Summary
Børste celler er sjældne kolinerge kemo sensoriske epiteliale celler findes i den naive mus luftrør. På grund af deres begrænsede antal, er ex vivo evaluering af deres funktionelle rolle i luftvejene immunitet og Remodeling udfordrende. Vi beskriver en metode til isolering af trakeal pensel celler ved flow cytometri.
Abstract
Tracheal børste celler er kolinerge kemo sensoriske epitelceller, der er klar til at transmittere signaler fra luftvejene lumen til immun-og nervesystemet. De er en del af en familie af chemosensoriske epitelceller, som omfatter Tuft celler i tarmslimhinden, børste celler i luftrøret, og ensomme kemo sensoriske og mikrovillous celler i næseslimhinden. Chemosensoriske celler i forskellige epiteliale rum deler centrale intracellulære markører og en kerne transkriptional signatur, men viser også signifikant transkriptional heterogenitet, sandsynligvis reflekterende af det lokale vævs miljø. Isolering af trakeal børste celler fra enkelt celle suspensioner er påkrævet for at definere funktionen af disse sjældne epiteliale celler i detaljer, men deres isolation er udfordrende, potentielt på grund af det tætte samspil mellem trakeal pensel celler og nerve afslutninger eller på grund af luftvejs-specifikke sammensætning af stramme og klæber kryds. Her beskriver vi en procedure for isolering af pensel celler fra muse trakeal epitel. Metoden er baseret på en indledende adskillelse af trakeal epitel fra submucosa, hvilket giver mulighed for en efterfølgende kortere inkubation af epitel arket med papain. Denne procedure giver en hurtig og bekvem løsning til flow cytometrisk sortering og funktionel analyse af levedygtige trakeal pensel celler.
Introduction
Pensel celler tilhører en klasse af chemosensoriske epitelceller karakteriseret ved ekspression af bitter smag receptorer og smagen receptor transduktionsmaskiner findes i smag bud celler. I modsætning til smag opløbet celler, er chemosensoriske epitelceller spredt i epitel overflader og omtales som ensomme chemosensoriske celler (SCCS) og mikrovillous celler i nasal epitel1,2, børste celler i luftrøret 3,4og Tuft celler i tarmen5,6. Epiteliale celler, der udtrykker bitter smags receptorer og den bitre smags transduktionsmaskineri, findes også i urinrøret7,8 og auditive tube9. Luftvejene børste celler har unikke funktioner i neurogene og immun luftvejs reaktioner. De er acetylcholin-producerer chemosensoriske celler, der fremkalder beskyttende respiratoriske reflekser ved aktivering med bitre forbindelser og bakterielle metabolitter som quorum-sensing stoffer10. Luftvejs børste celler er også den dominerende luftvejs epitelial kilde IL-25, som regulerer aeroallergen-fremkaldt type 2 betændelse i luftvejene3.
Karakterisering af den fulde transkriptomet af lavere luftvejs børste celler og deres reaktion på miljømæssige stimuli har været begrænset af deres lave tal i trakeal epitel og meget begrænsede tal ud over den store bronkier10. Teknikker, der anvendes til isolering af kemo sensoriske celler fra tarm epitelet har ikke givet forholdsmæssigt høje tal fra luftrøret, muligvis på grund af de intime kontakter af trakeal børste celler med nerveender10 eller andre vævsspecifikke faktorer i den respiratoriske slimhinde, såsom sammensætningen af klæber og tætte samlings proteiner. Nylige rapporter om vellykket isolering af trakeal pensel celler i højere tal for enkelt celle RNA-sekvensering analyse beskæftigede enten en 2 h inkubation med papain eller en 18 h inkubation med pronasen11,12. Da længere inkubationer med fordøjelsesenzymer kan nedsætte celle levedygtigheden og ændre den transkriptionelle profil af celler fra fordøjet væv13, dette kunne bias komparativ analyse med andre kemo sensoriske epiteliale populationer.
