Summary
Zellfreie Expressionssysteme sind leistungsstarke und kostengünstige Werkzeuge für den Hochdurchsatz-Synthese und Screening von wichtigen Proteinen. Hier beschreiben wir die Vorbereitung der zellfreien Protein Expressionssystems mit Vibrio Natriegens für die schnelle Proteinproduktion Plasmid-DNA, lineare DNA und mRNA-Vorlage verwenden.
Abstract
Die marinen Bakteriums Vibrio Natriegens hat beträchtliche Aufmerksamkeit als aufstrebenden mikrobielle Gastgeber für die Biotechnologie aufgrund seiner schnellen Wachstumsrate sammelte. Ein allgemeines Protokoll wird für die Zubereitung von V. Natriegens Rohöl Zellextrakte mit gemeinsamen Laborgeräte beschrieben. Dieses hohe ertragreiche Protokoll wurde speziell für die Zugänglichkeit Benutzer optimiert und Kosten reduziert. Zellfreie Proteinsynthese (GFP) in kleinem Maßstab 10 μL Batch Reaktionen in entweder einem 96 oder 384-Well-Format vorgenommen werden und reproduzierbar ergibt Konzentrationen von > 260 μg/mL super Ordner GFP (SfGFP) innerhalb von 3 h insgesamt, groben Zelle zu extrahieren, Vorbereitung und GFP kann ein einzelner Benutzer in 1−2 volle Tage erreicht werden. Dieses Protokoll kann leicht in vorhandene Protein Synthese Pipelines, Fortschritte in der Bio-Produktion und synthetische Biologie Anwendungen zu erleichtern integriert werden.
Introduction
Zellfreie Proteinsynthese ist eine vielseitige und kostengünstige Methode für die Ausprägung der wertvollen Proteine oder Peptide1,2,3,4. In der Vergangenheit wurde zellfreie Proteinsynthese mit Escherichia coli Expressionssysteme durchgeführt; Es wurde jedoch eine neue Schwankung im Umgang mit Alternativen, nicht-Modell Organismen mit neuartigen Eigenschaften als Fahrgestell für zellfreie Expression5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. Organismen mit einzigartigen Stoffwechselprofile sind Hauptkandidaten als Alternativen zu E. Coli zellfreien Systemen. Zum Beispiel Verdopplungszeit des marinen Bakteriums Vibrio Natriegens ist die am schnellsten wachsende aller bekannten Organismen mit einer beobachteten von weniger als 10 min13. Dies hat V. Natriegens große Aufmerksamkeit als eine aufstrebende mikrobielle Host für Forschung und Biotechnologie14,15,16,17,18sammelte. Angesichts der Tatsache, dass das schnelle Wachstum von V. Natriegens hat worden zu hohen Protein-Synthese und Stoffwechseleffizienz19,20,21, Nutzbarmachung der zellulären Maschinerie für zellfreie verbunden Synthese kann das Toolkit für schnelle Proteinproduktion und Hochdurchsatz-Screening deutlich erweitern.
Vor kurzem eine zellfreie V. Natriegens Expressionssystem wurde nachgewiesen, die in der Lage, super Ordner GFP (SfGFP) bei Konzentrationen von > 260 μg/mL in 3 h mit einer T7-Promotor-9ist. Das übergeordnete Ziel der Entwicklung dieser Methode war Benutzern eine sehr zugänglich, kostengünstige, reproduzierbare und ertragreiche zellfreien Protein Expressionssystems zur Verfügung zu stellen, die mit gemeinsamen Labor-Equipment in kürzester Zeit zubereitet werden können. Dieses Protokoll nutzt 1 L Kulturen in Fläschchen schütteln, Lyse der Zelle durch Puls-Beschallung und kleine Batch Reaktionen in einem 96 oder 384-Well-Format, Parallelisierung und screening-Durchsatz zu maximieren. Eine lange, anhaltende Protein-Expression wird als eine Energie Quelle8,22,23durch Supplementierung von 3-Phosphoglyceric-Säure (3-PGA) ermöglicht. Nach erfolgreichem Abschluss dieses Protokolls, ein Benutzer haben die Möglichkeit, einen gewünschten Proteins auszudrücken oder Satz von Proteinen in einem zellfreien Format mit V. Natriegens groben Zelle extrahieren.
Ausgehend von einem Glycerin-Lager, V. Natriegens Rohöl Zellextrakte bereiten wir aus Zellen geerntet eine Extinktion bei 600 nm (OD600) von 1,0. Eine 1 L-Kultur wird etwa 2−3 mL Extrakt, nachgeben, die für mehr als 800 zellfreie Reaktionen auf 25 % Rohöl Zelle Extrakt ausreicht. Proteine können mit Plasmid DNA, lineare DNA oder mRNA Vorlage ausgedrückt werden; lineare DNA-Vorlage-Abbau durch endogene Nukleasen bleibt jedoch einen großen Nachteil bei der Verwendung von Wildtyp V. Natriegens zellfreien System9. Ausgehend von V. Natriegens Kulturen, kann Protein nutzbar für downstream-Anwendungen von einem einzelnen Benutzer in 1−2 volle Tage erreicht werden.
Protocol
1. Vorbereitung des V. Natriegens groben Zelle extrahiert – Bakterienkultur
- Bereiten Sie V. Natriegens Bakterienwachstum Medien LB-V2 gemäß Tabelle 1. Sterilisieren Sie die Wachstumsmedien durch Autoklavieren. Erlauben Sie Medien zu erreichen, um Raumtemperatur (RT). Speichern Sie überschüssige Medien bei RT
Vorsicht: Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und konsultieren Sie Labor spezielle Anweisungen zu, wenn ein Autoklav in Betrieb. - Verwenden Sie einen Glycerin-bestand von Wildtyp V. Natriegens 3 mL LB-V2 Medien zu impfen. Wachsen Sie über Nacht bei 30 ° C unter Schütteln bei 225 Umdrehungen pro Minute.
- Waschen 1 mL der Nacht Kultur durch Zentrifugation bei 10.600 X g auf eine Benchtop-Zentrifuge für 1 min. Absaugen der Überstand ohne zu stören das resultierende Pellet und Aufschwemmen in 1 mL frisches LB-V2-Medien.
- In einem Autoklaven 4 L ratlos Erlenmeyerkolben mit steriler Abdeckung hinzufügen 1 L frisches LB-V2 Wachstumsmedium. Mit 1 mL der gewaschenen über Nacht Kultur (1:1, 000 Verdünnungsverhältnis) zu impfen. Kultur bei 30 ° C unter Schütteln bei 225 u/min zu wachsen.
Hinweis: V. Natriegens Kulturen können nach oben oder unten skaliert werden, unter Beibehaltung der 1:1,000 Verdünnungsverhältnis. Beispielsweise fügen Sie 250 μL der gewaschenen über Nacht Kultur, 250 mL frisches LB-V2 Wachstumsmedien in einem 2 L Erlenmeyerkolben mit steriler Abdeckung verblüfft. - Überwachen Sie die Kultur OD600 mit einem Spektralphotometer. Wenn Kultur erreicht OD600 = 1,0 ± 0,2, Ernte Kultur durch Zentrifugation bei 3.500 X g für 20 min bei 4 ° C. Legen Sie Pellets auf Eis.
