Summary
המטרה של הפרוטוקול הזה היא לתאר את הגישה החדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של יצור-הבעת אדנווירוס לתוך בלוטות החלב של העכבר. גישה זו מאפשרת גם מניפולציה ייחודית לסוג תא ולעוגב של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקר.
Abstract
סרטן השד הוא מחלה הטרוגנית, אולי בשל אינטראקציות מורכבות בין תאים שונים של מקורות ואירועים אונגניים. מודלים של עכברים הם אינסטרומנטלי בהשגת תובנות לתהליכים מורכבים אלה. למרות שדגמים רבים של העכבר פותחו כדי ללמוד תרומות של אירועים אונגניים שונים ותאים של המקור חזה tuמוריגנזה, מודלים אלה הם לעתים קרובות לא תא סוג או איבר ספציפי או לא יכול לגרום לחניכה של הפטמות tuמוריגנזה ב אופן זמני מבוקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור סוג חדש של מודלים העכבר של סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של המין-הביע אדנווירוס (לספירה) לתוך בלוטות החלב של העכבר (MGs). בשל הזרקה ישירה של לספירה לתוך צינורות החלב, גישה זו היא מיוחדת MG, ללא כל האינדוקציה סרטן בלתי רצויות באיברים אחרים. ההליך הזרקת הפנים ניתן לבצע בעכברים בשלבים שונים של פיתוח MG שלהם (ובכך, זה מאפשר שליטה הטמפורלית של האינדוקציה לסרטן, החל מ ~ 3-4 שבועות של גיל). ניתן להשיג את הספציפיות לסוג התא באמצעות היזמים שונים ספציפיים לסוג תא לכונן ביטוי היצור בווקטור אדנונגיפי. אנו מראים כי הלומיאל ותאי האפיתל של הפטמות הבזליים (MECs) יכול להיות ממוקד הדוק עבור מניפולציה הגנטית מבוססי לוטל/loxP באמצעות הזרקה הפנים של Ad-אני מתחת לשליטה של קרטין 8 או קרטין 5 מקדם, בהתאמה. על-ידי שילוב של כתב מותנה כתבת (למשל, בעלי מטרה/inducible Rosa26-YFP ), אנו מראים כי mecs ממוקד על ידי לספירה, ואת התאים הסרטניים נגזר מהם, ניתן לעקוב על ידי ביצוע העיתונאי-חיובי תאים לאחר הזרקה הפנימי.
Introduction
המטרה הכללית של שיטה זו היא לפתח גישה חדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקה הפנים של לספירה לתוך העכבר MG. הגישה הגנטית של שילוב מבוסס-loxP שימש באופן נרחב כדי לדגמן סרטן השד האנושי בעכברים. הדור הראשון של מודלים מבוססי סרטן השד המבוססת על העכבר מופקים על ידי שימוש בעכברים המבטא המגניים תחת השליטה של MEC ספציפיים היזמים (למשל, Mmtv-היצורים עבור הלומיאל mecs וחלק של הבסיס mecs, Wap- היצור ו בעלי הושלתי ומכתשיים לומיאל מכתשי, K14- היצור עבור בסיס וחלק של הלומיאל mecs1,2,3,4,5)6, מיכל סבן , בן שמונה , 9. עם זאת, בעוד שורות אלה היצורים הטרנסגניים לאפשר שליטה מרחבית של ביטוי היצור (כלומר, בקבוצות משנה שונות של mecs), הם אינם מאפשרים שליטה טמפורלית של ביטוי המין ו-מניפולציה גנטי loxp-תיווך. הדור השני של מודלים מבוססי סרטן השד המבוססת על העכבר לנצל inducible היצירה/ביטוי גישות (g., השימוש של היצור-היתוך קולטן אסטרוגן [CreER], אשר יכול רק לגרום ליצור/loxP שילוב מחדש על הממשל של טמוקסיפן), ו כתוצאה מכך, אלה כלים גנטיים היתר בקרות מרחבית ושליטה טמפורלית של הפעלת אירועים אונגניים ב mecs (למשל, K8-creer-ו K5-creerמודלים מבוססי)10,11,12 . בשני הדורות של מודלים העכבר סרטן השד, כמו היזמים משמש לנהוג ביטוי של היצור או CreER (למשל, Krt8, Krt5) עשוי להיות פעיל בתאי האפיתל של איברים אחרים (כלומר, הם תא סוג ספציפי אבל לא האיבר ספציפי) או יש ביטוי דולף סוגי תאים אחרים מאשר תאים אפיתל (למשל, Mmtv, אשר יש דליפה פעילות במח העצם המטבית), גישות אלה עלולה להוביל לפיתוח של סרטן לא רצויות (s) באיברים אחרים (s). אם אלה סרטן בלתי צפוי לגרום שטחיות בעכברים מושפעים, המטרה המקורית של סרטן השד מידול בעכברים האלה עשויים להיות אסורים (למשל, Mmtv-מונחה יצורים האירועים אונגניים עלול להוביל ממאירות המטתית ומוות מוקדם של העכברים , בשל הדביקות של היזם Mmtv בתאי המטפאות)4.
