Summary
브러쉬 세포는 순진한 마우스 기관에서 발견되는 희귀한 해 화학 감각 상피 세포이다. 그들의 한정된 수 때문에, 기도 면제 및 리모델링에 있는 그들의 기능적인 역할의 ex vivo 평가는 도전적입니다. 우리는 유세포에 의한 기관 브러시 세포의 격리 방법을 설명합니다.
Abstract
기관 브러쉬 세포는 면역 및 신경계에 기도 루멘에서 신호를 전송하는 태세 해 화학 감각 상피 세포입니다. 그(것)들은 장 점막에 있는 tuft 세포, 기관에 있는 브러쉬 세포, 및 비강 점막에 있는 고독한 화학 감각 및 microvillous 세포를 포함하는 화학 감각 상피 세포의 가족의 일부입니다. 상피 구획에 있는 화학 감각 세포는 중요한 세포 내 마커 및 핵심 전사 서명을 공유합니다, 그러나 또한 중요한 전사 이질성을 표시합니다, 현지 조직 환경의 가능성이 반사. 단세포 현탁액에서 기관 브러쉬 세포의 격리는 이 희소한 상피 세포의 기능을 상세히 정의하는 데 필요하지만, 기관 브러시 세포와 신경 종말 사이의 밀접한 상호 작용으로 인해 이들의 격리가 어려울 수 있습니다. 또는 단단하고 접합부의 기도 특정 조성으로 인해. 여기서, 우리는 마우스 기관 상피로부터 브러시 세포의 분리를 위한 절차를 기술한다. 이 방법은 점막에서 기관 상피의 초기 분리를 기반으로하여 파파인이있는 상피 시트의 후속 짧은 배양을 허용합니다. 이 절차는 실행 가능한 기관 브러시 세포의 유세포 측정 선별 및 기능 분석을위한 신속하고 편리한 솔루션을 제공합니다.
Introduction
브러쉬 세포는 미각 세포에서 발견되는 쓴 맛 수용체 및 미각 수용체 형질전환 기계의 발현을 특징으로 하는 화학 감각 상피 세포의 클래스에 속한다. 미각 세포와는 달리, 화학 감각 상피 세포는 상피 표면에 흩어져 있으며 비강 상피 1,2,기관내의 브러시 세포에서 독방 화학 감각 세포 (SCC) 및 마이크로 빌러스 세포라고합니다. 3,4,소장 5,6의터프 세포. 쓴 맛 수용체및 쓴 맛의 트랜스덕션 기계를 발현하는 상피 세포는또한 요도 7,8 및 청각 튜브9에서발견된다. 기도 브러쉬 세포는 신경 발생 및 면역 기도 반응에 있는 유일한 기능이 있습니다. 그들은 아세틸 콜린 생산 화학 감각 세포는 정족수 감지 물질10과 같은 쓴 화합물 및 세균 대사 산물로 활성화시 보호 호흡 반사를 불러 일으킨다. 기도 브러쉬 세포는 또한 기도 3에 있는 에어로알러겐 유도제 유도한 타입-2 염증을 통제하는IL-25의 지배적인 기도 상피 근원입니다.
하부 기도 브러쉬 세포의 전체 전사체의 특성및 환경 자극에 대한 이들의 반응은 기관상피의 낮은 수와 큰 기관지(10)를넘어서는 매우 제한된 수에 의해 제한되었다. 장 상피에서 화학 감각 세포의 격리에 사용되는 기술은 아마도 신경 종말10 또는 다른 기관 브러시 세포의 친밀한 접촉 때문에 기관에서 비례적으로 높은 숫자를 산출하지 않았습니다. 부착물 및 단단한 접합 단백질의 조성과 같은 호흡기 점막의 조직 별 인자. 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 높은 수치로 기관 브러시 세포의 성공적인 격리에 대한 최근의 보고는 파파인을 사용한 2시간 배양 또는 18시간 배양과 pronase11,12. 소화 효소를 가진 더 긴 배양은 세포 생존을 감소시키고 소화한 조직13에서세포의 전사 단면도를 바꿀 수 있기 때문에, 이것은 그밖 화학 감각 상피 인구와 비교 분석을 편향할 수 있었습니다.
여기서, 우리는 RNA 시퀀싱 3에 대한 기관 브러시 세포의격리를위한 방법을보고합니다. 고용량 디스파스로 기관을 치료하여 상피를 점막과 분리합니다. 파파인과 상피 시트의 후속 소화는이 구조 세포의 우수한 회복을 허용합니다.
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Protocol
다음 실험을 수행하기 전에 모든 동물 관리 사용 및 프로토콜이 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받고 국립 연구 위원회의 "치료 및 사용 가이드"에 따라 수행되었는지 확인하십시오. 실험실 동물"(8 판, 2011) 및 도착 지침. 아래에 설명된 모든 절차는 브리검 및 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 검토하고 승인했습니다.
1. 시약의 준비
- 16 U/mL 디스파스 및 20 μg/mL DNase I. 37°C의 수조에서 용액을 예열하기 전에 디스파스 분말이 완전히 용해되었는지 확인하는 PBS 용액인 디스파제 소화 용액을 준비합니다.
- 5% 열불활성화 된 태아 소 혈청 (FBS)을 덜베코 변형 독수리 배지 (DMEM)에 첨가하여 중지 용액을 만듭니다.
- 티로드 I 버퍼 준비: 칼슘이 없는 HEPES-Tyrode의 완충액에 26 U/mL 파파인(48 U/mg 파파인 용액 의 20 μL/mL)과 10 μL/mL L-시스테인을 추가하십시오.
- 티로드 II 완충제 준비: 칼슘이 있는 HEPES-Tyrode의 완충제에 2 μL/mL leupeptin(5 mg/mL)을 추가합니다.
- FACS 완충제 준비: 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드가 없는 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 사용하여 2 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 보충하고 2% FBS를 첨가합니다.
2. 마우스 기관의 해부
참고: 이 프로토콜에 사용된 마우스는ChAT(BAC)-eGFP(B6)이다. Cg-Tg (RP23- 268L19-EGFP)2Mik /J), 남녀 모두의 생후 3-6 개월. eGFP의 광표백을 줄이기 위해 직접 빛에 조직의 노출을 최소화합니다.
- 100 mg/kg 펜토바르비탈 안락사 용액으로 마우스를 복강 내 로 주입하거나 IACUC에서 승인한 표준 프로토콜을 사용하여 마우스를 안락사시하십시오.
- 상지와 하반신이 확장된 21G 바늘로 수술용 보드에 마우스를 고정합니다. 70% EtOH로 모피를 살포하여 이 지역을 살균합니다.
- 직선 집게를 사용하여 복부의 피부와 털을 들어 올리고 해부 가위 (직선 가위, 3cm)로 중앙에 절개를합니다. 가위를 사용하여 피부를 복부에서 망막으로 피하 조직에서 분리하십시오. 피하 조직을 집게로 들고복벽 중앙에 가위로 작은 절개를하십시오.
- V자 형 절개로 복막을 엽니다. 집게를 사용하여 소장을 옆으로 부드럽게 움직이고 복부 대강과 정맥을 찾고 해부 가위로 절개를하여 신속한 퇴출을 허용합니다.
- 다이어프램을 찾습니다. 18 G 바늘을 사용하여 흉골 바로 아래 의 횡격막에서 구멍을 만들어 폐를 수축시됩니다. 날카로운 직선 해부 가위를 사용하여 다이어프램을 리브 케이지에서 조심스럽게 분리하여 갈비뼈의 밑부분을 따라 자른다.
- 집게를 사용하여 흉골의 노출 된 끝을 들어 올리고 흉골을 흉골의 기지에서 목으로 세로로 자른다. 짧은 직선 가위 (2cm)로 중앙 자궁 경부 절개를하고 하악선의 두 개의 로브를 분리합니다.
- 조심스럽게 주변 결합 조직과 시뮤가 미세 한 쌍의 미세 한 부분 높은 정밀 집게로 카리나 위에 놓인 것을 조심스럽게 제거합니다.
- 먼저 후두개 염의 수준에서 근위 쪽 끝을 분리한 다음 기관의 분기 수준에서 말단을 해부하여 기관을 무료로 해부합니다.
- 후두개염을 찾아 후두개에서 카리나까지 세로로 기관을 자른다.
3. 기관 상피 소화
- 기관을 미리 데운(37°C)의 디스파스 소화 액의 750 μL을 함유하는 1.5 mL 튜브에 놓습니다. 실온에서 40 분 동안 200 rpm에서 셰이커에 인큐베이션하십시오. 직접 적인 빛에 노출을 줄이기 위해 알루미늄 호 일로 튜브를 덮습니다.
- 750 μL의 차가운 DMEM을 5% FBS로 첨가하여 반응을 멈춥시합니다. 얼음 위에 놓습니다.
- 기관을 페트리 접시(100mm x 15mm)로 옮기고 해부 현미경으로 놓습니다. 상피 측이 위를 향하여 기관을 방향을 지정합니다. 세로 해부 된 기관은 연골 고리에 의해 유지되는 반 원통형 모양을 가지고 있습니다. 상피는 오목한 표면에 있습니다.
- 페트리 접시에 직선 집게로 기관의 후두개 부위를 밧줄과 크기 22 일회용 메스를 사용하여, 기관에서 상피를 긁어. 상피 층은 반투명 시트로 분리됩니다.
- 메스로 상피를 다듬습니다. 상피 층을 2 mL 튜브로 옮김.
- 750 μL의 티로데 I 완충액으로 페트리 접시를 헹구고 상피층을 함유하는 2 mL 튜브로 옮김.
- 티로드 I에서 기관 상피 층을 200 rpm에서 셰이커상에서 37°C에서 30분 동안 완충한다. 직접 적인 빛에 노출을 줄이기 위해 알루미늄 호 일로 튜브를 덮습니다.
- 차가운 티로데 II 버퍼 750 μL을 추가합니다. 20-30 s. 18 G 바늘에 부착 된 주사기로 동종 을 10 회 격렬하게 소화 된 조직을 소용돌이. 21 G 게이지 바늘로 전환하고 10-20 번 더 삼중화하십시오.
- 100 μm 스트레이너를 통해 세포를 50 mL 원엽 튜브로 필터링합니다. 차가운 FACS 버퍼의 30:1 vol/vol을 추가합니다.
- 4 °C에서 10 분 동안 350 x g에서 회전하고 상류를 버립니다. 차가운 FACS 버퍼에 펠릿을 다시 일시 중단하고 서스펜션을 12mm x 75mm(5mL) 폴리스티렌 튜브로 옮김을 옮니다. 4 °C에서 10 분 동안 350 x g에서 다시 회전하고 상류를 버립니다.
- FACS 완충제의 100 μL에서 펠릿을 다시 중단시다.
- 1 μL의 항 마우스 CD16/32 차단 항체를 추가하여 비특이적 결합을 차단하고 얼음에 15분 동안 배양합니다. 씻지 마십시오.
- 다음 항체 및 각각의 등각형 대조군을 추가한다: 퍼시픽 블루 항마우스 CD45 또는 래트 IgG2a, k(0.25 μg/106 세포 100 μL 부피) 및 알로피코시아닌(APC) 항마우스 EpCAM 또는 래트 IgG2b, k(100 μL에서 0.5 μg/106 세포) 단일 클론 항체. 직접 빛으로부터 보호된 얼음에 45분 간 배양합니다. 4.5 mL의 차가운 FACS 버퍼를 넣고 4 °C에서 10 분 동안 350 x g에서 혼합하고 돌릴 수 있습니다. FACS 버퍼를 폐기하고 300 μL의 차가운 FACS 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다.
- 유세포세포측정 선별 직전에 프로피듐 요오드화물(PI)(5 μg/mL)을 추가합니다.
참고: 브러시 셀은 잠재적으로 필터준수를 증가시킬 수 있는 여러 프로세스를 가진 불규칙한 모양을 가지고 있습니다(그림3C). 우리는 30mm에서 70mm 및 100mm 필터를 비교한 결과, 더 큰 기공 필터가 더 나은 수율을 보장한다는 것을 발견했습니다. 또한, 파파인 소화 후 세포 현탁액의 철저한 삼각은 브러시 세포 수율을 현저하게 향상시킨다. 우리는 세포의 미세한 해리를 위한 더 작은 보어 (21 또는 23 G 바늘)에 선행된 초기 삼조를 위한 18G 바늘을 사용하는 것이 좋습니다.
4. 유세포 분석 게이팅 전략
- 전방 및 측면 산란 각도로 이물질에서 세포를 식별합니다. 전진 분산 높이와 너비 및 측면 분산 높이 및 너비를 사용하여 doublet를 제외합니다. doublets는 너비 값이 높은 셀입니다.
- 단일 셀 내에서 라이브 셀을 PI 음성인 집단으로 식별합니다.
- 살아있는 단 하나 세포 내, 이소형 대조군을 기초로 CD45 낮음에서 음성 세포를 확인한다.
- CD45 저/음세포 내에서 eGFP 양성(FITC 채널)인 EpCAM 양성 세포를 식별합니다. 이것은 브러시 셀의 모집단입니다(그림2A).
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Representative Results
이 절차는 RNA 시퀀싱3에대한 기관 브러시 세포를 격리하기 위해 성공적으로 구현되었습니다. 2단계 프로토콜로 조직의 기관 및 소화를 분리한 후(그림1), PI로 죽은 세포를 배제한 후 형광표지된 CD45 및 EpCAM으로 세포를 수집하고 염색하였다. 전진 및 측면 산란 특성에 따라 이중을 게이팅한 후 브러시 셀을 CD45의 낮음/음수, EpCAM에 대해 양수, eGFP에 대해 양수로 정의했습니다(그림2A). 브러쉬 세포는 유세포측정에 의해 CD45저/부정 세포의 ~0.16-0.42%를 나타내고 기관당 250-600개의 세포를 차지했다(그림2B). 우리는 기관 브러쉬 세포의 우리의 간행된 광대한 면역 조직학 평가에 근거를 둔 ChAT(BAC)-eGFP 마우스에서 전체 기관 마운트에 있는 ChAT-eGFP 양성 세포의 수의 추정에 이 수를 비교했습니다3 및 여기에서 예시된 것 ( 그림3). 야생 형의 기관 브러시 세포에 대한 우리의 이전 연구, ChAT(BAC)-eGFP 마우스와 Il25F25 / F25 마우스는 해 브러시 세포가 DCLK1+ 및 IL25+ 세포 및 계정과 90 % 겹치는 것으로 제안했습니다. 기관 당 600-1000 브러시셀 3. 특히, 이 숫자는 다른그룹(10)에의해 보고된 콜린성 브러쉬 세포의 수보다 낮다. 화학 감각 세포 수는 미생물 대사 산물 및 원생 동물5,14에노출에 의해 변경되기 때문에, 이 숫자는 기관 간 미생물에 있는 가변성을 반영할 지도 모릅니다. 따라서, 우리는 유동 세포 측정 분류에 의하여 단리된 브러쉬 세포의 예상수를 측정하기 위하여 형광 현미경 검사법에 의하여 브러쉬 세포의 수를 추정하는 것을 건의할 것입니다.
우리의 프로토콜을 설치하는 동안, 우리는 화학 감각 세포의 격리의몇몇 이전에 간행된 방법을 시도했습니다 (그림 4). 650 U/mL 콜라게나아제 IV와 DNase I로 보충된 1.84 U/mL 디스파스를 45분 동안 배양했을 때, 폐 균질제15에서단세포 현탁액을 얻기 위해 자주 사용되는 조합으로, 단일 세포 현탁액을 달성했습니다. 상피 세포, 그러나 우리는 단지 몇 브러시 세포를 복구 (그림4A). 장의 터프트 세포는 DNase I와 함께 2.5 mM EDTA 및 0.75 mM 디티오트레이톨(DTT)을 사용하여 성공적으로 분리되어 상피 세포를 20분 간 제거한 후 DNase10을 사용하여 방출된 상피 세포의 소화를 제거했습니다. 6. 우리의 손에, 이 절차를 사용하여 또한 최적이 아닌 기관 브러시 세포 복구를 주도 (그림4B). RNA 분석을 위한 기관 브러시 세포의 성공적인 격리를 위한 프로토콜은 Krasteva 외10에 의해 기술되었다. 이 프로토콜에 따라, 우리는 Tyrode 버퍼에 35 U /mL 파파인으로 다진 기관을 45 분 동안 배양하고 양호한 브러시 세포 회복을 달성하지 못했습니다 (그림4C). Rock et al.은 두 단계로 기저 세포 격리를 위한 기관 상피의 소화 방법을 설명했습니다: 실온에서 고용량 디스파스(16 U/mL)로 중간엽 층으로부터 상피를 분리한 후 벗겨진 상피의 배양 0.1 % 트립신과 37 °C16에서30 분 동안 1.6 mM EDTA. 이러한 단계를 수행하면 브러시 셀이 더 잘 회복되었지만 마우스당 달성된 숫자는 심층적인 기능 분석에 충분하지 않았습니다(그림4D). 프로토콜을 최적화하기 위해 마지막 두 가지 방법을 결합하기로 결정했습니다. 기관 상피를 고용량 디스파스로 분리함으로써, 우리는 기관 브러시 세포에 파파인의 더 나은 접근을 허용하는 것을 목표로했습니다. 따라서, 티로드 완충액에서 26 U/mL 파파인으로 상피및 후속 인큐베이션을 분리하기 위해 전체 기관에 실온에서 디스파스 16 U/mL을 사용하여 최고의 브러시 세포 회수로 이끌었다(그림4E).
그림 1 : 기관 브러시 세포의 격리를위한 제안 된 단계의 스키마. 프로토콜은 2 개의 주요 단계를 포함 : 해부 후, 전체 기관상상피를 분리하는 고용량 디스파스 용액으로 배양; 이것은 Tyrode 완충제 (Tyrode I) 및 항체 염색을 포함하는 칼슘에 있는 파파인을 가진 상피 시트의 소화에 선행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 기관 브러시 세포의 대표적인 유세포분석. (A). 유세포분석 게이팅 전략의 개략적 표현. 단일 세포는 그들의 전방 및 측 산란 특성에 기초하여 게이트되었고, 살아있는 세포는 프로피듐 요오드화의 배제에 기초하여 선택되었다. CD45 저/음세포는 등전형 대조군을 기반으로 선택되었고 EpCAM의 발현을 위해 평가되었다. EpCAM 양성 세포는 FITC 채널에서 eGFP 형광을 발현하는 경우 브러시 세포로 간주되었다. (B). 마우스 기관 당 콜린 성 기관 브러쉬 세포의 수 및 주파수 모든 CD45낮은/-세포의 백분율로 제시 하 고 CD45낮은/-EpCAM+ 세포의 백분율로. 각 점은 별도의 마우스를 나타냅니다. 데이터는 각각 2-3개의 마우스를 가진 3개의 개별적인 실험에서 입니다. (C). CD45 및 EpCAM용 으로 염색된 야생형 마우스로부터 기관 상피 다이제스트에서 eGFP 양성 브러쉬 세포의 부재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : ChAT(BAC)-eGFP 마우스의 마우스 기관 전체 마운트. 기관은 eGFP 녹색 형광 신호를 향상시키기 위해 경도 및 항 GFP 항체로 염색되었다. (a) ChAT(BAC)-eGFP 마우스의 전체 기관 마운트, 강렬한 녹색 형광 세포는 브러시 세포를 나타낸다; 스케일 바 1mm; (B) 브러쉬 세포의 부재를 입증하는 야생형 마우스의 전체 기관 마운트; 배율 막대 = 1mm; (C) 불규칙한 모양의 브러쉬 세포(green cells)뿐만 아니라 콜린성 신경 결말(arrow)을 시공하는 상피층의 배율); (D) 형광 신호의 항체 증강 없이 GFP용 으로 이미지화된 ChAT(BAC) -eGFP의 기관의 전체 기관 마운트; (e) 파라핀 내장 마우스 기관의 단면은 ChAT(BAC)-eGFP 마우스에 반GFP(녹색) 또는 염소 IgG 제어 및 DAPI(파랑)로 염색된 단계; 배율 막대 = 20 μm (C-E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 상이한 기관 소화 프로토콜의 비교. (A) 기관을 650 U/mL 콜라게나아제 IV및 1.84 U/mL 디스파제와 함께 45분 동안 DNase I로 보충하여 배양하였다. 본 실험을 2회 반복하였다. (B) 전체 기관을 2.5 mM EDTA 및 0.75 mM DTT로 배양하고 DNase I로 20 분 동안 보충하였다. 상피 세포를 10분 동안 0.01 U/mL 디스파제 및 DNase I로 더 소화하였다. 본 실험을 2회 반복하였다. (C) 기관을 티로드 I 버퍼에서 35 U/mL의 파파인으로 45분 동안 채굴하고 배양하였다; 잔류 파파인 활성은 류업틴으로 억제되었다. 이 실험은 한 번 수행하였다. (D) 전체 기관을 상피 시트를 분리하기 위해 30분 동안 고용량 디스파스(16 U/mL)로 배양한 다음, 상피 시트를 0.1% 트립신 및 1.6 mM EDTA로 30분 동안 배양하였다. 본 실험을 2회 반복하였다. (E). 전체 기관을 30분 동안 고용량 디스파제(16 U/mL)로 배양한 다음 티로드 완충액에서 26 U/mL 파파인을 가진 상피 시트의 소화를 30분 동안 배양하였다. 잔류 파파인 활성은 류업틴 및 고용량 희석으로 억제되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 40 분 동안 고용량 디스파스 치료의 조합과 짧은 파파인 치료 (30 분)가 기관 소화 및 브러시 세포 격리를위한 최적의 프로토콜을 제공한다는 것을 발견했습니다. 이 조합은 광범위한 소화를 방지하고 대체 프로토콜에 비해 브러시 셀의 가장 높은 수율을 생성합니다.
조혈 세포를 추출하는 폐 소화는 콜라게나아제 IV15와같은 가벼운 소화 효소에 고전적으로 의존해 왔지만 상피 세포의 분리는 더 복잡한 프로토콜을 필요로 한다. 상피 세포의 단세포 현탁액은 서로 및 지하 막에 결합하는 접합부와 세포 자체의 약점 때문에 단단하고 부착하기 때문에 달성하기가 더 어렵습니다. 상피 세포 소화를 위한 대부분의 프로토콜은 2개의 단계를 관련시킵니다 - 첫번째 단계는 지하 막에서 상피의 분리이고 상피 세포를 서로 붙이는 단단한 접합및 desmosomes를 방해하는 후속 단계가 뒤따릅니다 16세 , 17.
몇몇 단은 상피 세포의 격리를 위한 2 단계 프로토콜의 다른 수정을 사용하여 창자에서 화학감각 tuft 세포를 성공적으로 분리했습니다: 첫번째 단계는 sub점막에서 상피 세포를 풀어 놓기 위하여 EDTA와 DTT를 이용합니다 디스파스와 상피 시트의 소화. Howitt 외. 5 mM EDTA + 1 mM DTT의 혼합물을 사용 하 여 0.5 단위/mL 디스파제 II와 DNase14소화 다음. 게르베 외. 고농도 30 mM EDTA를 단독으로 사용하여 상피 분획을 분리하고 이어서 DNaseI18로보충된 디스파제로 배양하였다. 폰 몰트케 외. 사용 2.5 mM EDTA, 0.75 mM DTT 및 DNaseI 다음 디스파스 소화6. 우리는 이 기술이 기관에 있는 실행 가능한 상피 세포의 격리를 허용한다는 것을 것을을 발견했습니다 그러나 기관 브러쉬 세포의 백분율은 극단적으로 낮았습니다 (그림4B)및 1당 600-800의 브러쉬 세포의 격리의 우리의 기대와 일치하지 않습니다 우리의 학비 평가에 따라 기관.
기관 상피 세포 격리 프로토콜은 기저 상피 세포를 연구하기 위해 여러 그룹에 의해 개발되었습니다. 이 프로토콜과 창자에 고용 된 것 들 사이의 주요 차이점은 소화 효소의 순서에. 첫 번째 단계는 실온16에서고농도의 디스파제(16 U/mL)로 인큐베이션을 통해 기관 상피의 분리이다. 이는 상피가 중간엽층(19)으로부터단일 시트로서 분리될 수 있게 한다. 기관 상피의 후속 처리는 트립신과 EDTA의 조합을 사용, 세포 분리의 가장 자주 사용되는 효소 방법 중 하나, 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해. 트립신은 리신 과 아르기닌 아미노산 잔기의 C 말단 측에 펩티드를 절단하는 반면, EDTA는 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용(20)을 위한 칼슘 킬레이터로 사용된다. 이 기술을 사용하여, Rock et al. 전사 프로파일링16을 위한 기저상피 세포를 회복시키는 데 성공하였다. 유사한 프로토콜은 최근 Tas2r143-CreERT2구동 eGFP 리포터 및 B6로부터 세포를 발영하는 쓴 맛 수용체를 분리하는 데 사용되었다. IL25Flare25/플레어25 RNA 시퀀싱 연구5,8. 우리의 경험에서, 트립신과 EDTA를 가진 상피 시트의 소화는 우수한 상피 세포 복구를 지도했습니다 그러나 다중 마우스가 각각 풀린 하지 않는 한 기능적 또는 전사 분석을 위한 해 기관 브러쉬 세포의 부족한 수 샘플(그림4C)을 참조하십시오.
파파인은 파파야 라텍스에서 유래한 강력한 내분비 식물 시스테인 프로테아제이며, 페닐알라닌21에이어 기본 아미노산, 특히 아르기닌, 리신 및 잔류물을 포함하는 펩티드 결합을 갈라지는 것으로 알려져 있다. 기관 브러시 세포 격리는 ChAT(BAC)-eGFP 마우스로부터파파인을 사용하여 크라스테바 외10에의해 처음 보고되었다. 파파인 소화는 또한 최근에 브러쉬/터프트 세포가 상피 세포의 작은 분획을 구성하는 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 기도 상피 세포를 해리하는 데 사용되었다11. 파파인은 또한 생존 가능한 뉴런22의 분리를 위한 뇌조직의 소화에 가장 일반적으로 사용되는 효소이다. 30 분 동안 파파인과 뇌 조직의 해리는 트립신 소화에 비해 현저하게 더 높은 수율, 신경 생존 및 무결성 을 초래한다23. 몇몇 브러쉬 세포는 신경 종말3,10과단단히 얽혀 있기 때문에, papain의 사용은 뉴런에 브러쉬 세포 접합의 성공적인 절단을 위해 중요할지도 모릅니다. 그러나, 우리는 35-40 U/mL의 농도에서 파파인과 함께 45 분 소화가 극적으로 낮은 브러시 세포 회복으로 이어지는 상피 세포 생존력을 감소시키는 것을 발견했습니다 (그림4D).
