Summary
Pensel celler är sällsynta kolinerga kemosensoriska epitelceller som finns i den naiva mus luftstrupen. På grund av deras begränsade antal, ex vivo utvärdering av deras funktionella roll i luftvägarna immunitet och Remodeling är utmanande. Vi beskriver en metod för isolering av trakealborst celler med flödescytometri.
Abstract
Tracheal pensel celler är kolinerga kemosensoriska epitelceller redo att överföra signaler från luftvägslumen till immunförsvaret och nervsystemet. De är en del av en familj av chemosensoriska epitelceller som inkluderar tofs celler i tarmslemhinnan, pensel celler i luftstrupen, och ensamma chemosensoriska och microvillous celler i nässlemhinnan. Chemosensoriska celler i olika epiteliala fack dela viktiga intracellulära markörer och en kärna transkriptionella signatur, men också visa betydande transkriptionella heterogenitet, sannolikt reflekterande av den lokala vävnads miljön. Isolering av trakealborst celler från enstaka cellsuspensioner krävs för att definiera funktionen av dessa sällsynta epitelceller i detalj, men deras isolering är utmanande, potentiellt på grund av den nära interaktionen mellan trakealborst celler och nervändar eller på grund av luftvägsspecifika sammansättningen av snäva och anhängare korsningar. Här beskriver vi ett förfarande för isolering av pensel celler från mus trakeal epitel. Metoden är baserad på en första separation av trakeal epitel från submucosa, vilket möjliggör en efterföljande kortare inkubation av epitelial blad med papain. Detta förfarande erbjuder en snabb och bekväm lösning för flödescytometrisk sortering och funktionell analys av livskraftiga trakealborst celler.
Introduction
Pensel celler tillhör en klass av chemosensoriska epitelceller som kännetecknas av uttrycket av bitter smak receptorer och smak receptor signaltransduktion maskiner finns i smaken bud celler. Till skillnad från smak bud celler, chemosensoriska epitelceller är utspridda i epitelial ytor och kallas solitära kemosensoriska celler (SCCS) och microvillous celler i nasala epitelet1,2, pensel celler i luftstrupen 3,4, och tofs celler i tarmen5,6. Epitelceller som uttrycker bitter smak receptorer och bitter smak signaltransduktion maskiner finns också i urinröret7,8 och auditiva röret9. Luftvägarna borste celler har unika funktioner i neurogena och immun luftvägarna svar. De är acetylkolin-producerande chemosensoriska celler som framkallar skyddande respiratoriska reflexer vid aktivering med bitter föreningar och bakteriella metaboliter som kvorum-Sensing ämnen10. Luftvägarna borst celler är också den dominerande luftvägarna epitelial källa av IL-25, som reglerar aeroallergen-framkallade typ 2 inflammation i luftvägarna3.
Karakterisering av hela transkriptome av nedre luftvägarna pensel celler och deras svar på miljömässiga stimuli har begränsats av deras låga antal i trakealepitelet och mycket begränsat antal bortom den stora bronkerna10. Tekniker som används för isolering av chemosensoriska celler från tarmens epitel har inte gett proportionellt höga siffror från luftstrupen, möjligen på grund av intima kontakter luftrör pensel celler med nervändar10 eller andra vävnads-specifika faktorer i luftvägarna slemhinnan såsom sammansättningen av anhängare och snäva knutpunkt proteiner. Nyligen rapporter om framgångsrik isolering av trakealborst celler i högre antal för Single cell RNA sekvenserings analys anställd antingen en 2 h inkubation med papain eller en 18 h inkubering med pronase11,12. Eftersom längre inkuberingar med matsmältningsenzymer kan minska cellernas lönsamhet och förändra den transkriptionella profilen hos celler från smält vävnader13, detta kan bias jämförande analys med andra kemosensoriska epiteliala populationer.
Här rapporterar vi en metod för isolering av trakealborst celler för RNA-sekvensering3. Behandling av luftstrupen med hög dos dispas separerar epitelet från submucosa. Efterföljande nedbrytning av epitelial ark med papain möjliggör utmärkt återhämtning av denna strukturella cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Innan du utför följande experiment, se till att all användning av djuromsorg och alla protokoll är godkända av den institutionella djurvårds-och användnings kommittén (IACUC) och utförs i enlighet med det nationella forskningsrådets vägledning för skötsel och användning av Försöksdjur " (8: e upplagan, 2011) och riktlinjerna för Anländ. Alla procedurer som beskrivs nedan har granskats och godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Brigham and Women ' s Hospital.
1. beredning av reagenser
- Bered dispas digestionslösning, som är en PBS-lösning som innehåller 16 U/ml dispas och 20 μg/ml DNase i. Säkerställ att dispas-pulvret är helt upplöst innan lösningen värms upp i ett vattenbad vid 37 ° c.
- Tillsätt 5% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) till Dulbecco modifierad Eagle medium (DMEM) för att göra en stopplösning.
- Förbered Tyrode I-bufferten: Tillsätt 26 U/mL papain (20 μL/mL 48 U/mg papain-lösning) och 10 μL/mL L-cystein till HEPES-Tyrodes buffert utan kalcium.
- Förbered Tyrode II-bufferten: Tillsätt 2 μL/mL leupeptin (5 mg/mL) till HEPES-Tyrodes buffert med kalcium.
- Förbered FACS buffert: Använd Hanks balanserad saltlösning (HBSS) utan kalcium, magnesium & fenolrött, kompletterat med 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och tillsätt 2% FBS.
2. dissektion av mus luftstrupe
Anmärkning: Möss som används i detta protokoll är ChAT(BAC)-Egfp (B6. CG-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 månaders ålder av båda könen. Minimera exponeringen av vävnaden för direkt ljus för att minska photoblekning av eGFP.
- Euthanize musen med 100 mg/kg pentobarbital dödshjälp lösning injiceras intraperitonealt eller med hjälp av standardprotokoll som godkänts av IACUC.
- Fäst musen på ett kirurgiskt bräde i ryggläge med 21 G nålar med utökade övre och nedre extremiteter. Spraya pälsen med 70% EtOH att sanera området.
- Med hjälp av raka tång, lyfta huden och päls av buken och göra ett snitt i centrum med dissekera sax (rak sax, 3 cm). Med hjälp av saxen, separera huden från den subkutana vävnaden från buken till Mandibula. Medan du håller den subkutana vävnaden upp med tång, gör ett litet snitt med saxen i mitten av bukväggen.
- Öppna bukhinnan med en V-formad snitt. Med hjälp av tång, försiktigt flytta tunntarmen till sidan, lokalisera bukaorta och Vena Cava och göra ett snitt med dissekera saxen för att möjliggöra snabb exsanguination.
- Lokalisera membranet. Med hjälp av en 18 G nål, gör en öppning i membranet strax under bröstbenet att tömma lungorna. Försiktigt separera membranet från bröstkorgen med skarpa spetsiga raka dissekera sax för att skära längs basen av revbenen.
- Med hjälp av tång, lyft den exponerade änden av bröstbenet och skär bröstbenet längsled från basen av bröstkorgen till halsen. Gör en central cervikal snitt med korta raka sax (2 cm) och separera de två loberna i submandibular körtel.
- Ta försiktigt bort den omgivande bindväv och brässen överliggande Carina med ett par fina punkt hög precision tång.
- Dissekera luftstrupen fri först genom att separera den proximala änden på nivån av struplocket och sedan dissekera den distala änden på nivån för bifurkation av luftstrupen.
- Lokalisera struplocket och skär luftstrupen longitudinellt från struplocket till Carina.
3. trakeal epitelial nedbrytning
- Placera luftstrupen i en 1,5 ml tub som innehåller 750 μl förvärmda (till 37 ° c) dispas digestionslösning. Inkubera i en shaker vid 200 RPM för 40 min vid rumstemperatur. Täck röret med aluminiumfolie för att minska exponeringen för direkt ljus.