Her rapporterer vi en metode til isolering af trakeal pensel celler til RNA-sekvensering3. Behandling af luftrør med høj dosis dispase adskiller epitel fra submucosa. Efterfølgende fordøjelse af epitelial ark med papain giver mulighed for fremragende genopretning af denne strukturelle celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før du udfører følgende forsøg, skal du sørge for, at alle dyrepleje brug og protokoller er godkendt af den institutionelle dyrepleje og anvendelse udvalg (IACUC) og udført i overensstemmelse med det nationale Forskningsråd "vejledning til pleje og brug af Forsøgsdyr " (8 . udgave, 2011) og retningslinjerne for ankomst. Alle de procedurer, der er beskrevet nedenfor, er blevet gennemgået og godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug på Brigham and Women's Hospital.
1. klargøring af reagenser
- Forbered Dispase fordøjelsesopløsning, som er en PBS-opløsning, der indeholder 16 U/mL dispase og 20 μg/mL DNase I. Sørg for, at dispase pulveret er helt opløst, før opløsningen varmer op i et vandbad ved 37 °C.
- Tilsæt 5% varme inaktiveret føtal kvægserum (FBS) til Dulbecco modificeret Eagle medium (DMEM) for at lave en stopopløsning.
- Forbered Tyrode I buffer: Tilsæt 26 U/mL papain (20 μL/mL 48 U/mg papain opløsning) og 10 μL/mL L-Cystein til HEPES-Tyrode buffer uden calcium.
- Forbered Tyrode II-buffer: Tilsæt 2 μL/mL leupeptin (5 mg/mL) til HEPES-Tyrode buffer med calcium.
- Forbered FACS buffer: Brug Hanks ' afbalancerede salt opløsning (HBSS) uden calcium, magnesium & phenol rød, suppleret med 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og tilsæt 2% FBS.
2. dissektion af muse Trachea
Bemærk: Mus, der bruges i denne protokol, er ChAT(BAC)-Egfp (B6. CG-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 måneders alderen af begge køn. Minimer vævs eksponeringen til direkte lys for at reducere fotoblegning af eGFP.
- Euthanize musen med 100 mg/kg pentobarbital eutanasi opløsning injiceres intraperitonealt eller ved hjælp af standardprotokoller godkendt af iacuc.
- Fastgør musen på et kirurgisk bræt i liggende position med 21 G nåle med forlænget øvre og nedre ekstremiteter. Spray pels med 70% EtOH at rense området.
- Brug lige pincet, løft huden og pels i maven og lav et snit i midten med dissekere saks (lige saks, 3 cm). Brug saks, adskille huden fra det subkutane væv fra maven til mandibula. Mens du holder det subkutane væv op med pincet, lav et lille snit med saksen i midten af bugvæggen.
- Åbn bughinden med et V-formet snit. Ved hjælp af pincet, forsigtigt flytte tyndtarmen til siden, lokalisere den abdominale aorta og Vena cava og gøre et snit med dissekere saks til at give mulighed for hurtig exsanguination.
- Find diafragmaet. Ved hjælp af en 18 G nål skal du lave en åbning i membranen lige under brystbenet for at dedivere lungerne. Adskil membranen forsigtigt fra ribburet med skarp spids, lige dissekere saks til at skære langs ribbenene.
- Ved hjælp af pincet løftes den eksponerede ende af brystbenet, og brystbenet skæres i længderetningen fra bunden af ribburet til halsen. Lav en central cervikal indsnit med kort lige saks (2 cm) og adskille de to lapper af submandibulær kirtel.
- Fjern forsigtigt det omgivende bindevæv, og thymus overliggende Carina med et par fine punkt høj præcision pincet.
- Dissekere luftrør frit først ved at adskille den proksimale ende på niveauet af låget og derefter ved at dissekere den distale ende på niveau med bifurcation af luftrøret.
- Find låget og skær luftrør i længderetningen fra låget til Carina.
