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Immunology and Infection

अलगाव और माउस Tracheas से ब्रश कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन

Published: June 12, 2019 doi: 10.3791/59496
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Summary

ब्रश कोशिकाओं दुर्लभ कोलीनर्जिक chemosensory उपकला कोशिकाओं भोली माउस श्वासनली में पाया जाता है। उनकी सीमित संख्या के कारण, एयरवे प्रतिरक्षा और remodeling में उनकी कार्यात्मक भूमिका के पूर्व vivo मूल्यांकन चुनौतीपूर्ण है. हम प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

Tracheal ब्रश कोशिकाओं कोलीनर्जिक chemosensory उपकला कोशिकाओं प्रतिरक्षा और तंत्रिका तंत्र के लिए airway लुमेन से संकेत संचारित करने के लिए तैयार कर रहे हैं। वे chemosensory उपकला कोशिकाओं के एक परिवार का हिस्सा हैं जो आंतों के श्लेष्म में टफ्ट कोशिकाओं, श्वासनली में ब्रश कोशिकाओं, और नाक के श्लेष्म में एकान्त chemosensory और microvillous कोशिकाओं में शामिल हैं. विभिन्न उपकला डिब्बों में केमोसेंसरी कोशिकाओं कुंजी intracellular मार्करों और एक कोर प्रतिलिपिकरण हस्ताक्षर का हिस्सा है, लेकिन यह भी महत्वपूर्ण प्रतिलिपित्मक विषमता प्रदर्शित, संभावना स्थानीय ऊतक पर्यावरण के चिंतनशील. एकल सेल निलंबन से श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के अलगाव के विस्तार में इन दुर्लभ उपकला कोशिकाओं के समारोह को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है, लेकिन उनके अलगाव चुनौतीपूर्ण है, संभवतः श्वासनली ब्रश कोशिकाओं और तंत्रिका अंत के बीच करीब बातचीत के कारण या तंग और अनुयायियों जंक्शनों के airway-विशिष्ट संरचना के कारण। यहाँ, हम माउस श्वासनली उपकला से ब्रश कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. विधि सबम्यूकोसा से श्वासनली उपकला उपकला के प्रारंभिक पृथक्करण पर आधारित है, जिससे पैपिन के साथ उपकला शीट के बाद कम ऊष्मायन के लिए अनुमति दी जाती है। इस प्रक्रिया के प्रवाह cytometric छँटाई और व्यवहार्य श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक तेजी से और सुविधाजनक समाधान प्रदान करता है.

Introduction

ब्रश कोशिकाओं को कड़वा स्वाद रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति और स्वाद रिसेप्टर ट्रांसक्शन मशीनरी स्वाद कली कोशिकाओं में पाया द्वारा विशेषता chemosensory उपकला कोशिकाओं के एक वर्ग से संबंधित हैं। स्वाद कली कोशिकाओं के विपरीत, chemosensory उपकला कोशिकाओं उपकला सतहों में बिखरे हुए हैं और एकान्त chemosensory कोशिकाओं के रूप में संदर्भित कर रहे हैं (SCCs) और नाक उपकला में microvillous कोशिकाओं1,2, श्वासनली में ब्रश कोशिकाओं 3,4, और आंत में गुच्छा कोशिकाओं5,6. कड़वे स्वाद रिसेप्टर्स और कड़वा स्वाद transduction मशीनरी व्यक्त Epithelial कोशिकाओं भी मूत्रमार्ग7,8 और श्रवण ट्यूब9में पाए जाते हैं . एयरवे ब्रश कोशिकाओं neurogenic और प्रतिरक्षा airway प्रतिक्रियाओं में अद्वितीय कार्य किया है. वे acetylcholine उत्पादन chemosensory कोशिकाओं है कि कड़वा यौगिकों और कोरम संवेदन पदार्थों की तरह जीवाणु चयापचयों के साथ सक्रियण पर सुरक्षात्मक श्वसन सजगता पैदा कर रहे हैं10. एयरवे ब्रश सेल भी आईएल-25 के प्रमुख वायुमार्ग उपकला स्रोत हैं, जो वायुमार्ग3में एयरोएलर्जन-एब्ड टाइप 2 सूजन को नियंत्रित करता है।

निम्न वायुमार्ग ब्रश कोशिकाओं के पूर्ण ट्रांसक्रिप्टम की विशेषता और पर्यावरणीय उद्दीपकों के प्रति उनकी प्रतिक्रिया को श्वासनली उपकला में उनकी कम संख्या और बडे ब्रोंची10से परे बहुत सीमित संख्या द्वारा सीमित किया गया है . आंतों के उपकला से रसायन विज्ञान कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों में श्वासनली से आनुपातिक रूप से उच्च संख्या प्राप्त नहीं हुई है, संभवतः तंत्रिका अंत10 या अन्य के साथ श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के अंतरंग संपर्कों के कारण श्वसन श्लेष्म में ऊतक-विशिष्ट कारक जैसे कि अनुयायियों और तंग जंक्शन प्रोटीन की संरचना। एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए अधिक संख्या में श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के सफल अलगाव की हाल की रिपोर्टों में या तो पैपिन के साथ 2 एच ऊष्मायन या प्रोनास11,12के साथ 18 एच ऊष्मायन का प्रयोग किया गया . पाचन एंजाइमों के साथ लंबे समय तक ऊष्मायन सेल व्यवहार्यता को कम करने और पचा ऊतकों से कोशिकाओं की प्रतिलिपि प्रोफ़ाइल को बदल सकते हैं13के बाद से , यह अन्य chemosensory उपकला आबादी के साथ तुलनात्मक विश्लेषण पूर्वाग्रह सकता है.

