Summary
Cellfria uttryck system är kraftfulla och kostnadseffektiva verktyg för hög genomströmning syntes och screening av viktiga proteiner. Här beskriver vi beredning av cellfria protein uttryck systemet med Vibrio natriegens för snabba proteinproduktion med hjälp av plasmid DNA, linjära DNA och mRNA mall.
Abstract
Marina bakterien Vibrio natriegens har rönt stor uppmärksamhet som en framväxande mikrobiell värd för bioteknik på grund av sin snabba tillväxt. Ett allmänt protokoll beskrivs för beredning av V. natriegens rå cell extrakt med hjälp av gemensamma laboratorieutrustning. Hög avkastning protokollet har varit särskilt optimerad för användaren tillgänglighet och minskade kostnader. Cellfria proteinsyntesen (CFPS) kan utföras i liten skala 10 μL batch reaktioner i antingen en 96 - eller 384-bra format och reproducibly ger halter av > 260 μg/mL super mapp GFP (sfGFP) i 3 h. övergripande, rå cell extrahera förberedelse och CFPS kan uppnås i 1−2 hela dagar av en enskild användare. Detta protokoll kan enkelt integreras i befintliga proteinsyntes rörledningarna att underlätta framsteg i bio-produktion och syntetisk biologi tillämpningar.
Introduction
Cellfria proteinsyntesen är en mångsidig och kostnadseffektiv metod för uttrycket av värdefulla proteiner eller peptider1,2,3,4. Historiskt, har cellfria proteinsyntesen utförts med Escherichia coli uttryck system; Det har dock varit en senaste tidens uppgång i med alternativa, icke-modell organismer med nya egenskaper som chassi för cellfria uttryck5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismer med unika metaboliska profiler är främsta kandidaterna som alternativ till E. coli cell-fria system. Till exempel fördubbling Marina bakterien Vibrio natriegens är den snabbast växande alla kända organismer med en observerade tid på mindre än 10 min13. Detta har rönt V. natriegens stor uppmärksamhet som en framväxande mikrobiell värd för forskning och bioteknik14,15,16,17,18. Tanke på att den snabba tillväxten av V. natriegens har kopplats till höga priser av proteinsyntes och metabolisk effektivitet19,20,21, utnyttja dess cellulära maskineriet för cellfria syntes kan avsevärt utvidga toolkit för snabb proteinproduktion och high-throughput screening.
Nyligen, en cell-fri V. natriegens uttryck systemet har påvisats som är kapabel att producera super mapp GFP (sfGFP) vid koncentrationer > 260 μg/ml i 3 h med en T7 Promotorn9. Det övergripande syftet att utveckla denna metod var att ge användarna en mycket tillgänglig, kostnadseffektiva, reproducerbar och högavkastande cellfria protein uttryck systemet som kan framställas med hjälp av gemensamma labbutrustning i en kort tid. Detta protokoll använder tredjeparts 1 L kulturer i skaka kolvarna, cellys genom puls ultraljudsbehandling och småskaliga batch reaktioner i en 96 - eller 384-bra format för att maximera parallelization och screening genomströmning. En lång, ihållande proteinuttryck görs möjligt genom tillskott av 3-phosphoglyceric syra (3-PGA) som en energi källa8,22,23. Efter framgångsrikt avslutat detta protokoll, en användare kommer att ha kapacitet att uttrycka en önskad protein eller uppsättning proteiner i en cell-fria format med V. natriegens rå cell extrahera.
Start från en glycerol lager, V. natriegens rå cell extrakt är beredd från celler skördas på en optisk densitet på 600 nm (OD600) 1.0. En 1 L kultur kommer att ge cirka 2−3 mL extrakt, som är tillräcklig för mer än 800 cellfria reaktioner på 25% rå cell extrakt. Proteiner kan uttryckas med hjälp av plasmid DNA, linjära DNA eller mRNA mallen. linjära DNA mall nedbrytning av endogena nukleaser förblir dock en stor nackdel när du använder vildtyp V. natriegens cell-fria system9. Start från V. natriegens kulturer, kan protein användbar för nedströms tillämpningar uppnås genom en enskild användare i 1−2 heldagar.
Protocol
1. beredning av V. natriegens rå Cell extrakt – bakterieodling
- Förbered V. natriegens bakterietillväxt LB-V2 enligt tabell 1. Sterilisera tillväxt medier i autoklav. Tillåta mediet för att nå rumstemperatur (RT). Lagra överskott media på RT.
Varning: Bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) och konsultera lab specifika instruktioner när du använder en autoklav. - Använd en glycerol beståndet av vild typ V. natriegens för att Inokulera 3 mL LB-V2 media. Växa över natten vid 30 ° C under omskakning vid 225 rpm.
- Tvätta 1 mL av övernattning kultur genom centrifugering vid 10 600 x g på en bänkmonterade Centrifugera i 1 min. aspirera supernatanten utan att störa den resulterande pelleten och resuspendera i 1 mL färsk LB-V2 media.
- Förbryllad Erlenmeyerkolven med sterila lock, Lägg till 1 L färska LB-V2 tillväxt medier i en autoklaveras 4 L. Inokulera med 1 mL tvättade övernattning kultur (1:1, 000 utspädningsfaktorn). Växa kultur vid 30 ° C under omskakning vid 225 rpm.
Obs: V. natriegens kulturer kan skalas upp eller ner samtidigt som 1:1,000 utspädningsfaktorn. Exempelvis lägga till 250 μL av tvättade övernattning kultur till 250 mL färsk LB-V2 tillväxt medier i en 2 L snopen Erlenmeyerkolven med sterilt omslag. - Övervaka kulturens OD600 med en spektrofotometer. När kulturen når OD600 = 1,0 ± 0,2, skörd kultur genom centrifugering vid 3 500 x g i 20 min vid 4 ° C. Placera pellets på is.
Obs: V. natriegens växer snabbt, så nära övervakning av kulturen är nödvändig. Tillväxt till OD600 = 1.0 ska ta cirka 1.5−2 h 1:1,000 utspädningsfaktorn. - Aspirera supernatanten och omedelbart lagra resulterande bakteriell pelleten vid-80 ° C eller direkt gå vidare till cell lysis beskrivs i avsnitt 2.
