Summary
Penseel cellen zijn zeldzame cholinerge chemosensorische epitheelcellen gevonden in de naïeve muis trachea. Vanwege hun beperkte aantallen is de ex vivo-evaluatie van hun functionele rol in luchtweg-immuniteit en-renovatie een uitdaging. We beschrijven een methode voor isolatie van tracheale penseel cellen door flow cytometrie.
Abstract
Tracheale penseel cellen zijn cholinerge chemosensorische epitheelcellen die zijn geportiseerd om signalen van de luchtweg lumen naar het immuunsysteem en het zenuwstelsel te zenden. Ze zijn onderdeel van een familie van chemosensorische Epitheelcellen, waaronder Tuft cellen in het darmslijmvlies, borstel cellen in de luchtpijp en eenzame chemosensorische en microvillous cellen in het neusslijmvlies. Chemosensorische cellen in verschillende epitheliale compartimenten delen belangrijke intracellulaire markers en een kern transcriptionele handtekening, maar vertonen ook significante transcriptionele heterogeniteit, waarschijnlijk een afspiegeling van de lokale weefsel omgeving. Isolatie van tracheale borstel cellen van enkelvoudige celsuspensies is nodig om de functie van deze zeldzame epitheelcellen gedetailleerd te definiëren, maar hun isolatie is uitdagend, mogelijk als gevolg van de nauwe interactie tussen tracheale borstel cellen en zenuwuiteinden of door luchtweg-specifieke samenstelling van strakke en hecht knooppunten. Hier beschrijven we een procedure voor isolatie van penseel cellen van het tracheale epitheel van de muis. De methode is gebaseerd op een initiële scheiding van tracheaal epitheel van de submucosa, waardoor een daaropvolgende kortere incubatie van het epitheel blad met papaïne mogelijk is. Deze procedure biedt een snelle en gemakkelijke oplossing voor flowcytometrische sortering en functionele analyse van levensvatbare tracheale borstel cellen.
Introduction
Borstel cellen behoren tot een klasse van chemosensorische epitheelcellen gekenmerkt door de uitdrukking van bittere smaak receptoren en de smaak receptor transductie machines gevonden in smaak Bud cellen. In tegenstelling tot smaak Bud cellen, zijn chemosensorische epitheelcellen verspreid in epitheliale oppervlakken en worden aangeduid als eenzame chemosensorische cellen (scc's) en microvillous cellen in het neus epitheel1,2, borstel cellen in de luchtpijp 3,4en Tuft cellen in de darm5,6. Epitheelcellen die bittere smaak receptoren uitdrukken en de bittere smaak transductie machines zijn ook te vinden in de urethra7,8 en de gehoor buis9. Luchtweg borstel cellen hebben unieke functies in neurogene en immuun luchtweg reacties. Ze zijn acetylcholine-producerende chemosensorische cellen die beschermende respiratoire reflexen oproepen bij activering met bittere verbindingen en bacteriële metabolieten zoals Quorum-sensing stoffen10. Luchtweg borstel cellen zijn ook de dominante luchtweg epitheliale bron van IL-25, die de aeroallergen-opgewekt type 2 ontsteking in de luchtwegen3regelt.
De karakterisering van de volledige transcriptome van lagere luchtweg borstel cellen en hun reactie op milieu stimuli is beperkt door hun lage aantallen in het tracheale epitheel en zeer beperkte aantallen buiten de grote bronchiën10. Technieken die worden gebruikt voor de isolatie van chemosensorische cellen uit het intestinale epitheel hebben niet proportioneel hoge aantallen van de luchtpijp opgeleverd, mogelijk vanwege de intieme contacten van tracheale borstel cellen met zenuwuiteinden10 of andere weefsel-specifieke factoren in de respiratoire mucosa zoals de samenstelling van de aanhangers en nauwe Junction eiwitten. Recente rapporten van succesvolle isolatie van tracheale borstel cellen in hogere aantallen voor single cell RNA sequencing analyse gebruikt ofwel een 2 h incubatie met papaïne of een 18 h incubatie met pronase11,12. Aangezien een langere incubatie met spijsverteringsenzymen de levensvatbaarheid van de cellen kan verminderen en het transcriptionele profiel van cel uit verteerde weefsels13kunnen veranderen, kan dit de vergelijkende analyse met andere chemosensorische epitheel populaties vooroordelen.
