Incubeer de cel-vrije reacties voor 3−6 h terwijl de golflengten van de passende fluorescerende excitatie/emissie overeenkomt met het geuite eiwit controle. Bijvoorbeeld, de monitor bij Ex / Em = 485 nm/528 nm voor de sfGFP.
-
Cel-vrije eiwit expressie met behulp van mRNA sjabloon
- Ontdooi mRNA sjabloon bereid in stap 3.5.2 op RT en plaats op het ijs.
- Het uitvoeren van stap 4.1.1 tot 4.1.6 zoals eerder opgegeven voor lineaire of plasmide DNA sjabloon met behulp van tabel 4 voor te bereiden op een master mix van alternatieve cel-vrije reactie mRNA sjabloon.
5. kalibratie van de V. natriegens de cel-gratis reacties met sfGFP
Opmerking: Deze sectie is optioneel. De optimale cel-vrije reactie ion concentratie kan verschillen voor elk preparaat van de ruwe extract op basis van de voorwaarden voor lysis van de cel gebruikt. Moet u het optionele cel-vrije reactie ion kalibratie protocol beschreven hieronder met behulp van sfGFP als reactie opbrengsten aanzienlijk lager zijn dan verwacht (concentraties < 1.0 μg/mL) overwegen.
- De Mg2 + - en K+ ion ijkoplossingen zoals bepaald in tabel 5 in steriele DI water uit de 100 Mg-glutamaat en 2.000 mM K-glutamaat voorraden bereid in stap 3.1.1 voorbereiden. Plaats de ijkoplossingen op ijs totdat het nodig is.
-
Pipetteer 1 μL van de Mg-glutamaat en 2 μL van K-glutamaat ion ijkoplossingen in de juiste putjes in een 384-well PCR plaat na de kaart kalibratie in tabel 6.
- De volgorde van bewerkingen in dit stadium is als volgt: Pipet de Mg-glutamaat ion kalibratie-oplossing in de bodem van elk goed gevolgd door de K-glutamaat ion kalibratie-oplossing op de kant van goed zonder het aanraken van de vloeistof die reeds aanwezig zijn in de putjes.
- Verzegel de putten door het plaatsen van een kleefmiddel is bevestigd op de top van de plaat ter voorkoming van verdamping tijdens de voorbereiding van de kalibratie cel-vrije reactie master mix. Tik zachtjes op de plaat 384-goed te mengen van de ijkoplossingen Mg - en K-glutamaat.
Opmerking: Een repeater-Pipet is een aanrader voor de voltooiing van deze stap, reproducibly en snel.
- Bereiden de kalibratie cel-vrije reactie master mix zoals bepaald in tabel 5 met T7-pJL1-sfGFP plasmide DNA sjabloon in een tube van 2 mL. Voeg elke component in de volgende volgorde aan de master mix: aminozuur master mix, energiemix oplossing master T7-pJL1-sfGFP DNA sjabloon, PEG-8000, T7 RNA polymerase en RNase remmer. Zachtjes flick de buis te mengen na elke toevoeging van het onderdeel.
Opmerking: Voeg geen Mg2 + of K+ met de ijking cel-gratis master mix. - Verwijder de lijm van de plaat. Pipetteer zorgvuldig 7 μL van de kalibratie cel-vrije reactie master mix aan de zijkanten van de putten zonder het aanraken van de gemengde ion kalibratie-oplossing reeds aanwezig zijn in de putjes. Verzegelen de putjes met de lijm en tik zachtjes op de plaat van de PCR 384-goed te mengen van de cel-vrije master mix met de ion kalibratie-oplossing.
Opmerking: Een repeater-Pipet is een aanrader voor de voltooiing van deze stap, reproducibly en snel. - Kort centrifugeren de plaat 1.000 x g voor 10 s voor het bundelen van iedere ongemengde vloeistof die hebben worden geplakt op de zijkanten van de putten. Plaats de 384-well-plaat in een thermocycler ingesteld op 26 ° C met een verwarmde deksel vastgesteld op 105 ° C.