Obs: Detta steg är en bra rastplats; Det rekommenderas dock att pelleten behandlas omedelbart eller inom 1−2 dagar för bästa resultat.
2. beredning av V. natriegens rå Cell extrakt – Cell Lysis
- Förbereda S30 lyseringsbuffert enligt tabell 1 i sterilt avjoniserat vatten (DI) och justera pH till 7,7 med isättika.
Varning: Koncentrerad ättiksyra ska hanteras med lämplig personlig skyddsutrustning när du justerar pH. - Cool S30 lyseringsbuffert till ungefär 4 ° C i kylskåp eller på is innan cellen lysis proceduren.
Obs: För en snabb nedkylning, Lys kan buffert placeras vid-20 ° C. Tillåt inte bufferten att frysa. - Placera cell pellets på is för 10−20 min eller tills helt tinat. Återsuspendera alla pellets som härrör från samma 1 L kultur med 10 mL kall S30 lyseringsbuffert och sedan överföra suspension till en 50 mL tub. Om pellets inte är frysta i frysen vid-80 ° C i steg 1,6, vidare direkt till resuspension.
Obs: Öka volymen av S30 lyseringsbuffert brukade initialt omsuspendera pellets som behövs. - Centrifugera suspension vid 3 500 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Aspirera supernatanten utan att störa pelleten. Tvätta pelleten med 10 mL kall S30 lyseringsbuffert. Placera pellets på is.
-
I ett kallt rum, tillsätt 500 μL i kalla S30 lyseringsbuffert pelleten i 50 mL röret. Använda en wide-bore pipettspetsen, återsuspendera pelleten och noggrant överföra hela pellet suspensionen till en 2 mL tub.
Obs: Om ett brett bore pipetten är inte tillgänglig, Använd en sax för att klippa i slutet av en 1 mL pipettspetsen att öka hålet för pellet överföring.- Överföra så mycket pellet som möjligt utan att avsevärt öka volymen; pelleten bör dock vara resuspended i tillräckligt med vätska till vara sonicated, som indikeras av en homogen suspension i 2 mL röret. Överfyll inte 2 mL röret. Suspensionen bör inte överstiga 1,5 mL; delas upp i flera rör vid behov.
- Hålla cellpelleten på is och arbeta i ett kallt rum. Fyll en 600 mL-bägare med is och placera en 2 mL tub hållare ovanpå isen.
Obs: Det är bra att placera hållaren tube nära sidan av bägaren, så pellet fjädringen blir synliga i isen att övervaka ultraljudsbehandling (se figur 1). - Vortex suspenderade pelleten i 2 mL rör kort för att homogenisera cellerna, flick rör ta bort celler på undersidan av locket och placera i tube hållare med locket öppet. Sänka någon sonikator tip i upphängningen så att det är bara under vätskeytan.
- Förbereda ultraljudsbehandling set-up som avbildas i figur 2 med en någon sonikator sond med en radie-tums spets diameter. Mata in följande inställningar i någon sonikator kontrollen: 20 kHz frekvens och 50% amplitud, puls i tid: 10 s, puls OFF tid: 60 s.
- Kör pulse ultraljudsbehandling protokoll för tre cykler. Om den totala mängden pellets suspensionen är > 500 μL, kör pulse ultraljudsbehandling protokoll sex gånger.
Obs: I allmänhet är 3−6 pulser tillräckliga för att lysera V. natriegens pelletar; ytterligare pulser kan krävas beroende på någon sonikator. Under ultraljudsbehandling, Använd justering knopp plattformen för att flytta sonden upp och ner för att lysera eventuella pellet som kanske bosatte sig till botten av röret. Röret kan tas bort från hållaren och kort vortexed att åter homogenisera suspensionen mellan pulser. Se diskussion nedan för önskad konsistens av sonicated celler.
Varning: Bära lämpligt Hörselskydd när någon sonikator är aktiv. - Efter ultraljudsbehandling, centrifug rå cell extrahera vid 16 000 x g för 30−45 min vid 4 ° C eller tills lysate är någon cellulära skräp som avbildas i figur 3.
-
I ett kallt rum, alikvotens 50 μl av de resulterande supernatanterna till nya 2 mL rör utan att störa pelleten.
Obs: eventuellt skräp som överförs av misstag in i nya 2 mL-rören kommer att drastiskt minska extrakts kapacitet för hög avkastning proteinsyntesen.- Alternativt avsätta 10 μL av cell extrahera för efter Lys protein kvantifiering i en separat 2 mL rör (se steg 2.13 nedan).
- Blixt frysa rå cell extrakt genom att placera rören i en tube hållare med en doppa snöre fäst som avbildas i figur 4. Sänk ner rören i en Dewar som innehåller flytande kväve och placera omedelbart i en frys vid-80 ° C fram till användning.
Varning: Använd lämplig personlig skyddsutrustning för hantering av flytande kväve inklusive labbrock, skyddsglasögon, visir, cryogen förkläde och handskar. - Alternativt, kvantifiera det totala proteinet cellens lysate använder 10 μL ställa bortsett från steg 2.11.1 genom att späda provet 1: 100 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och med någon standard totalt protein kvantifiering analys såsom Bradford analys, bicinchoninic acid assay (BCA), etc.
3. beredning av cellfria reaktion komponenter
-
De allmänna reaktion komponenter
- Förbereda arbetande bestånd av Mg-glutamat och K-glutamat i 50 mL rör med steril DI vatten vid koncentrationer av 100 mM och 2000 mM, respektive.
- Förbereda ett fungerande lager med 50% (w/v) polyetylenglykol (PEG)-8000 genom att tillsätta 100 mL steril DI vatten till en 250 mL bägare. Placera en liten magnetomrörare i bägaren. Väg in 50 g av PEG-8000 och lägga till de 100 mL vatten i bägaren.
- Placera bägaren på en uppvärmd uppståndelse plattan till 100 ° C och rör vid 250 rpm tills PEG-8000 är i lösning. Att PEG-8000 flytande blandningen svalna innan du överför till 50 mL rör.
-
Energi lösning master mix
- Bered en 5 M Koh genom att lägga till 140 g KOH pellets till 500 mL steril DI-vatten.