यहाँ, हम आरएनए अनुक्रमण3के लिए श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि की रिपोर्ट. उच्च खुराक के साथ श्वासनली का उपचार उपम्यूकोसा से उपकला को अलग करता है। पैपिन के साथ उपकला शीट के बाद पाचन इस संरचनात्मक सेल के उत्कृष्ट वसूली के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

निम्नलिखित प्रयोगों का संचालन करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी पशु देखभाल का उपयोग करें और प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं और राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद के साथ समझौते में प्रदर्शन किया "देखभाल और उपयोग के लिए गाइड प्रयोगशाला पशु" (8वें संस्करण, 2011) और आगमन दिशानिर्देश. नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और ब्रिघम और महिला अस्पताल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. डिस्पेस पाचन समाधान तैयार करें, जो एक पीबीएस घोल है जिसमें 16 यू/एमएल डिस्पास और 20 ग्राम/एमएल DNase I. सुनिश्चित करें कि 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में समाधान को गर्म करने से पहले डिपैस पाउडर पूरी तरह से भंग हो जाता है।
  2. जोड़ें 5% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम करने के लिए (DMEM) एक रोक समाधान बनाने के लिए.
  3. Tyrod I बफर तैयार करें: कैल्शियम के बिना HEPES-Tyrode के बफर में 26 U/mL papain (20 डिग्री सेल्सियस/एमएल 48 यू/एमजी पैपिन समाधान) और 10 डिग्री सेल्सियस/एमएल एल-सिस्टीन जोड़ें।
  4. Tyrod द्वितीय बफर तैयार करें: कैल्शियम के साथ HEPES-Tyrod के बफर करने के लिए 2 डिग्री एल / एमएल ल्यूपटिन (5 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें।
  5. FACS बफर तैयार करें: कैल्शियम, मैग्नीशियम और फीनॉल लाल बिना हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) का उपयोग करें, 2 एमएम एथिलीनडिऐथिलीनटेरेएसेटिक एसिड (EDTA) के साथ पूरक और 2% एफबीएस जोड़ें।

2. माउस ट्रेकिया का विच्छेदन

नोट: चूहे इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया ChAT(बीएसी)-eGFP (B6) हैं. Cg-Tg(RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), दोनों लिंगों की उम्र के 3-6 महीने. eGFP के photobleaching को कम करने के लिए प्रकाश प्रत्यक्ष करने के लिए ऊतक के जोखिम को कम करें.

  1. 100 mg/kg pentobarbital इच्छामृत्यु समाधान के साथ माउस Euthanize intraperitoneally इंजेक्शन या मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर IACUC द्वारा अनुमोदित.
  2. विस्तारित ऊपरी और निचले हिस्सों के साथ 21 जी सुइयों के साथ सुपाच्य स्थिति में एक शल्य बोर्ड पर माउस को ठीक करें। क्षेत्र को साफ करने के लिए 70% EtOH के साथ फर स्प्रे।
  3. सीधे संदंश का उपयोग करके, पेट की त्वचा और फर को उठाएं और केंद्र में कैंची (सीधे कैंची, 3 सेमी) के साथ एक चीरा बनाएं। कैंची का उपयोग करना, चमड़े के नीचे ऊतक से पेट से mandibula के लिए त्वचा को अलग. जबकि subcutaneous ऊतक बल के साथ पकड़े हुए, पेट की दीवार के केंद्र में कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा बनाते हैं.
  4. एक वी के आकार के चीरा के साथ peritoneum खोलें. बलकाउपयोग करना, धीरे से पक्ष में छोटी आंत ले जाएँ, पेट aorta और vena cava का पता लगाने और विच्छेदन कैंची के साथ एक चीरा बनाने के लिए तेजी से exsanguination के लिए अनुमति देते हैं.
  5. डायाफ्राम का पता लगाएँ. एक 18 जी सुई का उपयोग करना, फेफड़ों को निष्क्रिय करने के लिए स्टर्नम के ठीक नीचे डायाफ्राम में एक खोलने बनाते हैं। पसलियों के आधार के साथ कटौती करने के लिए तेज-बिंदु वाले सीधे विच्छेदन कैंची का उपयोग करके रिब पिंजरे से डायाफ्राम को सावधानी से अलग करें।
  6. संदंश का उपयोग करके, स्टर्नम के उजागर अंत को उठाएं और रिब पिंजरे के आधार से गर्दन तक स्टर्नम को लंबे समय तक काट दें। छोटी सीधी कैंची (2 सेमी) के साथ एक केंद्रीय गर्भाशय ग्रीवा चीरा बनाओ और submandibular ग्रंथि के दो पालियों को अलग.
  7. ध्यान से ठीक बिंदु उच्च परिशुद्धता संदंश की एक जोड़ी के साथ आसपास के संयोजी ऊतक और थाइमस overlying करीना को हटा दें।
  8. एपिग्लोटिस के स्तर पर समीपस्थ अंत को अलग करके और फिर श्वासनली के विभाजन के स्तर पर दूरस्थ अंत को विभाजित करके पहले श्वासनली मुक्त को अलग करें।
  9. एपिग्लोटिस का पता लगाएँ और एपिग्लोटिस से कैरिना तक श् राक्किया को लंबे समय तक काट दिया जाए।

