Summary
O objetivo deste protocolo é descrever uma nova abordagem de modelagem de câncer de mama baseada na injeção intraductal de adenovírus expressando CRE em glândulas mamárias de camundongo. Esta aproximação permite a manipulação Cell-Type-e órgão-específica de eventos oncogênico em uma maneira temporally controlada.
Abstract
O câncer de mama é uma doença heterogênea, possivelmente devido a interações complexas entre diferentes células de origem e eventos oncogênicos. Os modelos de mouse são fundamentais para obter insights sobre esses processos complexos. Embora muitos modelos do rato sejam desenvolvidos para estudar contribuições de vários eventos e pilhas oncogênico da origem à tumorigenese do peito, estes modelos são frequentemente não Cell-Type ou órgão específico ou não podem induzir o início do tumorigênese mamária em um forma temporalmente controlada. Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar um novo tipo de modelos do rato do cancro da mama baseados na injeção intraductal do adenovírus CRE-expressando (AD-CRE) em glândulas mamária do rato (MGS). Devido à injeção direta de AD-CRE em dutos mamários, esta abordagem é específica de MG, sem qualquer indução de câncer indesejada em outros órgãos. O procedimento intraductal da injeção pode ser executado nos ratos em estágios diferentes de seu desenvolvimento do magnésio (assim, permite o controle temporal da indução do cancro, partindo de ~ 3-4 semanas da idade). A especificidade do tipo celular pode ser alcançada usando diferentes promotores específicos do tipo célula para impulsionar a expressão de CRE no vetor adenoviral. Nós mostramos que as pilhas epithelial mamária Luminal e basais (MECS) podem fortemente ser alvejadas para a manipulação genética CRE/loxp-baseada através de uma injeção intraductal de AD-CRE o controle do promotor da queratina 8 ou da queratina 5, respectivamente. Incorporando um repórter condicional de CRE (por exemplo, repórter de CRE/loxP-inducible Rosa26-YFP ), nós mostramos que os MECS alvejados por AD-CRE, e as pilhas do tumor derivou deles, podem ser traçados seguindo as pilhas repórter-positivas após a injeção intraductal.
Introduction
O objetivo geral deste método é desenvolver uma nova abordagem de modelagem de câncer de mama com base em uma injeção intraductal de AD-CRE no rato MG. A abordagem genética baseada em recombinação CRE/loxP tem sido amplamente utilizada para modelar o câncer de mama humano em camundongos. A primeira geração de modelos de ratos de câncer de mama baseados em CRE/loxP é gerada usando camundongos transgênicos que expressam CRE o controle de promotores específicos do MEC (por exemplo, MMTV-CRE para MECS luminais e uma porção de MECS basal, WAP-CRE e Blg-CRE para progenitores Luminal e MECs Luminal alveolares, K14-CRE para a parte basal e uma parcela de MECS Luminal1,2,3,4,5)6, 7 anos de , 8 . º , 9. Entretanto, quando estas linhas do CRE transgênicas permitirem o controle espacial da expressão de CRE (isto é, em subconjuntos diferentes dos MECS), não permitem o controle temporal da expressão de CRE e da manipulação genética de CRE/loxp-negociada. A segunda geração de modelos de mouse de câncer de mama baseados em CRE/loxp utilizam abordagens induzível de atividade/expressão CRE (por exemplo, uso de fusão do receptor de CRE-estrogênio [creer], que só pode induzir recombinação CRE/loxp após a administração de tamoxifeno), e Como resultado, essas ferramentas genéticas permitem o controle espacial e temporal da ativação de eventos oncogênicos em MECS (por exemplo, modelosbaseados em K8-creer-e K5-creer)10,11,12 . Em ambas as gerações de modelos de rato de cancro da mama, como promotores utilizados para conduzir CRE ou CreER expressão (por exemplo, Krt8, Krt5) também pode ser ativo em células epiteliais de outros órgãos (ou seja, eles são específicos do tipo de célula, mas não órgão específico) ou têm uma expressão gotejante em tipos de células que não as epiteliais (por exemplo, MMTV, que tem atividade de vazamento em células hematopoiéticas da medula óssea), essas abordagens podem levar ao desenvolvimento de câncer indesejado (s) em outros órgãos (s). Se esses cânceres inesperados causarem letalidade nos camundongos afetados, a finalidade original de modelar o câncer de mama nesses camundongos pode ser proibida (por exemplo, eventos oncogênicos conduzidos por MMTV-CREpodem levar a malignidades hematopoiéticas e morte precoce dos camundongos , devido à fuga do promotor MMTV em células hematopoiéticas)4.
