Summary
Sistemi di espressione senza cellula sono strumenti potenti e convenienti per la sintesi di alto-rendimento e screening di proteine importanti. Qui, descriviamo la preparazione del sistema di espressione della proteina senza cellula utilizzando Vibrio natriegens per la produzione di proteina rapida utilizzando il DNA del plasmide, DNA lineare e modello del mRNA.
Abstract
Il batterio marino Vibrio natriegens ha raccolto una notevole attenzione come un host microbico emergente per biotecnologia grazie al suo tasso di crescita rapida. Un protocollo generale è descritto per la preparazione di V. natriegens estratti cellulari grezzo utilizzando attrezzature di laboratorio comuni. Questo protocollo di rendimento elevato è stato specificamente ottimizzato per l'accessibilità degli utenti e la riduzione dei costi. Sintesi proteica senza cellula (CFPS) può essere effettuata nelle reazioni di piccola scala 10 μL batch in formato 96 o 384 pozzetti e riproducibile produce concentrazioni elevate di cartella super μg/mL di > 260 GFP (sfGFP) all'interno di 3 h. nel complesso, cella di greggio estratto preparazione e CFPS può avvenire in giorni pieni di 1 − 2 da un singolo utente. Questo protocollo è facilmente integrabile in proteina sintesi gasdotti esistenti per facilitare gli avanzamenti nella bio-produzione e applicazioni della biologia sintetica.
Introduction
Sintesi proteica senza cellula è un metodo versatile ed economico per l'espressione di preziose proteine o peptidi1,2,3,4. Storicamente, la sintesi delle proteine senza cellula è stata eseguita utilizzando sistemi di espressione di Escherichia coli ; Tuttavia, c'è stato un aumento recente utilizzando organismi alternativi, non modello con nuove proprietà come telaio per espressione senza cellula5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismi con profili metabolici unici sono candidati principali come alternative ai sistemi senza cellula di Escherichia coli . Ad esempio, il batterio marino che Vibrio natriegens è la più veloce crescita di tutti gli organismi noti con un osservato raddoppiando il tempo di meno di 10 min13. Questo ha raccolto V. natriegens considerevole attenzione come un host microbico emergente per ricerca e biotecnologie14,15,16,17,18. Dato che il tasso di crescita rapida di V. natriegens è stato collegato agli alti tassi di sintesi delle proteine ed efficienza metabolica19,20,21, sfruttando il suo macchinario cellulare per cellulare-free sintesi possono ampliare in modo significativo il toolkit per la produzione di proteine rapida e high throughput screening.
Recentemente, un cellulare-free V. natriegens sistema di espressione è stato dimostrato che è in grado di produrre super cartella GFP (sfGFP) alle concentrazioni di > 260 μg/mL in 3 h con un promotore di T79. L'obiettivo generale di sviluppare questo metodo era di fornire agli utenti un sistema di espressione di proteine senza cellula altamente accessibile, conveniente, riproducibili e ad alto rendimento che possa essere preparato con comuni attrezzature di laboratorio in un breve lasso di tempo. Questo protocollo utilizza 1L culture in boccette di agitare, lisi cellulare di sonicazione impulsi e reazioni di batch su piccola scala in formato 96 o 384 pozzetti per massimizzare la velocità effettiva di screening e parallelizzazione. Un'espressione di proteina prolungati è reso possibile dal completamento di 3-fosfoglicerato (3-PGA) come un fonte di energia8,22,23. Dopo aver completato con successo questo protocollo, un utente avrà la possibilità di esprimere una proteina voluta o set di proteine in un formato privo di cella utilizzando V. natriegens greggio Cella estrarre.
A partire da uno stock di glicerolo, V. natriegens estratti cellulari greggio sono preparati da cellule raccolte alle densità ottica a 600 nm (OD600) di 1.0. Una cultura di 1L produrrà circa 2−3 mL dell'estratto, che è sufficiente per più di 800 senza cellula reazioni al 25% estratti grezzi della cellula. Proteine possono essere espresso utilizzando il DNA del plasmide, DNA lineare o modello del mRNA; degradazione di modello lineare del DNA dall'azione delle nucleasi endogene rimane tuttavia un grave inconveniente, quando si utilizza il tipo selvaggio V. natriegens cell-free sistema9. A partire da V. natriegens culture, proteina utilizzabile per applicazioni a valle può avvenire da un singolo utente in 1 − 2 giorni pieni.
Protocol
1. preparazione del V. natriegens grezzi estratti cellulari – coltura batterica
- Preparare V. natriegens crescita batterica supporti LB-V2 secondo la tabella 1. Sterilizzare in autoclave i media di crescita. Consentire media per raggiungere a temperatura ambiente (TA). Conservare i supporti in eccesso a TA.
Attenzione: Indossare un equipaggiamento adeguato di protezione personale (PPE) e consultare le istruzioni specifiche di laboratorio durante il funzionamento di un autoclave. - Usare uno stock di glicerolo di tipo selvaggio V. natriegens per inoculare 3 mL di terreno LB-V2. Crescere una notte a 30 ° C mentre si stringono a 225 giri/min.
- Lavare 1 mL della coltura durante la notte per centrifugazione a 10.600 x g su una centrifuga da banco per 1 min. aspirare il supernatante senza disturbare il pellet risultante e risospendere in 1 mL di fresca LB-V2 media.
- In un'autoclave 4 L sconcertato matraccio di Erlenmeyer con telo sterile, aggiungere 1 L di terreni di coltura fresco LB-V2. Inoculare con 1 mL di lavato cultura durante la notte (1:1, 000 rapporto di diluizione). Far crescere la cultura a 30 ° C mentre si stringono a 225 giri/min.
Nota: V. natriegens culture possono essere scalate verso l'alto o verso il basso mantenendo il rapporto di diluizione di 1:1,000. Ad esempio, di aggiungere 250 μL di cultura lavato durante la notte a 250 mL di mezzi di sviluppo LB-V2 fresco in un 2 L sconcertato matraccio di Erlenmeyer con telo sterile. - Monitorare OD600 utilizzando uno spettrofotometro della cultura. Quando cultura raggiunge OD600 = 1,0 ± 0,2, cultura raccolto mediante centrifugazione a 3.500 x g per 20 min a 4 ° C. Pellet di posto sul ghiaccio.
Nota: V. natriegens cresce rapidamente, quindi è necessario un monitoraggio stretto della cultura. Crescita a OD600 = 1.0 dovrebbe prendere circa 1.5−2 h con il rapporto di diluizione di 1:1,000. - Aspirare il supernatante e memorizzare immediatamente il pellet batterico risultante a-80 ° C o procedere direttamente alla cella Lisi descritto nella sezione 2.