Hinweis: V. Natriegens wächst schnell, so dass enge Überwachung der Kultur erforderlich ist. Wachstum auf OD600 = 1.0 dauert etwa 1.5−2 h an das Verdünnungsverhältnis 1:1,000. - Aspirieren des Überstands und sofort speichern das resultierende bakterielle Pellet bei-80 ° C oder gehen Sie direkt zu Zell-Lyse in Abschnitt 2 beschrieben.
Hinweis: Dieser Schritt ist ein guter Zwischenstopp. Es wird jedoch empfohlen, die Pellets verarbeitet werden, sofort oder innerhalb von 1−2 Tagen für beste Ergebnisse.
2. Vorbereitung des V. Natriegens groben Zelle extrahiert – Zelle Lysis
- Bereiten Sie S30 Lyse Puffer gemäß Tabelle 1 in sterilen deionisiertes (DI) Wasser und justieren Sie pH bis 7.7 mit Eisessig.
Vorsicht: Eisessig sollte mit richtigen PSA behandelt werden, wenn den pH-Wert einstellen. - Cool S30 Lyse Puffer auf ca. 4 ° C im Kühlschrank oder auf Eis vor Beginn des Verfahrens Zelle Lysis.
Hinweis: Für eine schnelle Abkühlung, Lyse aufstellbar Puffer bei-20 ° C. Lassen Sie sich nicht den Puffer zu frieren. - Stellen Sie Zelle Pellets auf Eis für 10−20 min oder bis vollständig aufgetaut. Aufzuwirbeln Sie alle Pellets, die aus der gleichen 1 L Kultur mit 10 mL kalte S30 Lyse Puffer, dann Aussetzung auf eine 50 mL-Tube. Wenn Pellets in der Tiefkühltruhe bei-80 ° C im Schritt 1.6 nicht gefroren sind, gehen Sie direkt zu Wiederfreisetzung.
Hinweis: Erhöhen Sie die Lautstärke der S30 Lyse Puffer verwendet, um zunächst die Pellets nach Bedarf aufzuwirbeln. - Zentrifuge Aussetzung bei 3.500 X g für 10 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie den Überstand ohne zu stören das Pellet. Waschen Sie das Pellet ein zweites Mal mit 10 mL kalte S30 Lyse Puffer. Legen Sie Pellets auf Eis.
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Fügen Sie in einem kalten Raum 500 μL der kalten S30 Lyse Puffer das Pellet in der 50 mL Tube hinzu. Mit einer Pipettenspitze weite Bohrung, Aufschwemmen der Pellet und sorgfältig übertragen die gesamte Pellet Aussetzung zu einer 2 mL-Tube.
Hinweis: Wenn eine große Bohrung Pipette steht nicht zur Verfügung, verwenden eine Schere zum Schneiden Sie des Ende einer Pipettenspitze 1 mL Bohrung für Pellet-Übertragung zu erhöhen.- Übertragen Sie so viel Pellets möglichst ohne signifikant zu erhöhen das Volumen; Allerdings sollte das Pellet in genug Flüssigkeit zu beschallt werden, Nukleinsäuretablette werden, wie durch eine homogene Suspension in der 2 mL Tube. Überfüllen Sie 2 mL-Tube nicht. Die Aussetzung darf 1,5 mL nicht überschreiten; aufgeteilt in mehrere Rohre bei Bedarf.
- Halten Sie die Zelle Pellet auf Eis und arbeiten in einem kalten Raum. Füllen Sie ein 600-mL-Becherglas mit Eis und legen Sie eine 2 mL-Rohrhalter auf dem Eis.
Hinweis: Es ist hilfreich, in der Nähe von der Seite des Bechers, der Rohrhalter zu platzieren, so die Pellet-Suspension wird sichtbar in das Eis, Beschallung Fortschritt zu überwachen (siehe Abbildung 1). - Vortex ausgesetzt Pellet in 2 mL-Tube kurz, um die Zellen zu homogenisieren, Flick Rohre alle Zellen auf der Unterseite der Kappe zu entfernen, und legen in Schlauchhalter mit Kappe öffnen. Sonikator Spitze in die Suspension zu senken, so dass es nur unter der Flüssigkeitsoberfläche.
- Bereiten Sie die Beschallung Einrichtung wie dargestellt in Abbildung 2 mit einem Sonikator und Sonde mit einer Frontalsteifigkeit-Zoll-Durchmesser. Geben Sie die folgenden Einstellungen in das Sonikator-Steuerelement: 20 kHz Frequenz und Amplitude auf 50 %, Puls auf Zeit: 10 s, OFF Taktzeit: 60 s.
- Laufen Sie das Puls-Beschallung-Protokoll für drei Zyklen. Wenn das Gesamtvolumen der Pellet-Suspension > 500 μL ist, laufen Sie die Puls-Beschallung-Protokoll sechsmal.
Hinweis: 3−6 Impulse sind in der Regel ausreichend, um V. Natriegens Pellets lösen; Je nach Sonikator evtl. zusätzliche Impulse. Während der Beschallung verwenden Sie die Einstellung Knopf Plattform bewegen die Sonde auf und ab zu jeder Pellet lysiert, die an der Unterseite des Rohres angesiedelt haben kann. Das Rohr kann aus dem Halter und kurz verwirbelt, die Federung zwischen Impulsen wieder Homogenisieren entfernt werden. Siehe Diskussion unten für die gewünschte Konsistenz der beschallten Zellen.
Vorsicht: Geeigneten Gehörschutz zu tragen, wenn Sonikator aktiv ist. - Nach Beschallung Zentrifuge groben Zelle extrahieren bei 16.000 X g für 30−45 min bei 4 ° C oder bis lysate frei von jeder Zelltrümmer, wie in Abbildung 3dargestellt ist.
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In einem kalten Raum, aliquoten 50 μL der daraus resultierenden Überstände zu neuen 2 mL Röhrchen ohne zu stören das Pellet.
Hinweis: Schmutzpartikel, die versehentlich in die neue 2-mL-Röhrchen übertragen wird drastisch reduziert Extrakt der Kapazität für hohe Renditen Proteinsynthese.- Optional, beiseite, 10 μL der Zelle extrahieren für Post-Lyse Protein Quantifizierung in einer separaten 2 mL tube (siehe Schritt unten 2.13).
- Flash Einfrieren roh Zellextrakte indem man Röhren in einem Rohrhalter mit einem Dip Schnur befestigt, wie in Abbildung 4dargestellt. Tauchen Sie Rohre in einem Dewar mit flüssigem Stickstoff ein und sofort in einer Tiefkühltruhe bei-80 ° C bis zur Verwendung.
Vorsicht: Verwenden Sie geeignete PSA für den Umgang mit flüssigen Stickstoff einschließlich Laborkittel, Schutzbrille, Gesichtsschutz, Kryogen Schürze und Handschuhe. - Optional, Quantifizierung der gesamten-Proteins der Zelle lysate mit 10 μL abseits Schritt 2.11.1 durch Verdünnen Probe 1: 100 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und verwenden standard-Gesamt-Protein Quantifizierung Assay wie Bradford-Test, Bicinchoninic Säure Assay (BCA), etc.
3. Vorbereitung der zellfreien Reaktionskomponenten
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Allgemeine Reaktionskomponenten
- Arbeiten-Bestände von Mg-Glutamat und K-Glutamat in 50 mL Röhrchen mit Sterilwasser DI bei Konzentrationen von 100 mM und 2000 mM, bzw. vorzubereiten.