Aqui nós relatamos uma aproximação de modelagem do cancro da mama nos ratos que permite a manipulação Cell-Type-e órgão-específica de eventos oncogênico em uma maneira temporally controlada. Esta aproximação é baseada em uma injeção intraductal de AD-CRE em MGs do rato (e é, assim, órgão-específico). A expressão CRE pode ser controlada usando diferentes promotores específicos da subpopulação do MEC incorporados no vetor adenoviral (por exemplo, Krt8 para MECS LUMINAIS, Krt5 para MECS basais, conseguindo assim a especificidade do tipo celular). A indução do cancro em MGs pode ser controlada temporally por uma injeção de AD-CRE em ratos em idades diferentes, partindo de 3-4 semanas da idade (pubertal) ao estágio adulto.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) do Brigham and Women ' s hospital.
1. geração e manutenção de camundongos floxed
- Obtenha nocaute condicional com o câncer de mama relevante (por exemplo, Trp53tm1Brn [referido como Trp53l/l], Brca1tm1Aash [Brca1l/l]) ou linhas de mouse condicionais de Knock-in (por exemplo, Gt (rosa) 26SorTM1 (PIK3CA * H1047R) Egan) do repositório do laboratório de Jackson (JAX) ou do NCI mouse modelos de consórcio de câncer humano (MMHCC). Além disso, para facilitar a perseguição de MECs que passam por recombinação mediada por CRE, uma linha CRE-repórter condicional também pode ser obtida do JAX (por exemplo, gt (rosa) 26SorTM1 (eyfp) cos [referido como R26Y]).
- Produza camundongos homozygous de Trp53L/l com R26Y camundongos homzygous do repórter ou com os ratos homozygous que carreg os alelos do repórter R26Y e todo o nocaute condicional floxed adicional ou Knock-in alelos para diferente modelos do rato, para obter o macho e fêmea heterozygous de F1 progeny.
- Camundongos machos e fêmeas heterozygous de intercross F1 para obter os ratos fêmeas compostos F2 que são homozygous para cada alelo (como ratos experimentais), as well as fêmeas homozygous de R26Y-only (como ratos do controle). Camundongos F2 de genótipo com base nos primers de PCR e nas condições de ciclismo listados abaixo, configurando duas reações de PCR padrão de 20 μL (usando Taq 5X Master Mix) em dois tubos de PCR diferentes, um com os primers R26Y e outro com o Trp53L primers. Use camundongos adultos (tipicamente em torno de 2 – 4 meses de idade) para todos os reprodutores.
- Para R26Y, realize o PCR em 94 ° c por 3 minutos, a seguir em 94 ° c para 30 s, 60 ° c para 30 s, e 72 ° c por 1 minuto para 35 ciclos, seguidos por 72 ° c por 3 minutos, e manutenção em 14 ° c. Use primers (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
Nota: uma única faixa do PCR de 250 BP indica um homozygote R26Y , uma única faixa do pcr de 500 BP indica um selvagem-tipo (WT), e duas faixas do PCR (R26Y: 250 bp, peso: 500 BP) indicam um Heterozygote R26Y (Figura 1a).
Para Trp53L, execute o PCR em 94 ° c por 3 minutos, então em 94 ° c para 30 s, 60 ° c para 30 s, e 72 ° c para 1 minuto para 35 ciclos, seguidos por 72 ° c por 3 minutos, e manutenção em 14 ° c. Use primers (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (II) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA mordaça AC.
Nota: uma única faixa do PCR de 370 BP indica um homozygote de Trp53l/l , uma única faixa do PCR de 288 BP indica um Trp53+/+ WT, e duas faixas do PCR (WT: 288 BP, Trp53l: 370 BP) indicam um Trp53l /+ heterozigoto (Figura 1b).