Varning: Bered lösningen i en kemisk huva och Använd personlig skyddsutrustning vid hantering av starka baser. Lösningen blir varm så hatten på flaskan måste vara löst för att förhindra tryckuppbyggnad. Låt den KOH lösningen att nå RT innan du använder. - Förbereda en 1750 mM HEPES-KOH buffert genom att lägga till 20,85 g HEPES till en 100 mL flaska. Tillsätt långsamt sterilt avjoniseratvatten tills volymen nått 40 mL. Vortex flaska att upplösa HEPES. Använda 5 M KOH lösning för att justera pH till 8.0 och sedan föra lösning volymen till 50 mL.
Varning: KOH ska hanteras med lämplig personlig skyddsutrustning när du justerar pH. - Förbereda de återstående 10 x energi huvudmixen lager komponenter vid de koncentrationer som anges i tabell 2 i sterilt avjoniseratvatten och placera varje bestånd på is. Tina de 100 mM ATP, GTP, CTP och UTP bestånd på RT och plats på is.
Obs: En thermomixer satt till 37 ° C och 350 rpm kan användas att upplösa reagenser till lösning om det behövs. Inte överhettas eller lämna reagens på thermomixer under en längre tid. - I en 15 mL tub, lägga till varje energi huvudmixen komponent i enlighet med i ordning och volym anges i tabell 2. Vortex lösningen efter varje komponent läggs. Detta kommer att göra 5 mL 10 x energi lösning huvudmixen.
- Dela 10 x energi lösning master mix i 200 μL alikvoter i 2 mL rör. Blixt frysa varje alikvot som utförs i steg 2.12. Placera omedelbart dem i frysen-80 ° C fram till användning.
- Bered en 5 M Koh genom att lägga till 140 g KOH pellets till 500 mL steril DI-vatten.
-
Aminosyra master mix
- För att förbereda färska 4 x aminosyra huvudmixen, börja med upptining varje aminosyra bestånd på RT och sedan placera varje på isen. Använda en vortex och/eller thermomixer vid 37 ° C och 350 rpm så alla aminosyra bestånd är helt upplöst.
Obs: Cystein kan inte helt upplösa; Det kan läggas till huvudmixen aminosyra som en suspension. Inte överhettas eller lämna reagens på thermomixer under en längre tid. - I en 15 mL tub, lägga till de aminosyrorna för lämplig volym sterilt DI vatten så att slutlig koncentration av varje är 8 mM i följande ordning: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, hans, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU och CYS. Efter tillägger varje aminosyra, blanda vortex befälhavaren lösning. De volymer som anges i tabell 2 får upp 2,4 mL av aminosyra master mix.
- Dela 4 x aminosyra master mix i 200 μL alikvoter i 2 mL rör. Blixt frysa varje alikvot som utförs i steg 2.12. Placera omedelbart i en frys vid-80 ° C fram till användning.
- För att förbereda färska 4 x aminosyra huvudmixen, börja med upptining varje aminosyra bestånd på RT och sedan placera varje på isen. Använda en vortex och/eller thermomixer vid 37 ° C och 350 rpm så alla aminosyra bestånd är helt upplöst.
-
Produktion av reaktion-klar plasmid DNA mall
Obs: Cellfria proteinuttryck i detta system har optimerats med super mapp grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck vektorn T7-pJL1-sfGFP (Tabell för material). Det rekommenderas att använda denna plasmid som en kontroll för cellfria reaktion effektivitet och pJL1 ryggraden för kloning och uttryck för andra proteinsekvenser. Andra plasmid DNA mallar kan användas; Det är dock viktigt att notera att transkription styrs av en T7 Promotorn sekvens och förekomsten av T7 RNA-polymeras. Ett enkelt protokoll för storskalig produktion av en plasmid DNA mall från transformerade E. coli beskrivs nedan.- Rena önskade vektor med en plasmid rening kit enligt tillverkarens instruktioner (Tabell för material).
Obs: Att koncentrera plasmid DNA mallen som möjligt rekommenderas att uppfylla snäva volym begränsningar av cellfria reaktionen. I allmänhet eftersträva en 750−1500 ng/μl fungerande lager.
- Rena önskade vektor med en plasmid rening kit enligt tillverkarens instruktioner (Tabell för material).
-
Produktion av reaktion-klar mRNA mall
Obs: Detta avsnitt är valfritt. Proteinuttryck har testats med mRNA mallen genereras från in vitro-transkriptionen av Plasmiden T7-pJL1-sfGFP av den börsnoterade T7 RNA-polymerasen (Tabell för material).- Förbereda mRNA mall från plasmid DNA kodning proteinet av intresse med hjälp av in vitro-transkription reaktion komponenterna i tabell 3. Inkubera reaktioner för 1 h vid 37 ° C i en termocykler.
Obs: Det rekommenderas att utföra 8−10x av dessa reaktioner parallellt att generera tillräckligt med material. - Poolen alla transkription reaktioner. Rena med en mRNA rening och koncentrator kit enligt tillverkarens instruktioner (Tabell för material). Eluera mRNA mall i sterilt avjoniseratvatten. Store mRNA mall vid-80 ° C fram till användning.
- Förbereda mRNA mall från plasmid DNA kodning proteinet av intresse med hjälp av in vitro-transkription reaktion komponenterna i tabell 3. Inkubera reaktioner för 1 h vid 37 ° C i en termocykler.
4. utför cellfria Protein Eexpression reaktioner med V. natriegens rå extrakt
-
Cellfria proteinuttryck med hjälp av plasmid eller linjära DNA-mall
- Ta bort 10 x energi lösning huvudmixen och 4 x aminosyra huvudmixen alikvoter från-80 ° C frysen, Tina i RT och placera på isen. Ta bort T7 RNA-polymeras och RNase inhibitor bestånd från-20 ° C frysen och placera på isen. Tina DNA mall på RT och plats på is.
- Förbereda en cellfria reaktion master mix enligt tabell 4 genom att lägga till varje komponent i följande ordning en 2 mL tub på is: aminosyran huvudmixen, energi lösning master mix, Mg-glutamat, K-glutamat, DNA-mall, PEG-8000, T7 RNA-polymeras och RNase hämmare. Knacka försiktigt röret efter varje tillägg till huvudmixen.