- Incubeer de cel-vrije reacties voor 3u. Na incubatie, de inhoud van elk putje overbrengen naar een zwarte 384-well assay-plaat met een glazen bodem met een meerkanaals-pipet en lees de fluorescentie van sfGFP bij Ex / Em = 485 nm/528 nm met behulp van een afleesapparaat om te bepalen van de ion concentratie combinatie die levert de hoogste hoeveelheid eiwit.
Representative Results
De beschreven protocol voor eiwitproductie met behulp van V. natriegens cel-vrije expressie systeem kan in 1−2 dagen worden uitgevoerd door een enkele gebruiker, vanaf inoculatie van cultuur aan eiwit beschikbaar voor downstream toepassingen. Voorbereiding van ruwe cel extracten en master mix voorraden omvatten een aanzienlijk deel van deze tijd; echter zodra voorbereid, meeste bulk reagentia kunnen worden opgeslagen op lange termijn (tabel 7) en gebruikt als nodig is, verkorten van de tijd nodig om te voltooien van het protocol.
De expressie systeem beschreven is het best gebruikt met plasmide DNA sjabloon of mRNA gegenereerd door in vitro transcriptie reacties. Terwijl lineaire DNA kan ook worden gebruikt als sjabloon voor eiwitproductie, levert het aanzienlijk lagere hoeveelheid eiwit. Bijvoorbeeld, op de voorwaarden van de optimale reacties op 26 °C, kan een interne 10 μL cel-vrije reactie produceren > 260 μg/mL van sfGFP in 3 uur met behulp van 0.3 pmol van plasmide DNA sjabloon of een vergelijkbare > 125 μg/mL van sfGFP met behulp van 14 pmol van transcriptie van mRNA (figuur 5A B). 0.3 pmol van lineaire DNA ontstaat echter beduidend minder eiwit (< 20 μg/mL). Voor elk sjabloontype, zal de meerderheid van de proteïne worden geproduceerd binnen 1−1.5 h; het wordt echter aanbevolen dat de reactie wordt uitgevoerd voor een minimum van 3 uur. Cel-vrije reactie concentraties van sfGFP werden bepaald via lineaire regressie met behulp van een gezuiverde sfGFP standaard curve meten fluorescentie bij Ex / Em = 485 nm/528 nm.
De opbrengst van de productie van eiwitten wordt sterk beïnvloed door de concentratie van kalium en magnesium ionen (K+ en Mg2 +, respectievelijk). Onder optimale omstandigheden, bleek dat de optimale Mg2 + - en K+ ion concentraties 3,5 mM en 80 mM, respectievelijk zullen (figuur 6A, B). Afwijkingen van de optimale ion concentraties kunnen resulteren in een verminderde capaciteit van het systeem van de cel-vrije expressie voor de productie van eiwitten met aanzienlijke rendementen. Extra kalibratie kan nodig zijn als de opbrengsten van de reactie aanzienlijk lager zijn dan verwacht zijn. Een optioneel protocol voor de kalibratie van het ion wordt beschreven in sectie 5. Dit zorgt voor enige flexibiliteit in de ruwe cel extract variabiliteit ontstaan uit individuele cellysis van de uitrusting en voorwaarden te compenseren.