- Para R26Y, realize o PCR em 94 ° c por 3 minutos, a seguir em 94 ° c para 30 s, 60 ° c para 30 s, e 72 ° c por 1 minuto para 35 ciclos, seguidos por 72 ° c por 3 minutos, e manutenção em 14 ° c. Use primers (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
2. preparação pré-operatória
- Autoclave todas as ferramentas cirúrgicas 1 dia antes da cirurgia.
- Prepare 0,1% de azul de bromofenol em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e guarde-o a 4 ° c. Diluir o AD-cre que será usado para a injeção intraductal em meio DMEM com 0, 1 M CaCl2 e azul de bromofenol em uma proporção de 1:10 (ou seja, a mistura de injeção).
Nota: o AD-CRE utilizado aqui foi obtido a partir da Universidade de Iowa viral vector Core, com um título viral de ações de ~ 1010– 1011 pfu/ml. - Anestesie o rato fêmea (geração F2 como descrito na etapa 1,2, idade variando de 3 – 4 semanas de idade para adulto) usando uma câmara de isoflurano e aplique pomada ocular. Durante o procedimento, Anestesie o rato continuamente assegurando-o inala 1%-isoflurano de 2.5% no oxigênio. Verifique a profundidade da anestesia pelo menos a cada 15 min, realizando uma pitada de dedo do pé. Monitore com cuidado o rato para toda a mudança na taxa respiratória, ajustando o nível do isoflurano conformemente, se necessário.
- Injetar Meloxicam como analgesia por via subcutânea na dose de 5 mg/kg, antes do procedimento cirúrgico.
- Expor o sítio cirúrgico do mamilo aplicando várias gotas de creme de depilação; Remova o creme excessivo e o cabelo frouxo usando toalhas de papel macias.
Nota: execute esta etapa em uma área separada de onde a cirurgia deve ser executada. Barbear não é recomendado a fim de evitar danos aos mamilos. Use o cuidado para remover o agente depilatório químico em uma forma oportuna. Deixar o agente por muito tempo pode resultar em queimadura química para a pele - Desinfete o local cirúrgico com Iodóforos primeiramente, seguido pelo álcool de 70%, e termine com uma aplicação final de esfregue Iodóforos. Faça isso em um movimento circular do centro da área de trabalho em direção à periferia usando uma esponja de gaze ou aplicador com ponta de algodão. Repita o ciclo 3x – 4x.
3. injeção intraductal
- Use técnicas assépticas durante todo o procedimento cirúrgico.
- Faça um local de incisão sobre a pele a um comprimento de ~ 1 cm entre os dois quarto MGs inguinal (Figura 2). Separe cuidadosamente a aleta da pele (com o magnésio) do peritônio parietal para visualizar a árvore ductal mamária.
- Segure com cuidado o bocal com o fórceps do relojoeiro e remova o bocal exterior sem cortar nenhuma pele próxima, usando uma tesoura da microdissecção.
- Carga ~ 3 – 5 μL de mistura de injeção de AD-CRE numa seringa Hamilton de 25 μL com uma agulha de 33 G de cubo metálico afixada. Estimar o volume da mistura de injeção na seringa com base no corante azul incluído na mistura.
Nota: Use um volume menor (por exemplo, 3 μL) ao injetar em MGs de fêmeas de 3 – 4 semanas de idade e um volume maior (por exemplo, 10 μL) ao injetar em MGs de fêmeas lactantes. - Segure delicadamente a borda da aleta da pele com um pinça curvado fino e injete a mistura da injeção de AD-CRE lentamente no bocal, entrementes monitorando a propagação do corante azul na árvore ductal mamária. Manter a taxa de injeção tão baixa quanto possível para evitar danos ao lúmen ductal.
Nota: o líquido injetado (como ilustrado pela tintura azul de bromofenol incluída) que espalha durante todo a árvore ductal inteira sem escape no compartimento stromal indica uma injeção intraductal bem sucedida. - Retire suavemente a agulha do bocal para evitar qualquer vazamento do fluido injetado.
- Examine o lado distal (ou seja, longe do mamilo) do MG ou da área circundante do bocal injetado. Note que o inchaço da tintura azul (ou seja, a difusão da tintura para o estroma nas proximidades) indica uma injeção mamária de gordura pad em vez de uma injeção intraductal bem sucedida.