Nota: Questo passaggio è un buon punto di sosta; Tuttavia, è consigliabile che il pellet trattati immediatamente o entro 1 − 2 giorni per ottenere i migliori risultati.
2. preparazione del V. natriegens grezzi estratti cellulari – lisi cellulare
- Preparare il tampone di lisi S30 come da tabella 1 in acqua deionizzata sterile di (DI) e regolare il pH a 7,7 utilizzando acido acetico glaciale.
Attenzione: Acido acetico glaciale deve essere maneggiato con adeguata PPE durante la regolazione del pH. - Buffer di lisi S30 cool a circa 4 ° C in un frigorifero o sul ghiaccio prima di iniziare la procedura di lisi delle cellule.
Nota: Per un rapido raffreddamento, lysis buffer può essere collocato a-20 ° C. Non permettere al tampone di congelare. - Mettere palline delle cellule sul ghiaccio per 10−20 min o fino a quando completamente sciolto. Risospendere il pellet tutti derivanti dalla stessa coltura 1L utilizzando 10 mL di tampone di lisi S30 freddo, quindi trasferire la sospensione per un tubo da 50 mL. Se il pellet non sono congelati in freezer a-80 ° C al punto 1.6, procedere direttamente alla risospensione.
Nota: Aumentare il volume di tampone di lisi S30 usato per inizialmente risospendere il pellet come necessario. - Sospensione di centrifuga a 3.500 x g per 10 min a 4 ° C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet. Lavare la pallina una seconda volta utilizzando 10 mL di tampone di lisi S30 freddo. Pellet di posto sul ghiaccio.
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In una stanza fredda, aggiungere 500 μL di tampone di lisi S30 freddo al pellet nel tubo 50 mL. Utilizzando un puntale di wide-bore, risospendere il pellet e trasferire con cautela la sospensione di pellet intero in una provetta da 2 mL.
Nota: Se un ampio foro pipetta non è disponibile, utilizzare un paio di forbici per tagliare l'estremità della punta di una pipetta da 1 mL per aumentare il foro per il trasferimento di pellet.- Trasferire quanto più pellet come possibile senza aumentare significativamente il volume; Tuttavia, il pellet dovrebbe essere risospesi in abbastanza liquido per essere sonicato, come indicato da una sospensione omogenea nella provetta da 2 mL. Non riempire eccessivamente il tubo di 2 mL. La sospensione non deve superare 1,5 mL; dividere in tubi multipli se necessario.
- Tenere il pellet cellulare sul ghiaccio e lavorare in una stanza fredda. Riempire un becher da 600 mL con ghiaccio e un supporto del tubo 2ml sopra il ghiaccio.
Nota: È utile posizionare il supporto tubo vicino al lato del bicchiere, così la sospensione della pallina sarà visibile nel ghiaccio per monitorare i progressi di sonicazione (Vedi Figura 1). - Vortice sospeso pellet in provetta da 2 mL brevemente per omogeneizzare le cellule, flick tubi per rimuovere eventuali cellule sul fondo del tappo e posizionare nel supporto per tubo con tappo aperto. Punta di sonicatore inferiore nella sospensione così che è appena sotto la superficie del liquido.
- Preparare il set-up di sonicazione come raffigurato in Figura 2 utilizzando un sonicatore e sonda con un diametro di punta di ⅛ pollici. Le seguenti impostazioni nel controllo sonicatore in ingresso: frequenza di 20 kHz e 50% ampiezza, impulsi il tempo: 10 s, tempo di impulso OFF: 60 s.
- Eseguire il protocollo di sonicazione impulsi per tre cicli. Se il volume totale della sospensione della pallina è > 500 μL, esegue il protocollo di sonicazione impulsi sei volte.
Nota: In genere, 3−6 impulsi sono sufficienti per lisare V. natriegens pellet; Ulteriori impulsi possono essere richiesti a seconda sonicatore. Durante la sonicazione, utilizzare la piattaforma di manopola di regolazione per spostare la sonda su e giù per lisare qualsiasi pellet che potrebbe avere depositato alla parte inferiore del tubo. Il tubo può essere rimosso dal titolare e brevemente agitati con vortex per ri-omogeneizzare la sospensione tra impulsi. Veda la discussione qui sotto per ottenere la consistenza desiderata di lisati mediante cellule.
Attenzione: Indossare protezioni acustiche adeguate quando è attivo il sonicatore. - Dopo sonicazione, cella greggio centrifuga estrarre a 16.000 x g per 30−45 min a 4 ° C o fino a quando lisato è libera di eventuali detriti cellulari come raffigurato in Figura 3.
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In una stanza fredda, aliquotare 50 μL di surnatanti risultanti in nuove provette 2 mL senza disturbare il pellet.
Nota: eventuali detriti che vengono trasferiti accidentalmente nelle provette 2 mL nuovo ridurrà drasticamente la capacità dell'estratto per alto rendimento della sintesi proteica.- Facoltativamente, mettere da parte 10 μL di cella estrarre per quantificazione della proteina post-Lisi in un separato 2 mL tubo (Vedi punto 2.13 qui sotto).
- Flash congelare gli estratti cellulari greggio inserendo tubi in un supporto del tubo con una stringa tuffantesi collegato come illustrato nella Figura 4. Immergere le provette in un Dewar contenente azoto liquido e mettere immediatamente in un congelatore a-80 ° C fino all'utilizzo.
Attenzione: Uso dei DPI appropriati per la gestione dell'azoto liquido compreso camice da laboratorio, occhiali di sicurezza, visiere, grembiule di criogeno e guanti. - Facoltativamente, quantificare la proteina totale della cella lysata utilizzando 10 μL impostata a parte passo 2.11.1 diluizione del campione 1: 100 in 1x tampone fosfato salino (PBS) e utilizzando qualsiasi test di quantificazione della proteina totale standard quali analisi di Bradford, acido bicinconinico dosaggio (BCA), ecc.
3. preparazione dei componenti di reazione Cell-free
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Componenti di reazione generale
- Preparare il lavoro delle scorte di Mg-glutammato e K-glutammato in provette da 50 mL con acqua distillata sterile alle concentrazioni di 100 mM e 2000 mM, rispettivamente.
- Preparare un brodo di lavoro del 50% (p/v) di polietilenglicole (PEG) -8000 con l'aggiunta di 100 mL di sterile DI acqua in un becher da 250 mL. Posto un piccolo agitatore magnetico nel becher. Pesare 50 g di PEG-8000 e aggiungere 100 mL di acqua nel becher.