Figuur 1: een vergrote weergave van de houder van het bekerglas en de buis op het platform ultrasoonapparaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: ultrasoonapparaat installatie van de apparatuur voor de bereiding van ruwe cel extraheren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: een weergave van de pellet na ultrasoonapparaat en centrifugeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Flash bevriezing duik voor uittreksel opslag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Vertegenwoordiger resultaten voor V. natriegens cel-vrije eiwitsynthese met verschillende sjabloon typen. (A) eindpunt kwantitatieve analyse van de sfGFP productie met behulp van mengsel concentraties van plasmiden en lineaire DNA sjabloon (0.3 pmol), alsmede het toenemende concentraties van mRNA sjabloon. Cel-vrije sfGFP concentratie werd bepaald met behulp van een standaard curve van gezuiverde sfGFP gemeten bij Ex / Em 485 nm/528 nm = na 180 minuten incubatie bij 26 ° C bij optimale omstandigheden in 10 μL volumes. (B) kinetische kwantitatieve analyse van de sfGFP productie met behulp van mengsel concentraties van plasmiden en lineaire DNA sjabloon, alsmede het toenemende concentraties van mRNA sjabloon. sfGFP metingen werden genomen om de 3 minuten op Ex / EM = 485 nm/528 nm meer dan 180 minuten totale incubatietijd bij optimale omstandigheden in 10 μL volumes. Voor zowel eindpunt en kinetische vitrotests waren monsters leeg gecorrigeerd met behulp van cel-vrije reacties aangevuld met alle onderdelen met uitzondering van de sjabloon. Het gemiddelde en de standaardafwijking worden weergegeven (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: vertegenwoordiger resultaten voor ion concentratie kalibratie. (A) V. natriegens cel-vrije reacties werden aangevuld met toenemende concentraties van Mg2 + en voor 180 minuten in 10 μL reacties bij 26 ° C geïncubeerd. De totale concentratie van K+ was 160 mM voor alle Mg2 + concentraties. Cel-vrije sfGFP concentratie werd bepaald met behulp van een standaard curve van gezuiverde sfGFP gemeten bij Ex / Em = 485 nm/528 nm. (B) V. natriegens cel-vrije reacties werden aangevuld met toenemende concentraties van K+ en bij 180 min in 10 μL Reacties 26 ° C geïncubeerd. De totale concentratie van Mg2 + was 3.5 mM voor alle concentraties die K+ . Voor beide kalibraties waren monsters leeg gecorrigeerd met behulp van cel-vrije reacties aangevuld met alle onderdelen met uitzondering van de sjabloon. Het gemiddelde en de standaardafwijking worden weergegeven (n = 3). Dit cijfer is gewijzigd van Wiegand et al.9. Overgenomen met toestemming van de Wiegand, D.J., Lee, H.H., Ostrov, N., kerk, G.M. tot oprichting van een cel-Free Vibrio natriegens expressie systeem. ACS synthetische biologie. 7 (10), 2475−2479 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Tabel 1 per | Voorbereiding van LB-V2 bacteriegroei Media | ||
| Component | Hoeveelheid (g) | Eindconcentratie (mM) | Eindvolume (L) |
| De pond-Bouillon (Phil Miller) | 25 | 1 | |
| NaCl | 11.69 | 200 | |
| MgCl2 | 2.20 | 23,1 | |
| KCl | 0.31 | 4.2 | |
| Tabel 1 B | Voorbereiding van S30A Lysis Buffer | ||
| Component | Hoeveelheid (g) | Eindconcentratie (mM) | Eindvolume (L) |
| Tris oplossing (pH 8.0) - 1 M (mL) * | 25 | 50 | 0,5 |
| Mg-glutamaat | 2.72 | 14 | |
| K-glutamaat | 6.10 | 60 | |
| Dithiothreitol (DTT) - 1 M (mL) * | 1 | 2 | |
Tabel 1: reagentia voor de bereiding van 1 L van LB-V2 bacteriegroei media en 0.5 L van S30A cellysis-buffermengsel. Klik hier voor het downloaden van dit bestand in Excel.