- Feche as feridas cirúrgicas (da etapa 3,2) na pele com grampos da ferida.
4. cuidados pós-operatórios
- Retire o mouse da anestesia e colocá-lo em uma almofada de aquecimento dentro de uma gaiola limpa para a recuperação.
- Administrar Meloxicam por via subcutânea em 5 mgs/quilograma outra vez, 24 h após a cirurgia.
- Monitore as condições gerais do animal e procure sinais de infecção no local da incisão por 5 dias.
- Os grampos da ferida são removidos ~ 7-10 dias após a cirurgia.
5. acompanhamento do desenvolvimento do tumor mamário
- Monitore os camundongos injetados duas vezes por semana por palpação para qualquer sinal de desenvolvimento do tumor mamário.
- Uma vez que o tumor é palpável, monitore o rato diariamente e meça o tamanho do tumor até que alcangue o valor-limite experimental, como determinado pelo tamanho (por exemplo, alcangando 10%-15% do peso de corpo do rato) ou a circunstância (por exemplo, ulcerada ou Necrotic) do tumor, ou pelo estado geral de saúde do rato (por exemplo, Comatose, moribundo).
- Eutanizar o rato por dióxido de carbono asfixia, seguido por um método secundário (por exemplo, luxação cervical).
- Isolar os tecidos do tumor mamário e analisá-los por citometria de fluxo, imunofluorescência ou perfil de expressão (por exemplo, por sequenciamento de RNA [RNAseq] ou microarray), como descrito anteriormente12.
- Realizar análise citométrica de fluxo por gating para células linhagem-negativas (Lin-: negativo para marcadores de linhagem CD45 [marcador de leucócitos], CD31 [marcador de células endoteliais] e TER119 [marcador de eritrócitos]), e analisar as células do tumor com base em sua expressão de YFP, CD24 e CD29.
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Representative Results
Os resultados de genotipagem do PCR representativo para os alelos R26Y e Trp53L são mostrados na Figura 1.
Embora, em princípio, todos os 10 MGs podem ser submetidos ao procedimento de injeção intraductal, praticamente, os dois quarto MGs inguinal são tipicamente selecionados para injeção, devido à sua acessibilidade mais fácil e maiores tamanhos de MG (Figura 2). Durante a cirurgia, é importante manter uma área de trabalho desinfectada e organizada e realizar o procedimento com ferramentas estéreis (Figura 3). Durante a injeção intraductal, a inclusão de corante azul (por exemplo, azul de bromofenol) na mistura de injeção auxilia na visualização de uma injeção bem-sucedida de AD-CRE em toda a árvore ductal (Figura 4). Os ratos fêmeas os mais novos em que a injeção intraductal (com um volume menor da mistura da injeção) podem ser executados com sucesso são aqueles em ~ 3 semanas da idade (figura 4a), embora para a maioria de experimentos mamária da indução do tumor, ratos fêmeas adultos novos (por exemplo, 2 meses de idade) são normalmente utilizados (Figura 4B). Além disso, a injeção intraductal (com um volume maior de mistura de injeção) também pode ser realizada em camundongos fêmeas durante o início/meados da gestação para segmentar células alveolares (Figura 4C).
Em nossa experiência, em camundongos com o R26Y Reporter e Trp53l/l (com ou sem alelos condicionais adicionais), a recombinação mediada por CRE interromlitou os alelos de nocaute condicional Trp53 (e qualquer alelos de nocaute condicional, se usado) e, entretanto, ligado o repórter YFP (do alelo R26Y , bem como de qualquer adicional condicional Knock-in alelo, se usado). Para direcionar diferentes subpopulações de MEC para a indução do tumor mamário, os vírus ad-CRE o controle de diferentes promotores específicos de subgrupos do MEC foram utilizados para injeção (Figura 5). Por exemplo, AD-CRE o controle de queratina 8 (Krt8) promotor (ad-K8-CRE) foi usado para direcionar os MECS luminal. Previamente, nós relatamos o uso de AD-CRE o controle do promotor da queratina 14 (Krt14) (ad-K14-CRE) para alvejar os MECS básicos13. Entretanto, como nós relatado, a injeção intraductal de ad-K14-CRE não somente alvejou MECS básicos mas igualmente uma parcela de MECS Luminal13. Recentemente, testamos outro ad-CRE o controle do promotor queratina 5 (Krt5) (ad-K5-CRE)14 e descobrimos que ele pode direcionar mais firmemente a linhagem basal, levando à marcação genética de apenas MECS basais (Figura 5). As porcentagens típicas de MECs marcados com YFP da injeção ad-K8-CRE ou ad-K5-CRE são cerca de 0,1%-1%.