- Tillsätt 750 μL kallt DMEM med 5% FBS för att stoppa reaktionen. Plats på isen.
- Överför luftstrupen till en petriskål (100 mm x 15 mm) och placera den i ett dissekterande Mikroskop. Orientera luftstrupen med epitelial sida vänd uppåt. Den longitudinellt dissekerade luftstrupen har en semi-cylindrisk form upprätthålls av brosk ringarna. Epitelet är på den konkava ytan.
- Tjudra struplocket området av luftstrupen med raka Pink till petriskål och använda en storlek 22 disponibel skalpell, skrapa epitelet från luftstrupen. Epitelskiktet separerar som ett genomskinligt ark.
- Finhacka epitelet med skalpell. Överför epitelskiktet till en 2 mL tub.
- Skölj petriskål med 750 μL Tyrode I-buffert och överför till 2 mL-röret som innehåller epitelskiktet.
- Inkubera det trakeala epitelskiktet i Tyrode I-buffert i 30 min vid 37 ° c i en shaker vid 200 rpm. Täck röret med aluminiumfolie för att minska exponeringen för direkt ljus.
- Tillsätt 750 μL kall Tyrode II-buffert. Vortex den smälta vävnaden kraftigt för 20-30 s. Triturate homogena med en spruta fäst på en 18 G nål 10 gånger. Byt till en 21 G gauge nål och hackad 10-20 fler gånger.
- Filtrera cellerna genom en 100 μm SIL i ett 50 mL koniskt rör. Tillsätt 30:1 Vol/Vol kallt FACS buffert.
- Snurra på 350 x g i 10 min vid 4 ° c och Kassera supernatanten. Omsuspendera pelleten i kall FACS buffert och överför suspensionen till en 12 mm x 75 mm (5 mL) polystyren rör. Snurra igen på 350 x g i 10 min vid 4 ° c och Kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 100 μL av FACS-bufferten.
- Tillsätt 1 μL anti-Mouse CD16/32-blockerande antikropp för att blockera icke-specifik bindning och inkubera i 15 min på is. Tvätta inte.
- Tillsätt följande antikroppar och respektive isotyp-kontroller: Pacific Blue anti-Mouse CD45 eller råtta IgG2a, k (0,25 μg/106 celler i 100 μl volym) och allophycocyanin (APC) anti-Mouse EpCAM eller råtta IgG2b, k (0,5 μg/106 celler i 100 μl volym) monoklonala antikroppar. Inkubera i 45 min på is skyddad från direkt ljus. Tillsätt 4,5 mL kallt FACS buffert, blanda och snurra på 350 x g i 10 min vid 4 ° c. Kassera FACS-bufferten och återsuspendera pelleten i 300 μL kall FACS-buffert.
- Tillsätt propidiumjodid JODID (PI) (5 μg/mL) omedelbart före flödescytometrisk sortering.
Anmärkning: Pensel celler har en oregelbunden form med flera processer som potentiellt kan öka deras följsamhet till filter (figur 3C). Vi jämförde med 30 mm till 70 mm och 100 mm filter och fann att större porfilter säkerställde bättre avkastning. Dessutom, grundlig sönderdelning av cellsuspensionen efter papain matsmältningen avsevärt förbättrar borsten cell avkastningen. Vi rekommenderar att du använder en 18 G nål för initial sönderdelning följt av ett mindre hål (21 eller 23 G nål) för finare dissociation av celler.
4. flöde Cytometry gating strategi
- Identifiera celler från skräp genom att vidarebefordra och sida scatter vinkel. Exkludera dubbletterna med hjälp av framåtscatter-höjd och bredd och sido spridnings höjd och bredd. Dubbletterna skulle vara de celler som har höga breddvärden.
- I de enskilda cellerna identifierar du de levande cellerna som den population som är PI-negativ.
- I den levande enskilda celler, identifiera CD45 låg till negativa celler baserat på isotypen-kontroll.
- Inom CD45 låga/negativa celler, identifiera EpCAM positiva celler som också är eGFP positiva (i FITC kanal). Detta är populationen av borst celler (figur 2a).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna procedur har genomförts framgångsrikt för att isolera trakeal pensel celler för RNA-sekvensering3. Efter isolering av luftstrupen och nedbrytning av vävnaden med en 2-stegs protokoll (figur 1), celler samlades in och färgas med fluorescerande-märkta CD45 och EpCAM efter uteslutning av döda celler med PI. Efter gating ut dubletter baserat på framåt och sida scatter egenskaper, definierade vi pensel celler som låg/negativ för CD45, positivt för EpCAM och positiv för egfp (figur 2a). Pensel celler representerade ~ 0,16-0,42% av CD45låg/neg celler med flödescytometri och stod för 250-600 celler per luftstrupen (figur 2B). Vi jämförde dessa räknas till en uppskattning av antalet Chat-egfp positiva celler i hela luftrör fästen från Chat(BAC)-egfp möss baserat på vår publicerade omfattande immunohistokologiska utvärderingen av trakeal pensel celler3 och illustrerad här ( Figur 3). Våra tidigare studier av luftrör pensel celler i Wild Type, chat(BAC)-egfp möss och Il25F25/F25 möss föreslog att kolinerga pensel celler är 90% överlappande med DCLK1+ och Il25+ celler och konto för 600-1000 pensel celler per luftstrupe3. Särskilt, detta antal är lägre än antalet kolinerga pensel celler rapporteras av andra grupper10. Eftersom chemosensorisk cell nummer ändras genom exponering för mikrobiella metaboliter och protozoer5,14, kan dessa siffror återspegla en variation i interinstitutionell Microbiota. Därför föreslår vi att man beräknar antalet pensel celler med fluorescensmikroskopi för att mäta det förväntade antalet isolerade pensel celler med flödescytometrisk sortering.
När vi fastställde vårt protokoll försökte vi flera tidigare publicerade metoder för isolering av kemosensoriska celler (figur 4). När vi inkuberade malet luftstrupe med 650 u/ml kollagenas från IV och 1,84 U/ml dispas kompletterat med DNase I för 45 min, en kombination som ofta används för att få enstaka cellsuspensioner från lung Homogenates15, uppnådde vi en enda cellsuspension av epitelceller, men vi återhämtade bara några pensel celler (figur 4a). Tuft celler i tarmen har framgångsrikt isolerats med 2,5 mm EDTA och 0,75 mm dithiothreitol (dTT) med DNase I för 20 min att ta bort epitelceller följt av nedbrytning av de utgivna epitelceller med 0,01 U/ml dispas med dnasei för 10 min 6. i våra händer, med hjälp av detta förfarande ledde också till suboptimala trakealborste cell återhämtning (figur 4B). Ett protokoll för lyckad isolering av trakealborst celler för RNA-analys beskrevs av Krasteva et al.10. Efter detta protokoll, inkuberade vi malet luftstrupe med 35 U/mL papain i Tyrode buffert för 45 min och uppnådde inte bra borste cell återhämtning (figur 4C). Rock et al. beskrev en metod för nedbrytning av trakeal epitel för basalcells isolering med två steg: separation av epitelet från mesenkymala skikt med hög dos dispas (16 U/ml) vid rumstemperatur följt av inkubation av avskalade epitelet med 0,1% trypsin och 1,6 mM EDTA i 30 min vid 37 ° c16. Efter dessa steg ledde till en bättre återhämtning av pensel celler, men antalet uppnås per mus var otillräckliga för djupgående funktionella analyser (figur 4D). För att optimera protokollet bestämde vi oss för att kombinera de två sista metoderna. Genom att separera trakeal epitel med hög dos dispase, syftade vi till att möjliggöra bättre tillgång till papain till luftrör pensel celler. Sålunda, med hjälp av 16 u/ml av dispas vid rumstemperatur på hela luftstrupen att separera epitelet och efterföljande inkubering av epitelet med 26 U/ml papain i Tyrode buffert ledde till den bästa pensel cell återhämtning (figur 4E).
Figur 1 : Schema över föreslagna steg för isolering av trakealborst celler. Protokollet innehåller två stora steg: efter dissektion, hela luftstrupen inkuberas i en hög dos dispas lösning för att separera epitelet; Detta följs av nedbrytning av epitelial blad med papain i kalcium som innehåller Tyrode buffert (Tyrode I) och antikropp färgning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativ flödescytometri analys av trakealborst celler. (A). schematisk representation av flödescytometristrategin. Enstaka celler var gated baserat på deras framåt och sida scatter egenskaper och levande celler valdes baserat på uteslutning av Propidium jodid. CD45 låg/negativa celler valdes baserat på isotyp kontroll och utvärderas för deras uttryck av EpCAM. EpCAM positiva celler ansågs pensel celler om de uttryckte eGFP fluorescerande i FITC kanalen. (B). antal kolinerga trakeal pensel celler per mus luftstrupe och frekvens presenteras som procent av alla CD45låg/- celler och som en procentandel av CD45låg/-EpCAM+ celler. Varje punkt representerar en separat mus. Data är från 3 separata experiment med 2-3 möss vardera. (C). avsaknad av egfp positiva pensel celler i en trakeal epitelial smälta från en vild typ mus färgas för CD45 och EpCAM. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Hela berget av mus luftstrupen av en chatt(BAC)-egfp mus. Luftstrupen öppnades longitudinellt och färgas med anti-GFP antikropp för att förbättra eGFP gröna fluorescens signalen. (A) hela luftrör Mount Chat(BAC)-egfp mus, intensivt gröna fluorescerande celler representerar pensel celler; skal stång 1 mm; Bhela trakealberget av en vild typ mus som visar frånvaro av borst celler. Skalstapel = 1 mm; (C) förstoring av epitelskiktet som demonstrerar oregelbundet formade borst celler (gröna celler) som brunnar som en kolinerg nerv ändelse (pil). (D) hela luftrör Mount av en luftstrupe av en chat(BAC)-egfp avbildas för GFP utan antikropp-förstärkning av fluorescens signalen; (E) tvärsnitt av en paraffin-inbäddade mus luftstrupe av en chat(BAC)-egfp mus färgas med anti-GFP (grön) eller get IgG kontroll och DAPI (blå); Skalstreck = 20 μm (C-E). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Jämförelse av olika trakealnedbrytnings protokoll. Aluftstrupen har hackats och inkuberats med 650 u/ml-kollagenasiv och 1,84 U/ml-dispas kompletterad med DNase I för 45 min. Detta experiment upprepades 2 gånger. Bhela luftstrupen inkuberades med 2,5 mm EDTA och 0,75 mm DTT kompletterat med DNase I under 20 min. epitelcellerna var disingade och ytterligare smält med 0,01 U/ml dispas och DNase I för 10 min. Detta experiment upprepades 2 gånger. Cluftstrupen har hackats och inkuberats med 35 U/ml papain i Tyrode i-buffert för 45 min. kvarvarande papain aktivitet hämmade med leupeptin. Det här experimentet utfördes en gång. (D) hela luftstrupen inkuberades med höga doser dispas (16 U/ml) för 30 min att separera epitelial arket, följt av inkubation av epitelial blad med 0,1% trypsin och 1,6 mm EDTA i 30 min. Detta experiment upprepades 2 gånger. (E). hela luftstrupen inkuberades med höga doser dispas (16 U/ml) för 30 min följt av nedbrytning av epitelial blad med 26 U/ml papain i Tyrode buffert för 30 min. Resterande papain aktivitet hämmade med leupeptin och hög volym utspädning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi fann att en kombination av hög dos dispas behandling för 40 min följt av en kort papain behandling (30 min) ger ett optimalt protokoll för trakealnedbrytning och borste cell isolering. Denna kombination undviker omfattande nedbrytning och ger den högsta avkastningen av pensel celler, jämfört med alternativa protokoll.
Medan lung nedbrytning för att extrahera hematopoietiska celler har klassiskt förlitade sig på milda matsmältningsenzymer som kollagenase IV15, isolering av epitelceller kräver mer komplexa protokoll. Single cellsuspensioner av epitelceller är svårare att uppnå på grund av den snäva och adherens korsningar binda dem till varandra och basalmembranet och på grund av bräcklighet av cellerna själva. De flesta protokoll för epitelcellsnedbrytning innebär två steg-ett första steg är separationen av epitelet från basalmembranet följt av efterföljande steg för att störa de snäva korsningar och desmosomes som fäster epitelceller till varandra 16 , 17.
Flera grupper har framgångsrikt isolerat chemosensoriska tofs celler från tarmen med hjälp av olika modifieringar av ett 2-stegs protokoll för isolering av epitelceller: det första steget använder EDTA och DTT för att frigöra epitelceller från submucosa följt av nedbrytning av epiteliala ark med dispase. Howitt et al. använde en blandning av 5 mM EDTA + 1 mM DTT följt av matsmältningen med 0,5 enheter/mL Dispase II och DNase14. Gerbe et al. används hög koncentration 30 mm EDTA ensam att separera epitelial fraktion och därefter inkuberas med dispas kompletteras med dnasei18. Von Moltke et al. begagnade 2,5 mm EDTA, 0,75 mm DTT och dnasei följt av dispas matsmältning6. Vi fann att dessa tekniker möjliggör isolering av livskraftiga epitelceller i luftstrupen, men procent av trakeal pensel celler var extremt låg (figur 4B) och inte överensstämmer med vår förväntan om isolering av 600-800 pensel celler per luftstrupe baserat på vår histologisk utvärdering.
Tracheal epitelceller isolerings protokoll har utvecklats av flera grupper för att studera basal epitelcellerna. De stora skillnaderna mellan dessa protokoll och de som används i tarmen är i sekvensen av matsmältningsenzymer. Det första steget är separationen av trakealepitelet genom inkubation med en hög koncentration av dispas (16 U/ml) vid rumstemperatur16. Detta gör det möjligt för epitelet att separera som ett enda ark från mesenkymala lagret19. Efterföljande bearbetning av trakealepitel använder en kombination av trypsin och EDTA, en av de mest använda enzymatiska metoder för cell avlossning, att uppnå en enda cellsuspension. Trypsin klyver peptider på C-terminalen sidan av lysin och arginin aminosyra rester, medan EDTA används som en kalciumkelator för cell-cell och cell-Matrix interaktioner20. Med hjälp av denna teknik, rock et al. har varit framgångsrika i att återhämta basal epitelceller för transkriptionell profilering16. Ett liknande protokoll användes nyligen för att isolera bitter smak receptor som uttrycker celler från en Tas2r143-CreERT2 driven egfp-reporter och från B6. Il25Flare25/Flare25 för RNA-sekvenserings studier5,8. Enligt vår erfarenhet, nedbrytning av epitelial blad med trypsin och EDTA ledde till utmärkt epitelial cell återhämtning men otillräckligt antal kolinerga trakeal pensel celler för funktionell eller transkriptionell analys om inte flera möss poolades för varje provet (figur 4C).
Papain är en potent endolytisk växt cystein proteas härrör från Papaya latex, och det är känt att klyva peptid obligationer med grundläggande aminosyror, särskilt arginin, lysin och rester efter fenylalanin21. Tracheal borste cell isolering med papain från ChAT(BAC)-egfp möss rapporterades först av Krasteva et al10. Papain matsmältningen var också nyligen används för att separera luftvägarna epitelceller för Single cell RNA sekvensering där pensel/tuft celler bestod av en liten del av epitelceller11. Papain är också den mest använda enzymet för nedbrytning av hjärnvävnad för isolering av livskraftiga neuroner22. Dissociation av hjärnvävnad med papain för 30 min resultat i markant högre avkastning, neuronala överlevnad och integritet jämfört med trypsin matsmältning23. Eftersom vissa pensel celler är tätt sammanflätade med nervändar3,10, användning av papain kan vara avgörande för den framgångsrika klyvning av pensel cell korsningar till nervceller. Emellertid, vi fann att en 45 min matsmältning med papain vid en koncentration av 35-40 U/mL dramatiskt reducerad epitelial cell lönsamhet, vilket leder till låg pensel cell återhämtning (figur 4D).
Vi använde 3 metoder för att minska papain toxicitet och öka vår cellulära avkastningen. Först, genom att separera epitelial arket med dispase, reducerade vi den efterföljande inkubationstiden för papain från 45 till 30 min. För det andra hämmade vi omedelbart den papain aktivitet med leupeptin, en hämmare av cystein proteaser24. I synnerhet är leupeptin mycket instabilt vid 4 ° c och bör vara aliciterat och fryst vid-20 ° c. För det tredje fann vi att utspädning av den enzymatiskt smälta vävnaden i en stor volym av kallt PBS också bidrar till att bevara lönsamheten för de smälta cellerna. Ett annat steg som är avgörande för att öka cell avkastningen är rigorös sönderdelning10. Eftersom långvarig vortexa kan också minska lönsamheten, ersatte vi delvis det med trituration. Vi rekommenderar sönderdelning med en 18g nål för att separera större cellulära klumpar följt av ytterligare sönderdelning med en 21 g nål. Slutligen fann vi att eGFP är mycket ljuskänsligt och skydd mot direkt ljus exponering vid varje steg är till hjälp. Dessa modifieringar tillät en robust återhämtning av livskraftiga trakealborst celler (figur 4E).
De viktigaste begränsningarna i det protokoll som föreslås här är 2-stegs förfarandet och användningen av papain, en potent cystein proteas. Vissa grupper har nyligen ersatt liberase för dispas5 när isolerar chemosensoriska celler. Dessutom, liberase matsmältningen användes nyligen för att isolera chemosensoriska (pensel) epitelceller från nasal polyper25,26. Vi har inte direkt jämfört liberase nedbrytning till vår två-stegs dispase/papain digestionsprotokoll. Papain är en potent cystein proteashämmare som kan aktivera proteas aktiverad receptor PAR2 på epitelceller27 leder till aktivering av pensel celler själva eller till generering av medlare av andra andnings celler som i sin tur kan aktivera borsta celler. Slutligen kan papain modulera receptor uttryck genom klyvning av ytan receptorer gör det svårt att validera pensel cell receptor uttryck genom flödescytometri28,29.
Sammanfattnings, vi tillhandahåller ett protokoll för isolering av trakeal kolinerga pensel celler från ChAT-eGFP reporter möss som gör det möjligt för robust återhämtning av livskraftiga trakealborst celler. Detta protokoll har använts framgångsrikt för isolering och transkriptionell analys av pensel celler med RNA-sekvensering3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Adam Chicoine vid Brigham and Women ' s Human immunologi Center Flow Core för hans hjälp med Flow kors sortering. Detta arbete stöddes av nationella institut för hälso bidrag R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), och K08 AI132723 (L. G. B), och av American Academy of allergi, astma och immunologi (AAAAI)/American lung allergisk Respiratorisk sjukdom Award (N.A.B.), av AAAAI Foundation fakultet Development Award (L.G.B.), av Steven och Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), av Joycelyn C. Austen fonden för karriärutveckling av kvinnliga läkare forskare (L.G.B.), och av en generös donation av familjen Vinik (L.G.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 mm x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 mm x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