- Porre il becher su un insieme di piastra stir riscaldata a 100 ° C e mescolare a 250 giri/min fino a PEG-8000 è in soluzione. Lasciare il composto liquido PEG-8000 si raffreddi prima di trasferire in provette da 50 mL.
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Mix master soluzione di energia
- Preparare una soluzione di 5 M di KOH aggiungendo 140 g di KOH pellet a 500 mL di acqua distillata sterile.
Attenzione: Preparare questa soluzione in una cappa chimica e indossare PPE per maneggiare basi forti. La soluzione diventerà calda quindi il tappo del flacone deve essere sciolto per impedire l'accumulo di pressione. Lasciare la soluzione KOH raggiungere RT prima di utilizzare. - Preparare un tampone HEPES-KOH 1750mm aggiungendo 20,85 g di HEPES per una bottiglia da 100 mL. Lentamente aggiungere dell'acqua distillata sterile fino a quando il volume raggiunge 40 mL. Bottiglia di vortice per sciogliere l'HEPES. Utilizzare la soluzione KOH 5m per aggiustare il pH a 8.0 e quindi portare il volume di soluzione a 50 mL.
Attenzione: KOH deve essere maneggiato con adeguata PPE durante la regolazione del pH. - Preparare i restanti 10 x componenti stock mix master energia alle concentrazioni indicate nella tabella 2 in acqua distillata sterile e posizionare ogni stock sul ghiaccio. Scongelare le scorte di ATP, GTP, CTP e UTP 100 mM al RT e posto sul ghiaccio.
Nota: Un thermomixer impostato a 37 ° C e 350 rpm può essere utilizzato per sciogliere i reagenti in soluzione se necessario. Non surriscaldare o lasciare reagenti il thermomixer per un periodo prolungato di tempo. - In una provetta da 15 mL, aggiungere ogni componente di mix master soluzione energetica in conformità all'ordine e il volume specificato nella tabella 2. Vortice la soluzione dopo l'aggiunta di ogni componente. Questo farà 5 mL di 10 x mix master soluzione di energia.
- Dividere i 10 x mix master di energia soluzione 200 aliquote del μL in provette da 2 mL. Flash congelare ogni aliquota come eseguita nel passaggio 2.12. Immediatamente metterli nel congelatore-80 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare una soluzione di 5 M di KOH aggiungendo 140 g di KOH pellet a 500 mL di acqua distillata sterile.
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Mix master dell'amminoacido
- Per preparare freschi 4 x mix master dell'amminoacido, iniziare lo scongelamento ogni stock di aminoacido a RT e posizionando ciascuno sul ghiaccio. Utilizzare un vortice e/o thermomixer impostato a 37 ° C e 350 giri/min per assicurare che tutte le scorte di aminoacidi sono completamente dissolto.
Nota: Cisteina non può sciogliere completamente; può aggiungersi al mix master dell'aminoacido come una sospensione. Non surriscaldare o lasciare reagenti il thermomixer per un periodo prolungato di tempo. - In una provetta da 15 mL, aggiungere i volume appropriato di aminoacidi a sterile DI acqua affinché la concentrazione finale di ciascuno è di 8 mM nel seguente ordine: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, suo, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU e CYS. Dopo l'aggiunta di ciascun amminoacido, vortice il Maestro mescolare la soluzione. I volumi elencati nella tabella 2 comporranno 2,4 mL di mix master dell'amminoacido.
- Dividere il 4 x mix master dell'aminoacido in 200 aliquote del μL in provette da 2 mL. Flash congelare ogni aliquota come eseguita nel passaggio 2.12. Inserire subito nel congelatore a-80 ° C fino all'utilizzo.
- Per preparare freschi 4 x mix master dell'amminoacido, iniziare lo scongelamento ogni stock di aminoacido a RT e posizionando ciascuno sul ghiaccio. Utilizzare un vortice e/o thermomixer impostato a 37 ° C e 350 giri/min per assicurare che tutte le scorte di aminoacidi sono completamente dissolto.
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Produzione di modello di DNA del plasmide reazione-pronto
Nota: Espressione della proteina senza cellula in questo sistema è stato ottimizzato utilizzando il vettore di espressione della proteina fluorescente verde (GFP) cartella super T7-pJL1-sfGFP (Tabella materiali). Si consiglia di utilizzare questo plasmide come un controllo per efficienza di reazione senza cellula e la spina dorsale di pJL1 per la clonazione e l'espressione di altre sequenze proteiche. Altri modelli di DNA del plasmide possono essere utilizzati; Tuttavia, è importante notare che la trascrizione è controllata da una sequenza del promotore T7 e la presenza di T7 RNA polimerasi. Un semplice protocollo per la produzione su larga scala di qualsiasi modello di DNA del plasmide da trasformato e. coli è descritto di seguito.- Purificare il vettore desiderato utilizzando un kit di purificazione del plasmide come da istruzioni del produttore (Tabella materiali).
Nota: Concentrando il modello di DNA del plasmide per quanto possibile è consigliabile per soddisfare i vincoli di volume stretto della reazione senza cellula. In generale, lo scopo di uno stock di lavoro 750−1500 ng/μL.
- Purificare il vettore desiderato utilizzando un kit di purificazione del plasmide come da istruzioni del produttore (Tabella materiali).
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Produzione di modello del mRNA di reazione-pronto
Nota: Questa sezione è facoltativa. Espressione della proteina è stato testato utilizzando mRNA modello generato da trascrizione in vitro del plasmide T7-pJL1-sfGFP dall'elencati T7 RNA polimerasi (Tabella materiali).- Preparare il modello del mRNA da plasmide DNA codifica per la proteina di interesse utilizzando i componenti di reazione di trascrizione in vitro nella tabella 3. Incubare le reazioni per 1h a 37 ° C in un termociclatore.
Nota: Si consiglia di eseguire 8−10x di queste reazioni in parallelo per generare abbastanza materiale. - Tutte le reazioni di trascrizione della piscina. Purificare utilizzando un kit di purificazione e concentratore di mRNA come da istruzioni del produttore (Tabella materiali). Eluire il modello del mRNA in acqua deionizzata sterile. Modello del mRNA di negozio a-80 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare il modello del mRNA da plasmide DNA codifica per la proteina di interesse utilizzando i componenti di reazione di trascrizione in vitro nella tabella 3. Incubare le reazioni per 1h a 37 ° C in un termociclatore.