Hier rapporteren we een methode voor het isoleren van tracheale borstel cellen voor RNA-sequencing3. Behandeling van de luchtpijp met hoge dosis dispase scheidt het epitheel van de submucosa. Daaropvolgende vertering van het epitheel blad met papaïne zorgt voor een uitstekend herstel van deze structurele cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voordat de volgende experimenten worden uitgevoerd, moet ervoor worden gezorgd dat alle dierenverzorging en-protocollen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) en worden verricht in overeenstemming met de "gids van de nationale Onderzoeksraad voor de zorg en het gebruik van Proefdieren " (8e editie, 2011) en de richtlijnen voor aankomst. Alle hieronder beschreven procedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité in het Brigham and Women's Hospital.
1. bereiding van de reagentia
- Bereid de digestie oplossing voor, een PBS-oplossing met 16 e/mL dispase en 20 μg/mL DNase I. Zorg ervoor dat het dispase poeder volledig is opgelost voordat u de oplossing opwarmt in een waterbad van 37 °C.
- Voeg 5% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) toe aan Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) om een stop oplossing te maken.
- Bereid tyrode I buffer: Voeg toe 26 U/ml papaïne (20 μL/ml 48 U/mg papaïne oplossing) en 10 μL/ml L-cysteïne naar Hepes-tyrode de buffer zonder calcium.
- Bereid de Tyrode II-buffer voor: Voeg 2 μL/mL leupeptine (5 mg/mL) toe aan de buffer van HEPES-Tyrode met calcium.
- FACS-buffer voorbereiden: gebruik Hanks ' balanced salt solution (HBSS) zonder calcium, magnesium & fenolrood, aangevuld met 2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en voeg 2% FBS toe.
2. dissectie van muis trachea
Opmerking: Muizen die in dit protocol worden gebruikt, zijn ChAT(BAC)-EGFP (B6. CG-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 maanden oud van beide geslachten. Minimaliseer de blootstelling van het weefsel aan direct licht om fotobleaching van eGFP te verminderen.
- Euthanasie de muis met 100 mg/kg pentobarbital euthanasioplossing geïnjecteerd intraperitoneaal of met behulp van standaardprotocollen goedgekeurd door de iacuc.
- Bevestig de muis op een chirurgische plaat in rugligging met 21 G naalden met verlengde bovenste en onderste ledematen. Spray de vacht met 70% EtOH om het gebied te ontsmeseren.
- Met behulp van rechte Tang, til de huid en vacht van de buik en maak een incisie in het midden met ontleed schaar (rechte schaar, 3 cm). Scheid met behulp van de schaar de huid van het onderhuidse weefsel van de buik tot het mandibula. Terwijl u het onderhuidse weefsel met de Tang vasthoudt, maakt u een kleine incisie met de schaar in het midden van de buikwand.
- Open het peritoneum met een V-vormige incisie. Gebruik de Tang, beweeg voorzichtig de dunne darm naar de zijkant, lokaliseer de abdominale aorta en Vena Cava en maak een incisie met de ontleed schaar om snelle exsanguination mogelijk te maken.
- Zoek het diafragma. Gebruik een 18 G naald, maak een opening in het diafragma net onder het borstbeen om de longen te laten leeglopen. Scheid voorzichtig het diafragma van de ribbenkast met behulp van een scherp puntige rechte ontsnij schaar om langs de basis van de ribben te snijden.
- Met behulp van de Tang, til het blootgestelde uiteinde van het borstbeen en snijd het borstbeen longitudinaal van de basis van de ribbenkast naar de nek. Maak een centrale cervicale incisie met korte rechte schaar (2 cm) en scheid de twee lobben van de submandibulaire klier.
- Verwijder voorzichtig het omringende bindweefsel en de thymus boven de Carina met een paar fijne punt hoge precisie Tang.
- Ontleden de luchtpijp vrij eerst door het proximale uiteinde op het niveau van de epiglottis te scheiden en vervolgens door het distale uiteinde op het niveau van de bifurcatie van de luchtpijp uit te snijden.
- Zoek de epiglottis en snijd de luchtpijp longitudinaal van de epiglottis naar de Carina.
3. tracheale epitheliale spijsvertering
- Plaats de luchtpijp in een tube van 1,5 ml met 750 μL pre-warmed (tot 37 °c) oplossing voor de spijsvertering. Inincuberen op een shaker bij 200 rpm gedurende 40 min bij kamertemperatuur. Bedek de buis met aluminiumfolie om de blootstelling aan direct licht te verminderen.
- Voeg 750 μL koude DMEM toe met 5% FBS om de reactie te stoppen. Plaats op ijs.
- Breng de luchtpijp over naar een Petri schaaltje (100 mm x 15 mm) en plaats deze onder een ontsnij bare Microscoop. Oriënteer de luchtpijp met de epitheel zijde naar boven gericht. De longitudinaal ontleed luchtpijp heeft een semi-cilindrische vorm die wordt gehandhaafd door de kraakbeen vormige ringen. Het epitheel bevindt zich op het concave oppervlak.
- Tether het epiglottis gebied van de luchtpijp met rechte Tang naar de Petri schaal en met behulp van een maat 22 wegwerp scalpel, schrait het epitheum van de luchtpijp. De epitheliale laag scheidt als een doorschijnend blad.
- Het epitheel met het scalpël. Breng de epitheel laag over in een buis van 2 mL.
- Spoel de Petri schaal af met 750 μL Tyrode I-buffer en breng over naar de 2 mL-buis met de epitheliale laag.
- Inbroed de tracheale epitheliale laag in Tyrode I buffer gedurende 30 min bij 37 °C op een shaker bij 200 rpm. Bedek de buis met aluminiumfolie om de blootstelling aan direct licht te verminderen.
- Voeg 750 μL koude Tyrode II-buffer toe. Vortex het verteerde weefsel krachtig voor 20-30 s. Triturate het homogenaat met een spuit bevestigd aan een 18 G naald 10 keer. Overschakelen naar een 21 G gauge naald en wrijf 10-20 meer keren.
- Filtreer de cellen door een zeef van 100 μm in een conische buis van 50 mL. Voeg 30:1 vol/vol koude FACS-buffer toe.
- Spin bij 350 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en gooi het supernatant weg. Respendeer de pellet in de koude FACS buffer en breng de suspensie over in een polystyreen buis van 12 mm x 75 mm (5 mL). Draai opnieuw op 350 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de pellet in 100 μL FACS buffer.
- Voeg 1 μL anti-Mouse CD16/32 blokkerende antilichaam toe om niet-specifieke binding te blokkeren en gedurende 15 minuten op ijs te inbroed. Niet wassen.
- Voeg de volgende antilichamen en de respectieve Isotype-controles toe: Pacifische blauwe anti-muis CD45 of rat IgG2a, k (0,25 μg/106 cellen in 100 μL volume) en allophycocyanin (APC) anti-muis epcam of rat IgG2b, k (0,5 μg/106 cellen in 100 μL volume) monoklonale antilichamen. Incuberen voor 45 min op ijs beschermd tegen direct licht. Voeg 4,5 mL koude FACS buffer toe, meng en spin bij 350 x g gedurende 10 min bij 4 °c. Gooi de FACS buffer weg en onderbreek de pellet in 300 μL koude FACS buffer.
- Voeg propidium jodide (PI) (5 μg/mL) toe direct voor de stroom cytometrische sortering.
Opmerking: Penseel cellen hebben een onregelmatige vorm met verschillende processen die hun hechting op filters mogelijk zouden kunnen verhogen (Figuur 3C). We vergeleek 30 mm tot 70 mm en 100 mm filters en ontdekten dat grotere porie filters een betere opbrengst zorgden. Bovendien verbetert een grondige trituratie van de celsuspensie na de vertering van papaïne aanzienlijk de opbrengst van de borstel cellen. We raden aan om een 18G naald te gebruiken voor initiële trituratie gevolgd door een kleinere boring (21 of 23 G naald) voor een fijnere dissociatie van cellen.
4. Flowcytometrie gating strategie
- Identificeer cellen van puin door voorwaartse en zijspreidings hoek. Sluit de wambuizen uit met de hoogte en breedte van de voorwaartse spreidings hoogte en-breedte. De wambuizen zijn de cellen met hoge breedtewaarden.
- Identificeer in de afzonderlijke cellen de levende cellen als de populatie die PI-negatief is.
- Identificeer in de Live-afzonderlijke cellen de CD45 laag tot negatieve cellen op basis van het Isotype-besturingselement.
- Identificeer binnen de CD45 lage/negatieve cellen de EpCAM-positieve cellen die ook eGFP-positief zijn (in het FITC-kanaal). Dit is de populatie van penseel cellen (Figuur 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze procedure is met succes geïmplementeerd om tracheale penseel cellen te isoleren voor RNA-sequencing3. Na isolatie van de luchtpijp en de vertering van het weefsel met een 2-stappen Protocol (Figuur 1), werden cellen verzameld en gekleurd met fluorescently-GELABELDE CD45 en epcam na uitsluiting van dode cellen met pi. Na het uitgeren van wambuizen op basis van voorwaartse en zijspreidings karakteristieken, definieerde men de penseel cellen als laag/negatief voor CD45, positief voor epcam en positief voor EGFP (Figuur 2A). Borstel cellen vertegenwoordigd ~ 0.16-0.42% van CD45laag/NEG cellen doorstroming cytometrie en verantwoord 250-600 cellen per luchtpijp (Figuur 2B). We vergeleken deze graven om een schatting van het aantal ChAT-eGFP-positieve cellen in hele tracheale mounts van ChAT(BAC)-EGFP muizen op basis van onze gepubliceerde uitgebreide immunohistologische evaluatie van tracheale borstel cellen3 en geïllustreerd hier ( Figuur 3). Onze eerdere studies van tracheale borstel cellen in wild type, ChAT(BAC)-EGFP muizen en Il25F25/F25 muizen suggereerden dat cholinerge penseel cellen 90% overlappen met DCLK1+ en Il25+ cellen en account voor 600-1000 borstel cellen per luchtpijp3. Met name is dit aantal lager dan het aantal cholinerge penseel cellen dat wordt gerapporteerd door andere groepen10. Aangezien chemosensorische celaantallen worden gewijzigd door blootstelling aan microbiële metabolieten en protozoa5,14, kunnen deze getallen een variabiliteit in de interinstitutionele microbiota weerspiegelen. Daarom stellen we voor om het aantal penseel cellen te schatten met fluorescentiemicroscopie om het verwachte aantal geïsoleerde penseel cellen te meten door flowcytometrische sortering.
Tijdens het opstellen van ons protocol probeerden we een aantal eerder gepubliceerde methoden van isolatie van chemosensorische cellen (Figuur 4). Toen we fijngehakte luchtpijp met 650 U/mL Collagenase IV en 1,84 U/mL dispase aangevuld met DNase I voor 45 min, een combinatie vaak gebruikt voor het verkrijgen van enkele cel suspensies van Long homogeniseren15, we bereikten een enkelvoudige celsuspensie van epitheliale cellen, maar we herstelde slechts enkele penseel cellen (Figuur 4A). Tuft cellen in de darm zijn met succes geïsoleerd met behulp van 2,5 mm EDTA en 0,75 mm dithiothreitol (DTT) met DNase I voor 20 min om de epitheelcellen, gevolgd door de vertering van de vrijgekomen epitheelcellen met 0,01 U/ml dispase met dnasei voor 10 min te verjagen 6. in onze handen, met behulp van deze procedure ook leidde tot suboptimale tracheale borstel cel herstel (Figuur 4B). Een protocol voor succesvolle isolatie van tracheale borstel cellen voor RNA-analyse werd beschreven door Krasteva et al.10. Na dit protocol hebben we de fijngehakte luchtpijp met 35 U/ml papaïne in de tyrode-buffer voor 45 min geïnfiltreerd en geen goed herstel van de borstel cellen bereikt (Figuur 4C). Rock et al. beschreef een methode voor de vertering van tracheaal epitheel voor basaalcelisolatie met twee stappen: scheiding van het epitheel van de mesenchymale laag met hoge dosis dispase (16 U/mL) bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie van het gestripte epitheel met 0,1% trypsine en 1,6 mM EDTA gedurende 30 min bij 37 °C16. Na deze stappen leidde tot een beter herstel van de penseel cellen, maar de bereikte aantallen per muis waren onvoldoende voor diepgaande functionaalanalyses (Figuur 4D). Om het protocol te optimaliseren, hebben we besloten om de laatste twee benaderingen te combineren. Door het tracheale epitheel te scheiden met een hoge dosis dispase, hebben we ons gericht op een betere toegang van papaïne tot tracheale borstel cellen. Dus, met behulp van 16 U/mL dispase op kamertemperatuur op de hele luchtpijp om het epitheel te scheiden en daaropvolgende incubatie van het epitheel met 26 U/mL papaïne in Tyrode buffer leidde tot de beste borstel cel herstel (Figuur 4E).
Figuur 1 : Schema van voorgestelde stappen voor isolatie van tracheale penseel cellen. Het protocol bevat 2 belangrijke stappen: na dissectie wordt de hele luchtpijp geïnineerd in een hoge dosis dispase oplossing om het epitheel te scheiden; Dit wordt gevolgd door de vertering van het epitheel blad met papaïne in calcium dat Tyrode buffer (Tyrode I) en antilichaam kleuring bevat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Representatieve Flowcytometrie analyse van tracheale penseel cellen. (A). Schematische weergave van de Flowcytometrie strategie. Enkelvoudige cellen werden afgesloten op basis van hun voorwaartse en zijspreidings kenmerken en levende cellen werden gekozen op basis van de uitsluiting van Propidium jodide. CD45 lage/negatieve cellen werden gekozen op basis van de Isotype-regeling en geëvalueerd op hun expressie van EpCAM. EpCAM-positieve cellen werden beschouwd als borstel cellen als ze eGFP tl-licht uitgedrukt in het FITC-kanaal. (B). aantal cholinerge tracheale borstel cellen per muis luchtpijp en frequentie gepresenteerd als percentage van alle CD45lage/- cellen en als percentage van CD45laag/-epcam+ cellen. Elke stip vertegenwoordigt een afzonderlijke muis. Gegevens zijn afkomstig van 3 afzonderlijke experimenten met 2-3 muizen per stuk. (C). afwezigheid van EGFP-positieve penseel cellen in een tracheale epitheel verteren van een wild type muis gebeitst voor CD45 en epcam. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Hele Mount van muis luchtpijp van een praatje(BAC)-EGFP muis. De luchtpijp werd in de longitudinaal geopend en gekleurd met anti-GFP-antilichamen om het eGFP-groene fluorescentie signaal te verbeteren. (A) hele tracheale Mount of ChAT(BAC)-EGFP Mouse, intens groene fluorescerende cellen vertegenwoordigen penseel cellen; schaalbalk 1 mm; B) hele tracheale houder van een wild type muis die de afwezigheid van penseel cellen aantoont; Schaalbalk = 1 mm; C) vergroting van de epitheliale laag die onregelmatig gevormde penseel cellen (groene cellen) demonstreert als een cholinerge zenuw uitgang (Arrow); D) hele tracheale bevestiging van een luchtpijp van een praatje(BAC)-EGFP-afbeelding voor GFP zonder antilichaam-verbetering van het fluorescentie signaal; E) dwarsdoorsnede van een paraffine-ingesloten muis luchtpijp van een praatje(BAC)-EGFP muis gekleurd met anti-GFP (groen) of geit IgG controle en DAPI (blauw); Schaal staven = 20 μm (C-E). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Vergelijking van verschillende tracheale vergistings protocollen. A) de luchtpijp is fijngemalen en geïnfiltreerd met 650 e/ml COLLAGENASE IV en 1,84 U/ml dispase aangevuld met DNase I voor 45 min. Dit experiment werd 2 keer herhaald. B) de gehele luchtpijp werd geïnfiltreerd met 2,5 mm EDTA en 0,75 mm DTT, aangevuld met DNase I gedurende 20 min; de epitheliale cellen werden afgebroken en verder verteerd met 0,01 U/mL dispase en DNase ik voor 10 min. Dit experiment werd 2 keer herhaald. C) de luchtpijp werd fijngemalen en geïnfiltreerd met 35 e/ml papaïne in de buffer van tyrode I gedurende 45 min; resterende papaïne activiteit werd geremd met leupeptin. Dit experiment is eenmaal uitgevoerd. D) de hele luchtpijp werd geïnhaleerd met een hoge dosis dispase (16 e/ml) gedurende 30 minuten om het epitheel blad te scheiden, gevolgd door incubatie van het epitheel blad met 0,1% trypsine en 1,6 mm EDTA gedurende 30 minuten. Dit experiment werd 2 keer herhaald. (E). de hele luchtpijp werd gedurende 30 minuten geïnfiltreerd met een hoge dosis dispase (16 e/ml), gevolgd door de vertering van het epitheel blad met 26 e/ml papaïne in de tyrode-buffer gedurende 30 minuten. De resterende papaïne activiteit werd geremd met leupeptine en hoge volume verdunning. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We constateerden dat een combinatie van een hoge dosis dispase behandeling voor 40 min gevolgd door een korte papaïne behandeling (30 min) een optimaal protocol biedt voor tracheale spijsvertering en borstel celisolatie. Deze combinatie vermijdt uitgebreide spijsvertering en produceert de hoogste opbrengst van penseel cellen, vergeleken met alternatieve protocollen.
Terwijl Long spijsvertering te extract hematopoietische cellen heeft klassiek vertrouwd op milde spijsverteringsenzymen zoals Collagenase IV15, isolatie van epitheliale cellen vereist complexere protocollen. Enkele cel suspensies van epitheelcellen zijn moeilijker te bereiken vanwege de strakke en aanhechtende kruisingen die ze aan elkaar en het kelder membraan binden en vanwege de frailiteit van de cellen zelf. De meeste protocollen voor epitheliale celvertering betreffen twee stappen-een eerste stap is de scheiding van het epitheel uit het kelder membraan gevolgd door volgende stappen om de nauwe kruisingen en desmosomes die de epitheelcellen aan elkaar hechten te verstoren 16 , 17.
Verschillende groepen hebben met succes geïsoleerde chemosensorische Tuft cellen uit de darm met behulp van verschillende modificaties van een 2-stappen protocol voor isolatie van epitheliale cellen: de eerste stap gebruikt EDTA en DTT om epitheliale cellen vrij te geven van de de, gevolgd door vertering van de epitheliale vellen met dispase. Howitt et al. gebruikte een mengsel van 5 mM EDTA + 1 mM DTT gevolgd door spijsvertering met 0,5 eenheden/mL Dispase II en DNase14. Gerbe et al. gebruikte hoge concentratie 30 mM EDTA alleen om de epitheliale fractie te scheiden en vervolgens geïnineerd met dispase aangevuld met DNaseI18. Von Moltke et al. gebruikte 2,5 mM EDTA, 0,75 mM DTT en DNaseI gevolgd door dispase spijsvertering6. We ontdekten dat deze technieken de isolatie van levensvatbare epitheelcellen in de luchtpijp mogelijk maken, maar het percentage tracheale borstel cellen was extreem laag (Figuur 4B) en niet consistent met onze verwachting van isolatie van 600-800 borstel cellen per luchtpijp gebaseerd op onze histologie evaluatie.
Tracheale epitheliale cel isolatie protocollen zijn ontwikkeld door verschillende groepen om basale epitheelcellen te bestuderen. De belangrijkste verschillen tussen deze protocollen en degenen die werkzaam zijn in de darm zijn in de volgorde van spijsverteringsenzymen. De eerste stap is de scheiding van het tracheale epitheel door incubatie met een hoge concentratie van dispase (16 U/mL) bij kamertemperatuur16. Hierdoor kan het epitheel als één vel van de mesenchymale laag19worden gescheiden. De daaropvolgende verwerking van het tracheale epitheel maakt gebruik van een combinatie van trypsine en EDTA, een van de meest gebruikte enzymatische methoden van celloslating, om een enkelvoudige celsuspensie te bereiken. Trypsine Slaid peptiden op de C-Terminal zijde van lysine en arginine aminozuurresiduen, terwijl EDTA wordt gebruikt als een calciumchelator voor cel-cel en cel-matrix interacties20. Met behulp van deze techniek, rock et al. zijn succesvol geweest in het herstellen van basale epitheliale cellen voor transcriptionele profilering16. Een soortgelijk protocol werd onlangs gebruikt voor het isoleren van bittere smaak receptor uitdrukken van cellen van een Tas2r143-CreERT2 gedreven EGFP reporter en van B6. Il25Flare25/Flare25 voor RNA-sequentie studies5,8. In onze ervaring, de vertering van het epitheel blad met trypsine en EDTA leidde tot uitstekende epitheliale celherstel, maar onvoldoende aantallen cholinerge tracheale borstel cellen voor functionele of transcriptionele analyse, tenzij meerdere muizen werden samengevoegd voor elke monster (Figuur 4C).