Obs: Lägg till 5−10x mer material jämfört med plasmid mall att erhålla märkbar avkastning av protein om linjär mall som ska användas för cellfria proteinuttryck. - Ta bort V. natriegens rå cell lysate bereddes i steg 2.12 från-80 ° C frysar och plats på is 10−20 minuter tills tinat. Tillsätt lämplig volym råolja cell extrahera till huvudmixen cellfria reaktion enligt tabell 4 och blanda försiktigt genom att snärta eller pipettering upp och ner.
- Slutpunkten cellfria proteinuttryck med termocyklern
- Tillsätt 10 μL av cellfria reaktion huvudmixen längst ned i en 96 - eller 384-väl PCR-plattan. Mellan varje överföring till PCR-plattan, blanda huvudmixen genom att snärta röret försiktigt.
Obs: Cellfria reaktion huvudmixen ska blandas väl alltid att maximera reaktion reproducerbarhet och cellfria proteinuttryck i alla prover.
- Tillsätt 10 μL av cellfria reaktion huvudmixen längst ned i en 96 - eller 384-väl PCR-plattan. Mellan varje överföring till PCR-plattan, blanda huvudmixen genom att snärta röret försiktigt.
- Kort Centrifugera plattan vid 1 000 x g i 10 s till pool varje master mix som kan ha fastnat på sidorna av brunnarna. Täta brunnarna med en tallrik lim att förhindra avdunstning och sedan placera PCR-plattan i en termocykler inställd på 26 ° C med uppvärmd lock vid 105 ° C.
Obs: De jämn värmefördelning och uppvärmd locket på en termocykler förbättrar avsevärt protein uttryck avkastning. - Inkubera cellfria reaktioner i minst 3 tim. Efter inkubation, kan uttryckta proteiner renas, kvantifieras, och används för efterföljande processer.
Obs: Uttryckta proteiner kan kvantifieras direkt i cellfria reaktionen med en metod som användarens val. Till exempel fluorescerande proteiner kan kvantifieras med hjälp av en extern standardkurvan eller radioaktivitet kan mätas om använder en radiomärkt aminosyra i cellfria reaktionen. UV-synliga spektroskopi eller totalt protein assays är i allmänhet inte rekommenderas för att direkt mäta proteinproduktionen i cellfria reaktioner utan en inledande rening. - Alternativt kan du övervaka cellfria protein uttryck kinetik med hjälp av en tallrik-läsare.
- Tillsätt 10 μL av cellfria reaktion huvudmixen till botten av en svart 384-väl assay plattan med klarglas bottnar. Hålla assay plattan på is eller arbeta i ett kallt rum när du lägger till huvudmixen för att säkerställa att den fullständiga kinetiska profilen erhålls. Täta brunnarna med en tydlig skylt lim att förhindra avdunstning och sedan placera assay plattan i en spektrofotometer vid 26 ° C.
- Inkubera cellfria reaktionerna för 3−6 h medan övervakas de lämpliga fluorescerande excitation/utsläpp våglängderna motsvarar uttryckta proteinet. Till exempel övervaka på Ex / Em = 485 nm/528 nm för sfGFP.
-
Cellfria proteinuttryck med mRNA-mall
- Tina mRNA-mall som bereddes i steg 3.5.2 på RT och plats på is.
- Utför steg 4.1.1 till 4.1.6 som tidigare angetts för linjär eller plasmid DNA mall med tabell 4 för att förbereda en alternativa cellfria reaktion master mix för mRNA mall.
5. kalibrering av V. natriegens Cell-free reaktioner med sfGFP
Obs: Detta avsnitt är valfritt. Den optimala cellfria reaktion jonkoncentration kan variera något för tillredningen råa extrakt baserat på de villkor som används för cellen lysis. Överväga att utföra valfria cellfria reaktion ion kalibrering protokollet beskrivs nedan med sfGFP om reaktion avkastning är betydligt lägre än väntat (koncentrationer < 1,0 μg/mL).
- Förbereda Mg2 + och K+ ion kalibreringslösningar som anges i tabell 5 i sterilt DI vatten från 100 mM Mg-glutamat och 2.000 mM K-glutamat bestånd bereddes i steg 3.1.1. Placera kalibreringslösningar på is tills det behövs.
-
Efter kalibrering karta i tabell 6, Pipettera 1 μL av Mg-glutamat och 2 μL av K-glutamat ion kalibreringslösningar i lämpliga brunnar i en plattan med 384 brunnar i PCR.
- Utförs av det här steget är som följer: pipett Mg-glutamat ion kalibreringslösningen till botten av varje väl följt av K-glutamat ion kalibreringslösningen på sidan av väl utan att vidröra vätskan redan finns i brunnarna.
- Täta brunnarna genom att placera ett lim ovanpå plattan att förhindra avdunstning medan du förbereder kalibrering cellfria reaktion huvudmixen. Knacka försiktigt på 384-väl plattan för att blanda Mg - och K-glutamat kalibreringslösningarna.
Obs: En repeater pipett rekommenderas för att slutföra detta steg snabbt och reproducibly.
- Förbereda kalibrering cellfria reaktion huvudmixen som anges i tabell 5 med T7-pJL1-sfGFP plasmid DNA mall i en 2 mL tub. Lägger till varje komponent i följande ordning i huvudmixen: aminosyran huvudmixen, energi lösning master mix, T7-pJL1-sfGFP DNA-mall, PEG-8000, T7 RNA-polymeras och RNase inhibitor. Knacka försiktigt röret att blanda efter varje komponent dessutom.
Obs: Lägg inte till Mg2 + eller K+ för kalibrering cellfria huvudmixen. - Ta bort limmet från plattan. Pipettera försiktigt 7 μL av kalibrering cellfria reaktion huvudmixen vidare till sidorna av brunnarna utan att vidröra blandade ion kalibreringslösningen redan finns i brunnarna. Återförslut brunnarna med limmet och tryck försiktigt på 384-väl PCR-plattan för att blanda cellfria huvudmixen med ion kalibreringslösningen.
Obs: En repeater pipett rekommenderas för att slutföra detta steg snabbt och reproducibly. - Kort Centrifugera det platta 1000 x g för 10 s till pool oblandade vätska som kan ha fastnat på sidorna av brunnarna. Placera plattan med 384 brunnar i en termocykler inställd på 26 ° C med uppvärmd lock vid 105 ° C.
