Summary
תאי מברשת הם נדירים cholinergic האפיתל תאים כימוחושי נמצא בקנה הנשימה של העכבר נאיבי. בשל המספרים המוגבלים שלהם, הערכה לשעבר vivo של תפקידם התפקודי בחסינות דרכי הנשימה ושיפוץ הוא מאתגר. אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה על ידי הזרמת cy, לנסות.
Abstract
תאי מברשת הקנה הם cholinergic כימוחושי תאים אפיתל צפוי לשדר אותות מן לומן דרכי הנשימה אל מערכות החיסון והעצבים. הם חלק ממשפחה של תאים אפיתל כימוחושי הכוללים תאים קווצת ברירית המעי, תאי מברשת בקנה הנשימה, וכימוחושי בידוד תאים microvillous ברירית האף. כימוחושי תאים בתאי אפיתל שונים לשתף סמנים תאיים מפתח וחתימה ליבה ההמרה, אבל גם להציג משמעותי transcript טרוגניות, כנראה רפלקטיבית של סביבת הרקמה המקומית. בידוד של תאים מברשת הקנה מתוך תא יחיד השבולים נדרש כדי להגדיר את הפונקציה של אלה תאים אפיתל נדירים בפירוט, אבל הבידוד שלהם הוא מאתגר, בגלל האינטראקציה הקרובה בין תאים מברשת קנה הנשימה וקצות העצבים או עקב הרכב ספציפי לדרכי הנשימה של צמתים הדוקים ומחסיד. כאן, אנו מתארים הליך בידוד של תאי מברשת מתוך האפיתל הקנה הנשימה של העכבר. השיטה מבוססת על הפרדה ראשונית של האפיתל קנה הנשימה מן הרירית, המאפשר הדגירה קצר יותר של גיליון האפיתל עם papain. הליך זה מציע פתרון מהיר ונוח עבור מיון cytometric זרימה וניתוח פונקציונלי של תאים מברשת קיימא הקנה.
Introduction
תאי מברשת שייכים מחלקה של תאים אפיתל כימוחושי מאופיין על ידי ביטוי של קולטני טעם המר ואת מכונות קולטן הטעם מצאו בתאים ניצן טעם. בניגוד לטעם ניצן תאים, התאים האפיתל כימופי מפוזרים משטחים אפיתל מכונים תאים כימוחושי הבידוד (sccs) ותאים microvillous ב אפיתל האף1,2, תאי מברשת בקנה הנשימה . תאים 3,4, ו-קווצת במעי5,6 תאים אפיתל ביטוי קולטני טעם המר ואת מכונות טעם המר התמרה גם מצויים בשופכה7,8 ו שפופרת השמיעה9. בתאי מברשת נתיב האוויר יש פונקציות ייחודיות הנוירוגניים ואת התגובה החיסונית החיסון. הם מייצרים אצטילכולין בתאי כימוחושי שעוררו רפלקסים הנשימה הגנה על ההפעלה עם תרכובות מר ומטבוליטים חיידקיים כמו חומרים חישת-quorum10. תאים מברשת נתיב האוויר הם גם מקור האפיתל של דרכי הנשימה הדומיננטי של IL-25, אשר מווסת aeroallergen-מעורר סוג 2 דלקת בדרכי הנשימה3.
אפיון מלוא ההמרה של תאים מברשת האוויר התחתון ואת התגובה שלהם גירויים סביבתיים כבר מוגבל על ידי מספרים נמוכים שלהם באפיתל הקנה ומספרים מוגבלים מאוד מעבר סמפונות גדול10. טכניקות המשמשות לבידוד של תאים כימוחושי מן האפיתל המעי לא הניבו מספרים גבוהים באופן פרופורציונלי מקנה הנשימה, אולי בגלל הקשרים האינטימיים של תאים מברשת הקנה עם קצות העצבים10 או אחרים מרכיבים ספציפיים לרקמה ברירית הנשימה, כגון הרכב של מחסיד וחלבונים הדוקים עם הצומת. דיווחים אחרונים של בידוד מוצלח של תאים מברשת קנה הנשימה במספרים גבוהים יותר עבור ניתוח ה-RNA של תא בודד המועסקים או 2 h דגירה עם פפאין או 18 h הדגירה עם המואז11,12. מאז יותר incubations עם אנזימי העיכול יכול להפחית את הכדאיות התאים ולשנות את הפרופיל הטרנס של תאים מתוך רקמות מתעכל13, זה יכול הטיה ניתוח השוואתי עם אוכלוסיות אפיתל אחרות כימוחושי.