| Voorbereiding van 10 x oplossing Master energiemix | ||||
| Component | Voorraad concentratie (mM) | Eindconcentratie (mM) | Hoeveelheid (µL) | Eindvolume (µL) |
| HEPES-KOH pH 8 | 1750 | 500 | 1428.57 | 5000 |
| ATP | 100 | 15 | 750,00 | |
| GTP | 100 | 15 | 750,00 | |
| CTP | 100 | 9 | 450,00 | |
| UTP | 100 | 9 | 450,00 | |
| tRNA van E. coli MRE 600 (mg/mL) * | 100 | 2 | 100,00 | |
| Coenzym A hydraat | 200 | 2.6 | 65,00 | |
| NAD | 200 | 3.3 | 82,50 | |
| Kamp | 650 | 7.5 | 57.69 | |
| Folinic zuur | 100 | 0,7 | 35,00 | |
| Spermidine | 1600 | 10 | 31,25 | |
| 3-PGA | 2000 | 300 | 750,00 | |
| Steriel gedeïoniseerd Water | 49.99 | |||
| Voorbereiding van 4 x aminozuur Master Mix | ||||
| Component | Voorraad concentratie (mM) | Eindconcentratie (mM) | Hoeveelheid (µL) | Eindvolume (µL) |
| NL. | 168 | 8 | 114.3 | 2400 |
| ARG | 168 | 8 | 114.3 | |
| ASN | 168 | 8 | 114.3 | |
| ASP | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLN | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLU | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLYCINE | 168 | 8 | 114.3 | |
| ZIJN | 168 | 8 | 114.3 | |
| IIE | 168 | 8 | 114.3 | |
| LYS | 168 | 8 | 114.3 | |
| ONTMOET | 168 | 8 | 114.3 | |
| PHE | 168 | 8 | 114.3 | |
| PRO | 168 | 8 | 114.3 | |
| SER | 168 | 8 | 114.3 | |
| THR | 168 | 8 | 114.3 | |
| VAL | 168 | 8 | 114.3 | |
| TRP | 168 | 8 | 114.3 | |
| TYR | 168 | 8 | 114.3 | |
| LEU | 140 | 8 | 137.1 | |
| CYS | 168 | 8 | 114.3 | |
| Steriel gedeïoniseerd Water | 91,4 | |||
Tabel 2: Reagentia voor de bereiding van 5 mL 10 x energievorm meester mix en 4 x aminozuur master mix 2.4 mL. Klik hier voor het downloaden van dit bestand in Excel.
| T7 Polymerase van RNA In Vitro transcriptie reacties | ||||
| Component | Voorraad (mM) | Eindconcentratie (mM) | Hoeveelheid (µL) 1 x reactie | Hoeveelheid (µL) 50 x reacties |
| 10 x RNAPol reactie Buffer | 1,00 | 50 | ||
| ATP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| GTP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| CTP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| UTP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| DNA sjabloon (ng/µL) * | 1000 | 500 | 0.50 | 25 |
| T7 RNA-Polymerase | 200 | 2.6 | 2,00 | 100 |
| RNase Inhibitor, RattenUitrustingen | 200 | 3.3 | 0.50 | 25 |
| Steriel gedeïoniseerd Water | 15,60 | 780 | ||
| Reactie Volume (µL): | 20 | |||
Tabel 3: In vitro transcriptie onderdelen voor mRNA generatie. Klik hier voor het downloaden van dit bestand in Excel.