- Bereiten Sie einen arbeiten bestand von 50 % (w/V) Polyethylenglykol (PEG)-8000 durch Zugabe von 100 mL sterilen DI Wasser in einem 250 mL-Becherglas. Legen Sie einen kleinen Magnetrührer in den Becher. PEG-8000 50 g Abwiegen und verleihen der 100 mL Wasser in den Becher geben.
- Stellen Sie den Becher auf einem beheizten rühren Platte auf 100 ° C und bei 250 u/min rühren Sie, PEG-8000 in Lösung ist. Lassen Sie PEG-8000 liquid Mischung abkühlen, bevor Sie auf 50 mL Röhrchen zu übertragen.
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Energie-Lösung-master-mix
- Bereiten Sie eine 5 M Lösung von KOH 500 mL Sterilwasser DI 140 g KOH Pellets hinzu.
Vorsicht: Bereiten Sie diese Lösung in einer chemischen Kapuze und tragen Sie PSA beim Umgang mit starker Bases. Die Lösung wird heiß geworden, so dass die Kronkorken muss lose Druckaufbau zu verhindern. Lassen Sie die KOH-Lösung, RT vor der Verwendung zu erreichen. - Bereiten Sie 1750 mM HEPES-KOH Puffer durch Zugabe von 20,85 g HEPES eine 100 mL Flasche vor. Fügen Sie langsam steriles DI Wasser hinzu, bis das Volumen 40 mL erreicht. Vortex-Flasche, die HEPES aufzulösen. Verwenden Sie die 5 M KOH-Lösung anpassen des pH-Werts 8.0 und dann bringen die Lösung Volumen bis 50 mL.
Vorsicht: KOH sollte mit richtigen PSA behandelt werden, wenn den pH-Wert einstellen. - Bereiten Sie die verbleibenden 10 x Lager Energieanteilen master-Mix in den in Tabelle 2 in DI Sterilwasser angegebenen Konzentrationen und jede Aktie auf Eis. Die 100 mM ATP, GTP, CTP und UTP-Bestände bei RT und Platz auf dem Eis auftauen.
Hinweis: Ein Thermomixer, eingestellt auf 37 ° C und 350 u/min lässt sich Reagenzien in Lösung bei Bedarf auflösen. Nicht überhitzen oder Reagenzien für den Thermomixer für längere Zeit zu verlassen. - Fügen Sie in der 15 mL Tube jeder Lösungskomponente master-Mix Energie in Übereinstimmung mit die Bestellung und das Volumen in Tabelle 2angegeben hinzu. Wirbel die Lösung nach jeder Komponente hinzugefügt wird. Das macht 5 mL 10 x Energie-Lösung-master-Mix.
- Teilen Sie die 10 x Energie-Lösung-master-Mix in 200 μl-Aliquots in 2 mL-Tuben. Flash Einfrieren jeder Aliquote, wie in Schritt 2.12 durchgeführt. Sofort legen Sie sie in den Gefrierschrank-80 ° C bis zur Verwendung.
- Bereiten Sie eine 5 M Lösung von KOH 500 mL Sterilwasser DI 140 g KOH Pellets hinzu.
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Aminosäure-master-mix
- Um frische 4 x Aminosäure-master-Mix vorzubereiten, indem jede Aminosäure-Aktie bei RT Auftauen und dann jeweils auf Eis beginnen. Verwenden Sie ein Wirbel und/oder Thermomixer bei 37 ° C und 350 u/min eingestellt, um sicherzustellen, dass alle Aminosäuren-Bestände vollständig aufgelöst sind.
Hinweis: Cystein kann nicht vollständig auflösen; Es kann die Aminosäure-master-Mix als Suspension hinzugefügt werden. Nicht überhitzen oder Reagenzien für den Thermomixer für längere Zeit zu verlassen. - In der 15 mL Tube, fügen die entsprechenden Volumen Aminosäuren Sterilwasser DI so dass Endkonzentration von jeweils 8 mM in der folgenden Reihenfolge ist: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GJ, seine, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU und CYS. Nach dem Hinzufügen von einzelnen Aminosäuren, Wirbel der Master mix Lösung. Die in Tabelle 2 aufgeführten Mengen werden 2,4 mL Aminosäure-master-Mix ausmachen.
- Teilen Sie die 4 x Aminosäure-master-Mix in 200 μl-Aliquots in 2 mL-Tuben. Flash Einfrieren jeder Aliquote, wie in Schritt 2.12 durchgeführt. Legen Sie sofort in einen Gefrierschrank bei-80 ° C bis zur Verwendung.
- Um frische 4 x Aminosäure-master-Mix vorzubereiten, indem jede Aminosäure-Aktie bei RT Auftauen und dann jeweils auf Eis beginnen. Verwenden Sie ein Wirbel und/oder Thermomixer bei 37 ° C und 350 u/min eingestellt, um sicherzustellen, dass alle Aminosäuren-Bestände vollständig aufgelöst sind.
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Produktion von Reaktion einsetzbaren Plasmid DNA Schablone
Hinweis: Zellfreie Proteinexpression in diesem System wurde mit dem super Ordner grün fluoreszierendes Protein (GFP) Expressionsvektor T7-pJL1-SfGFP (Table of Materials) optimiert. Es wird empfohlen, dieses Plasmid als Steuerelement für zellfreie Reaktion Effizienz und das pJL1 Rückgrat für das Klonen und Ausdruck von anderen Proteinsequenzen verwenden. Anderen Plasmid-DNA-Templates verwendbar; Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Transkription von einem T7 Promotorsequenz und das Vorhandensein von T7-RNA-Polymerase gesteuert wird. Ein einfaches Protokoll für die großtechnische Produktion von jedem Plasmid DNA Schablone aus transformierten E. Coli wird nachfolgend beschrieben.- Reinigen Sie gewünschte Vektor mit einem Plasmid Reinigung Kit gemäß Anweisungen des Herstellers (Table of Materials).
Hinweis: Konzentration der Plasmid-DNA-Vorlage so weit wie möglich wird empfohlen, die enge Band Einschränkungen der zellfreien Reaktion erfüllen. In der Regel eine 750−1500 ng/μl arbeiten Lager anstreben.
- Reinigen Sie gewünschte Vektor mit einem Plasmid Reinigung Kit gemäß Anweisungen des Herstellers (Table of Materials).
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Produktion von Reaktion-fertige mRNA Vorlage
Hinweis: Dieser Abschnitt ist optional. Protein-Expression wurde getestet mit mRNA Vorlage generiert aus der in-vitro-Transkription des Plasmids T7-pJL1-SfGFP durch die aufgeführten T7-RNA-Polymerase (Table of Materials).- Bereiten Sie mRNA-Vorlage von Plasmid DNA Kodierung Proteins des Interesses mit der in-vitro-Transkription Reaktionskomponenten in Tabelle 3 vor. Inkubieren Sie Reaktionen für 1 h bei 37 ° C in einem Thermocycler.
Hinweis: Es wird empfohlen, 8−10x dieser Reaktionen erzeugen genügend Material parallel auszuführen. - Bündeln Sie alle Transkription Reaktionen. Reinigen Sie mit einer mRNA Reinigung und Konzentrator-Kit gemäß Anweisungen des Herstellers (Table of Materials). Eluieren Sie mRNA-Vorlage in DI Sterilwasser. MRNA-Vorlage bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
- Bereiten Sie mRNA-Vorlage von Plasmid DNA Kodierung Proteins des Interesses mit der in-vitro-Transkription Reaktionskomponenten in Tabelle 3 vor. Inkubieren Sie Reaktionen für 1 h bei 37 ° C in einem Thermocycler.
