Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Celle-fri Protein udtryk ved hjælp af hurtigt voksende bakterie Vibrio natriegens

Published: March 14, 2019 doi: 10.3791/59495
Automatic Translation
1,2, 1, *1, *1,2
1Department of Genetics, Harvard Medical School, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering
* These authors contributed equally

Summary

Celle-fri udtryk systemer er kraftfulde og omkostningseffektive værktøjer til høj overførselshastighed syntese og screening af vigtige proteiner. Her beskriver vi udarbejdelsen af celle-fri protein udtryk system ved hjælp af Vibrio natriegens til hurtig protein produktion ved hjælp af plasmid DNA, lineære DNA og mRNA skabelon.

Abstract

Marine bakterien Vibrio natriegens har høstet stor opmærksomhed som en spirende mikrobielle vært for bioteknologien på grund af sin hurtige vækst. En generel protokol er beskrevet til fremstilling af V. natriegens rå celle ekstrakter ved hjælp af fælles laboratorieudstyr. Denne høje højtydende protokol har været specielt optimeret til brugeren tilgængelighed og lavere omkostninger. Celle-fri proteinsyntesen (CFPS) kan udføres i lille skala 10 μL batch reaktioner i enten en 96 - eller 384-godt format og reproducerbar giver koncentrationer af > 260 μg/mL super mappen normal god landbrugspraksis (sfGFP) inden for 3 h. samlet, rå celle uddrag forberedelse og CFPS kan opnås i 1−2 fulde dage af en enkelt bruger. Denne protokol kan let integreres i eksisterende protein syntese rørledninger til at lette fremskridt inden for bio-produktion og syntetisk biologi applikationer.

Introduction

Celle-fri proteinsyntesen er en alsidig og omkostningseffektiv metode til udtryk af værdifulde proteiner eller peptider1,2,3,4. Celle-fri proteinsyntesen har historisk set udført ved hjælp af Escherichia coli udtryk systemer; dog har der været en nylig bølge i brugen af alternative, ikke-model organismer med nye egenskaber som kabinet for celle-fri udtryk5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismer med unikke metaboliske profiler er prime kandidater som alternativer til E. coli celle-fri systemer. For eksempel, fordobling marine bakterien Vibrio natriegens er det hurtigst voksende alle kendte organismer med en observerede tid på mindre end 10 min.13. Dette har høstet V. natriegens stor opmærksomhed som en spirende mikrobielle vært for forskning og bioteknologi14,15,16,17,18. Betragtning af, at den hurtige vækst af V. natriegens har været knyttet til høje priser af proteinsyntesen og metaboliske effektivitet19,20,21, udnytte dets cellulære maskiner til celle-fri Sammenfattende kan betydeligt udvide toolkit for hurtig protein produktion og høj overførselshastighed screening.

For nylig, en celle-gratis V. natriegens ekspressionssystem har påvist som er i stand til at producere super mappen normal god landbrugspraksis (sfGFP) i koncentrationer på > 260 μg/mL i 3 h med en T7 promotor9. Det overordnede formål at udvikle denne metode var at give brugere med et meget tilgængeligt, omkostningseffektiv, reproducerbare og højtydende celle-fri protein udtryk, der kan forberedes ved hjælp af fælles lab udstyr i en kort tid. Denne protokol udnytter 1 L kulturer i ryste kolber, celle lysering af pulse ultralydbehandling og små batch reaktioner i en 96 - eller 384-godt format at maksimere parallelization og screening overførselshastighed. En lang og vedvarende protein udtryk er muliggjort af tilskud af 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) som en energi kilde8,22,23. Efter endt denne protokol, en bruger vil have mulighed for at udtrykke en ønskede protein eller sæt af proteiner i en celle-fri format ved hjælp af V. natriegens rå celle uddrag.

Start fra en glycerol bestand, V. natriegens rå celle ekstrakter er fremstillet af celler høstet ved en optisk tæthed på 600 nm (OD600) 1.0. En 1 L kultur vil give ca 2−3 mL ekstrakt, som er tilstrækkelig for mere end 800 celle-fri reaktioner på 25% rå celle ekstrakt. Proteiner kan udtrykkes ved hjælp af plasmid DNA, lineære DNA eller mRNA skabelon; lineære DNA skabelon nedbrydning af endogene nukleaser er imidlertid en stor ulempe ved brug af vildtype V. natriegens celle-fri ordning9. Startende fra V. natriegens kulturer, kan protein brugbar for downstream applikationer opnås ved en enkelt bruger i 1−2 hele dage.

Protocol

1. fremstilling af V. natriegens rå celle ekstrakter – bakteriekulturen

  1. Forberede V. natriegens bakteriel vækst medier LB-V2 ifølge tabel 1. Sterilisere vækst medier ved autoklavering. Tillad medier til at nå til stuetemperatur (RT). Gemme overskydende medier på RT.
    Forsigtighed: Bære passende personlige værnemidler (PPE) og konsultere lab specifikke instrukser, når de opererer en autoklave.
  2. Bruge en glycerol bestand af vildtype V. natriegens til podes 3 mL af LB-V2 medier. Vokse natten over ved 30 ° C under omrystning ved 225 rpm.
  3. Vask 1 mL af overnight kultur ved centrifugering ved 10.600 x g på en benchtop centrifugeres i 1 min. aspirat supernatanten uden at forstyrre den resulterende pellet og resuspend i 1 mL frisk LB-V2 medier.
  4. I en autoklaveres 4 L tilføje forbløffet Erlenmeyerkolbe med steril cover, 1 L af frisk LB-V2 vækst medier. Podes med 1 mL vasket overnight kultur (1:1, 000 fortyndingsforholdet). Vokse kultur ved 30 ° C under omrystning ved 225 rpm.
    Bemærk: V. natriegens kulturer kan skaleres op eller ned samtidig med at 1:1,000 fortyndingsforhold. For eksempel tilføje 250 μL af vasket overnight kultur til 250 mL frisk LB-V2 vækst medier i en 2 L forbløffet Erlenmeyerkolbe med steril dækning.
  5. Overvåge den kultur OD600 bruger et spektrofotometer. Når kultur når OD600 = 1,0 ± 0,2, høst kultur via centrifugering ved 3.500 x g i 20 min. ved 4 ° C. Sted pellet på is.
    Bemærk: V. natriegens vokser hurtigt, så tæt overvågning af kulturen er nødvendigt. Vækst at OD600 = 1,0 bør tage ca 1.5−2 h på 1:1,000 fortyndingsforhold.
  6. Opsug supernatanten og umiddelbart gemme den resulterende bakteriel pellet ved-80 ° C eller direkte videre til celle lysis beskrevet i afsnit 2.
    Bemærk: Dette trin er en god standsested; Det anbefales dog at pellet behandles straks eller senest 1−2 dage for de bedste resultater.