| Cel-vrije reactie Master Mix | ||||
| Component | Voorraad concentratie (mM) | Eindconcentratie (mM) | Hoeveelheid (µL) 1 x reactie | Hoeveelheid (µL) 50 x reacties |
| Extract (%) * | 25 | 2,50 | 125,00 | |
| Mg-glutamaat | 100 | 3.5 | 0.35 | 17,50 |
| K-glutamaat | 2000 | 80 | 0,40 | 20,00 |
| 4 x aminozuur Master Mix | 8.0 | 2 | 2,50 | 125,00 |
| 10 x oplossing Master energiemix | 1,00 | 50,00 | ||
| Plasmide DNA (ng/µL) * | 1000 | 500 | 0.50 | 25,00 |
| 50% PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0,40 | 20,00 |
| T7 RNA-Polymerase | 1,00 | 50,00 | ||
| RNase Inhibitor, RattenUitrustingen | 0.10 | 5,00 | ||
| Steriel gedeïoniseerd Water | 1,25 | 62.50 | ||
| Reactie Volume (µL): | 10 | |||
| Alternatieve cel-vrije reactie Master Mix voor mRNA sjabloon | ||||
| Component | Voorraad concentratie (mM) | Eindconcentratie (mM) | Hoeveelheid (µL) 1 x reactie | Hoeveelheid (µL) 50 x reacties |
| Extract (%) * | 25 | 2,50 | 125,00 | |
| Mg-glutamaat | 100 | 3.5 | 0.35 | 17,50 |
| K-glutamaat | 2000 | 80 | 0,40 | 20,00 |
| 4 x aminozuur Master Mix | 8.0 | 2 | 2,50 | 125,00 |
| 10 x oplossing Master energiemix | 1,00 | 50,00 | ||
| mRNA sjabloon (ng/µL) * | 2000 | 4000 | 2,00 | 100,00 |
| 50% PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0,40 | 20,00 |
| RNase Inhibitor, RattenUitrustingen | 0.10 | 5,00 | ||
| Steriel gedeïoniseerd Water | 0,75 | 37,50 | ||
| Reactie Volume (µL): | 10 | |||
Tabel 4: Componenten voor geoptimaliseerde V. natriegens cel-gratis reactie master mix voor de sjabloon van het DNA en mRNA sjabloon. Klik hier voor het downloaden van dit bestand in Excel.
| Mg 2 + Kalibratie | Hoeveelheid (µL) 1 x reactie | Hoeveelheid (µL) 1 x reactie | Hoeveelheid (µL) 100 x reacties | Hoeveelheid (µL) 100 x reacties | |
| Finale (mM) | Voorraad | 100 mM Mg-Glu | diH 2 0 | 100 mM Mg-Glu | Gedeïoniseerd H2O |
| 2.5 | 0 | 0,00 | 1,00 | 0 | 100 |
| 3.5 | 1 | 0.10 | 0.90 | 10 | 90 |
| 4.5 | 2 | 0.20 | 0,80 | 20 | 80 |
| 5.5 | 3 | 0,30 | 0.70 | 30 | 70 |
| Reactie Volume (µL): | 10 | ||||
| K + Kalibratie | Hoeveelheid (µL) 1 x reactie | Hoeveelheid (µL) 1 x reactie | Hoeveelheid (µL) 100 x reacties | Hoeveelheid (µL) 100 x reacties | |
| Finale (mM) | Voorraad | 2000 mM K-Glu | diH 2 0 | 2000 mM K-Glu | Gedeïoniseerd H2O |
| 40 | 30 | 0,15 | 1,85 | 12 | 148 |
| 80 | 70 | 0.35 | 1.65 | 28 | 132 |
| 160 | 150 | 0,75 | 1,25 | 60 | 100 |
| 320 | 310 | 1.55 | 0,45 | 124 | 36 |
| Reactie Volume (µL): | 10 | ||||
| Ion kalibratie cel-vrije reactie Master Mix | |||||
| Component | Voorraad concentratie (mM) | Eindconcentratie (mM) | Hoeveelheid (µL) 1 x reactie | Hoeveelheid (µL) 50 x reacties | |
| Extract (%) * | 25 | 2,50 | 125,00 | ||
| Mg-glutamaat | Variabele | Variabele | 1,00 | 50,00 | |
| K-glutamaat | Variabele | Variabele | 2,00 | 100,00 | |
| 4 x aminozuur Master Mix | 8.0 | 2 | 2,50 | 125,00 | |
| 10 x oplossing Master energiemix | 1,00 | 50,00 | |||
| Plasmide DNA (ng/µL) * | 1000 | 250 | 0,25 | 12,50 | |
| 50% PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0,40 | 20,00 | |
| T7 RNA-Polymerase | 1,00 | 50,00 | |||
| RNase Inhibitor, RattenUitrustingen | 0.10 | 5,00 | |||
| Steriel gedeïoniseerd Water | 0,00 | 0,00 | |||
| Reactie Volume (µL): | 10 | ||||
Tabel 5: Ion concentratie kalibratie master mixen. Klik hier voor het downloaden van dit bestand in Excel.