Para Trp53L/l; R26Y camundongos fêmeas o fundo genético FVB, a injeção intraductal de ad-K8-CRE, que tem como alvo seus MECS LUMINAIS, levaram ao desenvolvimento de tumores mamários vários meses após a injeção (Figura 6a). Camundongos com um fundo genético diferente (por exemplo, C57/B6) podem apresentar uma latência mais longa de desenvolver tumores mamários após a injeção. Devido à inclusão do repórter condicional R26Y , as células epiteliais tumorais foram tipicamente marcadas pelo YFP e podem ser detectadas por citometria de fluxo (Figura 6B); Eles poderiam ser enriquecidos pela triagem de fluxo de células YFP+ para análise posterior.
Figura 1: resultados de genotipagem de PCR representativos para os alelos R26Y e Trp53L . WT = Wild-tipo; Homo = homozigoto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: diagrama esquemático da injeção intraductal do vírus ad-CRE em um mg. (A) local da incisão na linha média entre os dois quarto MGS. (B) injeção intraductal de AD-CRE com corante azul (para melhor visualização) em um dos quarto MGS. (C) fechamento da incisão na pele por clipes de ferida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: visão geral da instalação asséptica para cirurgia de roedores. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: visualização de uma injeção intraductal bem-sucedida em toda a árvore ductal mamária. (A) um exemplo da injeção intraductal de 3 μL de mistura de injeção (com azul de bromofenol) em um mg de um rato fêmea de 3 semanas de idade. (B) injeção intraductal de 5 μL de mistura de injeção em mg de um rato fêmea adulto jovem. (C) injeção intraductal de 10 μL de mistura de injeção em mg de um rato fêmea no início/meados da gestação. (D) um exemplo de uma injeção gorda mamária da almofada um pouco do que uma injeção intraductal bem sucedida. Injeção de intraductal de 5 μL da mistura da injeção em um magnésio de um rato fêmea adulto novo. (a) a área da pele em torno do bocal injetado; (b) o outro lado da aleta da pele que mostra a almofada gorda mamária; o círculo amarelo indica o corante difuso na almofada gorda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: parcelas representativas da análise citométrica do fluxo de células marcadas com YFP após injeção intraductal. YFP+ populações de MGS de R26Y virgens fêmeas 3 dias após uma injeção intraductal de ad-K8-CRE (esquerda, injeção em um titer de 7 x 109 pfu/ml) ou ad-K5-Cre (direito, injeção em um título de 7,86 x 109 Pfu/ mL) vírus. As parcelas são baseadas em uma análise de CD24 e de CD29 que mancham na linhagem-negativa (Lin-; isto é, negativo para CD45, CD31, e expressão TER119) YFP+ Cells. Lu = Lin-CD24HighCD29Low Luminal MEC Gate; BA = Lin-CD24baixaCD29alta basal MEC portão; a estratégia de gating para os MECs Luminal e basal é baseada em Shackleton et al.15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: desenvolvimento tumoral em Trp53L/l; R26Y ratos fêmeas injetados intraductalmente com ad-K8-CRE. (A) um rato representativo que mostra o crescimento do tumor (setas) diversos meses após uma injeção com ad-K8-CRE. (B) cerca de 8,8% das células ao vivo (com base na coloração por DAPI) de um tumor representativo foram positivas para a expressão de YFP, com base na análise citométrica de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O sucesso desta aproximação para induzir tumores mamária das subpopulações diferentes dos MECS confia não somente em escolher o Cell-Type-específico apropriado promotores (para conduzir a expressão de CRE) mas igualmente no procedimento intraductal da injeção próprio. A idéia por trás dessa abordagem é que os vírus ad-CRE injetados são retidos na árvore ductal, que é uma estrutura oculta com lúmen, e, portanto, apenas os MECs estão expostos aos vírus e estão infectados pelo AD-CRE. Devido ao espaço limitado do lúmen dentro dos dutos mamária, é importante injetar somente um volume pequeno da mistura da injeção a cada magnésio (isto é, ~ 3-5 μL). O volume injetado também deve ser ajustado com base na idade dos camundongos (ou seja, um volume menor deve ser usado quando é injetado em camundongos de 3 a 4 semanas de idade). Quando o volume do fluido injetado é excessivo devido à pressão da injeção e do espaço limitado do lúmen ductal, o fluido pode ser "empurrado" através das camadas epiteliais no estroma, levando a uma infecção viral indesejada em células estromais.