כאן, אנו מדווחים על שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה ברצף RNA3. טיפול בקנה הנשימה במינון גבוה dispase מפריד את האפיתל מן הרירית. העיכול הבאים של גיליון אפיתל עם פפאין מאפשר התאוששות מצוינת של תא זה מבניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לפני שתנהל את הניסויים הבאים, ודא שכל השימוש בבעלי חיים והפרוטוקולים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (iacuc) והופיעה בהסכמה עם המדריך הלאומי של מועצת המחקר לטיפול ושימוש ב חיות מעבדה "(8ה מהדורה, 2011) והנחיות הגעה. כל ההליכים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש בבית החולים לנשים בריגהם.
1. הכנת ריאגנטים
- הכנת פתרון העיכול Dispase, שהוא פתרון PBS המכיל 16 U/mL dispase ו 20 μg/mL DNase I. ודא כי אבקת dispase מומס היטב לפני התחממות הפתרון באמבט מים ב 37 ° c.
- הוסף 5% חום בלתי מופעל העובר סרום (FBS) כדי להפוך את מדיום נשר שונה בינונית (DMEM) כדי לבצע פתרון הפסקה.
- הכינו את המאגר האני מאגר: להוסיף 26 U/ml פפאין (20 μl/ml של 48 u/mg פתרון פפאין) ו 10 μl/ml l-cysteine של hepes-tyrode של מאגר ללא סידן.
- הכינו את המאגר השני של Tyrode: להוסיף 2 μL/mL ליופטין (5 מ"ג/mL) למאגר של הייפסי-טירכב עם סידן.
- להכין מאגר facs: השימוש בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (hbss) ללא סידן, מגנזיום & פנול אדום, שיושלם עם 2 מ"מ חומצה ethylenediammiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiihi
2. חיתוך של קנה הנשימה של העכבר
הערה: עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הם צ'אט(BAC)-Egfp (B6. Cg-Tg (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 חודשים של גיל שני המינים. מזער את החשיפה של הרקמה לאור ישיר כדי להפחית את הלבנת התמונות של eGFP.
- המתת חסד עם העכבר עם 100 mg/ק"ג פנטוברביטל המתת הרדמה intraperitoneally או באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים שאושרו על ידי IACUC.
- לתקן את העכבר על לוח כירורגי במצב פרקדן עם 21 מחטים G עם גפיים המורחבת העליון והתחתון. רסס את הפרווה עם 70% אטואה כדי לחטא את האזור.
- באמצעות מלקחיים ישרים, להרים את העור ואת הפרווה של הבטן ולעשות חתך במרכז עם מחתך מספריים (מספריים ישרים, 3 ס מ). באמצעות המספריים, הפרידו את העור מרקמת התת-עורית מהבטן אל הממהולה. בעוד מחזיק את הרקמה התת עורית למעלה עם מלקחיים, לעשות חתך קטן עם המספריים במרכז קיר הבטן.
- פתח את הצפק עם חתך בצורת V. באמצעות מלקחיים, בעדינות להזיז את המעי הדק בצד, לאתר את אבי העורקים הבטן ואת המטה קאווה ולעשות חתך עם המספריים מבתר כדי לאפשר הקלה מהירה לדימום.
- . תאתר את הסרעפת באמצעות מחט של 18 G, לעשות פתיחה בסרעפת מתחת עצם החזה כדי לרוקן את הריאות. הפרידו בקפידה את הסרעפת מכלוב הצלעות בעזרת מספריים חדים הפונים ישר לחיתוך לאורך בסיס הצלעות.