כאן אנו מדווחים על גישת מידול סרטן השד בעכברים המאפשר גם מניפולציה מסוג תא-ו-איבר ספציפי של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקרת. גישה זו מבוססת על הזרקה הפנים של לספירה לתוך העכבר MGs (והוא, ובכך, האיבר ספציפי). ביטוי היצור יכול להיות נשלט באמצעות היזמים שונים מסוג MEC משנה ספציפיים מוטבע וקטור אדנונגיפי (למשל, Krt8 עבור לומיאל Mecs, Krt5 עבור בסיס הבסיס, ובכך להשיג ספציפיים להתאים את התאים). האינדוקציה סרטן ב MGs יכול להיות נשלט באופן זמני על ידי הזרקה של לספירה לתוך עכברים בגילאים שונים, החל מ 3-4 שבועות של גיל (pubertal) לשלב המבוגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של בריגהם וביה לנשים.
1. הדור והאחזקה של עכברים מעורבבים
- להשיג סרטן השד רלוונטי מותנה מותנית הסתרה (g., Trp53tm1Brn [המכונה Trp53L/l], Brca1tm1Aash [Brca1l/l]) או שורות מותנה העכבר טוק-אין (למשל, Gt (רוזה) 26SorTm1 (PIK3CA * H1047R) איגן) ממעבדת ג'קסון (ג'אקס) או מודלים של עכבר NCI של סרטן האדם קונסורציום (MMHCC) מאגר. בנוסף, כדי להקל על הרדיפה של MECs כי לעבור את השילוב של היצור-תיווך מחדש, שורת מותנה הכתב שורה ניתן גם לקבל מ-ג'אקס (למשל, Gt (רוזה) 26SorTM1 (Eyfp) כי [המכונה R26Y]).
- מתרבים Trp53L/l homozygous עם עכברים R26Y homozygous כתבת או עם עכברים homozygous נושאים את אלס העיתונאי R26Y וכל הסתרה נוספת מותנה מותנית או טוק-באלס עבור שונים מודלים העכבר, כדי להשיג heterozygous F1 זכר ונקבה צאצאים.
- Intercross heterozygous F1 עכברים זכר ונקבה כדי להשיג את העכברים הנקבה F2 מורכבים כי הם homozygous עבור כל אלל (כמו עכברים ניסיוני), כמו גם R26Y-only homozygous נקבות (כמו עכברים שליטה). גנוטיפ F2 עכברים מבוסס על התנאים התחל ואופניים PCR המפורטים להלן, על ידי הגדרת שני רגיל 20 μL התגובות PCR (באמצעות Taq 5X הורים מיקס) בשני צינורות PCR שונים, אחד עם R26Y התחל והשני עם Trp53L צבעי יסוד. השתמש בעכברים מבוגרים (בדרך כלל כ-2 – 4 חודשים של גיל) עבור כל הרבייה.
- עבור R26Y, לבצע PCR ב 94 ° c עבור 3 דקות, אז ב 94 ° c עבור 30, 60 ° צ' עבור 30 s, ו72 ° c עבור 1 דקות עבור מחזורים 35, ואחריו 72 ° c עבור 3 דקות, ושמירה על 14 ° c. השתמש בתחל (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT TGT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG TCC TCC ACC; (3) R26YFP: GGA GGA גה ATG גת ATG.