| CF Ion kalibratie kaart | 40 mM K+ | 80 mM K+ | 160 mM K+ | 320 mM K+ | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| 2.5 mM Mg2 + | A | ||||||||||||
| 3.5 mM Mg2 + | B | ||||||||||||
| 4.5 mM Mg2 + | C | ||||||||||||
| 5.5 mM Mg2 + | D | ||||||||||||
Tabel 6: Ion kalibratie kaart. Klik hier voor het downloaden van dit bestand in Excel.
| Opslagomstandigheden en plank leven van CF-componenten | ||
| Component | Opslaglocatie | Houdbaarheid |
| Steriele LB-V2 groei Media | 4 ° C | 3-6 maanden |
| V. natriegens ruwe cel extraheren | -80 ° C | 1-3 weken |
| 100 mM Mg-glutamaat | Kamer Temp | 6 maanden |
| 2000 mM K-glutamaat | Kamer Temp | 6 maanden |
| 50% PEG-8000 | Kamer Temp | 6 maanden |
| 10 x oplossing Master energiemix | -80 ° C | 3-6 maanden |
| 4 x aminozuur Master Mix | -80 ° C | 3-6 maanden |
| Plasmide/lineaire DNA sjabloon | -20 ° C | 6-12 maanden |
| mRNA sjabloon | -80 ° C | 3-4 weken |
Tabel 7: Opslagomstandigheden cel-vrij en plank leven. Klik hier voor het downloaden van dit bestand in Excel.
Discussion
Dit protocol is geoptimaliseerd voor wild-type V. natriegens en bacteriële groei media bestaat uit LB aangevuld met V2 zouten (Tabel van materialen). Andere stammen van V. natriegens kunnen ook worden gekweekt voor het genereren van extracten van de ruwe cel voor cel-vrije reacties; het gebruik ervan vereist echter aanvullende optimalisatie van dit protocol. Bovendien, is deze cel-vrije eiwit expressie systeem geoptimaliseerd met behulp van 3-phosphoglyceric zuur (3-PGA) als de primaire energiebron voor de regeneratie. Andere energiebronnen voor de regeneratie mag worden gebruikt; optimalisatie van reagentia en kalibratie waarschijnlijk zullen echter moeten verkrijgen van hoge opbrengst eiwit expressie10,11.
Specifieke aandacht voor de verschillende kritische stappen in dit protocol zorgt voor maximale extract productiviteit voor hoge opbrengst cel-vrije productie van eiwitten. Eerst, ruwe cel uittreksel moet worden bereid uit V. natriegens celculturen geoogst in een midden-exponentiële fase van groei; eiwit opbrengst is maximale wanneer culturen een OD600 bereiken = 1,0 ± 0,2. Hoewel cel-vrije eiwitproductie uit cellen geoogst op een aantal optische dichtheden mogelijk is, hebben we eerder gevonden dat cellen geoogst in een exponentiële staat van groei aanzienlijk meer eiwit9opleveren. De waargenomen effecten van optische dichtheid op ruwe cel extract prestaties komen overeen met die voor andere cel-vrije expressiesystemen afgeleid van cellen gekweekt in batch cultuur voorwaarden1gerapporteerd. Omdat V. natriegens in een snel tempo groeit, is het essentieel om nauwlettend toe te culturen optische dichtheden. In het algemeen, de verwachting is dat V. natriegens culturen reproducibly tot een OD-600 voor 1.0 binnen 1−1.5 h met gebruikmaking van dit protocol; echter verbijsterd individuele groei omstandigheden zoals het gebruik van versus niet-verbijsterd kolven, welke invloed beluchting, of lucht versus water incubatie, die invloed op de snelheid en stabiliteit van incubatietemperatuur, groei tijd kunnen wijzigen. Bovendien is het in het algemeen aanbevolen om de cultuur van ten minste 250 mL V. natriegens in een maatkolf van 1 L verbijsterd om een grote cel pellet bij de oogst voor gemakkelijke manipulatie en overdracht. Dit verbetert sterk het succes van ruwe cel extract voorbereiding, alsmede verhoging van de totale hoeveelheid extract geproduceerd uit een pellet. Bij het gebruik van kleinere schaal voorbereiding, kunnen kweekomstandigheden en reagentia op passende wijze worden aangepast. Voor grootschalige gisting, kan verdere optimalisatie van de kweekomstandigheden worden verlangd. Tot slot, om ervoor te zorgen eiwitrijk rendement, is het essentieel dat cel pellets worden verwerkt, onmiddellijk na de oogst, of binnen 1−2 dagen na opslaan bij-80 ° C.