4. esecuzione senza cellula proteina Eexpression reazioni utilizzando V. natriegens greggio estrarre
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Espressione della proteina senza cellula tramite plasmide o modelli di DNA lineari
- Rimuovere 10 x mix master soluzione di energia e 4x aminoacido mix master aliquote dal congelatore-80 ° C, scongelare a temperatura ambiente e metterli su ghiaccio. Rimuovere la T7 RNA polimerasi e RNasi inibitore stock dal congelatore a-20 ° C e metterli su ghiaccio. Scongelare la mascherina del DNA in RT e luogo sul ghiaccio.
- Preparare un mix di reazione senza cellula master come da tabella 4 aggiungendo ogni componente nel seguente ordine in una provetta 2 mL su ghiaccio: mix master dell'amminoacido, soluzione master mix energetico, Mg-glutammato, K-glutammato, mascherina del DNA, PEG-8000, T7 RNA polimerasi e RNasi inibitore. Spostare delicatamente a scatti la provetta dopo ogni aggiunta al mix master.
Nota: Se il modello lineare deve essere utilizzato per l'espressione della proteina senza cellula, aggiungere 5−10x produce più materiale rispetto al modello di plasmide di ottenere apprezzabili della proteina. - Rimuovere V. natriegens greggio lysate delle cellule preparata al punto 2.12 dal congelatori-80 ° C e posto sul ghiaccio per 10−20 min fino a che sciolto. Aggiungere il volume appropriato greggio Cella estrarre il mix master di reazione senza cellula come da tabella 4 e mescolare delicatamente sfogliando o su e giù il pipettaggio.
- Espressione della proteina senza cellula end-point utilizzando thermocycler
- Aggiungere 10 μL del mix master senza cellula reazione verso il basso di una piastra PCR a 96 o 384 pozzetti. Tra ogni trasferimento alla piastra PCR, mescolare il mix master, spostando delicatamente il tubo.
Nota: Mix master senza cellula reazione dovrebbe essere ben mescolato in ogni momento per massimizzare la riproducibilità di reazione e l'espressione della proteina senza cellula in tutti i campioni.
- Aggiungere 10 μL del mix master senza cellula reazione verso il basso di una piastra PCR a 96 o 384 pozzetti. Tra ogni trasferimento alla piastra PCR, mescolare il mix master, spostando delicatamente il tubo.
- Centrifugare brevemente la piastra a 1.000 x g per 10 s a qualsiasi mix master che potrebbe avere diventare bloccato sui lati dei pozzi della piscina. Sigillare i pozzetti con un adesivo di piastra per evitare l'evaporazione e quindi posizionare la piastra PCR in un termociclatore impostato a 26 ° C con un coperchio riscaldato a 105 ° C.
Nota: La distribuzione uniforme del calore e coperchio riscaldato di un termociclatore migliora notevolmente i rendimenti di espressione della proteina. - Incubare le reazioni senza cellula per un minimo di 3 h. Dopo l'incubazione, proteine espresse possono essere purificati, quantificati e utilizzati per i processi a valle.
Nota: Proteine espresse possono essere quantificati direttamente nella reazione senza cellula utilizzando un metodo di scelta dell'utente. Ad esempio, le proteine fluorescenti possono essere quantificate utilizzando una curva standard esterna o radioattività può essere misurato se si utilizza un aminoacido radioattivo nella reazione senza cellula. Spettroscopia UV-visibile o analisi proteina totale non sono generalmente raccomandate per misurare direttamente la produzione di proteine in reazioni senza cellula senza una purificazione iniziale. - In alternativa, monitorare la cinetica di espressione della proteina senza cellula utilizzando un lettore di piastra.
- Aggiungere 10 μL del mix master senza cellula reazione verso il basso di una piastra nera dosaggio 384 pozzetti con fondo di vetro trasparente. Tenere la piastra di test sul ghiaccio o lavorare in una stanza fredda, mentre aggiungendo il mix master per garantire che il profilo cinetico pieno è ottenuto. Sigillare i pozzetti con un adesivo trasparente piastra per evitare l'evaporazione e quindi posizionare la piastra di dosaggio in un lettore di piastra a 26 ° C.
- Incubare le reazioni senza cellula per 3−6 h monitorando le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione fluorescente appropriato corrispondente alla proteina espressa. Ad esempio, monitorare presso Ex / Em = 485 nm/528 nm per sfGFP.
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Espressione della proteina senza cellula utilizzando il modello del mRNA
- Modello del mRNA di disgelo preparata al punto 3.5.2 a RT e posto sul ghiaccio.
- Eseguire passaggi da 4.1.1 a 4.1.6 come precedentemente specificato per lineare o modello di DNA plasmidico utilizzando la tabella 4 per preparare un mix master alternativo senza cellula reazione modello del mRNA.
5. taratura di reazioni V. natriegens Cell-free con sfGFP
Nota: Questa sezione è facoltativa. La concentrazione di ioni di reazione ottimale senza cellula può variare leggermente per ogni preparazione di greggio estratto sulla base delle condizioni usate per lisi cellulare. È consigliabile eseguire opzionale senza cellula reazione dello ione protocollo di calibratura descritto di seguito utilizzando sfGFP se rese di reazione sono significativamente più bassa di quanto mi aspettassi (concentrazioni < 1,0 μg/mL).
- Preparare il Mg2 + e soluzioni di calibrazione dello ione K+ come specificato nella tabella 5 in acqua deionizzata sterile dal 100 mM Mg-glutammato e 2.000 mM K-glutammato scorte preparate al punto 3.1.1. Porre soluzioni di calibrazione su ghiaccio fino a quando necessario.
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Seguendo la mappa di calibrazione nella tabella 6, Pipettare 1 μL del Mg-glutammato e 2 μL delle soluzioni di taratura dello ione K-glutammato negli appositi pozzetti in una piastra PCR a 384 pozzetti.
- L'ordine delle operazioni di questo passaggio è il seguente: soluzione di taratura dello ione pipetta il Mg-glutammato nella parte inferiore di ciascuna ben seguita dalla soluzione di taratura dello ione K-glutammato sul lato del pozzo senza toccare il liquido già presente nei pozzetti.
- Sigillare i pozzetti inserendo un adesivo sopra la piastra per evitare l'evaporazione durante la preparazione il mix master di reazione senza cellula di calibrazione. Picchiettare delicatamente la piastra 384 pozzetti per mescolare le soluzioni di taratura di Mg e K-glutammato.
Nota: Una pipetta a ripetizione è altamente raccomandata per completare questo passaggio in modo riproducibile e rapidamente.