2. fremstilling af V. natriegens rå celle ekstrakter-celle Lysis

  1. Forberede S30 lysisbuffer ifølge tabel 1 i sterile deioniseret vand (DI) vand og justere pH til 7.7 ved hjælp af iseddike.
    Forsigtighed: Iseddike bør håndteres med ordentlig PPE, når justere pH.
  2. Cool S30 lysisbuffer til omtrent 4 ° C i køleskab eller på is før du begynder proceduren celle lysering.
    Bemærk: For en hurtig cool ned lysis kan buffer placeres på-20 ° C. Tillad ikke bufferen til at fryse.
  3. Placer celle pellets på isen i 10−20 min eller indtil helt optøet. Resuspend alle pellets fra samme 1 L kultur ved hjælp af 10 mL af kolde S30 lysisbuffer og derefter overføre suspension til en 50 mL tube. Hvis pellets ikke er frosset i fryseren ved-80 ° C i trin 1,6, så gå direkte til resuspension.
    Bemærk: Øge mængden af S30 lysisbuffer bruges til i første omgang resuspend pellets efter behov.
  4. Centrifuge suspension ved 3.500 x g i 10 min. ved 4 ° C. Opsug supernatanten uden at forstyrre pelleten. Vaske pelleten endnu en gang ved hjælp af 10 mL af kolde S30 lysisbuffer. Sted pellet på is.
  5. I et koldt rum, tilsættes 500 μl kolde S30 lysisbuffer pellet i 50 mL tube. Brug en wide-bore pipette tip, resuspenderes og omhyggeligt overføre hele pellet suspension til en 2 mL tube.
    Bemærk: Hvis en bred bore pipette er ikke tilgængelige, brug et par saks til at skære i slutningen af en 1 mL pipette tip at øge boring for pellet overførsel.
    1. Overføre så meget pellet som muligt uden væsentligt øge mængden; dog bør pellet genopslemmes i nok væske til at være sonicated, som det fremgår af en homogen suspension i 2 mL tube. Fyld ikke for meget 2 mL tube. Suspensionen bør ikke overstige 1,5 mL; opdelt i flere rør, hvis nødvendigt.
  6. Holde den celle pellet på is og arbejde i et koldt rum. Fyld et 600 mL bægerglas med is og Placer en 2 mL tube holder oven på isen.
    Bemærk: Det er nyttigt at placere tube holder nær side af bægerglasset, så pellet suspension vil være synlige i isen til at overvåge sonikering fremskridt (Se figur 1).
  7. Vortex suspenderet pellet i 2 mL tube kortvarigt at homogenisere cellerne, flick rør til at fjerne enhver celler på bunden af fælles landbrugspolitik, og placere i tube indehaveren med hætte åben. Lavere sonikator tip til suspension, således at det er lige under den væske overflade.
  8. Forberede sonikering set-up, som afbilledet i figur 2 ved hjælp af en sonikator og sonde med ⅛-tommer tip diameter. De følgende indstillinger i kontrolelementet sonikator: 20 kHz frekvens og 50% amplitude, puls på tid: 10 s, pulse OFF tid: 60 s.
  9. Kør pulsen sonikering protokol til tre cykler. Hvis den samlede mængde af pellet suspension er > 500 μL, køre puls sonikering protokol seks gange.
    Bemærk: Generelt, 3−6 bælgfrugter er tilstrækkelig til at lyse V. natriegens pellets; yderligere impulser kan være påkrævet afhængigt af sonikator. Bruge justering knob platform under sonikering, for at flytte sonden op og ned til at lyse ethvert pellet, der kan have udlignet til bunden af røret. Røret kan blive fjernet fra den indehaveren og kortvarigt vortexed re homogeniseres suspension i mellem pulser. Se diskussion nedenfor for ønskede konsistens af sonicated celler.
    Forsigtighed: Bære passende høreværn, når sonikator er aktiv.
  10. Efter ultralydbehandling ekstrakt centrifugeres rå celle på 16.000 x g i 30−45 min. ved 4 ° C, eller indtil lysate er fri for enhver cellular vragdele afbilledet i figur 3.
  11. I et koldt rum, alikvot 50 μL af de resulterende supernatanter til nyt 2 mL rør uden at forstyrre pelleten.
    Bemærk:     eventuelle rester, der er overført ved et uheld i de nye 2 mL rør vil drastisk reducere ekstrakts kapacitet for høj højtydende proteinsyntesen.
    1. Valgfrit, der er afsat 10 μL af celle uddrag for post lysis protein kvantificering i en separat 2 mL tube (Se trin 2.13 nedenfor).
  12. Flash fryse rå celle uddrag ved at placere rør ind i en tube holder med dypning strengen vedlagt som afbilledet i figur 4. Dykke rør ind i en Dewar, som indeholder flydende nitrogen og umiddelbart sted i en fryser ved-80 ° C indtil brug.
    Forsigtighed: Anvende passende PPE til håndtering af flydende kvælstof herunder laboratoriekittel, beskyttelsesbriller, ansigtsskærm, cryogen forklæde og handsker.
  13. Valgfrit, kvantificere den total protein i cellen lysate ved hjælp af 10 μL indstillet bortset fra trin 2.11.1 ved fortynding af prøven 1: 100 i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og bruge enhver standard total protein kvantificering assay som Bradford assay, bicinchoninic syre assay (BCA), osv.