3. श्वास महाकाव्यीय पाचन

  1. श्वासनली को 1.5 एमएल ट्यूब में रखें जिसमें 750 डिग्री सेल्सियस पूर्व-वार्म्ड (से 37 डिग्री सेल्सियस) अपाहिज पाचन समाधान होता है। कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए 200 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट। प्रत्यक्ष प्रकाश के लिए जोखिम को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब कवर.
  2. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 5% FBS के साथ ठंड DMEM के 750 $L जोड़ें। बर्फ पर रखें.
  3. श्वासनली को पेट्री डिश (100 मिमी x 15 मिमी) में स्थानांतरित करें और विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के नीचे रखें। उपकला पक्ष के साथ श्वासनली को मुखाच्छा का सामना करना पड़ रहा है। लंबे समय तक विच्छेदित श् वासनली में उपास्थि के छल्ले द्वारा अनुरक्षित अर्ध-सिलिन्ड्रिक आकार होता है। उपकला अवतल सतह पर है।
  4. पेट्री डिश के लिए सीधे बलप्स के साथ श्वासनली के एपिग्लोटिस क्षेत्र को तेंथे और एक आकार 22 डिस्पोजेबल स्केलपेल का उपयोग करके, श्वासनली से उपकला को खत्म करें। उपकला परत एक पारदर्शी शीट के रूप में अलग करती है।
  5. स्कैल्पल के साथ उपकला को कम करें। उपकला परत को 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. Tyrode मैं बफर के 750 $L के साथ पेट्री पकवान कुल्ला और उपकला परत युक्त 2 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
  7. 200 आरपीएम पर एक शेकर पर 37 मिनट पर 30 मिनट के लिए टायरोड I बफर में श्वासनली उपकला परत को इनक्यूबेट करें। प्रत्यक्ष प्रकाश के लिए जोखिम को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब कवर.
  8. ठंड Tyrod द्वितीय बफर के 750 $L जोड़ें. 20-30 s. के लिए जोरदार रूप से पचे हुए ऊतक को 18 जी सुई से जुड़ी एक सिरिंज के साथ समरूप को 10 बार त्रिचित करें।  एक 21 जी गेज सुई और triturate 10-20 अधिक बार करने के लिए स्विच करें।
  9. कोशिकाओं को 100 डिग्री मीटर छलनी के माध्यम से 50 एमएल शंकु नली में फ़िल्टर करें। ठंड FACS बफर के 30:1 vol/vol जोड़ें.
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर स्पिन करें और सुपरनेंट को त्याग दें। ठंड FACS बफर में गोली resuspend और एक 12 मिमी x 75 मिमी (5 एमएल) polystyrene ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर फिर से स्पिन करें और सुपरनेंट को त्याग दें।
  11. FACS बफर के 100 $L में गोली फिर से निलंबित.
  12. बर्फ पर 15 मिनट के लिए गैर-विशिष्ट बाइंडिंग और इनक्यूबेट को ब्लॉक करने के लिए एंटीबॉडी को ब्लॉक करने वाले एंटी-बॉडी को ब्लॉक करने के लिए 1 $L जोड़ें। धोओ मत।
  13. निम्नलिखित एंटीबॉडी और संबंधित आईएसओटाइप नियंत्रण जोड़ें: प्रशांत नीले विरोधी माउस CD45 या चूहे IgG2a, k (0.25 डिग्री/ एकाणुक एंटीबॉडी. सीधे प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर ठंडा FACS बफर, मिश्रण और स्पिन के 4.5 एमएल जोड़ें। FACS बफर को छोड़ दें और ठंड FACS बफर के 300 $L में गोली फिर से निलंबित.
  14. प्रवाह साइटोमेट्रिक छँटाई से ठीक पहले प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) (5 ग्राम/एमएल) जोड़ें।
    नोट: ब्रश कोशिकाओं में कई प्रक्रियाओं के साथ एक अनियमित आकृति होती है जो संभवतः फ़िल्टर के प्रति उनके पालन को बढ़ा सकती है (चित्र 3ग)। हम तुलना में 30 मिमी करने के लिए 70 मिमी और 100 मिमी फिल्टर और पाया कि बड़ा pores फिल्टर बेहतर पैदावार सुनिश्चित किया. इसके अलावा, पपीन पाचन के बाद सेल निलंबन की पूरी तरह से trituration काफी ब्रश सेल पैदावार में सुधार. हम प्रारंभिक trituration के लिए एक 18G सुई का उपयोग करने की सलाह देते हैं एक छोटे बोर द्वारा पीछा किया (21 या 23 जी सुई) कोशिकाओं के बेहतर वियोजन के लिए.