- Preparare il mix master di reazione senza cellula di calibrazione come specificato nella tabella 5 , utilizzando il modello di DNA del plasmide T7-pJL1-sfGFP in una provetta da 2 mL. Aggiungere il mix master ogni componente nel seguente ordine: mix master dell'amminoacido, soluzione master mix energetico, mascherina del DNA T7-pJL1-sfGFP, PEG-8000, T7 RNA polimerasi e inibitore della RNAsi. Spostare delicatamente a scatti il tubo di mescolare dopo ogni aggiunta di componente.
Nota: Non aggiungere Mg2 + o K+ per la calibrazione senza cellula mix master. - Rimuovere l'adesivo dalla piastra. Pipettare attentamente 7 μL la calibrazione senza cellula master della miscela di reazione verso i lati dei pozzi senza toccare la soluzione di taratura dello ione mista già presente nei pozzetti. Sigillare i pozzetti con l'adesivo e picchiettare delicatamente la piastra PCR a 384 pozzetti per mescolare la miscela senza cellula matrice con la soluzione di taratura dello ione.
Nota: Una pipetta a ripetizione è altamente raccomandata per completare questo passaggio in modo riproducibile e rapidamente. - Centrifugare brevemente la piastra 1.000 x g per 10 s a qualsiasi liquido non miscelato che potrebbe avere diventare bloccato sui lati dei pozzi della piscina. Posizionare la piastra 384 pozzetti in un termociclatore impostato a 26 ° C con un coperchio riscaldato a 105 ° C.
- Incubare le reazioni senza cellula per 3 h. Dopo l'incubazione, trasferire il contenuto di ogni pozzetto di una piastra nera dosaggio 384 pozzetti con fondo in vetro con una pipetta multicanale e leggere la fluorescenza di sfGFP presso Ex / Em = 485 nm/528 nm utilizzando un lettore di piastra per determinare la combinazione di concentrazione di ioni che produce la più alta quantità di proteine.
Representative Results
Il protocollo descritto per la produzione di proteine usando V. natriegens sistema di espressione senza cellula può essere eseguito in 1 − 2 giorni da un singolo utente, a partire dall'inoculazione della cultura alla proteina disponibile per applicazioni a valle. Preparazione di estratti cellulari grezza e le scorte di mix master costituiscono una porzione significativa di questo tempo; Tuttavia, una volta preparata, la maggior parte alla rinfusa i reagenti possono essere memorizzati a lungo termine (tabella 7) e utilizzato come necessario, accorciando il tempo necessario per completare il protocollo.
Il sistema di espressione descritto è più utilizzato con mascherina del DNA del plasmide o mRNA generato da reazioni di trascrizione in vitro. Mentre DNA lineare può essere utilizzato anche come modello per la produzione di proteine, produce quantità significativamente più bassi di proteina. Ad esempio, alle condizioni ottimali reazioni a 26 °C, una reazione senza cellula singola 10 μL può produrre > 260 μg/mL di sfGFP in 3 ore utilizzando 0,3 pmol templato di DNA del plasmide o un paragonabile > 125 μg/mL di sfGFP utilizzando 14 pmol di trascrizione di mRNA (Figura 5A B). Tuttavia, 0,3 pmol di DNA lineare produrrà significativamente meno proteine (< 20 μg/mL). Per ogni tipo di modello, la maggior parte della proteina sarà prodotta all'interno di 1−1.5 h; Tuttavia, è consigliabile che la reazione viene eseguito per un minimo di 3 ore. Le concentrazioni di reazione senza cellula di sfGFP sono state determinate tramite regressione lineare utilizzando una curva standard purificata sfGFP misurare fluorescenza alle Ex / Em = 485 nm/528 nm.
La resa di produzione della proteina è significativamente influenzata dalla concentrazione di ioni di magnesio e potassio (K+ e Mg2 +, rispettivamente). Sotto condizioni ottimizzate, è stato trovato che l'ottimale Mg2 + e concentrazioni di ioni K+ saranno 3,5 mM e 80 mM, rispettivamente (Figura 6A, B). Deviazioni dalle concentrazioni ottimali dello ione possono provocare una capacità in diminuzione per il sistema di espressione senza cellula di produrre proteine con rendimenti apprezzabili. Taratura addizionali eventualmente se rese di reazione sono significativamente più bassa di quanto mi aspettassi. Un protocollo facoltativo per la calibrazione dello ione è descritto nella sezione 5. Questo permette una certa flessibilità nel compensare la variabilità di estratto grezzo cella sostenute da condizioni e attrezzature di lisi delle cellule individuali.
Figura 1: una vista ravvicinata del titolare Becher e tubo sulla piattaforma sonicazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: installazione dell'apparecchiatura sonicazione per la preparazione della cella greggio estratto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: una vista della pallina dopo sonicazione e centrifugazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: congelamento tuffo per l'Estratto di archiviazione Flash. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rappresentante risultati per V. natriegens sintesi proteica senza cellula utilizzando tipi di modello diverso. (A) analisi dell'endpoint della produzione sfGFP utilizzando le concentrazioni equimolari di plasmide e modello di DNA lineare (0,3 pmol) così come l'aumento delle concentrazioni di modello del mRNA. Senza cellula sfGFP concentrazione è stata determinata mediante una curva standard di sfGFP purificato misurato alle Ex / Em = 485 nm/528 nm dopo 180 minuti di incubazione a 26 ° C in condizioni di reazione ottimale in 10 volumi μL. (B) analisi cinetica di produzione sfGFP utilizzando le concentrazioni equimolari di plasmide e modello di DNA lineare così come l'aumento delle concentrazioni di modello del mRNA. sfGFP misurazioni sono state effettuate ogni 3 minuti alle Ex / EM = 485 nm/528 nm oltre 180 minuti di incubazione totale alle condizioni di reazione ottimale in 10 volumi μL. Per endpoint e test di cinetica enzimatica, campioni erano vuoti corretti utilizzando reazioni senza cellula completate con tutti i componenti tranne modello. Sono mostrate i medi e deviazioni standard (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: rappresentante risultati per calibrazione concentrazione ioni. (A) V. natriegens senza cellula reazioni sono state completate con aumento delle concentrazioni di Mg2 + e incubate a 26 ° C per 180 minuti in 10 reazioni μL. La concentrazione totale di K+ era 160 mM per tutte le concentrazioni di Mg2 + . Senza cellula sfGFP concentrazione è stata determinata mediante una curva standard di sfGFP purificato misurato alle Ex / Em = 485 nm/528 nm. (B) V. natriegens senza cellula reazioni sono state completate con aumento delle concentrazioni di K+ e incubate a 26 ° C per 180 minuti in 10 reazioni μL. La concentrazione totale di Mg2 + era 3,5 mM per tutte le concentrazioni di K+ . Per entrambe le tarature, i campioni erano vuoti corretti utilizzando reazioni senza cellula completate con tutti i componenti tranne modello. Sono mostrate i medi e deviazioni standard (n = 3). Questa figura è stata modificata da Wiegand et al.9. Ristampato con il permesso da Wiegand, D.J., Lee, H.H., Ostrov, N., Chiesa, G.M. che istituisce un Cell-Free Vibrio natriegens sistema di espressione. Biologia sintetica di ACS. 7 (10), 2475−2479 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tabella 1 | Preparazione di terreni di coltura batterica LB-V2 | ||
| Componente | Quantità (g) | Concentrazione finale (mM) | Volume finale (L) |
| Libbra di brodo (Miller) | 25 | 1 | |
| NaCl | 11,69 | 200 | |
| MgCl2 | 2.20 | 23,1 | |
| KCl | 0,31 | 4.2 | |
| Tabella 1 | Preparazione del tampone di lisi S30A | ||
| Componente | Quantità (g) | Concentrazione finale (mM) | Volume finale (L) |
| Soluzione di tris (pH 8.0) - 1 M (mL) * | 25 | 50 | 0,5 |
| Mg-glutammato | 2.72 | 14 | |
| K-glutammato | 6.10 | 60 | |
| Ditiotreitolo (DTT) - 1 M (mL) * | 1 | 2 | |
Tabella 1: reagenti per la preparazione di 1 L di media crescita batterica LB-V2 e 0,5 L di tampone di lisi delle cellule di S30A. Clicca qui per scaricare questo file in Excel.