4. Durchführung zellfreien Protein Eexpression Reaktionen Verwendung V. Natriegens Roh extrahieren
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Zellfreie Proteinexpression mit Plasmid oder lineare DNA-Vorlage
- Entfernen Sie 10 x Energie-Lösung-master-Mix und 4 x Aminosäure-master-Mix Aliquote aus der Tiefkühltruhe-80 ° C bei RT Auftauen, und auf Eis. Entfernen Sie die T7-RNA-Polymerase und RNase-Inhibitor Bestände aus dem Tiefkühler-20 ° C und auf Eis. DNA-Vorlage bei RT und Platz auf dem Eis auftauen.
- Bereiten Sie einen zellfreie Reaktion-master-Mix gemäß Tabelle 4 indem jede Komponente in der folgenden Reihenfolge zu einer 2 mL-Tube auf Eis: Aminosäure-master-Mix, Energie-Lösung-master-Mix, Mg-Glutamat, K-Glutamat, DNA Schablone, PEG-8000, T7-RNA-Polymerase und RNase Inhibitor. Streichen Sie sanft das Rohr nach jeder Zugabe um den master-Mix.
Hinweis: Wenn lineare Vorlage für zellfreie Proteinexpression verwendet werden soll, fügen Sie 5−10x mehr Material im Vergleich zu Plasmid Vorlage zu nennenswerten Erträge des Proteins. - Entfernen Sie V. Natriegens groben Zelle lysate 10−20 min bis aufgetaut in Schritt 2.12 von-80 ° C Gefrierschränke und Platz auf dem Eis vorbereitet. Fügen Sie das entsprechende Volumen groben Zelle extrahieren, um die zellfreie Reaktion-master-Mix gemäß Tabelle 4 und vorsichtig mischen durch streichen oder Pipettieren rauf und runter.
- Endpunkt-zellfreien Protein-Expression mit thermocycler
- Pipette 10 μL der zellfreien Reaktion-master-Mix auf den Boden einer 96 oder 384-Well-PCR-Platte. Dazwischen jede Übertragung auf die PCR-Platte, die master-Mix durch Streichen das Rohr vorsichtig mischen.
Hinweis: Zellfreie Reaktion master-Mix sollte gut zu allen Zeiten zur Maximierung Reaktion Reproduzierbarkeit und zellfreie Proteinexpression in allen Proben gemischt werden.
- Pipette 10 μL der zellfreien Reaktion-master-Mix auf den Boden einer 96 oder 384-Well-PCR-Platte. Dazwischen jede Übertragung auf die PCR-Platte, die master-Mix durch Streichen das Rohr vorsichtig mischen.
- Zentrifugieren Sie kurz die Platte bei 1.000 X g für 10 s, master-Mix zu bündeln, die auf den Seiten der Brunnen gesteckt werden kann. Versiegeln der Brunnen mit einem Teller Klebstoff um Verdunstung zu verhindern, und legen Sie die PCR-Platte in einem Thermocycler set bei 26 ° C mit einem beheizten Deckel bei 105 ° c eingestellt
Hinweis: Die gleichmäßige Wärmeverteilung und beheizte Deckel von einem Thermocycler verbessert es Protein Ausdruck Erträge. - Inkubieren Sie die zellfreie Reaktionen für ein Minimum von 3 h. Nach der Inkubation können exprimierten Proteine gereinigt, quantifiziert und verwendet für nachgelagerte Prozesse.
Hinweis: Exprimierten Proteine können direkt in die zellfreie Reaktion mit einer Methode der Auswahl des Benutzers quantifiziert werden. Z. B. fluoreszierende Proteine quantifiziert werden können mit einem externen standard Kurve oder Radioaktivität gemessen werden, wenn eine radioaktiven Aminosäure in der zellfreien Reaktion zu verwenden. UV-VIS Spektroskopie oder Gesamt-Protein-Assays sind im Allgemeinen nicht empfohlen für die Proteinproduktion in zellfreien Reaktionen ohne eine erste Reinigung direkt zu messen. - Alternativ überwachen Sie zellfreien Protein Ausdruck Kinetik mit einem Teller-Reader.
- Pipette 10 μL der zellfreien Reaktion-master-Mix an der Unterseite einer schwarzen 384-Well-Assay-Platte mit Klarglas Böden. Halten Sie die Test-Platte auf dem Eis oder arbeiten in einem kalten Raum beim Hinzufügen der master-Mix um sicherzustellen, dass die volle kinetische Profil gewonnen wird. Versiegeln der Brunnen mit einem klaren Platte Klebstoff zur Verhinderung von Verdunstung und legen Sie die Test-Platte in eine Platte-Leser setzen auf 26 ° C.
- Inkubieren Sie die zellfreie Reaktionen für 3−6 während der Überwachung der entsprechenden fluoreszierende Erregung/Emission Wellenlängen entsprechend dem ausdrücklichen Protein h. Z. B. monitor bei Ex / Em = 485 nm/528 nm für SfGFP.
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Zellfreie Proteinexpression mRNA Bohrschablone
- Tauwetter mRNA Vorlage in Schritt 3.5.2 bei RT und Platz auf dem Eis vorbereitet.
- Führen Sie Schritt 4.1.1 durch Schritt 4.1.6 wie oben angegeben für lineare oder Plasmid DNA Schablone anhand Tabelle 4 einen alternative zellfreie Reaktion-master-Mix für mRNA Vorlage verfassen.
(5) Kalibrierung von V. Natriegens zellfreie Reaktionen mit sfGFP
Hinweis: Dieser Abschnitt ist optional. Die optimale zellfreie Reaktion Ionenkonzentration kann für jede grobe Extrakt Zubereitung anhand der Bedingungen zur Lyse der Zelle etwas variieren. Betrachten Sie das optionale zellfreie Reaktion Ion Kalibrierung Protokoll beschrieben unter Verwendung SfGFP wenn Reaktion Erträge deutlich niedriger sind als erwartet (Konzentrationen < 1,0 μg/mL) durchführen.
- Bereiten Sie den Mg2 + und K+ Ion Kalibrierlösungen gemäß Tabelle 5 in sterilen DI-Wasser aus dem 100-mM-Mg-Glutamat und 2.000 mM K-Glutamat-Bestände im Schritt 3.1.1 vorbereitet. Platzieren Sie Kalibrierlösungen auf Eis, bis benötigt.
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Nach der Kalibrierung Karte in Tabelle 6 1 μL Mg-Glutamat und 2 μL des K-Glutamat Ion Kalibrierlösungen pipette in die entsprechenden Vertiefungen in ein 384-Well-PCR-Platte.
- Die Reihenfolge der Vorgänge in diesem Schritt lautet wie folgt: Pipette die Mg-Glutamat Ion Kalibrierlösung in die Unterseite der einzelnen gut gefolgt von der K-Glutamat Ion Kalibrierlösung auf der Seite des gut ohne die Flüssigkeit in die Bohrungen bereits vorhanden.
- Versiegeln Sie die Brunnen durch Platzieren eines Klebers auf die Platte, um die Verdunstung während der Vorbereitung der Kalibrierung zellfreie Reaktion-master-Mix zu verhindern. Klopfen Sie leicht die 384-Well-Platte um die Mg und K-Glutamat-Kalibrierlösungen zu mischen.
Hinweis: Eine Repeater-Pipette wird dringend empfohlen, für die Durchführung dieses Schrittes, schnell und reproduzierbar.