3. tracheal epitelial fordøjelse
- Luftrøret placeres i et 1,5 mL rør, der indeholder 750 μL præ-opvarmet (til 37 °C) dispase fordøjelsesopløsning. Inkuber på en shaker ved 200 rpm i 40 min ved stuetemperatur. Dæk røret med aluminiumsfolie for at reducere eksponeringen for direkte lys.
- Tilsæt 750 μL kold DMEM med 5% FB'ER for at standse reaktionen. Sted på is.
- Luftrøret overføres til en Petri skål (100 mm x 15 mm) og placeres under et dissekere mikroskop. Drej luftrør med epitelialsiden opad. Den langetriske dissekeret luftrør har en semi cylindrisk form, der vedligeholdes af brusk ringene. Epitelet er på den konkave overflade.
- Tether låget området af luftrør med lige tang til Petri skålen og ved hjælp af en størrelse 22 engangs skalpel, skrabe epitel ud af luftrør. Epiteliallaget adskilles som et gennemsigtigt ark.
- Mince epitelet med skalpel. Epitel laget overføres til et 2 mL rør.
- Petri skålen skylles med 750 μL Tyrode I buffer og overføres til 2 mL-røret, der indeholder epiteliallaget.
- Inkubatepitel-laget i Tyrode i buffer i 30 min ved 37 °C på en shaker ved 200 rpm. Dæk røret med aluminiumsfolie for at reducere eksponeringen for direkte lys.
- Tilsæt 750 μL kold Tyrode II-buffer. Vortex det Ford øjede væv kraftigt for 20-30 s. triturate homogenatet med en sprøjte fastgjort til en 18 G nål 10 gange. Skift til en 21 G gauge nål og udriv 10-20 gange mere.
- Cellerne filtreres gennem en 100 μm-si i et 50 ml konisk rør. Tilsæt 30:1 vol/vol af kold FACS buffer.
- Spin ved 350 x g i 10 minutter ved 4 °c og kassér supernatanten. Resuspension af pellet i kold FACS buffer og overføre suspensionen til en 12 mm x 75 mm (5 mL) polystyren tube. Drej igen ved 350 x g i 10 minutter ved 4 °c, og kassér supernatanten.
- Igen suspendere pellet i 100 μL af FACS buffer.
- Tilføj 1 μL anti-Mouse CD16/32 blokerende antistof for at blokere ikke-specifik binding og inkubere i 15 min på is. Må ikke vaskes.
- Tilsæt følgende antistoffer og de respektive isotype Kontroller: Pacific Blue anti-Mouse CD45 eller rat IgG2a, k (0,25 μg/106 celler i 100 μl volumen) og allophycocyanin (APC) anti-Mouse epcam eller rotte IgG2b, k (0,5 μg/106 celler i 100 μl volumen) monoklonale antistoffer. Inkuber 45 min på is beskyttet mod direkte lys. Tilsæt 4,5 mL kold FACS buffer, bland og spin ved 350 x g i 10 minutter ved 4 °c. Kassens buffer fjernes, og pelleten gensuspenderes i 300 μL kold FACS buffer.
- Tilsæt propidium kaliumiodid (PI) (5 μg/ml) umiddelbart før flow cytometrisk sortering.
Bemærk: Pensel celler har en uregelmæssig form med flere processer, der potentielt kan øge deres tilslutning til filtre (figur 3C). Vi sammenlignede 30 mm til 70 mm og 100 mm filtre og fandt ud af, at større pore filtre sikrede bedre udbytter. Desuden, grundig formalings af cellen suspension efter papain fordøjelsen betydeligt forbedrer pensel celle udbytter. Vi anbefaler at bruge en 18g nål til indledende formalings efterfulgt af en mindre boring (21 eller 23 G nål) for finere dissociation af celler.
4. flow cytometri gating strategi
- Identificer celler fra snavs ved fremad og side scatter vinkel. Udelad form ved hjælp af forlæns scatter højde og bredde og side scatter højde og bredde. Form ville være de celler, der har høj breddeværdier.
- I de enkelte celler identificeres levende celler som den population, der er PI negativ.
- I de levende enkeltceller skal du identificere de CD45 lave til negative celler baseret på isotype-kontrolelementet.
- Inden for CD45 lave/negative celler, identificere EpCAM positive celler, der også er eGFP positive (i den FITC kanal). Dette er populationen af pensel celler (figur 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne procedure er blevet implementeret med succes for at isolere trakeal Brush-celler til RNA-sekvensering3. Efter isolering af luftrør og fordøjelse af vævet med en 2-trins protokol (figur 1), blev cellerne indsamlet og plettet med fluorescently-mærket CD45 og epcam efter udelukkelse af døde celler med PI. Efter gating ud form baseret på fremad og side scatter egenskaber, vi definerede børste celler som lav/negativ for CD45, positiv for epcam og positiv for egfp (figur 2A). Børste cellerne repræsenterede ~ 0,16-0,42% af CD45Low/neg celler ved flowcytometri og tegnede sig for 250-600 celler pr. luftrør (figur 2B). Vi sammenlignede disse optællinger med et estimat af antallet af positive chat-egfp-celler i hele trakeal mounts fra chatten(BAC)-egfp-mus baseret på vores publicerede omfattende immunohistologiske evaluering af trakeal Brush-celler3 og illustreret her ( Figur 3). Vores tidligere undersøgelser af trakeal Brush-celler i Wild type, ChAT(BAC)-egfp-mus og Il25F25/F25 -mus antydede, at kolinerge pensel celler er 90% overlappende med DCLK1+ og Il25+ celler og konto for 600-1000 børste celler pr. luftrøret3. Især dette tal er lavere end antallet af kolinerge pensel celler rapporteret af andre grupper10. Da kemo sensoriske cellenumre ændres ved udsættelse for mikrobielle metabolitter og protozoer5,14, kan disse tal afspejle en variabilitet i den interinstitutionelle mikrobiota. Derfor vil vi foreslå at anslå antallet af pensel celler ved Fluorescens mikroskopi for at måle det forventede antal isolerede pensel celler ved flow cytometrisk sortering.
Under etableringen af vores protokol forsøgte vi flere tidligere offentliggjorte metoder til isolering af chemosensoriske celler (figur 4). Når vi inkuberet hakket luftrør med 650 u/ml kollagenase IV og 1,84 U/ml dispase suppleret med DNase I for 45 min, en kombination, der hyppigt anvendes til at opnå enkelt celle suspensioner fra lunge homogenater15, vi opnåede en enkelt cellesuspension af epiteliale celler, men vi genvandt kun få børste celler (figur 4A). Tuft celler i tarmen er med held isoleret ved hjælp af 2,5 mM EDTA og 0,75 mM dithiothreitol (DTT) med DNase I i 20 min at fjerne epiteliale celler efterfulgt af fordøjelsen af de frigivne epitelceller med 0,01 U/mL dispase med DNaseI i 10 min 6. i vores hænder, ved hjælp af denne procedure også ført til suboptimal trakeal pensel celle opsving (figur 4B). En protokol for vellykket isolering af trakeal Brush-celler til RNA-analyse blev beskrevet af krasteva et al.10. Efter denne protokol, vi inkuberet hakket luftrør med 35 U/mL papain i Tyrode buffer til 45 min og ikke opnå en god børste celle opsving (figur 4C). Rock et al. beskrev en metode til fordøjelse af trakeal epitel til basal celle isolation med to trin: adskillelse af epitel fra mesenchymal lag med høj dosis dispase (16 U/ml) ved stuetemperatur efterfulgt af inkubation af det afisolerede epitel med 0,1% trypsin og 1,6 mM EDTA i 30 min ved 37 °C16. Efter disse trin førte til en bedre genopretning af pensel celler, men de opnåede tal pr. mus var utilstrækkelige til dybtgående funktionelle analyser (figur 4D). For at optimere protokollen besluttede vi at kombinere de to sidste tilgange. Ved at adskille trakeal epitel med høj dosis dispase, vi havde til formål at give bedre adgang til papain til trakeal pensel celler. Således, ved hjælp af 16 u/ml dispase ved stuetemperatur på hele luftrøret at adskille epitelet og efterfølgende inkubation af epitelet med 26 u/ml papain i tyrode buffer førte til den bedste pensel celle opsving (figur 4E).
Figur 1 : Skema over foreslåede trin til isolering af trakeal Brush-celler. Protokollen indeholder 2 store trin: efter dissektion, er hele luftrør inkuberet i en høj-dosis dispase løsning til at adskille epitelet; Dette efterfølges af fordøjelsen af epitelialarket med papain i calcium indeholdende Tyrode buffer (Tyrode I) og antistof farvning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentativ flow cytometri analyse af trakeal børste celler. (A). skematisk gengivelse af flowcytometri gating-strategien. Enkeltceller blev gated baseret på deres fremad og side scatter egenskaber og levende celler blev valgt baseret på udelukkelse af Propidium iodide. CD45 lav/negative celler blev valgt baseret på isotype kontrol og evalueret for deres ekspression af EpCAM. EpCAM positive celler blev betragtet som børste celler, hvis de udtrykte eGFP fluorescerende i den FITC kanal. (B). antal kolinerge trakeal pensel celler pr. muse luftrør og hyppighed præsenteret som procent af alle CD45lav/- celler og som en procent af CD45lav/-epcam+ celler. Hver prik repræsenterer en separat mus. Data er fra 3 separate eksperimenter med 2-3 mus hver. (C). fravær af egfp positive børste celler i en trakeal epitelial Digest fra en vildtype mus farves for CD45 og epcam. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Hele mount af musen luftrøret af en ChAT(BAC)-egfp mus. Luftrøret blev åbnet i længderetningen og plettet med anti-GFP-antistoffer for at forstærke eGFP Green fluorescens signal. (A) hele trakeal Mount of ChAT(BAC)-egfp Mouse, intenst grønne fluorescerende celler repræsenterer pensel celler; skala bjælke 1 mm; B) hele trakeal mount af en vildtype mus, der viser fravær af børste celler Skala bjælke = 1 mm; C) forstørrelse af epiteliallaget, der demonstrerer uregelmæssigt formede pensel celler (grønne celler) som brønde som en kolinerge nerve slutning (pil); D) hele trakeal montering af et luftrør af en ChAT(BAC)-egfp, der er afbildet for gfp uden antistof-forstærkning af fluorescens signalet E) tværsnit af en paraffin-indlejret mus luftrør af en ChAT(BAC)-egfp mus farves med anti-gfp (grøn) eller ged IgG kontrol og dapi (blå); Skala stænger = 20 μm (C-E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Sammenligning af forskellige trakeal fordøjelsesprotokoller. A) luftrør blev hakket og inkuberet med 650 u/ml kollagenase IV og 1,84 U/ml dispase suppleret med DNase I for 45 min. Dette eksperiment blev gentaget 2 gange. B) hele luftrør blev inkuberet med 2,5 mm EDTA og 0,75 mm DTT suppleret med DNase i i 20 min; epitelialcellerne blev opløst og yderligere fordøjet med 0,01 U/mL dispase og DNase I I 10 min. Dette eksperiment blev gentaget 2 gange. C) luftrør blev hakket og inkuberet med 35 e/ml papain i tyrode i buffer til 45 min; resterende papain aktivitet blev hæmmet med leupeptin. Dette eksperiment blev udført én gang. D) hele luftrør blev inkuberet med høj dosis dispase (16 U/ml) i 30 min for at adskille epitel arket, efterfulgt af inkubation af epitel pladen med 0,1% trypsin og 1,6 mm EDTA i 30 min. Dette eksperiment blev gentaget 2 gange. (E). hele luftrør blev inkuberet med høj dosis dispase (16 u/ml) i 30 min efterfulgt af fordøjelsen af epitel arket med 26 U/ml papain i tyrode buffer i 30 min. Den resterende papain aktivitet blev hæmmet med leupeptin og høj volumen fortynding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi fandt, at en kombination af høj-dosis dispase behandling for 40 min efterfulgt af en kort papain behandling (30 min) giver en optimal protokol til trakeal fordøjelse og børste celle isolation. Denne kombination undgår både omfattende fordøjelse og producerer det højeste udbytte af pensel celler, sammenlignet med alternative protokoller.
Mens lunge fordøjelsen til at udtrække hæmatopoietiske celler har klassisk påberåbt sig milde fordøjelsesenzymer som kollagenase IV15, isolering af epiteliale celler kræver mere komplekse protokoller. Enkelt celle suspensioner af epiteliale celler er vanskeligere at opnå på grund af den stramme og klæber kryds bindende dem til hinanden og kælderen membran og på grund af skrøbelighed af cellerne selv. De fleste protokoller for epitelial cellenedbrydning involverer to trin-et første skridt er adskillelsen af epitel fra kælderen membran efterfulgt af efterfølgende trin for at forstyrre de stramme kryds og desmosomer, som klæber epitelcellerne til hinanden 16 , 17.
Flere grupper har med held isoleret kemo sensoriske Tuft celler fra tarmen ved hjælp af forskellige modifikationer af en 2-trins protokol til isolering af epiteliale celler: det første skridt bruger EDTA og DTT at frigive epitelceller fra submucosa efterfulgt af fordøjelse af epiteliale ark med dispase. Howitt et al. brugte en blanding af 5 mM EDTA + 1 mM DTT efterfulgt af fordøjelsen med 0,5 enheder/mL Dispase II og DNase14. Gerbe et al. brugte høj koncentration 30 mM EDTA alene til at adskille epitelial fraktion og efterfølgende inkuberet med dispase suppleret med DNaseI18. Von Moltke et al. brugt 2,5 mM EDTA, 0,75 mM DTT og DNaseI efterfulgt af dispase fordøjelse6. Vi fandt, at disse teknikker giver mulighed for isolering af levedygtige epitelceller i luftrøret, men procentdelen af trakeal børste celler var ekstremt lav (figur 4B) og ikke i overensstemmelse med vores forventning om isolering af 600-800 børste celler per luftrøret baseret på vores histologiske evaluering.
Tracheal epitel celle isolation protokoller er blevet udviklet af flere grupper til at studere basal epiteliale celler. De store forskelle mellem disse protokoller og dem, der anvendes i tarmen er i rækkefølgen af fordøjelsesenzymer. Det første trin er adskillelsen af trakeal epitel gennem inkubation med en høj koncentration af dispase (16 U/ml) ved stuetemperatur16. Dette gør det muligt for epitel at adskille som et enkelt ark fra mesenchymal lag19. Efterfølgende behandling af trakeal epitel bruger en kombination af trypsin og EDTA, en af de hyppigst anvendte enzymatiske metoder til celle afløsning, for at opnå en enkelt cellesuspension. Trypsin kløver peptider på C-terminalens side af Lysin og arginin aminosyrerester, hvorimod EDTA anvendes som en calciumchelator til celle celle-og cellematrix interaktioner20. Ved hjælp af denne teknik har rock et al. haft succes med at inddrive basal epiteliale celler til transkriptional profilering16. En lignende protokol blev for nylig brugt til at isolere bitter smag receptor ekspression celler fra en Tas2r143-CreERT2 drevet egfp reporter og fra B6. Il25Flare25/Flare25 for RNA-sekvensering undersøgelser5,8. Efter vores erfaring førte fordøjelsen af epitel arket med trypsin og EDTA til fremragende epitelial celle genvinding, men utilstrækkeligt antal kolinerge trakeal pensel celler til funktionelle eller transkriptionelle analyser, medmindre flere mus blev samlet for hver prøve (figur 4C).