| Preparazione di 10x energia soluzione Master Mix | ||||
| Componente | Concentrazione d'archivio (mM) | Concentrazione finale (mM) | Quantità (µ l) | Volume finale (µ l) |
| PH di HEPES-KOH 8 | 1750 | 500 | 1428.57 | 5000 |
| ATP | 100 | 15 | 750.00 | |
| GTP | 100 | 15 | 750.00 | |
| CTP | 100 | 9 | 450.00 | |
| UTP | 100 | 9 | 450.00 | |
| tRNA da e. coli MRE 600 (mg/mL) * | 100 | 2 | 100.00 | |
| Coenzima A idrato | 200 | 2.6 | 65.00 | |
| NAD | 200 | 3.3 | 82.50 | |
| cAMP | 650 | 7.5 | 57.69 | |
| Acido folinico | 100 | 0,7 | 35.00 | |
| Spermidina | 1600 | 10 | 31.25 | |
| 3-PGA | 2000 | 300 | 750.00 | |
| Acqua deionizzata sterile | 49.99 | |||
| Preparazione di 4 x amminoacido Master Mix | ||||
| Componente | Concentrazione d'archivio (mM) | Concentrazione finale (mM) | Quantità (µ l) | Volume finale (µ l) |
| ALA | 168 | 8 | 114.3 | 2400 |
| ARG | 168 | 8 | 114.3 | |
| ASN | 168 | 8 | 114.3 | |
| ASP | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLN | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLU | 168 | 8 | 114.3 | |
| GLY | 168 | 8 | 114.3 | |
| SUO | 168 | 8 | 114.3 | |
| IIE | 168 | 8 | 114.3 | |
| LYS | 168 | 8 | 114.3 | |
| HA INCONTRATO | 168 | 8 | 114.3 | |
| PHE | 168 | 8 | 114.3 | |
| PRO | 168 | 8 | 114.3 | |
| SER | 168 | 8 | 114.3 | |
| THR | 168 | 8 | 114.3 | |
| VAL | 168 | 8 | 114.3 | |
| TRP | 168 | 8 | 114.3 | |
| TYR | 168 | 8 | 114.3 | |
| LEU | 140 | 8 | 137.1 | |
| CYS | 168 | 8 | 114.3 | |
| Acqua deionizzata sterile | 91,4 | |||
Tabella 2: Reagenti per la preparazione di 5 mL di soluzione di energia: 10x master mix e 2,4 mL di 4 x mix master dell'aminoacido. Clicca qui per scaricare questo file in Excel.
| T7 RNA polimerasi In Vitro trascrizione reazioni | ||||
| Componente | Stock (mM) | Concentrazione finale (mM) | Reazione di 1 x di quantità (µ l) | Quantità (µ l) x 50 reazioni |
| 10X tampone di reazione di RNAPol | 1.00 | 50 | ||
| ATP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| GTP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| CTP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| UTP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| Mascherina del DNA (ng / µ l) * | 1000 | 500 | 0.50 | 25 |
| T7 RNA polimerasi | 200 | 2.6 | 2.00 | 100 |
| Inibitore di RNasi, murino | 200 | 3.3 | 0.50 | 25 |
| Acqua deionizzata sterile | 15,60 | 780 | ||
| Volume di reazione (µ l): | 20 | |||
Tabella 3: componenti di trascrizione In vitro per la produzione di mRNA. Clicca qui per scaricare questo file in Excel.
| Cell-free Mix Master di reazione | ||||
| Componente | Concentrazione d'archivio (mM) | Concentrazione finale (mM) | Reazione di 1 x di quantità (µ l) | Quantità (µ l) x 50 reazioni |
| Estratto (%) * | 25 | 2.50 | 125.00 | |
| Mg-glutammato | 100 | 3.5 | 0.35 | 17.50 |
| K-glutammato | 2000 | 80 | 0.40 | 20.00 |
| 4 x amminoacido Master Mix | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 |
| 10x energia soluzione Master Mix | 1.00 | 50.00 | ||
| Plasmide DNA (ng / µ l) * | 1000 | 500 | 0.50 | 25.00 |
| 50% PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0.40 | 20.00 |
| T7 RNA polimerasi | 1.00 | 50.00 | ||
| Inibitore di RNasi, murino | 0.10 | 5,00 | ||
| Acqua deionizzata sterile | 1.25 | 62.50 | ||
| Volume di reazione (µ l): | 10 | |||
| Alternative senza cellula reazione Master Mix per modello del mRNA | ||||
| Componente | Concentrazione d'archivio (mM) | Concentrazione finale (mM) | Reazione di 1 x di quantità (µ l) | Quantità (µ l) x 50 reazioni |
| Estratto (%) * | 25 | 2.50 | 125.00 | |
| Mg-glutammato | 100 | 3.5 | 0.35 | 17.50 |
| K-glutammato | 2000 | 80 | 0.40 | 20.00 |
| 4 x amminoacido Master Mix | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 |
| 10x energia soluzione Master Mix | 1.00 | 50.00 | ||
| Modello del mRNA (ng / µ l) * | 2000 | 4000 | 2.00 | 100.00 |
| 50% PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0.40 | 20.00 |
| Inibitore di RNasi, murino | 0.10 | 5,00 | ||
| Acqua deionizzata sterile | 0,75 | 37.50 | ||
| Volume di reazione (µ l): | 10 | |||
Tabella 4: Componenti di ottimizzato V. natriegens senza cellula master mix di reazione per modello di DNA e mRNA modello. Clicca qui per scaricare questo file in Excel.
| Mg 2 + Calibrazione | Reazione di 1 x di quantità (µ l) | Reazione di 1 x di quantità (µ l) | Quantità (µ l) x 100 reazioni | Quantità (µ l) x 100 reazioni | |
| Finale (mM) | Stock | 100 mM Mg-Glu | diH 2 0 | 100 mM Mg-Glu | Deionizzata H2O |
| 2.5 | 0 | 0.00 | 1.00 | 0 | 100 |
| 3.5 | 1 | 0.10 | 0.90 | 10 | 90 |
| 4.5 | 2 | 0.20 | 0.80 | 20 | 80 |
| 5.5 | 3 | 0.30 | 0.70 | 30 | 70 |
| Volume di reazione (µ l): | 10 | ||||
| K + Calibrazione | Reazione di 1 x di quantità (µ l) | Reazione di 1 x di quantità (µ l) | Quantità (µ l) x 100 reazioni | Quantità (µ l) x 100 reazioni | |
| Finale (mM) | Stock | 2000 mM K-Glu | diH 2 0 | 2000 mM K-Glu | Deionizzata H2O |
| 40 | 30 | 0.15 | 1.85 | 12 | 148 |
| 80 | 70 | 0.35 | 1.65 | 28 | 132 |
| 160 | 150 | 0,75 | 1.25 | 60 | 100 |
| 320 | 310 | 1,55 | 0.45 | 124 | 36 |
| Volume di reazione (µ l): | 10 | ||||
| Ione calibrazione senza cellula reazione Master Mix | |||||
| Componente | Concentrazione d'archivio (mM) | Concentrazione finale (mM) | Reazione di 1 x di quantità (µ l) | Quantità (µ l) x 50 reazioni | |
| Estratto (%) * | 25 | 2.50 | 125.00 | ||
| Mg-glutammato | Variabile | Variabile | 1.00 | 50.00 | |
| K-glutammato | Variabile | Variabile | 2.00 | 100.00 | |
| 4 x amminoacido Master Mix | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 | |
| 10x energia soluzione Master Mix | 1.00 | 50.00 | |||
| Plasmide DNA (ng / µ l) * | 1000 | 250 | 0.25 | 12.50 | |
| 50% PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0.40 | 20.00 | |
| T7 RNA polimerasi | 1.00 | 50.00 | |||
| Inibitore di RNasi, murino | 0.10 | 5,00 | |||
| Acqua deionizzata sterile | 0.00 | 0.00 | |||
| Volume di reazione (µ l): | 10 | ||||
Tabella 5: Mix master per il calibrazione concentrazione ioni. Clicca qui per scaricare questo file in Excel.
| Mappa di calibrazione dello ione CF | 40 mM K+ | 80 mM K+ | 160 mM K+ | 320 mM K+ | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| mM 2,5 Mg2 + | A | ||||||||||||
| 3,5 mM Mg2 + | B | ||||||||||||
| mM 4,5 Mg2 + | C | ||||||||||||
| 5,5 mM Mg2 + | D | ||||||||||||
Tabella 6: Ion Calibrazione mappa. Clicca qui per scaricare questo file in Excel.
| Condizioni di conservazione e vita di scaffale dei componenti CF | ||
| Componente | Posizione di archiviazione | Shelf Life |
| Terreni di coltura sterile LB-V2 | 4 ° C | 3-6 mesi |
| V. natriegens greggio Cell Extract | -80 ° C | 1-3 settimane |
| 100 mM Mg-glutammato | Camera Temp | 6 mesi |
| 2000 mM K-glutammato | Camera Temp | 6 mesi |
| 50% PEG-8000 | Camera Temp | 6 mesi |
| 10x energia soluzione Master Mix | -80 ° C | 3-6 mesi |
| 4 x amminoacido Master Mix | -80 ° C | 3-6 mesi |
| Mascherina del DNA del plasmide/lineare | -20 ° C | 6-12 mesi |
| mRNA modello | -80 ° C | 3-4 settimane |
Tabella 7: Condizioni di conservazione Cell-free e ripiano vita. Clicca qui per scaricare questo file in Excel.
Discussion
Questo protocollo è stato ottimizzato per selvaggio-tipo V. natriegens e crescita batterica media composto da LB completati con sali V2 (Tabella materiali). Altri ceppi di V. natriegens possono essere coltivate allo stesso modo per generare estratti cellulari grezzo per reazioni senza cellula; Tuttavia, il loro uso richiede ulteriore ottimizzazione del presente protocollo. Inoltre, questo sistema di espressione della proteina senza cellula è stato ottimizzato utilizzando 3-fosfoglicerato (3-PGA) come la fonte di rigenerazione di energia primaria. Altre fonti di rigenerazione di energia possono essere utilizzati; Tuttavia, ottimizzazione dei reagenti e calibrazione sarà probabilmente necessario ottenere alto rendimento proteina espressione10,11.
Un'attenzione specifica ai diversi passaggi critici in questo protocollo garantirà Estratto di massima produttività per ad alto rendimento senza cellula di produzione della proteina. In primo luogo, estratto grezzo delle cellule deve essere preparato da V. natriegens colture cellulari raccolte in una fase metà-esponenziale di crescita; proteina resa è massima quando culture raggiungono un OD600 = 1,0 ± 0,2. Mentre la produzione di proteine senza cellula è possibile da cellule raccolte in una gamma di densità ottiche, precedentemente abbiamo trovato che le cellule raccolte in un stato esponenziale di crescita rendimento significativamente più proteine9. Gli effetti osservati di densità ottica sulla cella greggio estratto di prestazioni sono coerenti con quelli riportati per altri sistemi di espressione senza cellula derivati dalle cellule coltivate in condizioni di coltura batch1. Poiché V. natriegens cresce ad un ritmo rapido, è essenziale monitorare attentamente le densità ottiche culture. In generale, è previsto che il V. natriegens culture riproducibile dovrebbero raggiungere un OD600 di 1.0 all'interno 1−1.5 h usando questo protocollo; Tuttavia, le condizioni di crescita individuale come l'uso di sconcertato contro boccette non sconcertato, che colpisce l'aerazione o aria contro incubazione di acqua, che colpisce il tasso e la stabilità della temperatura di incubazione, possono alterare il tempo di crescita. Inoltre, si consiglia in genere di almeno 250 mL di V. natriegens in un pallone da 1 L sconcertato per garantire un pellet di grandi cellule al momento del raccolto per la facile manipolazione e trasferimento della coltura. Questo migliora notevolmente il successo della preparazione estratto grezzo delle cellule così come aumenta il volume totale dell'estratto prodotto da una pallina. Quando si utilizza preparazione di scala più piccola, i reagenti e le condizioni di coltura possono essere regolati in modo appropriato. Per fermentazione su larga scala, ulteriore ottimizzazione delle condizioni di coltura può essere richiesto. Infine, per garantire il rendimento ad alta percentuale proteica, è fondamentale che il pellet cellulare vengono elaborati immediatamente dopo la raccolta, o all'interno di 1 − 2 giorni di conservazione a-80 ° C.
La lisi corretta del pellet cellulare tramite sonicazione di impulso è fondamentale per il successo dell'espressione della proteina senza cellula e spesso è l'aspetto più difficile di questo protocollo per i nuovi utenti. In genere, una pallina ben lisata produrrà un volume significativo di Estratto liquido privo di detriti. L'estratto deve essere leggermente viscoso, ma può facilmente essere pipettato quando aliquotare in deposito tubi prima di congelamento in azoto liquido flash. Figura 3 raffigura una rappresentazione di una pallina ben lisata (Figura 3A) rispetto ad un pellet scarsamente lisato (Figura 3B) dopo il passaggio di post lisi centrifugazione. Un'indicazione importante di lisi cellulare completo è una cella greggia estratto proteico totale concentrazione > 20 mg / mL come determinato mediante un test di proteine totali (passo 2.13). Sovra-sonicazione riscaldamento eccessivo dell'estratto grezzo cellulare danneggiano il macchinario cellulare, che non può essere determinato senza eseguire una reazione senza cellula. Così, è altamente benefico per testare l'efficienza di estratto con una reazione di controllo prima di dedicare molto tempo e sforzo per applicazioni di espressione di proteine a valle. Mentre ulteriore ottimizzazione può essere necessarie per le apparecchiature di sonicazione diversi, i passaggi di sonicazione impulsi descritti sono stati altamente riproducibili nelle nostre mani.
L'utilizzo del modello di DNA lineare derivato da amplificazione PCR, enzima di restrizione digest o sintesi di geni commerciale può aumentare significativamente la capacità di produzione di proteine ad alta velocità e rapida nell'espressione senza cellula sistemi24. Mentre la produzione di proteine da modello lineare amplificato di PCR è stata dimostrata, il rendimento di queste reazioni sono di circa 13.5-fold inferiore rispetto alle reazioni usando plasmide mascherina del DNA a rapporti equimolare9. Questo è principalmente a causa dell'instabilità del modello lineare del DNA che è probabile degradata dall'azione delle nucleasi endogene presenti in V. natriegens cella greggio estratto. Mentre fago lambda proteina GamS è stato precedentemente utilizzato per proteggere il DNA lineare modello24,25, è stato trovato per essere incompatibile con V. natriegens estratti9. Inoltre, mentre aumentando la concentrazione della mascherina del DNA lineare potrebbe consentire per un rendimento più elevato di proteine, la degradazione veloce in cella greggio estratto sarà ancora un grave problema.
Una soluzione per superare la degradazione di modello lineare del DNA può essere di completare senza cellula reazioni con modello di mRNA generata da trascrizione in vitro di DNA lineare. D'altra parte, l'uso di un inibitore di RNAsi offre la protezione significativa contro il degrado di trascrizione di mRNA e proteina apprezzabile rendimenti possono essere ottenuti nel formato da 10 μL reazione senza cellula (Figura 5AB). Clonazione del DNA lineare in un modello circolare attraverso la legatura TA, clonazione di TOPO, Golden Gate assembly o altri metodi di ricombinazione possono essere utilizzati per aggirare la degradazione di modello. Tuttavia, ulteriori approcci per inibizione dell'attività della nucleasi sarà necessari per l'espressione della proteina efficiente utilizzando il modello di DNA lineare.
Ad oggi, diversi approcci sono stati proposti per la preparazione dell'estratto grezzo per proteina senza cellula espressione9,10,11,26. Nello sviluppo di questo protocollo, abbiamo cercato di massimizzare l'accessibilità degli utenti, ridurre i costi complessivi e ridurre al minimo i passaggi che richiede tempo. Ad esempio, una resa ad alta percentuale proteica è ottenuta mediante un processo di centrifugazione sonicazione in due semplici passaggi e non richiede omogeneizzatori cella, passi lunghi dialisi o reazione di dilavamento. È semplice da eseguire in un breve periodo di tempo e non richiede elevata competenza del laboratorio. Così, può aiutare a facilitare l'espressione senza cellula come standard per la ricerca accademica traslazionale e progettazione di processo industriale.
Questo protocollo si espande il toolkit disponibile per l'inchiesta e l'utilità di V. natriegens, un organismo non-modello con proprietà biologiche uniche. Rendimento più elevato di proteine possa essere realizzato utilizzando reazioni senza cellula semi - o completamente-continuo, per consentire la rigenerazione di energia, rifornire di aminoacidi e la rimozione dei prodotti di scarto3,5,27. Inoltre, l'ingegneria di selvaggio-tipo V. natriegens per produrre ceppi DNasi - o RNasi-carenti, rimozione delle vie metaboliche deleteri e concorrenti e l'espressione di ulteriori tRNAs potrebbe migliorare notevolmente la produzione di proteine in Questo sistema28,29. Come abbiamo svelare la biologia sottostante la sua rapida crescita, ulteriore sviluppo del V. natriegens sistemi senza cellula può accelerare le capacità bioproduction e consentire robusta espressione di peptidi terapeutici, piccole molecole e sintetico materiali.
Disclosures
DJW, NO, e GMC ha presentato un brevetto relative a questo lavoro.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 e dipartimento di energia DE-FG02-02ER63445. Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam e Dr. Edgar Goluch per utili consigli su come costruire la sezione protocollo di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
| 2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| 384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
| 384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
| 50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
| 96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
| Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
| Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
| Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
| Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
| Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
| Dewar Flask - 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
| DL-Dithiothreitol solution - 1 M | Sigma | 42816 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
| Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
| Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
| Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip | Qsonica | 4422 | |
| RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
| RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
| Tris Solution (pH 8.0) - 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
| tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
| Uridine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |
References
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