Papaïne is een potente endolytische plant cysteïne protease afgeleid van Papaya latex, en het is bekend dat klieven peptide obligaties met fundamentele aminozuren, met name arginine, lysine en residuen na fenylalanine21. Tracheal Brush cell isolation met behulp van papaïne van ChAT(BAC)-EGFP muizen werd voor het eerst gerapporteerd door krasteva et al10. Papain spijsvertering werd ook onlangs gebruikt om te dissociëren luchtweg epitheliale cellen voor single cell RNA sequencing waar borstel/Tuft cellen bestond uit een kleine fractie van epitheliale cellen11. Papaïne is ook het meest gebruikte enzym voor de vertering van hersenweefsel voor isolatie van levensvatbare neuronen22. Dissociatie van hersenweefsel met papaïne gedurende 30 minuten resulteert in duidelijk hogere opbrengsten, neuronale overleving en integriteit in vergelijking met trypsine-spijsvertering23. Aangezien sommige borstel cellen nauw verweven zijn met zenuwuiteinden3,10, kan het gebruik van papaïne van cruciaal belang zijn voor het succesvolle decolleté van borstel celkoppelingen naar neuronen. Echter, we vonden dat een 45 min spijsvertering met papaïne in een concentratie van 35-40 U/ml drastisch verminderde epitheliale cel levensvatbaarheid, wat leidt tot lage borstel cel herstel (Figuur 4D).
We gebruikten 3 methoden om papaïne toxiciteit te verminderen en onze cellulaire opbrengsten te verhogen. Ten eerste, door het epitheel blad met dispase te scheiden, hebben we de daaropvolgende incubatietijd van papaïne verlaagd van 45 naar 30 minuten. Ten tweede, we onmiddellijk geremd de papaïne activiteit met leupeptin, een remmer van cysteïne proteasen24. Met name, leupeptine is zeer instabiel bij 4 °C en moet worden alicgeciteerd en bevroren bij-20 °C. Ten derde vonden we dat verdunning van het enzymatisch verteerde weefsel in een groot volume koude PBS ook helpt om de levensvatbaarheid van de verteerde cellen te behouden. Een andere stap die cruciaal is voor het verhogen van de celopbrengsten is rigoureuze trituratie10. Omdat langdurige grondig ook de levensvatbaarheid zou kunnen verminderen, hebben we het gedeeltelijk vervangen door trituratie. We bevelen een trituratie met een 18G naald aan om grotere cellulaire klonters te ontkoppelen, gevolgd door een extra trituratie met een 21 G naald. Tot slot constateerden we dat eGFP zeer lichtgevoelig is en dat bescherming tegen directe licht blootstelling bij elke stap nuttig is. Deze aanpassingen lieten een robuust herstel van levensvatbare tracheale borstel cellen mogelijk (Figuur 4E).
De belangrijkste beperkingen van het protocol dat hier wordt voorgesteld, zijn de 2-stappen procedure en het gebruik van papain, een potente cysteïne protease. Sommige groepen hebben onlangs liberase vervangen voor dispase5 bij het isoleren van chemosensorische cellen. Bovendien, liberase spijsvertering werd onlangs gebruikt om te isoleren chemosensorische (borstel) epitheelcellen uit nasale poliepen25,26. We hebben niet direct vergeleken liberase spijsvertering aan onze twee-stap dispase/papain spijsvertering protocol. Papaïne is een potente cysteïne protease dat de protease geactiveerde receptor PAR2 op epitheelcellen27 kan activeren, wat leidt tot activering van de borstel cellen zelf of tot de generatie van mediatoren door andere Ademhalings cellen die op hun beurt de penseel cellen. Tot slot, papaïne kan moduleren receptor expressie door het decolleté van oppervlak receptoren waardoor het moeilijk om te valideren van de borstel cel receptor expressie doorstroming flowcytometrieonderzoeken28,29.
Kortom, we bieden een protocol van isolatie van tracheale cholinerge borstel cellen van ChAT-eGFP reporter muizen die een robuust herstel van levensvatbare tracheale penseel cellen mogelijk maakt. Dit protocol is met succes gebruikt voor isolatie en transcriptionele analyse van penseel cellen door RNA-sequencing3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Adam Chicoine bij de Brigham and Women's Human Immunology Center flow core voor zijn hulp bij Flow cytometrische sortering. Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health subsidies R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), en K08 AI132723 (L. G. B), en door de American Academy of Allergy, astma, en Immunologie (AAAAI)/American Long allergische Respiratoire Disease Award (N.A.B.), door de AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), door de Steven en Judy Kaye Young innovators Award (N.A.B.), door het Fonds Joycelyn C. Austen voor loopbaanontwikkeling van vrouwelijke artsen wetenschappers (L.G.B.), en door een royale donatie van de familie Vinik (L.G.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