- Inkubera cellfria reaktionerna för 3 h. Efter inkubation, överföra innehållet i varje brunn till en svart 384-väl assay tallrik med glas botten med en flerkanalig pipett och läsa fluorescensen av sfGFP på Ex / Em = 485 nm/528 nm med en spektrofotometer för att bestämma kombinationen ion koncentration som ger den högsta mängden protein.
Representative Results
Protokollet beskrivs för produktion av proteiner med V. natriegens cellfria uttryck systemet kan köras i 1−2 dagar av en enskild användare, start från inokulering av kultur till protein för efterföljande program. Beredning av rå cell extrakt och master mix bestånd omfatta en betydande del av denna tid; men när förberett, de flesta bulk reagenser kan vara lagrade lång sikt (tabell 7) och används som behövs, förkorta tiden behövs för att slutföra protokollet.
Uttryck systemet beskrivs används bäst med plasmid DNA mall eller mRNA som genereras av in vitro-transkription reaktioner. Medan linjära DNA kan också användas som mall för produktion av proteiner, ger det betydligt lägre mängd protein. Till exempel på optimala reaktioner villkor vid 26 °C, kan en enda 10 μL cellfria reaktion producera > 260 μg/mL sfGFP i 3 timmar med 0.3 pmol av plasmid DNA mall eller en jämförbar > 125 μg/mL sfGFP med 14 pmol av mRNA avskrift (figur 5A B). Dock kommer att 0.3 pmol linjära DNA producera betydligt mindre protein (< 20 μg/mL). För varje Malltyp av kommer majoriteten av protein att produceras inom 1−1.5 h; Det rekommenderas dock att reaktion körs i minst 3 timmar. Cellfria reaktion koncentrationer av sfGFP bestämdes via linjär regression med en renad sfGFP standardkurva mäta fluorescens vid Ex / Em = 485 nm/528 nm.
Avkastningen av proteinproduktionen påverkas signifikant av koncentrationen av kalium och magnesium joner (K+ och Mg2 +, respektive). Optimerade villkor konstaterades det att den optimala Mg2 + och K+ jonkoncentrationer är 3,5 mM och 80 mM, respektive (figur 6A, B). Avvikelser från de optimala jonkoncentrationer kan resultera i en minskad kapacitet att producera protein med märkbar avkastning-systemet cellfria uttryck. Ytterligare kalibrering kan behövas om reaktion avkastningen är betydligt lägre än förväntat. Ett valfritt protokoll för ion kalibrering beskrivs i avsnitt 5. Detta möjliggör viss flexibilitet kompensera för råolja cell extrakt variabilitet som uppkommit från enskild cell lysis utrustning och förhållanden.
Figur 1: en närbild av innehavaren av bägaren och röret på ultraljudsbehandling plattformen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ultraljudsbehandling utrustning setup för beredning av rå cell extrahera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: en vy av pelleten efter ultraljudsbehandling och centrifugering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Flash frysning dopp för extrakt lagring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa resultat för V. natriegens cellfria proteinsyntes med olika malltyperna. (A) slutpunkt haltbestämning av sfGFP produktion med equimolar koncentrationer av plasmid och linjära DNA-mall (0.3 pmol) samt ökande koncentrationer av mRNA mall. Cell-fri sfGFP koncentrationen bestämdes med hjälp av en standardkurva av renat sfGFP uppmätta på Ex / Em = 485 nm/528 nm efter 180 minuters inkubation vid 26 ° C vid optimal reaktion villkor i 10 μl volymer. (B) Kinetic haltbestämning av sfGFP produktion med equimolar koncentrationer av plasmid och linjära DNA mall samt ökande koncentrationer av mRNA mall. sfGFP mätningar togs var 3 minuter på Ex / EM = 485 nm/528 nm över 180 minuter av total inkubationstiden på optimal reaktion villkor i 10 μl volymer. För både endpoint och kinetiska analyser var prover Tom korrigerat med cellfria reaktioner kompletteras med alla komponenter utom mall. Medelvärde och standardavvikelser visas (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativa resultat för Jon koncentration kalibrering. (A) V. natriegens cellfria reaktioner var kompletterad med ökande koncentrationer av Mg2 + och inkuberas vid 26 ° C 180 minuter i 10 μL reaktioner. Den totala koncentrationen av K+ var 160 mM för alla Mg2 + koncentrationer. Cell-fri sfGFP koncentrationen bestämdes med hjälp av en standardkurva av renat sfGFP uppmätta på Ex / Em = 485 nm/528 nm. (B) V. natriegens cellfria reaktioner var kompletterad med ökande koncentrationer av K+ och inkuberas vid 26 ° C för 180 min i 10 μL reaktioner. Den totala koncentrationen av Mg2 + var 3,5 mM för alla K+ koncentrationer. För båda kalibreringar var prover Tom korrigerat med cellfria reaktioner kompletteras med alla komponenter utom mall. Medelvärde och standardavvikelser visas (n = 3). Denna siffra har ändrats från Wiegand et al.9. Omtryckt med tillåtelse från Wiegand, D.J., Lee, H.H., Ostrov, N., kyrka, G.M. om inrättande av en Cell-Free Vibrio natriegens uttryck systemet. ACS syntetisk biologi. 7 (10), 2475−2479 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tabell 1 a | Beredning av LB-V2 bakterietillväxt Media | ||
| Komponent | Kvantitet (g) | Slutlig koncentration (mM) | Slutlig volym (L) |
| LB buljong (Mjölnare) | 25 | 1 | |
| NaCl | 11,69 | 200 | |
| MgCl2 | 2.20 | 23,1 | |
| KCl | 0,31 | 4.2 | |
| Tabell 1 b | Beredning av S30A lyseringsbuffert | ||
| Komponent | Kvantitet (g) | Slutlig koncentration (mM) | Slutlig volym (L) |
| Tris lösning (pH 8,0) - 1 M (mL) * | 25 | 50 | 0,5 |
| Mg-glutamat | 2.72 | 14 | |
| K-glutamat | 6.10 | 60 | |
| Ditiotreitol (DTT) - 1 M (mL) * | 1 | 2 | |
Tabell 1: reagenser för framställning av 1 L LB-V2 bakteriell tillväxt medier och 0,5 L S30A cell lyseringsbuffert. Vänligen klicka här för att hämta den här filen i Excel.