저희는 파파인 독성을 줄이고 세포 수율을 높이기 위해 3가지 방법을 사용했습니다. 첫째, 상피 시트를 디스파스로 분리하여, 파파인의 후속 배양 시간을 45분에서 30분으로 줄인다. 둘째, 우리는 즉시 시스테인 프로테아제24의억제제 인 leupeptin으로 파파인 활성을 억제했습니다. 특히, leupeptin은 4 °C에서 매우 불안정하며 -20 °C에서 aliquoted 및 냉동되어야합니다. 셋째, 우리는 감기 PBS의 다량에서 효소 소화 된 조직의 희석이 소화 된 세포의 생존력을 보존하는 데 도움이된다는 것을 발견했습니다. 세포 수율을 높이는 데 중요한 또 다른단계는 엄격한 삼각(10)이다. 장기간 의 소용돌이도 생존력을 떨어뜨릴 수 있기 때문에, 우리는 부분적으로 삼각으로 대체했습니다. 우리는 21 G 바늘로 추가 삼조 뒤에 더 큰 세포 덩어리를 해리하기 위하여 18G 바늘로 삼조를 추천합니다. 마지막으로, eGFP는 매우 빛에 민감하며 모든 단계에서 직접 적인 빛 노출로부터 보호하는 것이 도움이 된다는 것을 발견했습니다. 이러한 변형은 실행 가능한 기관 브러시 세포의 강력한 회복을 허용하였다(그림4E).
여기에 제안 된 프로토콜의 주요 제한 사항은 2 단계 절차와 강력한 시스테인 프로테아제 인 파파인의 사용입니다. 몇몇 단은 최근에 화학 감각 세포를 격리할 때 dispase5를 위한 liberase를 대체했습니다. 더욱이, 해방성 소화는 최근 비강 폴립25,26으로부터화학감각(brush) 상피 세포를 분리하는데 사용되었다. 우리는 우리의 2 단계 디스파스 / 파파인 소화 프로토콜에 해방 소화를 직접 비교하지 않았습니다. 파파인은 상피세포(27)에서 프로테아제 활성화 수용체 PAR2를 활성화시킬 수 있는 강력한 시스테인 프로테아제로서 브러시 세포 자체의 활성화 또는 다른 호흡기 세포에 의한 중재자의 생성으로 이어지는 브러시 셀. 마지막으로, 파파인은 표면 수용체의 분열을 통해 수용체 발현을 조절할 수 있어 유세포측정도28,29에의한 브러시 세포 수용체 발현을 검증하기 어렵다.
요약하면, 우리는 실행 가능한 기관 브러시 세포의 강력한 회복을 허용하는 ChAT-eGFP 리포터 마우스로부터 기관 해 브러시 세포의 격리 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 RNA 시퀀싱 3에 의한 브러시 세포의 격리및 전사 분석에 성공적으로 사용되었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
브리검 여성 인간 면역학 센터 플로우 코어의 아담 치코인(Adam Chicoine)에게 유동 세포 측정 분류에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), 및 K08 AI132723 (L.G.B), 및 알레르기, 천식 및 면역학의 미국 아카데미 (AAAAI)/ 미국 폐 알레르기 호흡기 질환 상 (N.A.B.), AAAI 재단 교수 개발 상 (L.G.B.), 스티븐과 주디 케이 젊은 혁신상 (N.A.B.), 여성 의사 과학자의 경력 개발을위한 조이셀린 C. 오스틴 기금에 의해 (L.G.B.), 그리고 에 의해 비닉 가족(L.G.B.)의 후원금 기부.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
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