3. forberedelse af celle-fri reaktion komponenter

  1. Generelle reaktion komponenter
    1. Forberede arbejder bestande af Mg-glutamat og K-glutamat i 50 mL rør med steril DI vand i koncentrationer på 100 mM og 2000 mM, henholdsvis.
    2. Forbered en arbejde status over 50% (w/v) polyethylenglycol (PEG)-8000 ved at tilføje 100 mL sterilt DI vand til et 250 mL bægerglas. Placer en lille magnetomrører i bægerglasset. Afvejes 50 g PIND-8000 og tilsættes 100 mL vand i bægerglasset.
    3. Bægerglasset anbringes på et opvarmet rør plade sæt til 100 ° C og rør på 250 omdr. / min., indtil PIND-8000 er i opløsning. Tillad PIND-8000 flydende blanding at køle før overførsel til 50 mL rør.
  2. Energi løsning master mix
    1. Forbered en 5 M opløsning af KOH ved at tilføje 140 g KOH pellets til 500 mL sterilt DI vand.
      Forsigtighed: Forberede denne løsning i en kemisk hætte og bære PPE ved omgangen med stærke baser. Løsningen bliver varm så den flaske cap skal være løs for at undgå pres oprustning. Tillad KOH løsning at nå RT før brug.
    2. Forbered en 1750 mM HEPES-KOH buffer ved at tilføje 20.85 g af HEPES til en 100 mL flaske. Langsomt tilføje sterile Deioniseret vand, indtil volumen når 40 mL. Vortex flaske til at opløse HEPES. Brug 5 M KOH løsning til justeres til pH 8,0 og derefter bringe løsning lydstyrken til 50 mL.
      Forsigtighed: KOH bør håndteres med ordentlig PPE, når justere pH.
    3. Forberede de resterende 10 x energi master mix bestand komponenter på de koncentrationer, der er angivet i tabel 2 i sterile DI vand og placere hver bestand på is. Optø 100 mM ATP, GTP, CTP og UTP bestandene på RT og sted på is.
      Bemærk: En thermomixer sat til 37 ° C og 350 rpm kan bruges til at opløse reagenser i løsning hvis det er nødvendigt. Ikke overophede eller forlade reagenser på thermomixer for en længere periode.
    4. I en 15 mL tube, tilføje hver energi løsning master mix komponent i henhold til ordre og mængden angivet i tabel 2. Vortex løsning efter hver komponent er tilføjet. Dette vil gøre 5 mL 10 x energi løsning master mix.
    5. Opdele 10 x energi løsning master mix i 200 μl delprøver i 2 mL rør. Flash fryse hver delprøve, som udføres i trin 2.12. Umiddelbart Placer dem i-80 ° C fryser indtil brug.
  3. Aminosyre master mix
    1. For at forberede frisk 4 x aminosyre master mix, begynde ved optøning hver aminosyre bestand på RT og derefter placere hver på is. Bruge en vortex thermomixer indstillet på 37 ° C og 350 rpm at sikre alle aminosyre bestande er helt opløst.
      Bemærk: Cystein kan ikke fuldt opløses; Det kan tilføjes til aminosyre master mix som en suspension. Ikke overophede eller forlade reagenser på thermomixer for en længere periode.
    2. I en 15 mL tube, tilføje de passende mængde aminosyrer sterile DI vand så endelig koncentration af hver er 8 mM i følgende rækkefølge: ALA, ARG, ASN, ASP, Localisation, GLU, GLY, hans, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU og CYS. Når du har føjet hver aminosyre, vortex master mix løsning. De mængder, der er anført i tabel 2 udgør 2,4 mL af aminosyre master mix.
    3. Opdele 4 x aminosyre master mix i 200 μl delprøver i 2 mL rør. Flash fryse hver delprøve, som udføres i trin 2.12. Umiddelbart Placer i en fryser ved-80 ° C indtil brug.
  4. Produktion af reaktion-ready plasmid DNA skabelon
    Bemærk: Celle-fri protein udtryk i dette system er blevet optimeret ved hjælp af super mappe grøn fluorescerende proteiner (NGL) udtryk vektor T7-pJL1-sfGFP (Tabel af materialer). Det anbefales at anvende denne plasmid som kontrol for celle-fri reaktion effektivitet og pJL1 rygraden for kloning og udtryk for andre protein-sekvenser. Andre plasmid DNA skabeloner kan anvendes; Det er dog vigtigt at bemærke, at transskription er kontrolleret af en T7 promotor sekvens og tilstedeværelsen af T7 RNA polymerase. En simpel protokol til storproduktion af enhver plasmid DNA skabelon fra transformerede E. coli er beskrevet nedenfor.
    1. Rense ønskede vektor ved hjælp af en plasmid rensning kit som pr fabrikantens anvisninger (Tabel af materialer).
      Bemærk: At koncentrere plasmid DNA skabelonen så meget som muligt anbefales at opfylde stram volumen begrænsninger af den celle-fri reaktion. Generelt sigte til en 750−1500 ng/μl arbejder bestand.
  5. Produktion af reaktion-ready mRNA skabelon
    Bemærk: Dette afsnit er valgfri. Protein udtryk er blevet testet ved hjælp af mRNA skabelon genereret fra in vitro-transkription af plasmid T7-pJL1-sfGFP af den børsnoterede T7 RNA-polymerase (Tabel af materialer).
    1. Forberede mRNA skabelon fra plasmid DNA kodning proteiner af interesse ved hjælp af in vitro-transskription reaktion komponenter i tabel 3. Inkuber reaktioner i 1 timer ved 37 ° C i en thermocycler.
      Bemærk: Det anbefales at udføre 8−10x af disse reaktioner i parallel til at generere nok materiale.
    2. Samle alle transskription reaktioner. Rense, ved hjælp af et mRNA rensning og koncentrator kit som pr fabrikantens anvisninger (Tabel af materialer). Elueres mRNA skabelon i sterile osmosevand. Butik mRNA skabelon ved-80 ° C indtil brug.