| Beredning av 10 x energi lösning Master Mix | ||||
| Komponent | Beståndet koncentration (mM) | Slutlig koncentration (mM) | Kvantitet (µL) | Slutlig volym (µL) |
| HEPES-KOH pH 8 | 1750 | 500 | 1428.57 | 5000 |
| ATP | 100 | 15 | 750.00 | |
| GTP | 100 | 15 | 750.00 | |
| CTP | 100 | 9 | 450,00 | |
| UTP | 100 | 9 | 450,00 | |
| tRNA från E. coli MRE 600 (mg/mL) * | 100 | 2 | 100,00 | |
| Coenzym A hydrat | 200 | 2.6 | 65.00 | |
| NAD | 200 | 3.3 | 82,50 | |
| cAMP | 650 | 7.5 | 57.69 | |
| Folinsyra | 100 | 0,7 | 35.00 | |
| Spermidine | 1600 | 10 | 31.25 | |
| 3-PGA | 2000 | 300 | 750.00 | |
| Sterilt avjoniserat vatten | 49.99 | |||
| Beredning av 4 x aminosyra Master Mix | ||||
| Komponent | Beståndet koncentration (mM) | Slutlig koncentration (mM) | Kvantitet (µL) | Slutlig volym (µL) |
| ALA | 168 | 8 | 114,3 | 2400 |
| ARG | 168 | 8 | 114,3 | |
| ASN | 168 | 8 | 114,3 | |
| ASP | 168 | 8 | 114,3 | |
| GLN | 168 | 8 | 114,3 | |
| GLU | 168 | 8 | 114,3 | |
| GLY | 168 | 8 | 114,3 | |
| HANS | 168 | 8 | 114,3 | |
| IIE | 168 | 8 | 114,3 | |
| LYS | 168 | 8 | 114,3 | |
| TRÄFFADE | 168 | 8 | 114,3 | |
| PHE | 168 | 8 | 114,3 | |
| PRO | 168 | 8 | 114,3 | |
| SER | 168 | 8 | 114,3 | |
| THR | 168 | 8 | 114,3 | |
| VAL | 168 | 8 | 114,3 | |
| TRP | 168 | 8 | 114,3 | |
| TYR | 168 | 8 | 114,3 | |
| LEU | 140 | 8 | 137,1 | |
| CYS | 168 | 8 | 114,3 | |
| Sterilt avjoniserat vatten | 91,4 | |||
Tabell 2: Reagenser för beredning av 5 mL 10 x energilösning master mix och 2,4 mL av 4 x aminosyra huvudmixen. Vänligen klicka här för att hämta den här filen i Excel.
| T7 RNA-polymeras i Vitro transkription reaktioner | ||||
| Komponent | Lager (mM) | Slutlig koncentration (mM) | Kvantitet (µL) 1 x reaktion | Kvantitet (µL) 50 x reaktioner |
| 10 x RNAPol reaktion buffert | 1,00 | 50 | ||
| ATP | 100 | 0,5 | 0,10 | 5 |
| GTP | 100 | 0,5 | 0,10 | 5 |
| CTP | 100 | 0,5 | 0,10 | 5 |
| UTP | 100 | 0,5 | 0,10 | 5 |
| DNA-mall (ng/µL) * | 1000 | 500 | 0,50 | 25 |
| T7 RNA-polymeras | 200 | 2.6 | 2,00 | 100 |
| RNase Inhibitor, murin | 200 | 3.3 | 0,50 | 25 |
| Sterilt avjoniserat vatten | 15,60 | 780 | ||
| Reaktionsvolym (µL): | 20 | |||
Tabell 3: In vitro-transkription komponenter för mRNA generation. Vänligen klicka här för att hämta den här filen i Excel.
| Cell-free reaktion Master Mix | ||||
| Komponent | Beståndet koncentration (mM) | Slutlig koncentration (mM) | Kvantitet (µL) 1 x reaktion | Kvantitet (µL) 50 x reaktioner |
| Extrakt (%) * | 25 | 2,50 | 125.00 | |
| Mg-glutamat | 100 | 3.5 | 0,35 | 17,50 |
| K-glutamat | 2000 | 80 | 0,40 | 20.00 |
| 4 x aminosyra Master Mix | 8.0 | 2 | 2,50 | 125.00 |
| 10 x energi lösning Master Mix | 1,00 | 50.00 | ||
| Plasmid DNA (ng/µL) * | 1000 | 500 | 0,50 | 25.00 |
| 50% PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0,40 | 20.00 |
| T7 RNA-polymeras | 1,00 | 50.00 | ||
| RNase Inhibitor, murin | 0,10 | 5,00 | ||
| Sterilt avjoniserat vatten | 1,25 | 62,50 | ||
| Reaktionsvolym (µL): | 10 | |||
| Alternativa cellfria reaktion Master Mix för mRNA mall | ||||
| Komponent | Beståndet koncentration (mM) | Slutlig koncentration (mM) | Kvantitet (µL) 1 x reaktion | Kvantitet (µL) 50 x reaktioner |
| Extrakt (%) * | 25 | 2,50 | 125.00 | |
| Mg-glutamat | 100 | 3.5 | 0,35 | 17,50 |
| K-glutamat | 2000 | 80 | 0,40 | 20.00 |
| 4 x aminosyra Master Mix | 8.0 | 2 | 2,50 | 125.00 |
| 10 x energi lösning Master Mix | 1,00 | 50.00 | ||
| mRNA mall (ng/µL) * | 2000 | 4000 | 2,00 | 100,00 |
| 50% PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0,40 | 20.00 |
| RNase Inhibitor, murin | 0,10 | 5,00 | ||
| Sterilt avjoniserat vatten | 0,75 | 37,50 | ||
| Reaktionsvolym (µL): | 10 | |||
Tabell 4: Komponenter i optimerad V. natriegens cellfria reaktion master mix för mRNA och DNA mallen. Vänligen klicka här för att hämta den här filen i Excel.