De juiste lysis van de cel pellet met het ultrasoonapparaat puls is cruciaal voor het succes van cel-vrije eiwit expressie en is vaak het moeilijkste aspect van dit protocol voor nieuwe gebruikers. Een goed lysed pellet levert meestal een aanzienlijk volume aan vloeibaar extract dat is vrij van vuil. Het extract moet licht viskeuze maar kan gemakkelijk worden pipetted als aliquoting in opslag buizen voordat flash ingevroren in vloeibare stikstof. Figuur 3 toont een vertegenwoordiging van een goed lysed pellet (figuur 3A) in vergelijking met een slecht lysed pellet (figuur 3B) na de post lysis centrifugeren stap. Een belangrijke indicatie van volledige cellysis is een ruwe cel extraheren totaal eiwit concentratie > 20 mg / mL zoals bepaald door een totaal eiwit assay (stap 2.13). Overmatige ultrasoonapparaat of buitensporige verwarming van het extract van de ruwe cel beschadigt de cellulaire machines, die kan niet worden bepaald zonder het uitvoeren van een reactie van cel-vrij. Het is dus zeer gunstig voor het testen van de efficiëntie van het extract met de reactie van een besturingselement voor het wijden van aanzienlijke tijd en moeite aan downstream eiwit expressie toepassingen. Aanvullende optimalisatie nodig kan zijn voor verschillende ultrasoonapparaat apparatuur, zijn de pols ultrasoonapparaat stappen geweest zeer reproduceerbaar in onze handen.
Het gebruik van lineaire DNA sjabloon afgeleid van PCR versterking, restrictie-enzym verificatiesamenvatting of commerciële gene synthese kan de capaciteit voor de productie van hoge-doorvoer en snelle eiwitten in cel-vrije expressie systemen24aanzienlijk verhogen. Terwijl de productie van eiwitten van PCR versterkte lineaire sjabloon heeft aangetoond, de opbrengst van deze reacties zijn ongeveer 13.5-fold lager in vergelijking met reacties met behulp van de plasmide DNA sjabloon bij mengsel ratio's9. Dit is voornamelijk te wijten aan de instabiliteit van de lineaire DNA-sjabloon die afgebroken door endogene nucleasen aanwezig in V. natriegens ruwe cel extract dreigt. Terwijl lambda phage eiwit GamS is eerder gebruikt ter bescherming van lineaire DNA sjabloon24,25, bleek niet compatibel zijn met V. natriegens extracten9. Bovendien, terwijl de verhoging van de concentratie van lineaire DNA sjabloon mogelijk is voor een hoger rendement van de eiwitten, wel zijn snelle degradatie in ruwe cel extract een groot probleem.