4. udførelse af celle-fri Protein Eexpression reaktioner bruger V. natriegens rå ekstrakt

  1. Celle-fri protein udtryk ved hjælp af plasmidet eller lineære DNA-skabelon
    1. Fjerne 10 x energi løsning master mix og 4 x aminosyre master mix delprøver fra-80 ° C fryseren, tø på RT, og Anbring på is. Fjern T7 RNA polymerase og RNase hæmmer bestande fra-20 ° C fryser og Anbring på is. Tø DNA skabelon på RT og sted på is.
    2. Forberede en celle-fri reaktion master mix ifølge tabel 4 ved at føje hver komponent i følgende rækkefølge til en 2 mL tube på is: aminosyre master mix, energi løsning master mix, Mg-glutamat, K-glutamat, DNA skabelon, PIND-8000, T7 RNA polymerase og RNase hæmmer. Forsigtigt svirp røret efter hver tilsætning til master mix.
      Bemærk: Tilføj 5−10x mere materiale i forhold til plasmid skabelon at opnå mærkbare udbytter af protein, hvis lineær skabelon skal bruges til celle-fri protein udtryk.
    3. Fjerne V. natriegens rå celle lysate udarbejdet i trin 2.12 fra-80 ° C frysere og sted på isen i 10−20 min. indtil optøet. Tilføje den passende mængde rå celle uddrag til celle-fri reaktion master mix ifølge tabel 4 og forsigtigt blandes ved at bladre eller pipettering op og ned.
    4. End-point celle-fri protein udtryk ved hjælp af thermocycler
      1. Tilsæt 10 μl af celle-fri reaktion master mix til bunden af en 96 - eller 384-godt PCR plade. I mellem hver overførsel til PCR-plade, mix master mix af svippede røret forsigtigt.
        Bemærk: Celle-fri reaktion master mix bør være godt blandet på alle tidspunkter for at maksimere reaktion reproducerbarhed og celle-fri protein udtryk i alle prøver.
    5. Kort centrifugeres plade ved 1.000 x g i 10 s til at samle alle master mix, der kan blive fast på siderne af brøndene. Forsegle brønde med en plade klæbemiddel til at forhindre fordampning og derefter placere PCR-plade i en thermocycler sat på 26 ° C med en opvarmet låg, indstillet til 105 ° C.
      Bemærk: Selv varmefordeling og opvarmet låg af en thermocycler i høj grad forbedrer protein udtryk udbytter.
    6. Inkuber de celle-fri reaktioner for et minimum af 3 h. Efter inkubationen kan udtrykte proteiner være renset, kvantificeres og anvendes til downstream processer.
      Bemærk: Udtrykte proteiner kan kvantificeres direkte i celle-fri reaktion ved hjælp af en metode af brugerens valg. For eksempel, fluorescerende proteiner kan kvantificeres ved hjælp af en ekstern standardkurve eller radioaktivitet kan måles, hvis bruger en radiolabeled aminosyre i celle-fri reaktion. UV-synlige spektroskopi eller total protein assays er generelt ikke anbefales til direkte måling af proteinproduktionen i celle-fri reaktioner uden en indledende rensning.
    7. Alternativt kan du overvåge celle-fri protein udtryk kinetik ved hjælp af en Pladelæser.
      1. Tilsæt 10 μl af celle-fri reaktion master mix til bunden af en sort 384-godt assay plade med klart glas bund. Holde assay pladen på is eller arbejde i et koldt rum under tilføjelse af master mix for at sikre, at den fulde kinetiske profil er opnået. Forsegle brønde med en tydelig plade klæbemiddel til at forhindre fordampning og derefter placere assay plade i en Pladelæser fastsat til 26 ° C.
    8. Inkuber de celle-fri reaktioner til 3−6 h mens overvågningen passende fluorescerende excitation/emission bølgelængder svarende til de udtrykte proteiner. For eksempel, overvåge på Ex / Em = 485 nm/528 nm for sfGFP.
  2. Celle-fri protein udtryk ved hjælp af mRNA skabelon
    1. Tø mRNA skabelon udarbejdet trin 3.5.2 ved RT og sted på is.
    2. Udføre trin 4.1.1 til 4.1.6 som tidligere angivet for lineær eller plasmid DNA skabelon ved hjælp af tabel 4 til at forberede en alternativ celle-fri reaktion master mix til mRNA skabelon.

5. kalibrering af V. natriegens celle-gratis reaktioner med sfGFP

Bemærk: Dette afsnit er valgfri. Optimal celle-fri reaktion ion koncentration kan variere en smule for hvert rå ekstrakt præparat baseret på de betingelser, der anvendes til celle lysering. Overveje at udfører den valgfri celle-fri reaktion ion kalibrering protokollen beskrevet nedenfor ved hjælp af sfGFP, hvis reaktion udbytter er betydeligt lavere end forventet (koncentrationer < 1,0 μg/mL).

  1. Forberede Mg2 + og K+ ion kalibreringsopløsningerne som angivet i tabel 5 i sterile DI vand fra 100 mM Mg-glutamat og 2.000 mM K-glutamat bestande forberedt i trin 3.1.1. Placer kalibreringsopløsningerne på is, indtil det skal bruges.
  2. Efter kalibrering kort i tabel 6, afpipetteres 1 μL af Mg-glutamat og 2 μl af K-glutamat ion kalibreringsopløsninger i de passende brønde i en 384-godt PCR plade.
    1. Rækkefølgen af operationer i dette trin er som følger: Pipette Mg-glutamat ion kalibreringsopløsningen ind i bunden af hver godt efterfulgt af K-glutamat ion kalibreringsopløsningen på siden af godt uden at røre den flydende allerede er til stede i brøndene.
    2. Forsegle brøndene ved at placere et klæbemiddel på toppen af pladen til at forhindre fordampning samtidig med at forberede kalibrering celle-fri reaktion master mix. Tryk forsigtigt på 384-godt plade for at blande kalibreringsopløsningerne Mg - og K-glutamat.
      Bemærk: En repeater pipette er stærkt anbefales til at fuldføre dette trin reproducerbar og hurtigt.
  3. Forberede kalibrering celle-fri reaktion master mix som angivet i tabel 5 bruger T7-pJL1-sfGFP plasmid DNA skabelon i et 2 mL tube. Tilføje hver komponent i følgende rækkefølge til master mix: aminosyre master mix, energi løsning master mix, T7-pJL1-sfGFP DNA skabelon, PIND-8000, T7 RNA polymerase og RNase inhibitor. Forsigtigt svirp tube blandes efter hver komponent tilsætning.
    Bemærk: Tilføjer ikke Mg2 + eller K+ til kalibreringen celle-gratis master mix.
  4. Fjern selvklæbende fra pladen. Omhyggeligt tilsæt 7 μl af kalibrering celle-fri reaktion master mix på siderne af brøndene uden at røre den blandede ion kalibreringsopløsningen allerede er til stede i brøndene. Forsegl brønde med limen og tryk forsigtigt på 384-godt PCR plade for at blande den celle-fri master mix med ion kalibreringsopløsningen.
    Bemærk: En repeater pipette er stærkt anbefales til at fuldføre dette trin reproducerbar og hurtigt.
  5. Kort centrifugeres plade 1.000 x g i 10 s til pool ublandet væske der kan blive fast på siderne af brøndene. 384-godt pladen anbringes i en thermocycler sat på 26 ° C med en opvarmet låg, indstillet til 105 ° C.
  6. Inkuber de celle-fri reaktioner til 3 h. Efter inkubationen overføre indholdet af hver brønd til en sort 384-godt assay plade med glas bund med en multikanal-pipette og læse fluorescens af sfGFP på Ex / Em = 485 nm/528 nm ved hjælp af en pladelæseren til at bestemme ion koncentration kombination, giver det højeste beløb af protein.