4. प्रवाह साइटोमेट्री गैटिंग रणनीति

  1. आगे और पक्ष तितर बितर कोण द्वारा मलबे से कोशिकाओं की पहचान. आगे स्कैटर ऊंचाई और चौड़ाई और साइड स्कैटर ऊंचाई और चौड़ाई का उपयोग करके डबलट को शामिल न करें. डबलेट वे कक्ष होंगे जिनमें उच्च चौड़ाई मान हैं.
  2. एकल कक्षों में, जीवित कोशिकाओं को PI ऋणात्मक जनसंख्या के रूप में पहचानें.
  3. लाइव एकल कक्षों के भीतर, isotype नियंत्रण पर आधारित नकारात्मक कोशिकाओं के लिए कम CD45 की पहचान करें।
  4. CD45 कम/नकारात्मक कक्षों के भीतर, ECAM धनात्मक कक्ष ों जो भी eGFP सकारात्मक हैं (FITC चैनल में) की पहचान करें। यह ब्रश कोशिकाओं की जनसंख्या है (चित्र 2क)

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Representative Results

यह प्रक्रिया आरएनए अनुक्रमण3के लिए श्वासनली ब्रश कोशिकाओं को अलग करने के लिए सफलतापूर्वक कार्यान्वित की गई है . एक 2 कदम प्रोटोकॉल के साथ श्वासनली और पाचन के अलगाव के बाद (चित्र1), कोशिकाओं को एकत्र किया गया और PI के साथ मृत कोशिकाओं के बहिष्कार के बाद फ्लोरोसेंट लेबल CD45 और EpCAM के साथ दाग. आगे और पक्ष तितर बितर विशेषताओं के आधार पर doublets बाहर gating के बाद, हम CD45 के लिए कम /नकारात्मक के रूप में ब्रश कोशिकाओं को परिभाषित, EpCAM के लिए सकारात्मक और eGFP के लिए सकारात्मक (चित्र 2ए). ब्रश कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व किया $0.16-0.42% CD45कम / हम ChAT-eGFP सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या का एक अनुमान के लिए इन मायने रखता है की तुलना में पूरे श्वासनली mounts से ChAT(BAC)-eGFP चूहों हमारे प्रकाशित व्यापक इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के आधार पर श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के3 और यहाँ सचित्र ( चित्र 3) . जंगली प्रकार में श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के हमारे पिछले अध्ययन, ChAT(बीएसी)-eGFP चूहों और Il25F25/F25 चूहों का सुझाव दिया है कि कोलीनर्जिक ब्रश कोशिकाओं 90% DCLK1 के साथ ओवरलैपिंग कर रहे हैं+ और IL25+ कोशिकाओं और खाते के लिए 600-1000 ब्रश कोशिकाओं प्रति श्वासनली3. विशेष रूप से, यह संख्या अन्य समूहों द्वारा रिपोर्ट कोलीनर्जिक ब्रश कोशिकाओं की संख्या से कमहै 10. के रूप में chemosensory सेल संख्या माइक्रोबियल चयापचयों और प्रोटोजोआ5,14के लिए जोखिम द्वारा बदल रहे हैं , इन नंबरों interinstitutional microbiota में एक परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित हो सकता है. इसलिए, हम प्रवाह साइटोमेट्रिक छँटाई द्वारा पृथक ब्रश कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या को मापने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा ब्रश कोशिकाओं की संख्या का आकलन करने का सुझाव देंगे।

हमारे प्रोटोकॉल की स्थापना करते समय, हमने रसोसेंसरी कोशिकाओं के पृथक्जन के पहले प्रकाशित कई विधियों का प्रयास किया (चित्र 4)। जब हम 650 U/mL collagenase IV और 1.84 U/mL dispase के साथ कीमा बनाया श्वासनली 45 मिनट के लिए DNase मैं के साथ पूरक, एक संयोजन अक्सर फेफड़ों homogenates से एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया15, हम की एक एकल सेल निलंबन हासिल उपकला कोशिकाओं, लेकिन हम केवल कुछ ब्रश कोशिकाओं को बरामद (चित्र 4ए) . आंत में टफ्ट कोशिकाओं को सफलतापूर्वक 2.5 एमएम EDTA और 0.75 m Dithiothreitol (DTT) के साथ DNase I के साथ 20 मिनट के लिए उपकला कोशिकाओं के पाचन के बाद जारी उपकला कोशिकाओं के पाचन के बाद से अलग किया गया है 0.01 U/m / 6. हमारे हाथों में, इस प्रक्रिया का उपयोग करने से उपऑप्टिमल श्वासनली ब्रश सेल वसूली भी हुई (चित्र 4ठ) . आरएनए विश्लेषण के लिए श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के सफल अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल क्रास्टेवा एट अल10द्वारा वर्णित किया गया था. इस प्रोटोकॉल के बाद, हमने 45 मिनट के लिए Tyrode बफर में 35 U/mL papain के साथ कीमा बनाया श्वासनली incubated और अच्छा ब्रश सेल वसूली प्राप्त नहीं किया (चित्र 4सी)। रॉक एट अल. दो चरणों के साथ बेसल सेल अलगाव के लिए श्वासनली उपकला के पाचन की एक विधि का वर्णन: उच्च खुराक dispase के साथ mesenchymal परत से उपकला का पृथक्करण (16 U/mL) कमरे के तापमान पर छीन उपकला के ऊष्मायन के बाद के साथ 0.1 % trypsin और 1.6 m EDTA 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस16पर . इन कदमों के बाद ब्रश कोशिकाओं की बेहतर वसूली हुई, लेकिन प्रति माउस प्राप्त की गई संख्या गहराई कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए अपर्याप्त थी (चित्र 4D)। प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए, हम पिछले दो दृष्टिकोण गठबंधन करने का फैसला किया. श्वासनली उपकला को उच्च खुराक के साथ अलग करके, हम पपेन के बेहतर उपयोग के लिए श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के लिए अनुमति देने के उद्देश्य से. इस प्रकार, पूरे श्वासनली पर कमरे के तापमान पर 16 U/mL dispase का उपयोग करने के लिए उपकला और उपकला के बाद ऊष्मायन के साथ 26 U/mL papain Tyrod बफर में सबसे अच्छा ब्रश सेल वसूली के लिए नेतृत्व किया (चित्र 4ई) .

Figure 1
चित्र 1 : श्वासनली ब्रश कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रस्तावित कदम की स्कीमा. प्रोटोकॉल में 2 प्रमुख कदम शामिल हैं: विच्छेदन के बाद, पूरे श्वासनली को उपकला को अलग करने के लिए एक उच्च खुराक डिपैस समाधान में इनक्यूबेट किया जाता है; इसके बाद उपकला शीट के पाचन के बाद Tyrode बफर (Tyrode I) और एंटीबॉडी धुंधला युक्त कैल्शियम में पैपिन के साथ होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : श्वासनली ब्रश कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण. (ए) प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एकल कोशिकाओं को उनके आगे और पक्ष तितर बितर विशेषताओं के आधार पर गेट किया गया था और लाइव कोशिकाओं को प्रोपिडियम आयोडाइड के बहिष्करण के आधार पर चुना गया था। CD45 निम्न/ऋणात्मक कक्षों को समप्रकार नियंत्रण के आधार पर चुना गया और EpCAM की उनकी अभिव्यक्ति के लिए मूल्यांकित किया गया. EpCAM सकारात्मक कोशिकाओं ब्रश कोशिकाओं माना जाता था अगर वे FITC चैनल में eGFP फ्लोरोसेंट व्यक्त की. (बी) माउस श्वासनली और आवृत्ति सभी CD45कम/- कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत प्रति कोलीनर्जिक श्वासनली ब्रश कोशिकाओं की संख्या और CD45कम/-EpCAM+ कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया। प्रत्येक बिंदु एक अलग माउस का प्रतिनिधित्व करता है. डेटा 2-3 चूहों प्रत्येक के साथ 3 अलग प्रयोगों से कर रहे हैं. (ग) CD45 और EpCAM के लिए दाग एक जंगली प्रकार माउस से एक श्वासनली उपकला डाइजेथेल डाइजेस्ट में eGFP सकारात्मक ब्रश कोशिकाओं की अनुपस्थिति. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : एक ChAT(BAC)-eGFP माउस के माउस श्वासनली की पूरी माउंट. श्वासनली लंबे समय से खोला गया था और eGFP हरी फ्लोरोसेंट संकेत को बढ़ाने के लिए विरोधी जीएफपी एंटीबॉडी के साथ दाग. (क) CHAT(BAC)की पूरी श्वासनली माउंट -eGFP माउस, तीव्रता से हरी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं ब्रश कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व; पैमाने पर बार 1 मिमी; (बी) एक जंगली प्रकार के माउस के पूरे श्वासनली माउंट ब्रश कोशिकाओं की अनुपस्थिति का प्रदर्शन; स्केल बार - 1 मिमी; (ग) उपकला परत का आवर्धन अनियमित आकार की ब्रश कोशिकाओं (हरी कोशिकाओं) के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक कोलीनर्जिक तंत्रिका अंत (तीर); (डी) एक CHAT(BAC)की एक श्वासनली माउंट की पूरी श्वासनली माउंट -eGFP fluorsc संकेत के एंटीबॉडी वृद्धि के बिना GFP के लिए छवि; (ई) एक ChAT(BAC)के एक पैराफिन-एम्बेडेड माउस श्वासनली के पार अनुभाग -eGFP माउस विरोधी GFP (हरा) या बकरी आईजीजी नियंत्रण और DAPI (नीले) के साथ दाग; स्केल बार्स ] 20 डिग्री मी (सी-ई)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : विभिन्न श्वासनली पाचन प्रोटोकॉल की तुलना. (ए) श्वासनली को कीमा बनाया गया था और 650 यू/एमएल कोलाजनेस IV और 1.84 यू/एम एल डिस्पास के साथ 45 मिनट के लिए DNase I के साथ पूरक किया गया था। इस प्रयोग को 2 बार दोहराया गया था। (बी) पूरे श्वासनली को 2.5 एमएम EDTA और 0.75 एम एम डीटीटी के साथ 20 मिनट के लिए DNase I के साथ पूरक किया गया था; उपकला कोशिकाओं को उखाड़ दिया गया और आगे 0.01 U/mL dispase और DNase मैं 10 मिनट के लिए के साथ पचा रहे थे. इस प्रयोग को 2 बार दोहराया गया था। (ग) ट्रेकिया को कीमा बनाया गया था और 45 मिनट के लिए Tyrode I बफर में 35 यू/एमएल पैपिन के साथ इनक्यूबेट किया गया था; अवशिष्ट पैपेन गतिविधि ल्यूपेटिन के साथ बाधित थी। यह प्रयोग एक बार किया गया था. (घ) संपूर्ण श्वासनली को 30 मिनट के लिए उच्च खुराक डिपेस (16 यू/एमएल) के साथ उपकला शीट को अलग करने के लिए इनक्यूबेट किया गया था, जिसके बाद उपकला शीट के ऊष्मायन के बाद 0.1% ट्रिप्सिन और 30 मिनट के लिए 1.6 एमएम ईडीटीए। इस प्रयोग को 2 बार दोहराया गया था। (ई) संपूर्ण श्वासनली को उच्च मात्रा में डिस्पास (16 यू/एमएल) के साथ 30 मिनट के लिए उपकला शीट के पाचन के बाद 30 मिनट के लिए टाइरोड बफर में 26 यू/ अवशिष्ट पैपेन गतिविधि ल्यूपप्टिन और उच्च मात्रा कमजोर पड़ने के साथ बाधित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमने पाया है कि 40 मिनट के लिए उच्च खुराक dispase उपचार का एक संयोजन एक छोटी papain उपचार के बाद (30 मिनट) श्वासनली पाचन और ब्रश सेल अलगाव के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल प्रदान करता है. इस संयोजन दोनों व्यापक पाचन से बचा जाता है और ब्रश कोशिकाओं की उच्चतम उपज पैदा करता है, वैकल्पिक प्रोटोकॉल की तुलना में.

जबकि फेफड़ों के पाचन hematopoietic कोशिकाओं को निकालने के लिए शास्त्रीय रूप से collagenase चतुर्थ15की तरह हल्के पाचन एंजाइमों पर भरोसा किया है , उपकला कोशिकाओं के अलगाव और अधिक जटिल प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. उपकला कोशिकाओं के एकल सेल निलंबन तंग और अनुयायियों जंक्शनों की वजह से उन्हें एक दूसरे और तहखाने झिल्ली के लिए बाध्यकारी और खुद कोशिकाओं की कमजोरी की वजह से प्राप्त करने के लिए और अधिक कठिन हैं। उपकला कोशिका पाचन के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल में दो कदम शामिल हैं - पहला कदम तहखाने झिल्ली से उपकला का पृथक्करण है जिसके बाद तंग जंक्शनों और desmosomes को परेशान करने के लिए जो उपकला कोशिकाओं का पालन करते हैं, एक दूसरे को परेशान करने के लिए 16 , 17.

कई समूहों को सफलतापूर्वक उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक 2 कदम प्रोटोकॉल के विभिन्न संशोधनों का उपयोग आंत से chemosensory गुच्छा कोशिकाओं को अलग किया है: पहला कदम EDTA और DTT का उपयोग करता है submucosa से उपकला कोशिकाओं को जारी करने के बाद अपाहिज के साथ उपकला शीट का पाचन। Howitt एट अल 5 एमएम EDTA + 1 एमएम DTT के एक मिश्रण का इस्तेमाल किया 0.5इकाइयों के साथ पाचन के बाद / Gerbe एट अल. उच्च सांद्रता 30 एमएम EDTA अकेले उपकला अंश को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया और बाद में DNaseI18के साथ पूरक dispase के साथ incubated . वॉन Moltke एट अल इस्तेमाल किया 2.5 m EDTA, 0.75 mM DTT और DNaseI dispase पाचन6के बाद . हमने पाया कि इन तकनीकों श्वासनली में व्यवहार्य उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन श्वासनली ब्रश कोशिकाओं का प्रतिशत बहुत कम था (चित्र 4बी) और प्रति 600-800 ब्रश कोशिकाओं के अलगाव की हमारी उम्मीद के अनुरूप नहीं श् वासनली हमारे ऊतकविज्ञान मूल्यांकन पर आधारित है।

श्वास उपकला कोशिका अलगाव प्रोटोकॉल आधारउपल कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए कई समूहों द्वारा विकसित किया गया है। इन प्रोटोकॉल और पेट में कार्यरत लोगों के बीच प्रमुख अंतर पाचन एंजाइमों के अनुक्रम में हैं. पहला कदम कमरे के तापमान16पर डिपेस (16 U/mL ) की उच्च सांद्रता के साथ ऊष्मायन के माध्यम से श्वासनली उपकला का पृथक्करण है. इससे उपकला को मेसेन्काइमल परत19से एक शीट के रूप में अलग किया जा सकता है . श्वासनली उपकला के बाद प्रसंस्करण trypsin और EDTA, सेल टुकड़ी के सबसे अक्सर इस्तेमाल एंजाइमी तरीकों में से एक का एक संयोजन का उपयोग करता है, एक एकल सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए. ट्रिप्सिन क्लीव्स पेप्टाइड्स लाइसाइन और आर्जिनिन एमिनो एसिड अवशेषों के सी-टर्मिनल पक्ष पर, जबकि EDTA सेल सेल और सेल-मैट्रिक्स बातचीत20के लिए एक कैल्शियम chelator के रूप में प्रयोग किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, रॉक एट अल ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग16के लिए बेसल उपकला कोशिकाओं को ठीक करने में सफल रहे हैं। एक इसी तरह के प्रोटोकॉल हाल ही में कड़वा स्वाद रिसेप्टर एक Tas2r143से कोशिकाओं को व्यक्त करने को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था- CreERT2 प्रेरित eGFP रिपोर्टर और B6 से. RNA अनुक्रमण अध्ययन5,8के लिए Il25Flare25/ हमारे अनुभव में, trypsin और EDTA के साथ उपकला शीट के पाचन उत्कृष्ट उपकला सेल वसूली के लिए नेतृत्व किया, लेकिन कार्यात्मक या प्रतिलेखन विश्लेषण के लिए कोलीनर्जिक श्वासनली ब्रश कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या जब तक कई चूहों प्रत्येक के लिए जमा थे नमूना (चित्र 4ग)

पपीते एक शक्तिशाली एंडोलिटिक पादप सिस्टेस्टीन प्रोटीज़ है जो पपीता लेटेक्स से प्राप्त होता है, और यह पेप्टाइड बांडों को छोड़ने के लिए जाना जाता है जिसमें बुनियादी एमिनो एसिड, विशेष रूप से आर्जिनिन, लाइसिन और अवशेष ों को फेनिलएलनिन21के बाद शामिल किया जाता है। ChAT(BAC)से पैपेन का उपयोग कर Tracheal ब्रश सेल अलगाव पहले Krasteva एट अल10द्वारा सूचित किया गया था. पापाइन पाचन का उपयोग हाल ही में एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण के लिए वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए भी किया गया था जहां ब्रश / टफ्ट कोशिकाओं में उपकला कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश11था . पापाइन भी जीवनक्षम न्यूरॉन्स22के अलगाव के लिए मस्तिष्क के ऊतकों के पाचन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया एंजाइम है. 30 मिनट के लिए पैपिन के साथ मस्तिष्क के ऊतकों के विघटन के परिणामस्वरूप स्पष्ट रूप से अधिक पैदावार, न्यूरॉन अस्तित्व और अखंडता की तुलना में trypsin पाचन23. के बाद से कुछ ब्रश कोशिकाओं कसकर तंत्रिका अंत के साथ intertwined रहे हैं3,10, papain का उपयोग न्यूरॉन्स के लिए ब्रश सेल जंक्शनों के सफल दरार के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. तथापि, हमने पाया कि 35-40 U/mL की सांद्रता में पैपिन के साथ 45 मिनट का पाचन नाटकीय रूप से उपकला कोशिका व्यवहार्यता को कम करता है, जिससे कम ब्रश सेल वसूली होती है (चित्र 4D)।