הערה: פס PCR יחיד של 250 bp מצביע על R26Y הומוגוטה, להקה אחת של ה-pcr של 500 bp מציין מסוג פראי (wt), ושני להקות Pcr (R26Y: 250 bp, wt: 500 bp) מצביעים על R26Y הטרוזיציטים (איור 1a).
עבור Trp53L, לבצע PCR ב 94 ° c עבור 3 דקות, אז ב 94 ° c עבור 30 s, 60 ° c עבור 30, ו 72 ° c עבור 1 דקות עבור 35 מחזורים, ואחריו 72 ° c עבור 3 דקות, ושמירה על 14 ° c. השתמש בתחל (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG טה AAC אמנות עכשווית G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA תג מחסום.
הערה: פס pcr יחיד של 370 bp מציין Trp53l/l הומוזיטה, פס pcr יחיד של 288 bp מציין Trp53+/+ WT, ושני להקות pcr (WT: 288 bp, Trp53L: 370 bp) לציין Trp53l /+ הטרוזיגוטה (איור 1b).
- עבור R26Y, לבצע PCR ב 94 ° c עבור 3 דקות, אז ב 94 ° c עבור 30, 60 ° צ' עבור 30 s, ו72 ° c עבור 1 דקות עבור מחזורים 35, ואחריו 72 ° c עבור 3 דקות, ושמירה על 14 ° c. השתמש בתחל (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT TGT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG TCC TCC ACC; (3) R26YFP: GGA GGA גה ATG גת ATG.
2. הכנה לפני הניתוח
- האוטוקלב כל כלי ניתוח 1 יום לפני הניתוח.
- הכינו 0.1% ברומאופנול כחול בתמיסת מלח (PBS) ואחסן אותה ב -4 ° c. לדלל את הספירה שישמשו עבור הזרקת הפנים בינונית DMEM דיום עם 0.01 M CaCl2 ו ברומאופנול כחול ביחס של 1:10 (כלומר, תערובת ההזרקה).
הערה: המודעה בשימוש כאן התקבל מאוניברסיטת איווה ליבה וקטורית ויראלי, עם מניות ויראלי סיכוייו של~ 10 10 – 1011 pfu/mL. - לשים את העכבר הנשי (F2 הדור כמתואר בשלב 1.2, גיל החל 3-4 שבועות של גיל למבוגר) באמצעות תא isofלאנה ולהחיל משחה העין. במהלך ההליך, מורדם את העכבר ברציפות על ידי הבטחת שהוא שואף 1% – 2.5% isofלוריאן בחמצן. בדוק את עומק ההרדמה לפחות כל 15 דקות על ידי ביצוע צביטה בבוהן. בזהירות לפקח על העכבר על כל שינוי בקצב הנשימה, התאמת רמת isofלכאן בהתאם, אם יש צורך.
- הכנס מלוקסיאם כאבים תת-עורי במינון של 5 מ"ג/ק"ג, לפני ההליך הכירורגי.
- לחשוף את האתר כירורגי הפטמה על ידי החלת מספר טיפות של קרם להסרת שיער; להסיר קרם מוגזם ושיער רופף באמצעות מגבות נייר רך.
הערה: בצע שלב זה באזור הנפרד מהמקום שבו יש לבצע את הניתוח. לא מומלץ להתגלח על מנת למנוע נזק לפטמות. השתמש בזהירות כדי להסיר סוכן מסיר כימי באופן מתוזמן. השארת הסוכן במשך זמן רב עלולה לגרום לכוויות כימיות בעור - לחטא את האתר כירורגי עם שפתי-האדם הראשון, ואחריו 70% אלכוהול, ולסיים עם היישום הסופי של שפתי-התחת קרצוף. עשה זאת בתנועה מעגלית ממרכז אזור העבודה לכיוון הפריפריה בעזרת ספוג גזה או כותנה משופעת. חזור על מחזור 3x – 4x.
3. הזרקת פנים
- להשתמש בטכניקות אספטי לאורך ההליך הכירורגי.