Uma vez que a especificidade do tipo celular é alcançada pelo promotor utilizado no vetor adenoviral para impulsionar a expressão CRE, uma limitação dessa abordagem é a potencial falta de um promotor adequado para direcionar a expressão CRE para uma subpopulação específica do MEC. Nós relatamos previamente o uso do vírus Pan-Luminal de ad-K8-CRE para alvejar os MECS Luminal12,13 e o uso do vírus de ad-WAP-CRE aos progenitores luminais alveolares do alvo5. Neste estudo, mostramos o uso do vírus ad-K5-CRE para direcionar os MECS basais (Figura 5). Nós ainda faltam a habilidade de usar esta aproximação para alvejar o subpopulation Luminal do MEC do receptor-positivo do estrogen. O vetor adenoviral que usamos aqui pode acomodar uma pastilha de até 8 KB. Assim, para desenvolver o MEC-subconjunto-específico ad-CRE, o promotor usado para conduzir a expressão CRE só poderia ser inferior a 7 KB. Praticamente, um grande fragmento de promotor, mesmo que menos de 7 KB de tamanho, pode ser difícil de subclone. A fim caber no vetor adenoviral, embora um promotor truncado possa ser usado, pode não recapitular fielmente o teste padrão da expressão de seu gene correspondente quando o controle do promotor endógeno, cheio.
O repórter condicional R26Y incluído no modelo do mouse aqui forneceu uma maneira de marcar as células de origem e rastrear sua progressão para células cancerosas. De notar, a percentagem de células cancerosas marcadas pelo YFP no tumor resultante pareceu ser razoavelmente baixa (Figura 6B). Isto poderia ser devido a uma possibilidade que, além do que as pilhas epithelial tumor-marcadas YFP, o tumor igualmente incluíram muitas pilhas imunes e pilhas stromal, que constituíram o volume da massa do tumor.
Comparado a outros modelos do rato do cancro da mama, esta aproximação conduz à iniciação mamária do tumor de um número pequeno de MECS somente (por exemplo, MECS Luminal quando ad-K8-CRE é injetado), frequentemente em um nível clonal12. Como a iniciação do tumorigênese humano é provável ser clonal, esta aproximação recapitula esse aspecto do desenvolvimento humano do cancro mais fielmente. Além disso, mesmo quando a p53 é interrompida em apenas um pequeno número de MECs, a perda de p53 leva à sua expansão clonal, levando à produção de uma maior piscina de MECs mutados; Isto permitiria uma evolução clonal mais adicional dos MECs p53-deficientes (em cima da aquisição de mutações somáticas adicionais)12. Como TP53 é o gene o mais geralmente mutado no cancro da mama humano16 e como a mutação TP53 é um evento adiantado no tumorigênese humano do peito17,18, combinando o modelo Trp53 floxed do rato com rato modelos para outros eventos oncogênico, nós podemos estudar como estes eventos oncogênico cooperam com perda p53 e como contribuem conjuntamente ao desenvolvimento mamária do tumor de uma origem celular definida. Além disso, como menos reprodução é necessária para colocar vários alelos juntos, essa abordagem minimizaria o custo e o tempo de reprodução, o que deve facilitar os estudos de modelagem de câncer de mama em uma escala maior, em um período mais curto.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) conceder R01 CA222560 e pelo departamento de defesa Breakthrough Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L |
References
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