Papain er en potent endolytisk plante cystein proteasehæmmere afledt af papaya latex, og det er kendt for at kløve peptid obligationer, der involverer grundlæggende aminosyrer, især arginin, lysin og rester efter phenylalanin21. Tracheal pensel celle isolation ved hjælp af papain fra ChAT(BAC)-egfp-mus blev først rapporteret af Krasteva et al10. Papain fordøjelsen blev også for nylig brugt til at adskille luftvejene epitelceller for enkelt celle RNA sekventering hvor børste/Tuft celler bestod en lille brøkdel af epiteliale celler11. Papain er også det mest almindeligt anvendte enzym til fordøjelse af hjernevæv til isolering af levedygtige neuroner22. Dissociation af hjernevæv med papain i 30 min resulterer i markant højere udbytter, neuronal overlevelse og integritet sammenlignet med trypsin fordøjelse23. Da nogle børste celler er tæt sammenflettet med nerveender3,10, kan brugen af papain være afgørende for den vellykkede spaltning af børste celle vejkryds til neuroner. Men, vi fandt, at en 45 min fordøjelse med papain i en koncentration på 35-40 U/mL dramatisk reduceret epitelial cellelevedygtighed, fører til lav børste celle opsving (figur 4D).
Vi brugte 3 metoder til at reducere papain toksicitet og øge vores cellulære udbytter. Først ved at adskille epitel arket med dispase reducerede vi den efterfølgende inkubationstid for papain fra 45 til 30 minutter. For det andet inhiberede vi straks papain-aktiviteten med leupeptin, en hæmmer af cystein-proteaser24. Især er leupeptin meget ustabil ved 4 °C og bør være aliciteret og frosset ved-20 °C. For det tredje konstaterede vi, at fortynding af det enzymatisk Ford øjede væv i en stor mængde af kolde PBS også bidrager til at bevare levedygtigheden af de Ford øjede celler. Et andet skridt, der er afgørende for at øge celle udbyttet er streng formalings10. Da forlænget vortexning også kunne mindske levedygtigheden, vi delvist erstattet det med trituration. Vi anbefaler formalings med en 18g nål til at adskille større cellulære klumper efterfulgt af yderligere formalings med en 21 g nål. Endelig fandt vi, at eGFP er meget let følsom og beskyttelse mod direkte lys eksponering på ethvert trin er nyttigt. Disse modifikationer tilladt for robust genvinding af levedygtige trakeal pensel celler (figur 4E).
De vigtigste begrænsninger i den protokol, der foreslås her, er 2-trins proceduren og brugen af papain, en potent cystein protease. Nogle grupper har for nylig erstattet liberase for dispase5 ved isolering af chemosensoriske celler. Desuden blev liberase fordøjelsen for nylig brugt til at isolere kemo sensoriske (børste) epiteliale celler fra nasale polypper25,26. Vi har ikke direkte sammenlignet liberase fordøjelsen til vores to-trins dispase/papain fordøjelse protokol. Papain er en potent cystein proteasehæmmere, der kan aktivere proteaseaktiverede receptor PAR2 på epiteliale celler27 , hvilket fører til aktivering af pensel celler selv eller til generering af mediatorer af andre respiratoriske celler, som igen kan aktivere pensel celler. Endelig kan papain moduere receptor ekspression gennem spaltning af overflade receptorer gør det vanskeligt at validere børste celle receptor udtryk ved flow flowcytometri28,29.
Sammenfattende giver vi en protokol for isolering af trakeal kolinerge børste celler fra ChAT-egfp reporter mus, der giver mulighed for robust genopretning af levedygtige trakeal pensel celler. Denne protokol er med held blevet anvendt til isolation og transkriptional analyse af pensel celler ved RNA-sekvensering3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Adam Chicoine på Brigham and Women's Human Immunology Center flow Core for hans hjælp med flow cytometrisk sortering. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed tilskud R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), og K08 AI132723 (L. G. B), og af American Academy of allergi, astma, og Immunologi (AAAAI)/American Lung allergisk Luftvejssygdom Award (N.A.B.), af AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), af Steven og Judy Kaye Young innovators Award (N.A.B.), af Joycelyn C. Austen Fund for karriereudvikling af kvindelige lægevidenskabelige videnskabsfolk (L.G.B.), og af en generøs donation af familien Vinik (L.G.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