- Bereiten Sie die Kalibrierung zellfreie Reaktion master-Mix wie in Tabelle 5 T7-pJL1-SfGFP Plasmid DNA Schablone in einer 2 mL-Tube mit angegeben. Jede Komponente in der folgenden Reihenfolge zu den master-Mix hinzufügen: Aminosäure-master-Mix, Energie-Lösung-master-Mix, T7-pJL1-SfGFP-DNA Schablone, PEG-8000, T7-RNA-Polymerase und RNase-Inhibitor. Streichen Sie sanft das Rohr nach jeder Komponente Zugabe zu mischen.
Hinweis: Fügen Sie keine Mg2 + oder K+ zur Kalibration zellfreien master-Mix. - Entfernen Sie den Kleber von der Platte. Sorgfältig pipette 7 μL der Kalibrierung zellfreie Reaktion master-Mix auf den Seiten der Brunnen ohne Berührung der gemischten Ion Kalibrierlösung bereits in den Brunnen vorhanden. Der Brunnen mit dem Klebstoff verschließen und 384-Well PCR Platte um die zellfreie master-Mix mit der Ionen-Kalibrierlösung mischen vorsichtig antippen.
Hinweis: Eine Repeater-Pipette wird dringend empfohlen, für die Durchführung dieses Schrittes, schnell und reproduzierbar. - Zentrifugieren Sie kurz die Platte 1.000 X g für 10 s, unvermischt Flüssigkeiten zu bündeln, die auf den Seiten der Brunnen gesteckt werden kann. Legen Sie die 384-Well-Platte in einem Thermocycler set bei 26 ° C mit einem beheizten Deckel bei 105 ° c eingestellt
- Inkubieren Sie die zellfreie Reaktionen für 3 h. Nach der Inkubation der Inhalt jedes gut auf einer schwarzen 384-Well-Assay-Platte mit Glas-Böden mit einer Multi-Kanal-Pipette übertragen und lesen die Fluoreszenz des SfGFP bei Ex / Em = 485 nm/528 nm mit einem Teller-Reader um die Ionen-Konzentration-Kombination zu ermitteln, die ergibt die höchste Menge an Protein.
Representative Results
Das beschriebene Protokoll für Protein-Produktion mit V. Natriegens zellfreie Expressionssystems kann von einem einzelnen Benutzer, Inokulation von Kultur an Protein für downstream-Anwendungen verfügbar ab in 1−2 Tagen ausgeführt werden. Vorbereitung der rohen Zellextrakte und master-Mix Bestände umfassen einen Großteil dieser Zeit; jedoch musste einmal bereit, die meisten Masse Reagenzien können gespeicherte langfristig (Tabelle 7) und verwendet je nach Bedarf, verkürzt die Zeit, füllen Sie das Protokoll.
Das beschriebene System Ausdruck eignet sich besonders mit Plasmid DNA Schablone oder mRNA durch in vitro Transkription Reaktionen erzeugt. Während lineare DNA auch als Vorlage für die Proteinproduktion verwendet werden kann, so erhält man deutlich geringere Menge an Protein. Beispielsweise kann bei optimalen Reaktionen Bedingungen bei 26 °C, eine einzelne 10 μL zellfreie Reaktion > 260 μg/mL SfGFP in 3 Stunden mit 0,3 Pmol von Plasmid DNA Schablone oder eine vergleichbare > 125 μg/mL SfGFP mit 14 Pmol von mRNA-Transkript (Abbildung 5A produzieren B). 0,3 Pmol lineare DNA produziert jedoch deutlich weniger Protein (< 20 μg/mL). Für jede Vorlage wird die Mehrheit des Proteins innerhalb 1−1.5 h hergestellt werden; Es wird jedoch empfohlen, Reaktion für ein Minimum von 3 Stunden läuft. Zellfreie Reaktion Konzentrationen von SfGFP waren bestimmt über lineare Regression mit einer gereinigten SfGFP Standardkurve Messung der Fluoreszenz bei Ex / Em = 485 nm/528 nm.
Die Ausbeute an Protein-Produktion wird wesentlich beeinflusst durch die Konzentration von Kalium und Magnesium-Ionen (K+ und Mg2 +, beziehungsweise). Unter optimierten Bedingungen festgestellt wurde, dass die optimale Mg2 + und K+ Ionenkonzentrationen 3,5 mM und 80 mM betragen werden (Abbildung 6A, B). Abweichungen von der optimalen Ionenkonzentrationen können dazu führen, dass eine verminderte Kapazität für zellfreie Expressionssystems, Protein mit nennenswerten Erträge zu produzieren. Zusätzliche Kalibrierung kann notwendig sein, wenn Reaktion Erträge deutlich niedriger sind als erwartet. Ein Fakultativprotokoll zur Ionen-Kalibrierung wird in Abschnitt 5 beschrieben. Dies ermöglicht eine gewisse Flexibilität bei der groben Zelle Extrakt Variabilität aus einzelnen Zelle Lysis Ausstattung und Konditionen entstehen, zu kompensieren.
Abbildung 1: eine Nahaufnahme von den Becher und Rohr Halter auf der Plattform Beschallung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beschallung Geräte Setup für die Vorbereitung der groben Zelle extrahieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: ein Blick auf das Pellet nach Beschallung und Zentrifugierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Flash-Dip für Auszug Lagerung einfrieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Vertreter ergibt sich für die V. Natriegens zellfreie Proteinsynthese mit verschiedenen Vorlagentypen. (A) Endpunkt der SfGFP Produktion mit äquimolaren Konzentrationen von Plasmid und lineare DNA-Vorlage (0,3 Pmol) sowie die steigenden Konzentrationen von mRNA Vorlage Assay. Zellfreie SfGFP Konzentration wurde anhand einer Standardkurve des gereinigten SfGFP gemessenen bei Ex / Em = 485 nm/528 nm nach 180 Minuten Inkubation bei 26 ° C bei optimalen Reaktionsbedingungen in 10 μL Volumen. (B) Kinetic Assay SfGFP Produktion mit äquimolaren Konzentrationen von Plasmid und lineare DNA Schablone sowie die steigenden Konzentrationen der mRNA-Vorlage. SfGFP Messungen wurden alle 3 Minuten bei Ex / EM = 485 nm/528 nm über 180 Minuten insgesamt Inkubationszeit bei optimalen Reaktionsbedingungen in 10 μL Volumen. Für Endpunkt und kinetic Assays wurden Proben leere mittels zellfreien Reaktionen ergänzt durch alle Komponenten außer Vorlage korrigiert. Der Mittelwert und die Standardabweichung dargestellt (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Vertreter ergibt sich für die Ionen-Konzentration-Kalibrierung. (A) V. Natriegens zellfreie Reaktionen wurden mit steigenden Konzentrationen von Mg2 + ergänzt und für 180 Minuten in 10 μL Reaktionen bei 26 ° C inkubiert. Die Gesamtkonzentration des K+ war 160 mM für alle Mg2 + Konzentrationen. Zellfreie SfGFP Konzentration wurde anhand einer Standardkurve des gereinigten SfGFP gemessenen bei Ex / Em = 485 nm/528 nm. (B) V. Natriegens zellfreie Reaktionen wurden ergänzt mit steigenden Konzentrationen von K+ und bei 26 ° C 180 min 10 μL Reaktionen inkubiert. Die Gesamtkonzentration an Mg2 + war 3,5 mM für alle K+ -Konzentrationen. Für beide Kalibrierungen waren Proben leer mittels zellfreien Reaktionen ergänzt durch alle Komponenten außer Vorlage korrigiert. Der Mittelwert und die Standardabweichung dargestellt (n = 3). Diese Zahl wurde von Wiegand Et Al.9geändert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Wiegand, D.J., Lee, H.H Ostrov, N., Kirche, zur Gründung einer zellfreien Vibrio Natriegens Expressionssystems G.M. ACS synthetische Biologie. 7 (10), 2475−2479 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Tabelle 1 | Vorbereitung der LB-V2 Bakterienwachstum Medien | ||
| Komponente | Menge (g) | Endkonzentration (mM) | Volumen (L) |
| LB-Bouillon (Miller) | 25 | 1 | |
| NaCl | 11.69 | 200 | |
| MgCl2 | 2.20 | 23.1 | |
| KCl | 0,31 | 4.2 | |
| Tabelle 1 | Vorbereitung der S30A Lysis Puffer | ||
| Komponente | Menge (g) | Endkonzentration (mM) | Volumen (L) |
| Tris-Lösung (pH 8,0) - 1 M (mL) * | 25 | 50 | 0,5 |
| Mg-Glutamat | 2,72 | 14 | |
| K-Glutamat | 6.10 | 60 | |
| Dithiothreitol (DTT) - 1 M (mL) * | 1 | 2 | |
Tabelle 1: Reagenzien für die Zubereitung von 1 L LB-V2 Bakterienwachstum Medien und 0,5 L des S30A Zelle Lysis Puffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei in Excel herunterladen.
| Vorbereitung von 10 x Energie-Lösung-Master-Mix | ||||
| Komponente | Lager-Konzentration (mM) | Endkonzentration (mM) | Menge (µL) | Endvolumen (µL) |
| HEPES-KOH pH 8 | 1750 | 500 | 1428,57 | 5000 |
| ATP | 100 | 15 | 750,00 | |
| GTP | 100 | 15 | 750,00 | |
| CTP | 100 | 9 | 450.00 | |
| UTP | 100 | 9 | 450.00 | |
| tRNA aus E. Coli MRE 600 (mg/mL) * | 100 | 2 | 100.00 | |
| Coenzym A Hydrat | 200 | 2.6 | 65.00 | |
| NAD | 200 | 3.3 | 82,50 | |
| cAMP | 650 | 7.5 | 57.69 | |
| Folinic Acid | 100 | 0,7 | 35.00 | |
| Spermidine | 1600 | 10 | 31,25 | |
| 3-PGA | 2000 | 300 | 750,00 | |
| Sterile deionisiertes Wasser | 49.99 | |||
| Vorbereitung von 4 x Aminosäure Master Mix | ||||
| Komponente | Lager-Konzentration (mM) | Endkonzentration (mM) | Menge (µL) | Endvolumen (µL) |
| ALA | 168 | 8 | 114,3 | 2400 |
| ARG | 168 | 8 | 114,3 | |
| ASN | 168 | 8 | 114,3 | |
| ASP | 168 | 8 | 114,3 | |
| GLN | 168 | 8 | 114,3 | |
| GLU | 168 | 8 | 114,3 | |
| GLY | 168 | 8 | 114,3 | |
| seine | 168 | 8 | 114,3 | |
| IIE | 168 | 8 | 114,3 | |
| LYS | 168 | 8 | 114,3 | |
| ERFÜLLT | 168 | 8 | 114,3 | |
| PHE | 168 | 8 | 114,3 | |
| PRO | 168 | 8 | 114,3 | |
| SER | 168 | 8 | 114,3 | |
| THR | 168 | 8 | 114,3 | |
| VAL | 168 | 8 | 114,3 | |
| TRP | 168 | 8 | 114,3 | |
| TYR | 168 | 8 | 114,3 | |
| LEU | 140 | 8 | 137.1 | |
| CYS | 168 | 8 | 114,3 | |
| Sterile deionisiertes Wasser | 91,4 | |||
Tabelle 2: Reagenzien für die Zubereitung von 5 mL 10 x Energielösung master-Mix und 2,4 mL 4 x Aminosäure-master-Mix. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei in Excel herunterladen.
| T7-RNA-Polymerase In Vitro Transkription Reaktionen | ||||
| Komponente | Lager (mM) | Endkonzentration (mM) | Menge (µL) 1 X Reaktion | Menge (µL) 50 X Reaktionen |
| 10 x RNAPol Reaktion Puffer | 1.00 | 50 | ||
| ATP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| GTP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| CTP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| UTP | 100 | 0,5 | 0.10 | 5 |
| DNA-Vorlage (ng/µL) * | 1000 | 500 | 0,50 | 25 |
| T7-RNA-Polymerase | 200 | 2.6 | 2,00 | 100 |
| RNase-Inhibitor, Murine | 200 | 3.3 | 0,50 | 25 |
| Sterile deionisiertes Wasser | 15.60 | 780 | ||
| Reaktionsvolumen (µL): | 20 | |||
Tabelle 3: In-vitro-Transkription Komponenten für mRNA Generation. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei in Excel herunterladen.
| Zellfreie Reaktion Master Mix | ||||
| Komponente | Lager-Konzentration (mM) | Endkonzentration (mM) | Menge (µL) 1 X Reaktion | Menge (µL) 50 X Reaktionen |
| Extrakt (%) * | 25 | 2.50 | 125.00 | |
| Mg-Glutamat | 100 | 3.5 | 0,35 | 17.50 |
| K-Glutamat | 2000 | 80 | 0,40 | 20.00 Uhr |
| 4 x Aminosäure Master Mix | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 |
| 10 x Energie-Lösung-Master-Mix | 1.00 | 50,00 | ||
| Plasmid DNA (ng/µL) * | 1000 | 500 | 0,50 | 25,00 |
| 50 % PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0,40 | 20.00 Uhr |
| T7-RNA-Polymerase | 1.00 | 50,00 | ||
| RNase-Inhibitor, Murine | 0.10 | 5,00 | ||
| Sterile deionisiertes Wasser | 1.25 | 62.50 | ||
| Reaktionsvolumen (µL): | 10 | |||
| Alternative zellfreie Reaktion Master Mix für mRNA Vorlage | ||||
| Komponente | Lager-Konzentration (mM) | Endkonzentration (mM) | Menge (µL) 1 X Reaktion | Menge (µL) 50 X Reaktionen |
| Extrakt (%) * | 25 | 2.50 | 125.00 | |
| Mg-Glutamat | 100 | 3.5 | 0,35 | 17.50 |
| K-Glutamat | 2000 | 80 | 0,40 | 20.00 Uhr |
| 4 x Aminosäure Master Mix | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 |
| 10 x Energie-Lösung-Master-Mix | 1.00 | 50,00 | ||
| mRNA-Vorlage (ng/µL) * | 2000 | 4000 | 2,00 | 100.00 |
| 50 % PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0,40 | 20.00 Uhr |
| RNase-Inhibitor, Murine | 0.10 | 5,00 | ||
| Sterile deionisiertes Wasser | 0,75 | 37,50 | ||
| Reaktionsvolumen (µL): | 10 | |||
Tabelle 4: Komponenten des optimierten V. Natriegens zellfreie Reaktion master-Mix für DNA Schablone und mRNA Vorlage. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei in Excel herunterladen.
| Mg 2 + Kalibrierung | Menge (µL) 1 X Reaktion | Menge (µL) 1 X Reaktion | Menge (µL) 100 X Reaktionen | Menge (µL) 100 X Reaktionen | |
| Finale (mM) | Lager | 100 mM Mg-Glu | diH 2 0 | 100 mM Mg-Glu | Entionisiertem H2O |
| 2.5 | 0 | 0.00 | 1.00 | 0 | 100 |
| 3.5 | 1 | 0.10 | 0.90 | 10 | 90 |
| 4.5 | 2 | 0,20 | 0,80 | 20 | 80 |
| 5.5 | 3 | 0,30 | 0.70 | 30 | 70 |
| Reaktionsvolumen (µL): | 10 | ||||
| K + Kalibrierung | Menge (µL) 1 X Reaktion | Menge (µL) 1 X Reaktion | Menge (µL) 100 X Reaktionen | Menge (µL) 100 X Reaktionen | |
| Finale (mM) | Lager | 2000 mM K-Glu | diH 2 0 | 2000 mM K-Glu | Entionisiertem H2O |
| 40 | 30 | 0,15 | 1,85 | 12 | 148 |
| 80 | 70 | 0,35 | 1.65 | 28 | 132 |
| 160 | 150 | 0,75 | 1.25 | 60 | 100 |
| 320 | 310 | 1,55 | 0,45 | 124 | 36 |
| Reaktionsvolumen (µL): | 10 | ||||
| Ionen-Kalibrierung zellfreie Reaktion Master Mix | |||||
| Komponente | Lager-Konzentration (mM) | Endkonzentration (mM) | Menge (µL) 1 X Reaktion | Menge (µL) 50 X Reaktionen | |
| Extrakt (%) * | 25 | 2.50 | 125.00 | ||
| Mg-Glutamat | Variable | Variable | 1.00 | 50,00 | |
| K-Glutamat | Variable | Variable | 2,00 | 100.00 | |
| 4 x Aminosäure Master Mix | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 | |
| 10 x Energie-Lösung-Master-Mix | 1.00 | 50,00 | |||
| Plasmid DNA (ng/µL) * | 1000 | 250 | 0,25 | 12.50 | |
| 50 % PEG-8000 (%) * | 50 | 2 | 0,40 | 20.00 Uhr | |
| T7-RNA-Polymerase | 1.00 | 50,00 | |||
| RNase-Inhibitor, Murine | 0.10 | 5,00 | |||
| Sterile deionisiertes Wasser | 0.00 | 0.00 | |||
| Reaktionsvolumen (µL): | 10 | ||||
Tabelle 5: Ionen-Konzentration Kalibrierung master Mix. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei in Excel herunterladen.
| CF-Ion Kalibrierung Karte | 40 mM K+ | 80 mM K+ | 160 mM K+ | 320 mM K+ | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| 2,5 mM Mg2 + | A | ||||||||||||
| 3,5-mM-Mg2 + | B | ||||||||||||
| 4,5 mM Mg2 + | C | ||||||||||||
| 5,5 mM Mg2 + | D | ||||||||||||
Tabelle 6: Ionen-Kalibrierung Karte. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei in Excel herunterladen.
| Lagerung und Haltbarkeit von CF-Komponenten | ||
| Komponente | Lagerort | Shelf-Life |
| Sterile LB-V2 Wachstumsmedien | 4 ° C | 3-6 Monate |
| V. Natriegens groben Zelle extrahieren | -80 ° C | 1-3 Wochen |
| 100 mM Mg-Glutamat | Raumtemp | 6 Monate |
| 2000 mM K-Glutamat | Raumtemp | 6 Monate |
| 50 % PEG-8000 | Raumtemp | 6 Monate |
| 10 x Energie-Lösung-Master-Mix | -80 ° C | 3-6 Monate |
| 4 x Aminosäure Master Mix | -80 ° C | 3-6 Monate |
| Plasmid/lineare DNA Schablone | -20 ° C | 6-12 Monate |
| mRNA Vorlage | -80 ° C | 3-4 Wochen |
Tabelle 7: Zellfreie Lagerbedingungen und Haltbarkeiten. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei in Excel herunterladen.
Discussion
Dieses Protokoll wurde für Wildtyp V. Natriegens und Bakterienwachstum Medien bestehend aus LB ergänzt mit V2 Salze (Table of Materials) optimiert. Andere Stämme von V. Natriegens können in ähnlicher Weise kultiviert werden, um grobe Zellextrakte für zellfreie Reaktionen zu erzeugen; Ihr Einsatz erfordert jedoch zusätzliche Optimierung dieses Protokolls. Darüber hinaus wurde dieses zellfreien Protein Ausdruck System optimiert, mit 3-Phosphoglyceric-Säure (3-PGA) als die primäre Energiequelle für die Regeneration. Andere Energiequellen Regeneration können verwendet werden; Optimierung von Reagenzien und Kalibrierung werden jedoch wahrscheinlich zu hoch ertragreiche Protein Ausdruck10,11erwerben.
Besondere Aufmerksamkeit auf einige wichtige Schritte in diesem Protokoll sorgt für maximale Extrakt Produktivität für ertragreiche zellfreien Protein-Produktion. Zunächst groben Zelle extrahieren muss bereit sein, von V. Natriegens Zellkulturen geerntet in eine Mitte-exponentielle Wachstumsphase; Proteinausbeute ist maximal, wenn Kulturen eines OD600 erreichen = 1,0 ± 0,2. Während zellfreien Protein-Produktion von Zellen in einem Bereich der optischen Dichte möglich ist, haben wir bereits festgestellt, dass Zellen in einem exponentiellen Wachstum deutlich mehr Protein9ergeben. Die beobachteten Effekte der optischen Dichte auf Rohöl Zellleistung Extrakt entsprechen denen anderer zellfreie Expressionssysteme Zellen gezüchtet in Batch-Kultur-Bedingungen-1abgeleitet. Da V. Natriegens rasant wächst, ist es wichtig zu optischen Dichte der Kulturen verfolgen. Im Allgemeinen wird erwartet, dass V. Natriegens Kulturen reproduzierbar ein OD600 von 1,0 in 1−1.5 h unter Verwendung dieses Protokolls erreichen sollte; allerdings verblüfft individuelle Wachstumsbedingungen wie die Verwendung von versus nicht ratlos Flaschen, welche Affekte Belüftung oder Luft im Vergleich zu Wasser Inkubation, betrifft die Geschwindigkeit und Stabilität der Inkubationstemperatur Wachstumszeit verändern können. Darüber hinaus empfiehlt es im allgemeinen Kultur mindestens 250 mL V. Natriegens in einem 1 L ratlos Kolben um eine große Zelle Pellet bei der Ernte für einfache Handhabung und Übertragung zu gewährleisten. Dies verbessert den Erfolg der groben Zelle Extrakt Zubereitung sowie steigt das Gesamtvolumen der Auszug aus einem Pellet hergestellt. Bei der Verwendung von kleineren Maßstab Vorbereitung können Kulturbedingungen und Reagenzien entsprechend angepasst werden. Für die groß angelegte Gärung weitere sein Optimierung der Kulturbedingungen erforderlich. Schließlich um proteinreiche Ausbeute zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die Zelle Pellets sofort nach der Ernte oder innerhalb von 1−2 Tagen Lagerung bei-80 ° c verarbeitet werden
Die richtige lyse der Zelle Pellet durch Puls Ultraschallbehandlung ist entscheidend für den Erfolg der zellfreien Proteinexpression und ist oft der schwierigste Aspekt dieses Protokolls für neue Benutzer. Ein gut lysierten Pellet wird in der Regel einen signifikanten Teil der Flüssigextrakt hervorbringen, die frei von Fremdkörpern ist. Der Extrakt sollte leicht viskose aber kann leicht pipettiert werden, wenn Rohre Aliquotierung Einlagerung vor Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Abbildung 3 zeigt eine Darstellung eines gut lysierten Pellet (Abbildung 3A) im Vergleich zu einem schlecht lysierten Pellet (Abb. 3 b) nach der Post Lyse Zentrifugationsschritt. Ein wichtiger Indikator für vollständige Zelle Lysis ist eine grobe Zelle extrahieren Gesamtprotein Konzentration > 20 mg / mL eine Gesamt-Protein Assay (Schritt 2.13) bestimmt. Übermäßige Anwendung von Ultraschall oder übermäßige Erhitzung des groben Zelle Extraktes beschädigen die zelluläre Maschinerie, die ohne Durchführung einer zellfreien Reaktion nicht ermittelt werden kann. Daher ist es sehr vorteilhaft, Extrakt Effizienz mit einem Kontrollreaktion bevor widmet viel Zeit und Mühe auf nachgelagerten Protein Ausdruck Anwendungen testen. Zusätzliche Optimierung für verschiedene Beschallung Geräte erforderlich sind, wurden die beschriebenen Schritte zur Beschallung der Puls hoch reproduzierbare in unseren Händen.
Die Verwendung von linearen DNA-Vorlage abgeleitet von PCR-Amplifikation, Restriktionsenzym verdauen oder kommerzielle Gensynthese kann die Kapazität für hohen Durchsatz und schnelle Proteinproduktion in zellfreien Ausdruck Systeme24deutlich erhöhen. Während Protein-Produktion von PCR amplifizierten lineare Vorlage wurde nachgewiesen, die Ausbeute dieser Reaktionen sind etwa 13.5-fold niedriger im Vergleich zu Reaktionen mit Plasmid DNA Schablone äquimolaren Verhältnisse9. Dies ist in erster Linie aufgrund der Instabilität der linearen DNA-Vorlage dürfte abgebaut durch endogene Nukleasen in V. Natriegens groben Zelle extrahieren vorhanden. Während des Lambda-Phagen Protein GamS hat früher zum Schutz der lineare DNA Schablone24,25, ergab für unvereinbar mit V. Natriegens 9extrahiert. Darüber hinaus während Erhöhung der Konzentration von linearen DNA Schablone für einen höheren Eiweiß-Ertrag ermöglichen, werden seinen schnellen Abbau in groben Zelle Extrakt nach wie vor ein großes Problem.
Eine Lösung zur Überwindung der linearen DNA Schablone Verschlechterung möglicherweise zellfreie Reaktionen mit mRNA Vorlage generiert aus in-vitro-Transkription von linearen DNA zu ergänzen. Auf der anderen Seite die Verwendung von ein RNase-Inhibitor bietet erhebliche Schutz gegen mRNA-Transkript-Abbau und spürbare Protein Erträge erhalten Sie in den 10 μL zellfreie Reaktion Format (Abbildung 5AB). Klonen von linearen DNA in eine kreisförmige Vorlage durch TA Ligation, können TOPO Klonen, Golden Gate Montage oder Rekombination Methoden zur Vorlage Abbau zu umgehen. Dennoch werden weitere Ansätze zur Hemmung der Aktivität der Nuklease für effiziente Proteinexpression mit linearen DNA Schablone erforderlich sein.
Bisher wurden verschiedene Ansätze zur Vorbereitung von Rohöl Extrakt zellfreien Protein Ausdruck9,10,11,26vorgeschlagen. Bei der Entwicklung dieses Protokolls, haben wir versucht, maximale Zugänglichkeit Benutzer, reduzieren Gesamtkosten und zeitaufwändigen Schritte zu minimieren. Zum Beispiel ein hohen Protein-Ertrag erfolgt über einen einfachen Schritten Beschallung-Zentrifugation und erfordert keine Zelle Homogenisatoren, langwierige Dialyse Schritte oder Run-off Reaktion. Es ist einfach, in kurzer Zeit auszuführen und erfordert keine hohe Labor Kompetenz. So kann es helfen, zellfreie Ausdruck als Standard für die translationale Forschung und industrielle Prozess-Design zu erleichtern.
Dieses Protokoll erweitert das Toolkit für Untersuchung und den Nutzen von V. Natriegens, nicht-Modellorganismus mit einzigartigen biologischen Eigenschaften zur Verfügung. Höherer Eiweiß-Ertrag erzielt werden, durch den Einsatz von halb - oder voll-ständige zellfreie Reaktionen zu ermöglichen, Energierückgewinnung, Nachschub von Aminosäuren und die Beseitigung der Abfallprodukte3,5,27. Darüber hinaus könnte das Engineering von Wildtyp V. Natriegens , DNAse oder RNAse-defizienten Stämme produzieren, Entfernung von schädlichen und konkurrierenden Stoffwechselwege und Ausdruck der zusätzlichen tRNAs erheblich die Produktion von Proteinen in verbessern Dieses System28,29. Da wir die Biologie zugrunde liegenden seines schnellen Wachstums entwirren, kann Weiterentwicklung von V. Natriegens zellfreien Systemen Bioproduktion Fähigkeiten zu beschleunigen und ermöglichen robuste Ausdruck der therapeutischen Peptide, small Molecules und synthetische Materialien.
Disclosures
DJW, Nein, und GMC haben meldete ein Patent im Zusammenhang mit dieser Arbeit.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 und Abteilung von Energie-DE-FG02-02ER63445 finanziert. Die Autoren möchten Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam und Dr. Edgar Goluch Danke für hilfreiche Tipps zu konstruieren die Protokoll-Abschnitt des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Tubes | Corning | 352196 | |
| 2 mL Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| 384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
| 384-well PCR Plates | Eppendorf | 951020702 | |
| 50 mL Tubes | Corning | 352070 | |
| 96-well PCR Plates | Eppendorf | 30129300 | |
| Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate | Sigma | A6885 | |
| Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler | ThermoFisher | 4388444 | |
| Assay Plate Adhesives | BioRad | MSB1001 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma/Roche | 10127965001 | |
| Coenzyme A hydrate | Sigma | C4283 | |
| Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma | P8877 | |
| Dewar Flask - 4L | ThermoScientific | 10-194-100C | |
| DL-Dithiothreitol solution - 1 M | Sigma | 42816 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma | 47612 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | A6283 | |
| Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate | Sigma | 49605 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma | G1149 | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Plasmid pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
| Plasmid Plus Maxi kit | Qiagen | 12963 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 | Sigma | 89510 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Potassium hydroxide Pellets | Sigma/Roche | 1050121000 | |
| Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip | Qsonica | 4422 | |
| RNA Clean and Concentrator Kit | Zymo | R1013 | |
| RNase Inhibitor, Murine | NEB | M0314 | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T7 RNA Polymerase | NEB | M0251 | |
| Tris Solution (pH 8.0) - 1 M | Invitrogen | AM9856 | |
| tRNA from E. coli MRE 600 | Sigma/Roche | 10109541001 | |
| Uridine 5'-triphosphate - 100 mM | NEB | N0450L | |
| Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock | ATCC | 14048 |
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