Een oplossing voor het overwinnen van lineaire aantasting van de sjabloon van het DNA kan worden ter aanvulling van cel-vrije reacties met mRNA sjabloon gegenereerd op basis van in vitro transcriptie van lineaire DNA. Aan de andere kant, het gebruik van een RNase-remmer biedt aanzienlijke bescherming tegen aantasting van de transcriptie van mRNA en merkbare eiwit opbrengst kunnen worden verkregen in de 10 μL reactie cel-vrij formaat (figuur 5AB). Klonen van lineaire DNA in een circulaire sjabloon via TA afbinding, mogen klonen TOPO, Golden Gate vergadering of andere recombinatie methoden worden gebruikt voor het omzeilen van de aantasting van de sjabloon. Echter zal verdere benaderingen voor remming van de nuclease activiteit nodig zijn voor efficiënte eiwit expressie met behulp van lineaire DNA sjabloon.
Tot op heden zijn verscheidene verschillende benaderingen voorgesteld voor bereiding van ruwe extract voor cel-vrije eiwit expressie9,10,11,26. Bij het ontwikkelen van dit protocol, dat wij willen maximaliseren gebruiker toegankelijkheid, het verminderen van de totale kosten, en het minimaliseren van tijdrovende stappen. Bijvoorbeeld, een eiwitrijk rendement wordt bereikt met behulp van een eenvoudige stappen ultrasoonapparaat-centrifugeren, en vereist geen cel homogeniseerders, lange dialyse stappen of afspoeling reactie. Het is eenvoudig uit te voeren in een korte periode van tijd en vereist geen hoog niveau van deskundigheid van het laboratorium. Het kan dus helpen vergemakkelijken van cel-vrije meningsuiting als een standaard voor het translationeel academisch onderzoek en industrieel procesontwerp.
Dit protocol breidt de toolkit beschikbaar voor onderzoek en het nut van V. natriegens, een niet-model-organisme met unieke biologische eigenschappen. Hogere eiwit opbrengst kan worden bereikt door gebruik te maken van semi - of volledig-continu cel-vrije reacties, met het oog op energie regeneratie, bevoorraden van aminozuren, en de verwijdering van afvalproducten3,5,27. Bovendien, de engineering van wild-type V. natriegens DNAse - of RNAse-deficiënte stammen produceren, verwijdering van schadelijke en concurrerende stofwisselingsroutes en expressie van extra tRNAs kan sterk verbeteren de productie van eiwitten in Dit systeem28,29. Zoals wij de biologie die ten grondslag liggen aan de snelle groei ontrafelen, kan verdere ontwikkelingen van V. natriegens cel-vrije systemen versnellen bioproduction mogelijkheden en robuuste expressie van therapeutische peptiden, kleine moleculen en synthetische inschakelen materialen.
Disclosures
DJW, Nee, en GMC hebben ingediend te patent verband met dit werk.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 en de afdeling van DE energie-FG02-02ER63445. De auteurs bedank Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam en Dr. Edgar Goluch voor nuttig advies over het bouwen van de protocol-sectie van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
| 2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| 384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
| 384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
| 50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
| 96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
| Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
| Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
| Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
| Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
| Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
| Dewar Flask - 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
| DL-Dithiothreitol solution - 1 M | Sigma | 42816 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
| Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
| Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
| Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip | Qsonica | 4422 | |
| RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
| RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
| Tris Solution (pH 8.0) - 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
| tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
| Uridine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |
References
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Schoborg, J. A., et al. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Henrich, E., Hein, C., Dötsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
- Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. Establishing a high yielding streptomyces‐based cell‐free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
- Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).
- Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements. Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).
- Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements. Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).
- Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System. ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).
- Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).
- Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens. Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).
- Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).
- Eagon, R. G. Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes. Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).
- Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology. Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).
- Lee, H. H., et al. Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse. bioRxiv. , 058487 (2016).
- Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. Recombineering in Vibrio natriegens. bioRxiv. , 130088 (2017).
- Schleicher, L., et al. Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes. Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).
- Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E., Carmona, M. Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory. Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).
- Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).
- Hoffart, E., et al. High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology. Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).
- Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis. Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation. Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).
- Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors. Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).
- Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