- הפוך את אתר החתך על העור באורך של ~ 1 ס מ בין שני המקלעים הרביעית הרביעי (איור 2). הפרד בזהירות את כנף העור (עם ה-MG) מצפק הקודקודית כדי להמחיש את עץ החלב.
- החזיקו בזהירות את הפטמה בעזרת מלקחיים של שען והסירו את הפטמה החיצונית מבלי לחתוך את העור הסמוך, תוך שימוש במספריים לניתוח מיקרו.
- לטעון ~ 3 – 5 μL של הזרקת לספירה הזרקה לתוך 25 μL המילטון מזרק עם המחט מתכת 33 G-hub מודבקת. העריכו את עוצמת תערובת ההזרקה במזרק המבוסס על הצבע הכחול הנכלל בתערובת.
הערה: השתמש באמצעי אחסון קטן יותר (לדוגמה, 3 μL) בעת הזרקת לתוך MGs של 3-4 שבועות נשים זקנות ונפח גדול יותר (למשל, 10 μL) בעת הזרקת לתוך MGs של נקבות מניקות. - בעדינות להחזיק את הקצה של כנף העור עם פינצטה מעוקל דק ולהזריק את תערובת הזרקה של הזמן לאט לתוך הפטמה, בינתיים ניטור התפשטות הצבע הכחול לעץ החלב. שמור על קצב ההזרקה נמוך ככל האפשר כדי למנוע נזק ללוטל לומן.
הערה: נוזל מוזרק (כפי שמודגם על-ידי הצבע הכחול הכלול ברומאופנול) המתפשט בכל עץ הדוטל מבלי לדלוף לתא הסטרומה מעיד על הזרקה מוצלחת. - בעדינות למשוך את המחט מן הפטמה כדי למנוע דליפה של הנוזל המוזרק.
- בחנו את הצד המרוחק (כלומר, הרחק מן הפטמה) של ה-MG או האזור שמסביב לפטמה המוזרקת. שימו לב כי צבע כחול מתנפח (כלומר, צבען מפזר לתוך הסטרומה הסמוכה) מעיד על הזרקת משטח שומן במקום בזריקה מוצלחת.
- סגרו את הפצעים המנתחים (משלב 3.2) בעור עם אטבי פצעים.
4. טיפול פוסט-פעיל
- להסיר את העכבר מן ההרדמה ולמקם אותו על משטח חימום בתוך כלוב נקי להתאוששות.
- תת-עורי מלוקסיב 5 מ"ג/ק"ג שוב, 24 שעות לאחר הניתוח.
- לעקוב אחר התנאים הכלליים של בעל החיים ולחפש סימנים של זיהום באתר החתך במשך 5 ימים.
- קליפי הפצע יוסרו ~ 7-10 ימים לאחר הניתוח.
5. ניטור התפתחות הגידול בחלב
- עקוב אחר העכברים המוזרקים פעמיים בשבוע על ידי מישוש עבור כל סימן של התפתחות הגידול בפטמות.
- לאחר הגידול מוחשי, לפקח על העכבר מדי יום ולמדוד את גודל הגידול עד שהוא מגיע נקודת הקצה ניסיוני, כפי שנקבע על ידי גודל (למשל, להגיע 10% – 15% ממשקל הגוף של העכבר) או מצב (למשל, כיבית או נקרוטיק) של הגידול, או על ידי מצב בריאותי כללי של העכבר (למשל, בתרדמת, מורבנד).
- המתת החסד של העכבר על ידי חנק פחמן דו חמצני, ואחריו שיטה משנית (למשל, פריקה צוואר הרחם).
- לבודד את רקמות הגידול בחלב ולנתח אותם על ידי הזרמת cy, החיסונית, או ביטוי בפרופיל (למשל, על-ידי רצפי RNA [RNAseq] או microarray), כפי שמתואר בעבר12.
- לבצע ניתוח הזרימה cytometric על ידי ביצוע עבור שושלת היוחסין-תאים שליליים (לין-: שלילי עבור סמנים השושלת CD45 [סמן לוקיציט], CD31 [מסמן תא אנדותל], ו TER119 [אריתרופויוקטה סמן]), ולנתח את התאים בגידול בהתבסס על ה ביטוי של YFP, CD24 ו-CD29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מייצג את תוצאות ה-PCR R26Y ו- Trp53L מוצגים באיור 1.
למרות, בעיקרון, כל 10 MGs יכול להיות נתון הליך הזרקת הפנים, כמעט, שני המקלעים הרביעית הרביעי מסומנים בדרך כלל עבור הזרקה, בשל הנגישות הקלה שלהם בגדלים גדולים יותר MG (איור 2). במהלך הניתוח חשוב לשמור על שטח עבודה מחוטא ומסודר ולבצע את ההליך עם כלים סטריליים (איור 3). במהלך הזריקה הפנים, הכללת צבע כחול (למשל, ברומרופנול כחול) בתערובת ההזרקה מסייעת להדמיה של הזרקה מוצלחת של מודעות לספירה לתוך עץ הדוטל כולו (איור 4). העכברים הצעירים ביותר שבהם הזרקת הפנים (עם נפח קטן יותר של תערובת ההזרקה) ניתן לבצע בהצלחה הם אלה ב ~ 3 שבועות של גיל (איור 4A), למרות ברוב הניסויים השראה הגידול בחלב, עכברים נשים צעירות בוגרים (למשל, 2 חודשים של גיל) משמשים בדרך כלל (איור 4B). בנוסף, הזרקת הפנים (עם נפח גדול יותר של תערובת ההזרקה) ניתן לבצע גם בעכברים נקבה במהלך מוקדם/אמצע ההריון כדי למקד את התאים מכתשיים (איור 4C).
בניסיון שלנו, בעכברים עם הכתבת R26Y ו- Trp53l/l (עם או בלי כל האללים התנאים הנוספים), שילוב מחדש של מתווך היצור-תיווך שיבש את הTrp53 התנאי של הסתרה (וכל אחד נוסף כלים הסתרה מותנה, אם בשימוש) ו, בינתיים, מופעל כתבת YFP (מ R26Y alleles, כמו גם מכל מותנה נוספת להקיש-in alleles, אם נעשה שימוש). כדי למקד את האוכלוסיות משנה MEC שונים עבור האינדוקציה גידול הפטמות, וירוסים לספירה באמצעות שליטה של מערכת המשנה של MEC שונים ספציפיים שימשו להזרקה (איור 5). למשל, לספירה באמצעות השליטה של קרטין 8 (Krt8) יזם (ad-K8-היצורים) שימש למקד את הלומיאל mecs. בעבר, אנו דיווחו על השימוש ב-Ad-היצורים תחת השליטה של קרטין 14 (Krt14) יזם (Ad-K14-היצורים) כדי למקד את הבסיס mecs13. עם זאת, כפי שדווחו, הזרקת הפנים של Ad-K14- היצור לא רק ממוקדות הבסיס mecs אלא גם חלק של לומיאל mecs13. לאחרונה בדקנו את המודעה מודעה נוספת תחת השליטה של קראטין 5 (Krt5) יזם (Ad-K5-היצורים)14 ומצא כי זה יכול יותר בחוזקה היעד השושלת הבזליים, המוביל לסימון גנטי של הבסיס האחרון (איור 5). האחוזים הטיפוסיים של YFP-מסומנים MECs מ- ad-K8- היצור או הזרקת ad-K5- היצור הם כ 0.1%-1%.
עבור Trp53L/l; R26Y עכברים הנשי תחת הרקע הגנטי FVB, הזרקת הפנים של Ad-K8-היצור, אשר מטרות האור שלהם mecs, הוביל להתפתחות של גידולים בחלב כמה חודשים לאחר ההזרקה (איור 6a). עכברים עם רקע גנטי שונה (למשל, C57/B6) עשוי להפגין השהיה ארוכה יותר של פיתוח גידולים בפטמות לאחר ההזרקה. בשל הכללת R26Y המותנה כתב, תאים אפיתל הגידול היו בדרך כלל מסומנים על ידי yfp ויכול להיות מזוהה על ידי הזרימה cy, Try (איור 6b); הם יכולים להיות מועשרים על ידי זרימה-מיון של YFP+ תאים לניתוח נוסף.
איור 1: הנציגים של ה-PCR מייצגים את תוצאות הR26Y ו-Trp53L . WT = פראי; . הומו = הומוזיגוטה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמה סכמטית של הזרקת הפנים של וירוס הספירה לתוך מג. (א) חתך האתר בקו האמצע בין שני המקלעים הרביעי. (ב) הזרקת המידוטל של לספירה עם צבע כחול (עבור הדמיה טובה יותר) לתוך אחד המקלעים הרביעי. (ג) סגירת החתך בעור על ידי מחסניות הפצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סקירה של ההתקנה אספטי עבור ניתוח מכרסמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה של הזרקה מוצלחת של עץ דוטל החלב כולו. (א) דוגמה לזריקה הפנים של 3 μl של תערובת הזרקה (עם כחול ברומרופנול) לתוך MG של עכבר נקבה בן 3 שבועות. (ב) הזרקה של 5 μl של תערובת הזרקה לתוך MG של עכבר בוגר נקבה האישה. (ג) הזרקה של 10 μl של תערובת הזרקה לתוך מ ג של העכבר הנשי בשלב מוקדם/אמצע ההיריון. (ד) דוגמא להזרקת שומן בשמן במקום הזרקת-משטח מוצלחת. הזרקת הפנים של 5 μL של תערובת הזרקה לתוך מ ג של עכבר צעיר נקבה למבוגרים. (א) אזור העור המקיף את הפטמה המוזרקת; (ב) הצד השני של מתלה העור המראה את משטח שומן החלב; עיגול צהוב מעיד על פיזור צבע לתוך משטח השומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: חלקות מייצגות של ניתוח ציטומטלי הזרימה של תאים בעלי מסומן YFP על ידי הזרקה. Yfp+ אוכלוסיות מ-MGs של הנקבות הבתולה R26Y 3 ימים לאחר הזרקה הפנים של Ad-K8-היצורים (שמאל, הזרקה על סיכוייו של 7 x 109 pfu/mL) או Ad-K5- היצור (זכות, הזרקה על סיכוייו של 7.86 x 109 pfu/ mL) וירוסים. מגרשים מבוססים על ניתוח של CD24 ו CD29 כתמים בשושלת היוחסין-שלילי (לין-; כלומר, שלילי עבור CD45, CD31, ו TER119 ביטוי) yfp+ תאים. Lu = Lin-CD24גבוהCD29 לומיאלנמוך שער MEC; Ba = Lin-CD24נמוךCD29גבוהה בסיס שער; אסטרטגיית העליה של הלומיאל והבסיס מבוססת על שקלטון ואח '15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: התפתחות הגידול ב Trp53L/l; R26Y עכברים נשיים. מוזרקים באמצעות Ad-K8- מן (A) אחד העכבר הנציג מראה צמיחת הגידול (חיצים) כמה חודשים לאחר הזרקה עם Ad-K8-היצורים. (ב) כ-8.8% מהתאים החיים (המבוססים על כתמים של dapi) מגידול מייצג, היו חיוביים לביטוי yfp, בהתבסס על ניתוח ציטומטלי זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההצלחה של גישה זו לגרימת גידולים בפטמות מקבוצות משנה שונות של MECs מסתמך לא רק על בחירת מתאים מסוג התא המתאים היזמים (כדי לנהוג ביטוי היצור) אבל גם על הליך הזרקת הפנים עצמו. הרעיון מאחורי הגישה הזאת הוא כי וירוסים מוזרק לאחר הספירה נשמרים עץ ductal, שהוא מבנה מוסתר עם לומן, ולכן, רק MECs חשופים לווירוסים והם נגועים על ידי לספירה. בשל החלל לומן מוגבלת בתוך צינורות הפטמות, חשוב רק להזריק נפח קטן של תערובת ההזרקה לכל MG (כלומר, ~ 3-5 μL). יש לכוונן את אמצעי האחסון המוזרק בהתאם לגיל העכברים (כלומר, אמצעי אחסון קטן יותר כאשר הוא מוזרק לעכברים בני 3 עד 4 שבועות). כאשר הנפח של הנוזל המוזרק הוא מוגזם בשל הלחץ מן הזריקה ואת המרחב מוגבלת ductal לומן, נוזל יכול להיות "דחף החוצה" דרך שכבות אפיתל לתוך משתית, המוביל זיהום נגיפי רצוי בתאי סטרומה.