हम Papain विषाक्तता को कम करने और हमारे सेलुलर पैदावार बढ़ाने के लिए 3 तरीकों का इस्तेमाल किया. सबसे पहले, उपकला शीट को डिपेस के साथ अलग करके, हमने पैपेन के बाद के ऊष्मायन समय को 45 से 30 मिनट तक कम कर दिया। दूसरा, हम तुरंत ल्यूपेटिन, सिस्टीन proteases24के एक अवरोधक के साथ papin गतिविधि को बाधित किया. विशेष रूप से, ल्यूपेटिन 4 डिग्री सेल्सियस पर अत्यधिक अस्थिर होता है और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा किया जाना चाहिए। तीसरा, हमने पाया कि ठंड पीबीएस की एक बड़ी मात्रा में एंजाइमी डाइजेस्ट ऊतक के कमजोर पड़ने से भी पचा कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बनाए रखने में मदद मिलती है। एक और कदम है कि सेल पैदावार बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है कठोर trituration10है . लंबे समय तक भंवरिंग भी व्यवहार्यता कम कर सकता है के बाद से, हम आंशिक रूप से यह trituration के साथ प्रतिस्थापित. हम एक 18G सुई के साथ trituration की सिफारिश करने के लिए बड़ा सेलुलर clumps एक 21 जी सुई के साथ अतिरिक्त trituration के बाद अलग. अंत में, हमने पाया कि eGFP अत्यधिक प्रकाश संवेदनशील है और किसी भी कदम पर प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम से संरक्षण उपयोगी है. इन संशोधनों को व्यवहार्य श्वासनली ब्रश कोशिकाओं की मजबूत वसूली के लिए अनुमत किया गया है (चित्र 4ई)

यहाँ प्रस्तावित प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमाएं 2-चरण प्रक्रिया और पैपेन, एक शक्तिशाली सिस्टीन प्रोटीज़ का उपयोग कर रहे हैं। कुछ समूहों ने हाल ही में डिपेस5 के लिए लिब्रेसेकोस को प्रतिस्थापित किया है जब रसोसेंसरी कोशिकाओं को अलग-थलग किया गया है। इसके अलावा, लाइब्रेस पाचन हाल ही में नाक जंतु25,26से chemosensory (ब्रश) उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था . हमने अपने द्वि-चरणीय डिस्पेस/पैपिन पाचन प्रोटोकॉल की तुलना सीधे लिब्रेस पाचन से नहीं की है। Papain एक शक्तिशाली cysteine protease है कि उपकला कोशिकाओं पर protease सक्रिय रिसेप्टर PAR2 सक्रिय कर सकते हैं27 ब्रश कोशिकाओं के सक्रियण के लिए अग्रणी खुद को या अन्य श्वसन कोशिकाओं है कि बारी में सक्रिय कर सकता है द्वारा मध्यस्थों की पीढ़ी के लिए ब्रश कोशिकाओं. अंत में, पैपेन सतह रिसेप्टर्स के दरार के माध्यम से रिसेप्टर अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट कर सकता है जिससे प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ब्रश सेल रिसेप्टर अभिव्यक्ति को मान्य करना मुश्किल हो जाता है28,29.

सारांश में, हम ChAT-eGFP रिपोर्टर चूहों से श्वासनली कोलीनर्जिक ब्रश कोशिकाओं के अलगाव का एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो व्यवहार्य श्वासनली ब्रश कोशिकाओं की मजबूत वसूली के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का आरएनए अनुक्रमण 3 द्वारा ब्रश कोशिकाओं के पृथक्सन और प्रतिलेखनीय विश्लेषण के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गयाहै.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम प्रवाह cytometric छँटाई के साथ उसकी मदद के लिए Brigham और महिला मानव इम्यूनोलॉजी सेंटर फ्लो कोर में एडम Chicoine धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., द्वारा समर्थित किया गया था L.G.B), और K08 AI132723 (L.G.B), और एलर्जी, अस्थमा, और इम्यूनोलॉजी (AAAAI) / अमेरिकी फेफड़ों एलर्जी के अमेरिकन अकादमी द्वारा श्वसन रोग पुरस्कार (N.A.B.), AAAAI फाउंडेशन संकाय विकास पुरस्कार (L.G.B.) द्वारा, स्टीवन और जूडी काय यंग इनोवेटर्स पुरस्कार (N.A.B.) द्वारा, Joycelyn सी ऑस्टेन फंड द्वारा महिला चिकित्सक वैज्ञानिकों के कैरियर के विकास के लिए (L.G.B.), और एक द्वारा Vinik परिवार (L.G.B.) द्वारा उदार दान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) Abcam cat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8) Biolegend cat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype control Biolegend cat#400511
DAPI Biolegend cat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies/Molecular Probes cat#A-11055
Normal Goat IgG R&D Systems cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) Biolegend cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control Biolegend cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend cat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Dispase Gibco cat# 17105041 
DNase I Sigma  cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter Boston BioProducts cat# PY-912
Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) Boston BioProducts cat# BSS-355
L-Cysteine Sigma cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate salt Sigma cat# L2023
Papain from papaya latex Sigma cat# P3125
Propidium iodide  Sigma cat# P4170
Experimental Models: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) The Jackson Laboratory 7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope Zeiss
LSRFortessa BD 647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubes Thomas Scientific 1157C86
5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style Falcon 14-959-1A
50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style Falcon 352098
Feather Disposable Scalpel no.12 Fisher Scientific NC9999403
Petri dish, 100 mm x 15 mm Style Falcon 351029
Sterile cell strainer, 100 μm Fisherbrand cat#22363549

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References

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Ualiyeva, S., Yoshimoto, E., Barrett, N. A., Bankova, L. G. Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas. J. Vis. Exp. (148), e59496, doi:10.3791/59496 (2019).

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