Representative Results

Den beskrevne protokol for protein produktion ved hjælp af V. natriegens celle-gratis expression system kan udføres i 1−2 dage af en enkelt bruger, startende fra podning af kultur til protein tilgængelige for downstream applikationer. Forberedelse af rå celle ekstrakter og master mix aktier udgør en betydelig del af denne tid; men når der tilberedes, de fleste bulk reagenser kan være gemt lang sigt (tabel 7) og bruges efter behov, forkorte tiden nødvendig for at fuldføre protokollen.

Udtrykket systemet beskrevet bruges bedst med plasmid DNA skabelon eller mRNA genereret af in vitro-transskription reaktioner. Mens lineære DNA kan også bruges som skabelon for protein produktion, giver det betydeligt lavere mængde af protein. For eksempel, på optimal reaktioner betingelser ved 26 °C, kan en enkelt 10 μL celle-fri reaktion producere > 260 μg/mL af sfGFP i 3 timer med 0,3 pmol af plasmid DNA skabelon eller en sammenlignelig > 125 μg/mL af sfGFP ved hjælp af 14 pmol af mRNA udskrift (figur 5A B). Dog vil 0.3 pmol lineære DNA producere betydeligt mindre protein (< 20 μg/mL). For hver skabelon, vil fleste af protein blive produceret i 1−1.5 h; Det anbefales dog, at reaktionen er køre i mindst 3 timer. Celle-fri reaktion koncentrationer af sfGFP blev fastlagt via lineær regression ved hjælp af en renset sfGFP standardkurven måling fluorescens på Ex / Em = 485 nm/528 nm.

Protein produktion påvirkes væsentligt af koncentrationen af kalium og magnesium ioner (K+ og Mg2 +, henholdsvis). Optimeret betingelser, konstateredes det, at den optimale Mg2 + og K+ ion koncentrationer vil være 3,5 mM og 80 mM, henholdsvis (fig. 6A, B). Afvigelser fra de optimale ion koncentrationer kan resultere i en nedsat evne til celle-gratis expression system til at producere protein med betydelige udbytter. Yderligere kalibrering kan være nødvendig, hvis reaktionen udbytter betydeligt lavere end forventet. En valgfri protokol til ion kalibrering er beskrevet i afsnit 5. Dette giver mulighed for en vis fleksibilitet i kompensation for rå celle ekstrakt variabilitet afholdt fra enkelt celle lysis udstyr og betingelser.

Figure 1
Figur 1: et nærbillede af indehaveren af bægerglas og rør på sonikering platform. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: sonikering udstyr setup for udarbejdelsen af rå celle uddrag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: en visning af pellet efter ultralydbehandling og centrifugering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Flash frysning dip til ekstrakt opbevaring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentant resultater af V. natriegens celle-fri proteinsyntese ved hjælp af forskellige skabelontyper. (A) slutpunkt analysen af sfGFP produktion ved hjælp af equimolar koncentrationer af plasmid og lineære DNA skabelon (0,3 pmol) samt stigende koncentrationer af mRNA skabelon. Celle-fri sfGFP koncentration blev bestemt ved hjælp af en standardkurve for renset sfGFP målt på Ex / Em = 485 nm/528 nm efter 180 minutters inkubation ved 26 ° C ved optimal reaktionsbetingelser i 10 μL diskenheder. (B) Kinetic analyse af sfGFP produktion ved hjælp af equimolar koncentrationer af plasmid og lineære DNA skabelon samt stigende koncentrationer af mRNA skabelon. sfGFP målinger blev taget hver 3 minutter på Ex / EM = 485 nm/528 nm over 180 minutter af samlede inkubationstiden på optimal reaktionsbetingelser i 10 μL diskenheder. For både slutpunkt og kinetic assays var stikprøverne Tom korrigeret ved hjælp af celle-fri reaktioner suppleret med alle komponenter undtagen skabelon. Det betyder, og standardafvigelser er vist (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: repræsentant resultater af ion koncentration kalibrering. (A) V. natriegens celle-fri reaktioner blev suppleret med stigende koncentrationer af Mg2 + og inkuberes ved 26 ° C til 180 minutter i 10 μL reaktioner. Den samlede koncentration af K+ var 160 mM for alle Mg2 + koncentrationer. Celle-fri sfGFP koncentration blev bestemt ved hjælp af en standardkurve for renset sfGFP målt på Ex / Em = 485 nm/528 nm. (B) V. natriegens celle-fri reaktioner blev suppleret med stigende koncentrationer af K+ og inkuberes ved 26 ° C til 180 min. i 10 μL reaktioner. Den samlede koncentration af Mg2 + var 3,5 mM for alle K+ koncentrationer. For begge kalibreringer var stikprøverne Tom korrigeret ved hjælp af celle-fri reaktioner suppleret med alle komponenter undtagen skabelon. Det betyder, og standardafvigelser er vist (n = 3). Dette tal er blevet ændret fra Wiegand et al.9. Genoptrykt med tilladelse fra Wiegand, DJ, Lee, H.H., Ostrov, N., kirke, G.M. om oprettelse af en celle-fri Vibrio natriegens udtryk System. ACS syntetisk biologi. 7 (10), 2475−2479 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1 a Forberedelse af LB-V2 bakteriel vækst medier
Komponent Mængde (g) Endelig koncentration (mM) Endelige volumen (L)
LB bouillon (Miller) 25 1
NaCl 11.69 200
MgCl2 2.20 23.1
KCl 0.31 4.2
Tabel 1 B Forberedelse af S30A lysisbuffer
Komponent Mængde (g) Endelig koncentration (mM) Endelige volumen (L)
Tris løsning (pH 8,0) - 1 M (mL) * 25 50 0,5
Mg-glutamat 2,72 14
K-glutamat 6.10 60
Dithiothreitol (DTT) - 1 M (mL) * 1 2