מאחר שהייחודיות של סוג התא מושגת על ידי היזם המשמש בווקטור אדנונגיפי לכונן ביטוי של היצור, מגבלה של גישה זו היא חוסר הפוטנציאל של היזם המתאים כדי למקד את ביטוי היצור לאוכלוסיית משנה מסוימת של MEC. בעבר דיווחו על השימוש פאן-לומיאל Ad-K8- וירוס היצור כדי למקד את הלומיאל mecs12,13 ואת השימוש בווירוס Ad-Wap- וירוס למטרה מכתשי לומיאל ושלתי5. במחקר זה, הראנו את השימוש בווירוס Ad-K5- וירוס כדי למקד את הבסיס mecs (איור 5). עדיין חסר לנו את היכולת להשתמש בגישה זו כדי למקד את קולטן אסטרוגן-חיובי הלומיאל משנה האוכלוסייה. הווקטור אדנונגיפי שבו השתמשנו כאן יכול להכיל הכנסה של עד 8 kb. לפיכך, כדי לפתח משתמש ספציפי מערכת משנה ספציפיים, היזם המשמש לכונן ביטוי היצור יכול להיות רק פחות מ 7 kb. למעשה, קטע יזם גדול, גם אם פחות מ -7 kb בגודל, עשוי להיות קשה subclone. על מנת להתאים את הווקטור אדנונגיפי, למרות מיזם נחתך עשוי לשמש, זה לא יכול בנאמנות להפוך את תבנית הביטוי של הגן המתאים שלה כאשר תחת השליטה של אנדוגניים, מלא מקדם.
הכתב המותנה R26Y כלול במודל העכבר כאן סיפק דרך לסמן את התאים של המקור ולעקוב אחר ההתקדמות שלהם לתאי הסרטן. של הערה, אחוז מתאי סרטן מסומנים YFP בגידול שהתקבל נראה נמוך למדי (איור 6B). זה יכול להיות בגלל האפשרות כי, בנוסף על YFP מסומנים בתאי האפיתל הגידול, הגידול כללה גם תאים חיסוניים רבים תאים סטרומה, אשר היוו את הכמות של מסת הגידול.
לעומת מודלים של עכבר אחרים של סרטן השד, גישה זו מובילה לטקס הגידול בפטמות ממספר קטן של MECs בלבד (למשל, מנורות MECs כאשר Ad-K8-היצורים מוזרק), לעתים קרובות ברמה שבטיים12. ככל שהחניכה של המין האנושי עשויה להיות שבטיים, גישה זו מקבלת את ההיבט הזה של התפתחות הסרטן האנושי בנאמנות. בנוסף, גם כאשר p53 מופרת רק מספר קטן של MECs, אובדן של p53 מוביל הרחבת המשובטים שלהם, המובילה לייצור של בריכה גדולה יותר של מוטציה; זה היה לאפשר האבולוציה שבטים נוספים מן p53 לקוי (על רכישת מוטציות סומטיים נוספות)12. כמו TP53 הוא הגן הנפוץ ביותר בסרטן השד האנושי16 וכמו מוטציה TP53 הוא אירוע מוקדם בתור השד האנושי tuמוריגנזה17,18, על-ידי שילוב מודל העכבר Trp53 מ, עם העכבר מודלים עבור אירועים אחרים אונגניים, אנו יכולים ללמוד כיצד אלה האירועים אונגניים לשתף פעולה עם אובדן p53 וכיצד הם תורמים במשותף להתפתחות גידול בפטמות ממקור סלולרי מוגדר. בנוסף, כמו פחות הרבייה יש צורך לשים כלים מרובים יחד, גישה זו למזער את עלות הרבייה ואת הזמן, אשר צריך להקל על הדוגמנות סרטן השד לימודי בקנה מידה גדול יותר, בתקופה קצרה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) גרנט R01 CA222560 ועל ידי המחלקה להגנה פריצת דרך פרס W81XWH-18-1-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