| Mg 2 + Kalibrering | Kvantitet (µL) 1 x reaktion | Kvantitet (µL) 1 x reaktion | Kvantitet (µL) 100 x reaktioner | Kvantitet (µL) 100 x reaktioner | |
| Final (mM) | Beståndet | 100 mM Mg-Glu | Dihs 2 0 | 100 mM Mg-Glu | Avjoniserat H2O |
| 2.5 | 0 | 0.00 | 1,00 | 0 | 100 |
| 3.5 | 1 | 0,10 | 0,90 | 10 | 90 |
| 4.5 | 2 | 0,20 | 0,80 | 20 | 80 |
| 5.5 | 3 | 0,30 | 0,70 | 30 | 70 |
| Reaktionsvolym (µL): | 10 | ||||
| Karlsson + Kalibrering | Kvantitet (µL) 1 x reaktion | Kvantitet (µL) 1 x reaktion | Kvantitet (µL) 100 x reaktioner | Kvantitet (µL) 100 x reaktioner | |
| Final (mM) | Beståndet | 2000 mM K-Glu | Dihs 2 0 | 2000 mM K-Glu | Avjoniserat H2O |
| 40 | 30 | 0,15 | 1,85 | 12 | 148 |
| 80 | 70 | 0,35 | 1,65 | 28 | 132 |
| 160 | 150 | 0,75 | 1,25 | 60 | 100 |
| 320 | 310 | 1,55 | 0,45 | 124 | 36 |
| Reaktionsvolym (µL): | 10 | ||||
| Ion kalibrering cellfria reaktion Master Mix | |||||
| Komponent | Beståndet koncentration (mM) | Slutlig koncentration (mM) | Kvantitet (µL) 1 x reaktion | Kvantitet (µL) 50 x reaktioner | |
| Extrakt (%) * | 25 | 2,50 | 125.00 | ||
| Mg-glutamat | Variabel | Variabel | 1,00 | 50.00 | |
| K-glutamat | Variabel | Variabel | 2,00 | 100,00 | |
| 4 x aminosyra Master Mix | 8.0 | 2 | 2,50 | 125.00 | |
| 10 x energi lösning Master Mix | 1,00 | 50.00 | |||
| Plasmid DNA (ng/µL) * | 1000 | 250 | 0,25 | 12,50 | |
| 50% PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0,40 | 20.00 | |
| T7 RNA-polymeras | 1,00 | 50.00 | |||
| RNase Inhibitor, murin | 0,10 | 5,00 | |||
| Sterilt avjoniserat vatten | 0.00 | 0.00 | |||
| Reaktionsvolym (µL): | 10 | ||||
Tabell 5: Ion koncentration kalibrering master mixar. Vänligen klicka här för att hämta den här filen i Excel.
| CF Ion kalibrering karta | 40 mM K+ | 80 mM K+ | 160 mM K+ | 320 mM K+ | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| 2,5 mM Mg2 + | A | ||||||||||||
| 3,5 mM Mg2 + | B | ||||||||||||
| 4.5 mM Mg2 + | C | ||||||||||||
| 5.5 mM Mg2 + | D | ||||||||||||
Tabell 6: Ion kalibrering karta. Vänligen klicka här för att hämta den här filen i Excel.
| Lagring och hylla liv av CF-komponenter | ||
| Komponent | Lagringsplats | Hållbarhet |
| Sterila LB-V2 tillväxt medier | 4 ° C | 3-6 månader |
| V. natriegens rå Cell extrahera | -80 ° C | 1-3 veckor |
| 100 mM Mg-glutamat | Rumstemp | 6 månader |
| 2000 mM K-glutamat | Rumstemp | 6 månader |
| 50% PEG-8000 | Rumstemp | 6 månader |
| 10 x energi lösning Master Mix | -80 ° C | 3-6 månader |
| 4 x aminosyra Master Mix | -80 ° C | 3-6 månader |
| Plasmid/linjära DNA-mall | -20 ° C | 6-12 månader |
| mRNA mall | -80 ° C | 3-4 veckor |
Tabell 7: Cell-fri lagring och hållbarhetstid liv. Vänligen klicka här för att hämta den här filen i Excel.
Discussion
Detta protokoll har optimerats för vildtyp V. natriegens och bakterietillväxt media består av LB kompletteras med V2 salter (Tabell för material). Andra stammar av V. natriegens kan vara likaså odlas för att generera rå cell extrakt för cellfria reaktioner; deras användning kräver dock ytterligare optimering av detta protokoll. Dessutom har detta cellfria protein uttryck system optimerats med 3-phosphoglyceric syra (3-PGA) som den primära energikällan för regenerering. Andra energikällor för regenerering kan användas; optimering av reagenser och kalibrering kommer dock sannolikt att behöva få hög avkastning protein uttryck10,11.
Särskild uppmärksamhet till flera kritiska steg i detta protokoll garanterar maximal extrakt produktivitet för högavkastande cellfria proteinproduktion. Först, rå cell extrakt måste beredas från V. natriegens cellkulturer skördas i en mitten-exponentiell fas av tillväxt. protein avkastning är svårast när kulturer når en OD600 = 1,0 ± 0,2. Även cellfria proteinproduktion är möjligt från celler skördas vid en rad optiska densiteter, har vi tidigare funnit att celler skördas i tillståndet exponentiell tillväxt ger betydligt mer protein9. De observerade effekterna av optisk densitet på råolja cell extrakt prestanda överensstämmer med de som rapporterats för andra cellfria uttryck system härrör från celler odlas i batch kultur villkor1. Eftersom V. natriegens växer i snabb takt, är det viktigt att noga övervaka kulturers optiska densiteter. I allmänhet, förväntas det att V. natriegens kulturer reproducibly bör nå en OD600 1.0 inom 1−1.5 h använder detta protokoll. dock snopen enskilda tillväxt villkor såsom användning av kontra icke-förbryllad kolvar, som påverkar luftning, eller luft kontra vatten ruvningen, som påverkar den hastighet och stabilitet av inkubering temperatur, ändra tillväxt tid. Dessutom är det generellt rekommenderas att kultur minst 250 mL av V. natriegens i en 1 L förbryllad kolv att säkerställa en stor cellpelleten vid skörd för lätt manipulation och överföring. Detta förbättrar avsevärt framgången av rå cell extrahera förberedelse samt ökar den totala volymen av extrakt produceras från en pellet. När du använder mindre skala förberedelse, kan odlingsbetingelser och reagenser justeras på lämpligt sätt. För storskaliga jäsning, kan ytterligare optimering av odlingsbetingelser behövas. Slutligen, för att säkerställa hög proteinhalt avkastning, är det kritiskt att cell pellets behandlas omedelbart efter skörd, eller inom 1−2 dagar lagra vid-80 ° C.
Ordentlig Lys av cellpelleten av puls ultraljudsbehandling är avgörande för framgången av cellfria proteinuttryck och är ofta den svåraste aspekten av detta protokoll för nya användare. Vanligtvis, en väl lyserat pellet kommer att ge en betydande mängd flytande extrakt som är fri från skräp. Extraktet bör vara något trögflytande men kan vara enkelt pipetteras när alikvotering inlagrats rör innan blixten fryser i flytande kväve. Figur 3 illustrerar en representation av en väl lyserat pellet (figur 3A) i jämförelse med en dåligt lyserat pellet (figur 3B) efter det inlägget lysis centrifugeringssteget. En viktig indikation på komplett cellys är en rå cell extrahera totalprotein koncentration > 20 mg / mL som med en totalt protein analysmetod (steg 2.13). Överdriven ultraljudsbehandling eller överdriven uppvärmning av rå cell extraktet skadar det cellulära maskineriet, som inte kan bestämmas utan att utföra en cellfria reaktion. Därför är det mycket fördelaktigt att testa extrakt effektivitet med en kontroll reaktion innan ägna betydande tid och ansträngning till nedströms protein uttryck applikationer. Medan ytterligare optimering kan behövas för olika ultraljudsbehandling utrustning, har puls ultraljudsbehandling stegen som beskrivs varit mycket reproducerbara i våra händer.
Användning av linjära DNA-mall som härrör från PCR-amplifiering, restriktionsenzym sammanfattad eller kommersiella gen syntes kan avsevärt öka kapaciteten för produktion av högt dataflöde och snabba proteiner i cellen-fria uttryck system24. Medan proteinproduktion från PCR-förstärkta linjär mall har påvisats, är avkastningen av dessa reaktioner cirka 13.5-fold lägre jämfört med reaktioner med hjälp av plasmid DNA mall på equimolar nyckeltal9. Detta beror främst på instabiliteten i den linjära DNA-mallen som sannolikt försämras av endogena nukleaser närvarande i V. natriegens rå cell extrakt. Samtidigt lambda phage protein GamS har använts tidigare att skydda linjära DNA mall24,25, konstaterades vara oförenliga med V. natriegens extrakt9. Dessutom, medan öka koncentrationen av linjära DNA-mall kan möjliggöra en högre protein avkastning, kan dess snabb nedbrytning i rå cell extrakt fortfarande ett stort problem.
En lösning till att övervinna linjära DNA mall nedbrytning kan vara att komplettera cellfria reaktioner med mRNA mallen genereras från in vitro-transkription av linjära DNA. Däremot, användningen av en RNase inhibitor erbjuder betydande skydd mot mRNA avskrift nedbrytningen och märkbar protein avkastning kan erhållas i formatet 10 μL cellfria reaktion (figur 5AB). Kloning av linjära DNA i ett cirkulär mall genom TA ligatur, kan TOPO kloning, Golden Gate församlingen eller andra rekombination metoder användas till att kringgå mall nedbrytning. Dock ytterligare blir strategier för hämning av nuclease aktivitet nödvändigt för effektiv proteinuttryck med linjära DNA-mall.
Hittills har har flera olika metoder föreslagits för beredning av råa extrakt för cellfria protein uttryck9,10,11,26. Vid utvecklingen av detta protokoll har försökt vi maximera användaren tillgänglighet, minska totalkostnaden och minimera tidskrävande steg. Exempelvis en proteinrik avkastning uppnås med hjälp av en enkel tvåstegsprocess ultraljudsbehandling-centrifugering, och kräver inte cell Homogenisatorer, långa dialys steg eller avrinning reaktion. Det är enkelt att köra i en kort tidsperiod och kräver inte hög laboratorium kompetens. Således kan det hjälpa underlätta cellfria uttryck som en standard för translationell akademisk forskning och industriell processdesign.
Detta protokoll expanderar toolkit tillgänglig för utredning och nyttan av V. natriegens, en icke-modell organism med unika biologiska egenskaper. Högre protein avkastning kan uppnås genom att anställa semi - eller fullt-kontinuerlig cellfria reaktioner, att möjliggöra energi regenerering, skärande av aminosyror, och avlägsnande av slaggprodukter3,5,27. Dessutom konstruktion av vildtyp V. natriegens att producera DNAS - eller RNAse-brist stammar, borttagning av skadliga och konkurrerande metaboliska vägar och uttryck för ytterligare tRNAs kan kraftigt öka produktionen av proteiner i Detta system28,29. Som vi riva upp biologin bakom sin snabba tillväxt, kan vidareutveckling av V. natriegens cellfria system påskynda bioproduktion funktioner och aktivera robust uttryck för terapeutiska peptider, små molekyler och syntetiska material.
Disclosures
DJW, nej, och GMC har lämnat in ett patent med anknytning till detta arbete.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 och Institutionen för energi DE-FG02-02ER63445. Författarna vill tacka Dr Richard Kohman, Dr. Jenny Tam och Dr. Edgar Goluch för goda råd om att bygga avsnittet protokollet av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
| 2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| 384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
| 384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
| 50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
| 96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
| Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
| Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
| Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
| Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
| Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
| Dewar Flask - 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
| DL-Dithiothreitol solution - 1 M | Sigma | 42816 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
| Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
| Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
| Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip | Qsonica | 4422 | |
| RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
| RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
| Tris Solution (pH 8.0) - 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
| tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
| Uridine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |
References
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Schoborg, J. A., et al. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Henrich, E., Hein, C., Dötsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
- Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. Establishing a high yielding streptomyces‐based cell‐free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
- Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).
- Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements. Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).
- Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements. Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).
- Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System. ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).
- Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).
- Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens. Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).
- Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).
- Eagon, R. G. Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes. Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).
- Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology. Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).
- Lee, H. H., et al. Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse. bioRxiv. , 058487 (2016).
- Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. Recombineering in Vibrio natriegens. bioRxiv. , 130088 (2017).
- Schleicher, L., et al. Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes. Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).
- Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E., Carmona, M. Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory. Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).
- Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).
- Hoffart, E., et al. High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology. Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).
- Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis. Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation. Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).
- Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors. Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).
- Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