Tabel 1: reagenser til fremstilling af 1 L LB-V2 bakteriel vækst medier og 0,5 L af S30A celle lysisbuffer. Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel. 

Forberedelse af 10 x energi løsning Master Mix
Komponent Stock koncentration (mM) Endelig koncentration (mM) Mængde (µL) Endelige volumen (µL)
HEPES-KOH pH 8 1750 500 1428.57 5000
ATP 100 15 750,00
GTP 100 15 750,00
CTP 100 9 450.00
UTP 100 9 450.00
tRNA fra E. coli MRE 600 (mg/mL) * 100 2 100,00
Coenzym A hydrat 200 2.6 65,00
NAD 200 3.3 82.50
cAMP 650 7.5 57.69
Folinic syre 100 0,7 35,00
Spermidine 1600 10 31.25
3-PGA 2000 300 750,00
Sterile ionbyttet vand 49.99
Forberedelse af 4 x aminosyre Master Mix
Komponent Stock koncentration (mM) Endelig koncentration (mM) Mængde (µL) Endelige volumen (µL)
ALA 168 8 114.3 2400
ARG 168 8 114.3
ASN 168 8 114.3
ASP 168 8 114.3
LOCALISATION 168 8 114.3
GLU 168 8 114.3
GLY 168 8 114.3
HANS 168 8 114.3
IIE 168 8 114.3
LYS 168 8 114.3
MØDTE 168 8 114.3
PHE 168 8 114.3
PRO 168 8 114.3
SER 168 8 114.3
THR 168 8 114.3
VAL 168 8 114.3
TRP 168 8 114.3
TYR 168 8 114.3
LEU 140 8 137,1
CYS 168 8 114.3
Sterile ionbyttet vand 91,4

Tabel 2: Reagenser for forberedelse af 5 mL 10 x energiløsning master mix og 2,4 mL 4 x aminosyre master mix.    Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.

T7 RNA Polymerase i Vitro transskription reaktioner
Komponent Stock (mM) Endelig koncentration (mM) Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 50 x reaktioner
10 x RNAPol reaktion Buffer 1,00 50
ATP 100 0,5 0,10 5
GTP 100 0,5 0,10 5
CTP 100 0,5 0,10 5
UTP 100 0,5 0,10 5
DNA skabelon (ng/µL) * 1000 500 0,50 25
T7 RNA Polymerase 200 2.6 2.00 100
RNase Inhibitor, Murine 200 3.3 0,50 25
Sterile ionbyttet vand 15.60 780
Reaktion volumen (µL): 20

Tabel 3: In vitro transskription komponenter til mRNA generation.    Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.

Celle-gratis reaktion Master Mix
Komponent Stock koncentration (mM) Endelig koncentration (mM) Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 50 x reaktioner
Ekstrakt (%) * 25 2,50 125,00
Mg-glutamat 100 3.5 0,35 17,50
K-glutamat 2000 80 0,40 20,00
4 x aminosyre Master Mix 8.0 2 2,50 125,00
10 x energi løsning Master Mix 1,00 50,00
Plasmid DNA (ng/µL) * 1000 500 0,50 25,00
50% PIND-8000 (%) * 50 2 0,40 20,00
T7 RNA Polymerase 1,00 50,00
RNase Inhibitor, Murine 0,10 5,00
Sterile ionbyttet vand 1,25 62,50
Reaktion volumen (µL): 10
Alternative celle-fri reaktion Master Mix til mRNA skabelon
Komponent Stock koncentration (mM) Endelig koncentration (mM) Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 50 x reaktioner
Ekstrakt (%) * 25 2,50 125,00
Mg-glutamat 100 3.5 0,35 17,50
K-glutamat 2000 80 0,40 20,00
4 x aminosyre Master Mix 8.0 2 2,50 125,00
10 x energi løsning Master Mix 1,00 50,00
mRNA skabelon (ng/µL) * 2000 4000 2.00 100,00
50% PIND-8000 (%) * 50 2 0,40 20,00
RNase Inhibitor, Murine 0,10 5,00
Sterile ionbyttet vand 0,75 37,50
Reaktion volumen (µL): 10

Tabel 4: Komponenter af optimeret V. natriegens celle-gratis reaktion master mix DNA og mRNA skabelon.    Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.

Mg 2 + Kalibrering Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 100 x reaktioner Mængde (µL) 100 x reaktioner
Finalen (mM) Stock 100 mM Mg-Glu diH 2 0 100 mM Mg-Glu Ionbyttet H2O
2.5 0 0,00 1,00 0 100
3.5 1 0,10 0.90 10 90
4.5 2 0,20 0,80 20 80
5.5 3 0,30 0.70 30 70
Reaktion volumen (µL): 10
K + Kalibrering Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 100 x reaktioner Mængde (µL) 100 x reaktioner
Finalen (mM) Stock 2000 mM K-Glu diH 2 0 2000 mM K-Glu Ionbyttet H2O
40 30 0,15 1,85 12 148
80 70 0,35 1,65 28 132
160 150 0,75 1,25 60 100
320 310 1,55 0,45 124 36
Reaktion volumen (µL): 10
Ion kalibrering celle-fri reaktion Master Mix
Komponent Stock koncentration (mM) Endelig koncentration (mM) Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 50 x reaktioner
Ekstrakt (%) * 25 2,50 125,00
Mg-glutamat Variabel Variabel 1,00 50,00
K-glutamat Variabel Variabel 2.00 100,00
4 x aminosyre Master Mix 8.0 2 2,50 125,00
10 x energi løsning Master Mix 1,00 50,00
Plasmid DNA (ng/µL) * 1000 250 0,25 12.50
50% PIND-8000 (%) * 50 2 0,40 20,00
T7 RNA Polymerase 1,00 50,00
RNase Inhibitor, Murine 0,10 5,00
Sterile ionbyttet vand 0,00 0,00
Reaktion volumen (µL): 10

Tabel 5: Ion koncentration kalibrering master mix.    Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.