- באמצעות מלקחיים, להרים את הקצה החשוף של עצם החזה ולחתוך את עצם החזה מlongitudinally מהבסיס של כלוב הצלעות לצוואר. בצע חתך צוואר הרחם המרכזי עם מספריים ישרים קצרים (2 ס מ) ולהפריד את שתי האונות של בלוטת הלסת התחתונה.
- הסר בזהירות את רקמת החיבור המקיפים את בלוטת התימוס על ידי קרינה עם זוג מלקחיים דיוק באיכות גבוהה גבוה.
- לנתח את קנה הנשימה בחינם הראשון על ידי הפרדת הקצה הטוב ביותר ברמה של אפיגלוטיס ולאחר מכן על ידי מבתר את הקצה המרוחק ברמת הבייון של קנה הנשימה.
- לאתר את אפיגלוטיס ולחתוך את קנה הנשימה longitudinally מן אפיגלוטיס אל קרינה.
3. מסדר העיכול האפיתל
- מניחים את קנה הנשימה לתוך צינור 1.5 mL המכיל 750 μL של טרום מחומם (כדי 37 ° c) פתרון העיכול dispase. דגירה על שייקר ב 200 סל ד עבור 40 דקות בטמפרטורת החדר. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להקטין את החשיפה לאור ישיר.
- הוסף 750 μL של DMEM קר עם 5% FBS כדי לעצור את התגובה. . מקום על הקרח
- העבר את קנה הנשימה לצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) ומקום תחת מיקרוסקופ מבתר. כוון את קנה הנשימה עם הצד האפיתל פונה כלפי מעלה. בקנה הנשימה longitudinally גזור צורה חצי גליל מתוחזק על ידי טבעות הסחוס. . האפיתל נמצא על משטח הקימור
- לקשור את האזור אפיגלוטיס של קנה הנשימה עם מלקחיים ישר לצלחת פטרי באמצעות גודל 22 אזמל חד פעמי, לגרד את האפיתל את קנה הנשימה. שכבת האפיתל מפרידה כסדין שקוף.
- . הללו את האפיתל עם האזמל העבר את שכבת האפיתל לשפופרת של 2 מ ל.
- לשטוף את צלחת פטרי עם 750 μL של Tyrode אני מאגר ולהעביר לצינור 2 מ"ל המכיל את שכבת האפיתל.
- מודדאת שכבת האפיתל הקנה בתוך Tyrode אני מאגר עבור 30 דקות ב 37 ° c על שייקר ב 200 סל ד. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להקטין את החשיפה לאור ישיר.
- הוסף 750 μL של המאגר השני של טירודה. מערבולת את הרקמה מתעכל במרץ עבור 20-30 s. Triturate את הגון אכל עם מזרק מוצמד 18 גרם מחט 10 פעמים. מעבר למחט מחוון של 21 גרם ו קצוצות 10-20 יותר פעמים.
- לסנן את התאים באמצעות מסננת 100 יקרומטר לתוך צינורית חרוט 50 mL. הוסף 30:1 vol/vol של מאגר FACS קר.
- ספין ב 350 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולהיפטר supernatant. השהה מחדש את הגלולה במאגר FACS קר להעביר את ההשעיה של 12 מ"מ x 75 מ"מ (5 mL) פוליסטירן מוקצף. ספין שוב ב 350 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולהיפטר supernatant.
- השהה מחדש את הגלולה ב-100 μL של מאגר FACS.
- הוסף 1 μL של אנטי עכבר CD16/32 נוגדן חסימת לחסום את הכריכה הלא ספציפית מודטה עבור 15 דקות על הקרח. . אל תשטוף את הכביסה
- להוסיף את הנוגדנים הבאים שולטת isotype: פסיפיק כחול נגד עכבר CD45 או עכברוש IgG2a, k (0.25 μg/106 תאים בנפח 100 μl) ו allophycocyanin (APC) נגד עכבר epcam או עכברוש IgG2b, k (0.5 μg/106 תאים ב 100 μl) נוגדנים מונבטיים. דגירה של 45 דקות על הקרח מוגן מפני אור ישיר. הוסף 4.5 mL של מאגר FACS קר, לערבב ספין ב 350 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. להיפטר מאגר FACS ולהשעות מחדש את הגלולה ב 300 μL של מאגר FACS קר.
- הוסף propidium יודיד (PI) (5 μg/mL) מיד לפני מיון cytometric הזרימה.
הערה: לתאי מברשת יש צורה לא סדירה עם מספר תהליכים שעלולים להגביר את הדבקות שלהם במסננים (איור 3ג). השוונו 30 מ"מ ל 70 מ"מ ו 100 מ"מ מסננים ומצא כי מסנני הנקבוביות גדול יותר מבטיח תשואה טובה יותר. בנוסף, נשחקו יסודית של ההשעיה התא לאחר עיכול פפאין משפרת באופן משמעותי את התשואות תא מברשת. אנו ממליצים להשתמש במחט 18g עבור נשחקו הראשונית ואחריו קטן נשא (21 או 23 G מחט) לדיסוציאציה עדינה יותר של תאים.
4. הזרם Cy, לנסות להזרים אסטרטגיה
- זיהוי תאים מפסולת באמצעות זווית פיזור לפנים ולצד. לא לכלול את doublets באמצעות גובה פיזור הקדמי ורוחב ורוחב פיזור הצד ורוחבו. Doublets יהיו התאים בעלי ערכי רוחב גבוהים.
- בתוך התאים היחידים, זהה את התאים החיים כאוכלוסיה שהיא PI שלילית.
- בתוך התאים היחידים החיים, זהה את CD45 נמוך לתאים שליליים בהתבסס על פקד isotype.
- בתוך CD45 תאים נמוכים/שליליים, לזהות את התאים החיוביים EpCAM כי הם גם eGFP חיובי (בערוץ FITC). זוהי האוכלוסייה של תאי מברשת (איור 2א).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הליך זה יושם בהצלחה כדי לבודד תאים מברשת הקנה הנשימה עבור רצפי RNA רצף3. לאחר בידוד של קנה הנשימה ואת העיכול של הרקמה עם פרוטוקול 2-step (איור 1), תאים נאספו והוכתם עם התווית FLUORESCENTLY ו-epcam לאחר החרגה של תאים מתים עם PI. לאחר היציאה doublets מבוסס על מאפייני פיזור בצד הקדמי, הגדרת תאי מברשת נמוך/שלילי עבור CD45, חיובי עבור EpCAM ו חיובי עבור eGFP (איור 2א). תאי מברשת מיוצגים ~ 0.16-0.42% מתאים CD45נמוך/מינוס על-ידי זרימה cy, ה250-600 תאים לכל קנה הנשימה (איור 2ב). השוונו את הסעיפים הללו לאומדן של מספר התאים צ'אט-eGFP בקנה הנשימה כולו עולה מצ(BAC)-egfp עכברים מבוסס על הערכה החיסונית הנרחבת שלנו הערכת האבחון של תאים מברשת קנה הנשימה3 ו מאוירים כאן ( איור 3). המחקרים הקודמים שלנו של תאים מברשת קנה הנשימה סוג פראי, צ'אט(BAC)-egfp עכברים ו Il25F25/F25 עכברים הציע cholinergic מברשת תאים הם 90% חופפים עם DCLK1+ ו Il25+ תאים וחשבון עבור 600-1000 תאי מברשת לכל קנה הנשימה3. בעיקר, מספר זה נמוך יותר ממספר תאי המברשת הcholinergic שדווחו על-ידי קבוצות אחרות10. כמו מספרי התאים כימוחושי משתנים על ידי חשיפה לחומרים מטבוליטים ו פרוטותים5,14, מספרים אלה עשויים לשקף את השונות במיקרוביוטה הבינמוסדית. לכן, היינו מציעים להעריך את מספר תאי מברשת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי למדוד את המספר הצפוי של תאים מברשת מבודדים על ידי מיון cytometric זרימה.
בזמן הקמת הפרוטוקול שלנו, ניסינו מספר שיטות של בידוד של תאי כימוחושים (איור 4). כאשר אנו מודטים את קנה הנשימה הטחון עם 650 U/mL קולגן הרביעי ו 1.84 U/mL dispase שיושלם עם DNase I עבור 45 min, שילוב המשמש לעתים קרובות כדי להשיג תא בודד השעיות של המגון הריאה15, השגנו השעיית תא בודד של תאים אפיתל, אבל המצאנו רק כמה תאי מברשת (איור 4א). תאים tuft במעי כבר מבודדים בהצלחה באמצעות 2.5 mM EDTA ו 0.75 mM Dithiothreitol (DTT) עם DNase I עבור 20 דקות כדי להוציא את התאים האפיתל ואחריו העיכול של תאים האפיתל שוחרר עם 0.01 U/mL dispase עם DNaseI עבור 10 דקות 6. בידינו, באמצעות הליך זה הובילו גם לשחזור מברשת קנה הנשימה התת-אופטימלי (איור 4ב). פרוטוקול לבידוד מוצלח של תאי מברשת של קנה הנשימה עבור ניתוח רנ א תוארה על ידי Krasteva ואח '10. בעקבות פרוטוקול זה, אנו מודחים הקנה הנשימה עם 35 U/mL פפאין במאגר tyrode עבור 45 דקות ולא להשיג התאוששות טובה תא מברשת (איור 4ג). רוק ואח ' תיאר שיטה של עיכול של האפיתל הקנה הנשימה עבור בידוד תא בסיס עם שני שלבים: הפרדת האפיתל מן השכבה mesenchymal עם מינון גבוה dispase (16 U/mL) בטמפרטורת החדר ואחריו דגירה של האפיתל הפשיטו עם 0.1% טריפסין ו 1.6 מ"מ EDTA במשך 30 דקות ב 37 ° צ'16. בעקבות שלבים אלה הובילו להתאוששות טובה יותר של תאי מברשת, אך המספרים שהושגו לכל עכבר לא היו מספיקים לניתוח תפקודי עומק (איור 4D). כדי לייעל את הפרוטוקול, החלטנו. לשלב את שתי הגישות האחרונות על ידי הפרדת אפיתל הקנה במינון גבוה dispase, כיוונו לאפשר גישה טובה יותר של פפאין לתאי מברשת הקנה. כך, שימוש 16 u/mL של dispase בטמפרטורת החדר על קנה הנשימה כולו כדי להפריד את האפיתל ואת הדגירה הבאה של האפיתל עם 26 U/ml פפאין מאגר tyrode הוביל את ההתאוששות הטובה ביותר תא מברשת (איור 4E).
איור 1 : סכימת הצעדים המוצעים לבידוד של תאי מברשת של קנה הנשימה. הפרוטוקול כולל 2 שלבים עיקריים: לאחר הניתוח, קנה הנשימה כולו מודבטים בתמיסה במינון גבוה dispase להפריד את האפיתל; זה לאחר מכן העיכול של גיליון אפיתל עם פפאין בסידן המכיל מאגר tyrode (tyrode I) וכתמים נוגדן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : זרימת הנציג cy, לנסות ניתוח של תאים מברשת הקנה. (א). ייצוג סכמטית של הזרם cy, לנסות את האסטרטגיה. תאים בודדים היו מגודרת על בסיס מאפייני פיזור הקדמי והצד שלהם ותאים חיים נבחרו מבוסס על הדרה של Propidium יודיד. CD45 תאים נמוכים/שליליים נבחרו בהתבסס על בקרת isotype והעריכו על הביטוי שלהם של EpCAM. התאים EpCAM חיובי נחשבו תאי מברשת אם הם הביעו פלורסנט eGFP בערוץ FITC. (ב). מספר תאי המברשת cholinergic מברשת לקנה הנשימה של העכבר ותדירות הציג כאחוז של כל CD45low- תאים וכאחוז של CD45low/-epcam+ תאים. כל נקודה מייצגת עכבר נפרד. נתונים הם מ 3 ניסויים נפרדים עם 2-3 עכברים כל אחד. (ג). העדר בתאי מברשת חיוביים באמצעות הקנה והאפיתל מעכבר סוג פראי מוכתם עבור CD45 ו-epcam. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : הר שלם של קנה הנשימה של העכבר של צ'אט(BAC)-egfp העכבר. קנה הנשימה נפתח longitudinally ומוכתם עם נוגדן anti-GFP כדי לשפר את האות הירוק eGFP של זריחה. (A) כל הר הקנה של צ ' אט(BAC)-egfp העכבר, תאי פלורסנט ירוק באינטנסיביות לייצג תאים מברשת; סרגל בקנה מידה 1 מ"מ; (ב) קנה הנשימה השלם של עכבר סוג פראי להפגין העדר תאים מברשת; סרגל קנה מידה = 1 מ"מ; (ג) הגדלה של שכבת האפיתל להפגין תאים מברשת בצורה אסימטרית (תאים ירוקים) כמו בארות כמו סיום עצבי cholinergic (חץ); (ד) קנה הנשימה כל הר של קנה מתוך של צ ' אט(BAC)-egfp התמונה עבור gfp ללא שיפור נוגדנים של האות הפלואורסצנטית; (ה) חתך רוחב של מוטבע עכבר קנה הנשימה של צ ' אט(BAC)-egfp העכבר מוכתם עם אנטי gfp (ירוק) או עז igg בקרת ו dapi (כחול); סרגל ברים = 20 יקרומטר (C-E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : השוואה בין פרוטוקולי העיכול השונים. (A) קנה הנשימה היה מוקשה ו-מודב עם 650 u/ml קולגן הרביעי ו 1.84 U/ml dispase שיושלם עם DNase I עבור 45 דקות. ניסוי זה חזר פעמיים. (ב) קנה הנשימה כולו היה מודרט עם 2.5 MM edta ו 0.75 mm dtt שיושלם עם DNase I עבור 20 דקות; התאים האפיתל היו במקומם ומתעכל נוסף עם 0.01 U/mL dispase ו DNase I עבור 10 דקות. ניסוי זה חזר פעמיים. (ג) קנה הנשימה היה טחון ו מודבטים עם 35 U/mL של פפאין ב tyrode אני מאגר עבור 45 דקות; פעילות פפאין שיורית היה מעוכבים עם leupeptin. . הניסוי הזה בוצע פעם (ד) קנה הנשימה כולו היה מודעם במינון גבוה dispase (16 U/mL) עבור 30 דקות כדי להפריד את גיליון האפיתל, ואחריו דגירה של גיליון האפיתל עם 0.1% טריפסין ו 1.6 MM edta עבור 30 דקות. ניסוי זה חזר פעמיים. (E). קנה הנשימה כולו היה מודעם במינון גבוה dispase (16 U/mL) עבור 30 דקות ואחריו העיכול של גיליון האפיתל עם 26 u/ml פפאין במאגר tyrode עבור 30 דקות. פעילות פפאין שיורית היה מעוכבים עם leupeptin ודילול נפח גבוה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מצאנו כי שילוב של טיפול במינון גבוה dispase עבור 40 דקות ואחריו טיפול פפאין קצר (30 דקות) מספק פרוטוקול אופטימלי לעיכול הקנה ובידוד תא מברשת. שילוב זה גם נמנע מעיכול נרחב ומייצר את התשואה הגבוהה ביותר של תאי מברשת, לעומת פרוטוקולים חלופיים.
בעוד העיכול הריאה לחלץ תאים המטפאות יש הסתמך באופן קלאסי על אנזימים העיכול מתון כמו קולגן הרביעי15, בידוד של תאים אפיתל דורש פרוטוקולים מורכבים יותר. תא בודד השעיות של תאים אפיתל קשה יותר להשיג בגלל הצמתים צר וחסיד מחייב אותם זה לזה ואת קרום המרתף בגלל החולשה של התאים עצמם. רוב הפרוטוקולים עבור העיכול תא אפיתל לערב שני שלבים-הצעד הראשון הוא הפרדת האפיתל מתוך קרום המרתף ואחריו בצעדים הבאים כדי להפריע את הצמתים הדוקים desmosomes אשר לדבוק בתאי האפיתל אחד לשני מיכל בן 16 , . שבע עשרה
כמה קבוצות מבודדות בהצלחה תאים כימוחושי קווצת מהמעי באמצעות שינויים שונים של פרוטוקול 2-צעד לבידוד של תאים אפיתל: השלב הראשון משתמש edta ו-dtt כדי לשחרר תאים אפיתל מתוך רירית המשנה ואחריו עיכול של גיליונות האפיתל עם dispase. הוביט ואח '. השתמשו בתערובת של 5 מ"מ EDTA + 1 מ"מ DTT ולאחר מכן העיכול עם 0.5 יחידות/mL Dispase II ו-DNase14. . להיות ואח השתמשו בריכוז גבוה 30 מ"מ EDTA בלבד כדי להפריד את שבר האפיתל ולאחר מכן מודבטים עם dispase שיושלם עם DNaseI18. פון מולטקה ואח ' בשימוש 2.5 mM EDTA, 0.75 mM DTT ו DNaseI ואחריו העיכול בשעה6. מצאנו כי טכניקות אלה מאפשרים בידוד של תאים אפיתל קיימא בקנה הנשימה אבל את אחוז התאים מברשת הקנה היה נמוך מאוד (איור 4ב) ולא עקבי עם הציפייה שלנו בידוד של 600-800 תאי מברשת לכל קנה הנשימה בהתבסס על הערכת היסטולוגיה שלנו.
בידוד תא האפיתל התאים פותחו על ידי כמה קבוצות לחקור תאים אפיתל בסיס. ההבדלים העיקריים בין הפרוטוקולים הללו לבין אלה המועסקים בבטן הם ברצף של אנזימי העיכול. הצעד הראשון הוא ההפרדה של אפיתל הקנה הנשימה דרך דגירה עם ריכוז גבוה של dispase (16 U/mL) בטמפרטורת החדר16. זה מאפשר האפיתל להפריד כגיליון אחד מן השכבה mesenchymal19. עיבוד הבא של האפיתל הקנה הנשימה משתמש בשילוב של טריפסין ו EDTA, אחת השיטות הנפוצות ביותר לשימוש אנזימטית של הניתוק התא, כדי להשיג השעיית תא בודד. טריפסין מעלים פפטידים על צד C-terminal של ליזין ושאריות חומצות אמינו של ארגיטין, ואילו EDTA משמש ככלור סידן לתא תאים ואינטראקציות תא מטריקס20. באמצעות טכניקה זו, רוק ואח ' הצליחו לשחזר את התאים האפיתל הבסיס על פרופיל הטרנססקריפט16. פרוטוקול דומה שימש לאחרונה כדי לבודד קולטן טעם המר לבטא תאים מכתב eGFP מונחה Tas2r143-CreERT2 ו-B6. Il25Flare25/Flare25 ללימודים ברצף של RNA5,8. בניסיון שלנו, העיכול של גיליון האפיתל עם טריפסין ו EDTA הוביל התאוששות מעולה האפיתל התאים אבל מספר מספיק של תאים cholinergic קנה מברשת לניתוח פונקציונלי או הטרנס, אלא אם עכברים מרובים היו ממאגר עבור כל דוגמה (איור 4ג).
Papain הוא צמח האנדוליטי רב עוצמה ציסטאין פרוטאז הנגזר פפאיה לייטקס, והוא ידוע לקליב אג ח פפטיד מעורבים חומצות אמינו בסיסיות, במיוחד arginine, ליזין ושאריות בעקבות פנילאלנין21. הבידוד תא קנה מברשת באמצעות פפאין מ צ'אט(BAC)-egfp העכברים דווחו לראשונה על ידי krasteva ואח '10. העיכול papain היה גם בשימוש לאחרונה כדי לנתק את התאים האפיתל דרכי הנשימה של תא בודד ברצף RNA שבו מברשת/tuft תאים מורכב חלקיק קטן של תאים אפיתל11. Papain הוא גם האנזים הנפוץ ביותר לעיכול של רקמת המוח לבידוד של נוירונים קיימא22. דיסוציאציה של רקמת המוח עם פפאין עבור 30 דקות תוצאות בתשואות גבוהות במידה ניכרת, הישרדות עצביים ויושרה לעומת טריפסין עיכול23. מאז כמה תאים מברשת הם שזורים היטב עם קצות העצבים3,10, השימוש פפאין עשוי להיות קריטי עבור המחשוף מוצלח של צמתים מברשת מברשות נוירונים. עם זאת, מצאנו כי העיכול 45 דקות עם פפאין בריכוז של 35-40 U/mL מופחתת באופן דרמטי הכדאיות תא אפיתל, המוביל שחזור תא מברשת נמוכה (איור 4ד).
השתמשנו 3 שיטות כדי להפחית רעילות פפאין ולהגדיל את התשואות הסלולר שלנו. ראשון, על ידי הפרדת גיליון האפיתל עם dispase, הפחיתו את זמן הדגירה הבאים של פפאין מ 45 עד 30 דקות. שנית, אנו מעכבות מיד את פעילות פפאין עם leupeptin, מעכב של ציסטאין הפרוטסייסים24. בעיקר, לוקיטין מאוד לא יציבה ב -4 ° c ויש לצוטט ולקפוא ב-20 ° c. שלישית, מצאנו כי דילול של הרקמה מתעכל אנזימטי בנפח גדול של PBS הקרה גם עוזר לשמר את הכדאיות של התאים מתעכל. צעד נוסף קריטי כדי להגדיל את תשואות התא הוא נשחקו קפדני10. מכיוון שוורטקציה ממושכת יכולה גם להקטין את יכולת הכדאיות, החלפנו אותו באופן חלקי בעזרת משולש. אנו ממליצים על נשחקו עם מחט 18g לנתק את הגושים הסלולריים גדול ואחריו נשחקו נוספים עם מחט G 21. לבסוף, מצאנו כי eGFP הוא רגיש באור מאוד והגנה מפני חשיפה ישירה באור בכל שלב הוא מועיל. שינויים אלה מותרים להתאוששות חזקה של תאים קיימא מברשת הקנה (איור 4E).
המגבלות העיקריות של הפרוטוקול המוצע כאן הם ההליך 2-השלב ואת השימוש papain, פרוטאז ציסטאין חזק. קבוצות מסוימות הוחלף לאחרונה ליבראז עבור dispase5 כאשר בידוד תאים כימוחושי. יתרה מזאת, העיכול ליבראז השתמשו לאחרונה כדי לבודד את התאים האפיתל של כימוחושי (מברשת) בתאי האף25,26. לא השוונו ישירות את העיכול הלימואז לפרוטוקול העיכול בשני השלבים שלנו. Papain הוא פרוטאז ציסטאין רב עוצמה שיכול להפעיל את הקולטן פרוטאז מופעל PAR2 על תאים אפיתל27 המוביל להפעלה של תאי מברשת עצמם או לדור של מגשרים על ידי תאי הנשימה אחרים שיכולים בתורו להפעיל את ה תאי מברשת. לבסוף, פפאין יכול לווסת את הביטוי הקולטן דרך המחשוף של קולטני פני השטח מקשה לאמת ביטוי קולטן תא מברשת על ידי הזרמת cy,28,29.
לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול של בידוד של תאים מברשת cholinergic הקנה מ צ'אט-eGFP העיתונאי עכברים המאפשר התאוששות חזקה של תאים מברשת קיימא קנה הנשימה. פרוטוקול זה שימש בהצלחה עבור בידוד וניתוח העברה של תאי מברשת על-ידי שימוש ברצף RNA3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לאדם שכינין במרכז ליבת מרכז האימונולוגיה של הנשים במהלך הסיוע באמצעות מיון ציטומטלי זרימה. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (נ. א. ב), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), ו K08 AI132723 (L. G. B), ועל ידי האקדמיה האמריקנית לאלרגיה, אסטמה, ואימונולוגיה (ראה)/אמריקן לונג אלרגיות פרס מחלת הנשימה (N.A.B.), על-ידי פרס פיתוח הפקולטה למדעי הקרן (L.G.B.), על ידי הפרס הצעיר של סטיבן וג קיי (N.A.B.), על ידי הקרן לפיתוח קריירה של מדעני נשים (L.G.B.), וב תרומה נדיבה של משפחת ויניק (L.G.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