CF Ion kalibrering kort 40 mM K+ 80 mM K+ 160 mM K+ 320 mM K+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2,5 mM Mg2 + A
3,5 mM Mg2 + B
4,5 mM Mg2 + C
5,5 mM Mg2 + D

Tabel 6: Ion kalibrering kort.    Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.

Betingelser for opbevaring og hylde liv af CF komponenter
Komponent Opbevaring placering Holdbarhed
Sterile LB-V2 vækst medier 4 ° C 3-6 måneder
V. natriegens rå celle uddrag -80 ° C 1-3 uger
100 mM Mg-glutamat Værelse Temp 6 måneder
2000 mM K-glutamat Værelse Temp 6 måneder
50% PIND-8000 Værelse Temp 6 måneder
10 x energi løsning Master Mix -80 ° C 3-6 måneder
4 x aminosyre Master Mix -80 ° C 3-6 måneder
Plasmid/lineære DNA-skabelon -20 ° C 6-12 måneder
mRNA skabelon -80 ° C 3-4 uger

Tabel 7: Cell-free opbevaringsforhold og hylde liv.    Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.

Discussion

Denne protokol er blevet optimeret til vildtype V. natriegens og bakteriel vækst medier består af LB suppleret med V2 salte (Tabel af materialer). Andre stammer af V. natriegens kan ligeledes kulturperler for at generere rå celle ekstrakter til celle-fri reaktioner; deres anvendelse kræver imidlertid yderligere optimering af denne protokol. Derudover er denne celle-fri protein ekspressionssystem blevet optimeret ved hjælp af 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) som den primære energikilde regenerering. Andre energi regenerering kilder kan anvendes; men optimering af reagenser og kalibreringen vil sandsynligvis være forpligtet til at opnå høj højtydende protein udtryk10,11.

Særlig opmærksomhed til flere kritiske trin i denne protokol vil sikre maksimal ekstrakt produktivitet for højtforrentede celle-gratis protein produktion. Først, rå celle ekstrakt skal vaere tilberedt af V. natriegens cellekulturer høstet i en midt-eksponentiel vækst; protein udbytte er maksimal, når kulturer nå en OD600 = 1,0 ± 0,2. Mens celle-fri protein produktion er muligt fra celler høstet på en vifte af optiske tætheder, har vi tidligere fundet, at celler høstet i en eksponentiel tilstand af vækst giver betydeligt mere protein9. De observerede virkninger af optisk tæthed på rå celle ekstrakt ydeevne er i overensstemmelse med dem, der indberettes til andre celle-fri udtryk systemer stammer fra celler dyrkes i batch kultur betingelser1. Fordi V. natriegens vokser i et hastigt tempo, er det afgørende at nøje overvåge kulturer optisk tætheder. Generelt forventes det, at V. natriegens kulturer reproducerbar bør nå en OD600 1.0 inden for 1−1.5 h bruger denne protokol; dog forbløffet enkelte vækstbetingelser såsom brugen af versus ikke-forvirret kolber, hvilket påvirker luftning eller luft versus vand inkubation, der påvirker den hastighed og stabilitet i inkubation temperatur, kan ændre vækst tid. Det anbefales generelt at kultur mindst 250 mL af V. natriegens i en 1 L forbløffet kolbe til at sikre en stor celle pellet ved høst for easy manipulation og overførsel. Dette forbedrer succes af rå celle ekstrakt forberedelse samt øger den samlede mængde af ekstrakt fremstillet af en pellet. Når du bruger mindre skala forberedelse, justeres dyrkningsbetingelserne og reagenser korrekt. For storstilet gæring, kan yderligere optimering af kultur betingelser være påkrævet. Endelig, for at sikre høj protein udbytte, det er afgørende, at celle pellets forarbejdes straks efter høst, eller senest 1−2 dage oplagring ved-80 ° C.

Den ordentlig lysering af celle pellet ved puls sonikering er afgørende for succes af celle-fri protein udtryk og er ofte den vanskeligste aspekt af denne protokol for nye brugere. Typisk, en godt lysed pellet vil give en betydelig mængde af flydende ekstrakt, der er fri for snavs. Ekstrakten skal være lidt tyktflydende men kan være let pipetted, når aliquoting i opbevaring rør før flash fryser i flydende kvælstof. Figur 3 viser en repræsentation af en godt lysed pellet (figur 3A) i forhold til et dårligt lysed pellet (figur 3B) efter post lysis centrifugering skridt. En større angivelse af komplet celle lysis er en rå celle ekstrakt total protein koncentration > 20 mg / mL, som bestemmes af en total protein assay (trin 2.13). Overdreven sonikering eller overdreven opvarmning af rå celle ekstrakt vil skade den cellulære maskiner, der ikke kan fastsættes uden at udføre en celle-fri reaktion. Det er således meget gavnligt at teste ekstrakt effektivitet med en kontrol reaktion før afsætte betydelige tid og kræfter til downstream protein udtryk ansøgninger. Mens yderligere optimering kan være nødvendigt for forskellige sonikering udstyr, har pulse sonikering trinene beskrevet været stærkt reproducerbare i vores hænder.

Brug af lineære DNA skabelon afledt af PCR forstærkning, begrænsning enzym digest eller kommercielle gen syntese kan øge kapaciteten til høj overførselshastighed og hurtige protein produktion i celle-fri udtryk systemer24. Mens protein produktion fra PCR forstærket lineær skabelon er blevet påvist, udbyttet af disse reaktioner er ca 13.5-fold lavere sammenlignet med reaktioner ved hjælp af plasmid DNA skabelon på equimolar nøgletal9. Dette skyldes primært ustabiliteten i den lineære DNA-skabelon, som er sandsynligvis nedbrudt af endogene nukleaser stede i V. natriegens rå celle ekstrakt. Mens lambda phage protein GamS har tidligere er blevet anvendt til at beskytte lineære DNA skabelon24,25, konstateredes det, at være uforenelig med V. natriegens ekstrakter9. Derudover mens øger koncentrationen af lineære DNA skabelon kan give mulighed for et højere protein udbytte, vil dens hurtig nedbrydning i rå celle ekstrakt stadig være et stort problem.

En løsning til at overvinde lineære DNA skabelon nedbrydning kan være at supplere celle-fri reaktioner med mRNA skabelon genereret fra in vitro-transskription af lineære DNA. På den anden side brugen af en RNase hæmmer tilbyder betydelig beskyttelse mod mRNA udskrift nedbrydning og mærkbar protein udbyttet kan fås i 10 μL celle-fri reaktion format (figur 5AB). Kloning af lineære DNA i en cirkulær skabelon gennem TA ligatur, kan TOPO kloning, Golden Gate forsamling eller andre rekombination metoder anvendes til at omgå skabelon nedbrydning. Ikke desto mindre vil yderligere tilgange til hæmning af nukleasen aktivitet være nødvendigt for effektiv protein udtryk ved hjælp af lineære DNA skabelon.

Til dato, er blevet foreslået flere forskellige tilgange til tilberedning af rå ekstrakt til celle-fri protein udtryk9,10,11,26. I udviklingen af denne protokol, forsøgte vi at maksimere bruger tilgængelighed, reducere samlede omkostninger og minimere tidskrævende trin. For eksempel, et højt proteinindhold udbytte er opnået ved hjælp af en simpel totrinsproces sonikering-centrifugering, og kræver ikke celle homogenizers, langvarige dialyse trin eller afstrømning reaktion. Det er simpelt at udføre i en kort periode og kræver ikke højt niveau af ekspertise, laboratorium. Det kan således bidrage til at lette celle-fri udtryk som en standard for Translationel akademisk forskning og industriel procesdesign.

Denne protokol udvider toolkit tilgængelig for undersøgelse og nytte af V. natriegens, en ikke-model organisme med unikke biologiske egenskaber. Højere protein udbytte kan opnås ved at ansætte semi - eller fuldt-løbende celle-fri reaktioner, at tillade energi regenerering, genlevering af aminosyrer, og fjernelse af affaldsprodukter3,5,27. Derudover engineering af vildtype V. natriegens at producere DNAse - eller RNAse-mangelfuld stammer, fjernelse af skadelige og konkurrerende stofskifteveje og udtryk for yderligere tRNAer kunne i høj grad øge produktionen af proteiner i Dette system28,29. Som vi optrævle biologi bag sin hurtige vækst, kan videreudvikling af V. natriegens celle-fri systemer fremskynde bioproduktion kapaciteter og aktiverer robust udtryk for terapeutisk peptider, små molekyler og syntetiske materialer.

Disclosures

DJW, nej, og GMC har indgivet en patent relateret til dette arbejde.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 og Institut for energi DE-FG02-02ER63445. Forfatterne vil gerne takke Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam og Dr. Edgar Goluch for nyttige råd om konstruere protokoltjenesten af dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Tubes Corning 352196
2 mL Tubes Eppendorf 22363352
384-well Black Assay Plates Corning 3544
384-well PCR Plates Eppendorf 951020702
50 mL Tubes Corning 352070
96-well PCR Plates Eppendorf 30129300
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate Sigma A6885
Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler ThermoFisher 4388444
Assay Plate Adhesives BioRad MSB1001
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) Sigma/Roche 10127965001
Coenzyme A hydrate Sigma C4283
Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) Sigma P8877
Dewar Flask - 4L ThermoScientific 10-194-100C
DL-Dithiothreitol solution - 1 M Sigma 42816
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma 47612
Glacial Acetic Acid Sigma A6283
Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
HEPES Sigma H3375
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate Sigma 49605
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma G1149
LB Broth (Miller) Sigma L3522
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Plasmid pJL1-sfGFP Addgene 69496
Plasmid Plus Maxi kit Qiagen 12963
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 Sigma 89510
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333
Potassium hydroxide Pellets Sigma/Roche 1050121000
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip Qsonica 4422
RNA Clean and Concentrator Kit Zymo R1013
RNase Inhibitor, Murine NEB M0314
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride (NaCl) Sigma S7653
Spermidine Sigma S0266
T7 RNA Polymerase NEB M0251
Tris Solution (pH 8.0) - 1 M Invitrogen AM9856
tRNA from E. coli MRE 600 Sigma/Roche 10109541001
Uridine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock ATCC 14048

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  2. Schoborg, J. A., et al. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Henrich, E., Hein, C., Dötsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  5. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. Establishing a high yielding streptomyces‐based cell‐free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  6. Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678 (2017).
  7. Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements. Synthetic Biology. 3 (1), ysy003 (2018).
  8. Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements. Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).
  9. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System. ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).
  10. Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).
  11. Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens. Frontiers in Microbiology. 9, 1146 (2018).
  12. Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).
  13. Eagon, R. G. Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes. Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).
  14. Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology. Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).
  15. Lee, H. H., et al. Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse. bioRxiv. , 058487 (2016).
  16. Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. Recombineering in Vibrio natriegens. bioRxiv. , 130088 (2017).
  17. Schleicher, L., et al. Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes. Frontiers in Microbiology. 9, 2537 (2018).
  18. Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E., Carmona, M. Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory. Scientific Reports. 7 (1), 16046 (2017).
  19. Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).
  20. Hoffart, E., et al. High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology. Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).
  21. Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis. Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).
  22. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  23. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  24. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  25. Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation. Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 16524 (2017).
  27. Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors. Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).
  28. Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).
  29. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).

Tags

Bioteknologi sag 145 Vibrio natriegens rå celle ekstrakt celle-fri system TX-TL in vitro-proteinsyntese høj overførselshastighed skærm
Celle-fri Protein udtryk ved hjælp af hurtigt voksende bakterie <em>Vibrio natriegens</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov,… More

Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (145), e59495, doi:10.3791/59495 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter