Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Modellering bröst cancer via en intraductal injektion av CRE-uttrycker adenovirus i musen bröstkörteln

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59502

Summary

Målet med detta protokoll är att beskriva en ny modell för bröstcancer modellering baserad på den intraduktalt injektion av CRE-uttrycker adenovirus i mus mjölkkörtlar. Detta tillvägagångssätt tillåter både cell-typ-och organspecifik manipulation av onkogena händelser på ett tidsmässigt kontrollerat sätt.

Abstract

Bröstcancer är en heterogen sjukdom, möjligen på grund av komplexa interaktioner mellan olika celler av ursprung och onkogena händelser. Musmodeller bidrar till att få insikter i dessa komplexa processer. Även om många musmodeller har utvecklats för att studera bidrag från olika onkogena händelser och celler av ursprung till bröst tumorigenes, dessa modeller är ofta inte cell-typ eller organspecifika eller kan inte inducera initiering av bröst tumorigenes i en på ett tidsmässigt kontrollerat sätt. Här beskriver vi ett protokoll för att generera en ny typ av bröstcancer musmodeller baserade på den intraduktalt injektion av CRE-uttrycker adenovirus (AD-CRE) i mus bröstkörtlar (MGS). På grund av direkt injektion av AD-CRE i bröst kanaler, detta tillvägagångssätt är MG specifik, utan någon oönskad cancerinduktion i andra organ. Den intraduktalt injektion förfarande kan utföras i möss i olika stadier av deras mg utveckling (alltså, det tillåter temporala kontroll av cancerinduktion, från ~ 3-4 veckors ålder). Den cell-typ specificitet kan uppnås genom att använda olika cell-typ-specifika initiativtagare att köra CRE uttryck i adenovirala vektor. Vi visar att luminala och basal bröst epitelceller (mecs) kan vara tätt riktade för CRE/loxP-baserad genetisk manipulation via en intraduktalt injektion av AD-CRE under kontroll av keratin 8 eller keratin 5 promotor, respektive. Genom att införliva en villkorlig CRE reporter (t. ex., CRE/loxP-inducible Rosa26-yfp reporter), visar vi att mecs riktade av AD-CRE, och tumörceller som härrör från dem, kan spåras genom att följa reportern-positiva celler efter intraduktalt injektion.

Introduction

Det övergripande målet med denna metod är att utveckla en ny modell för bröstcancer modellering baserat på en intraduktalt injektion av AD-CRE i mus mg. Den CRE/loxP recombination-baserade genetiska metoden har använts i stor utsträckning för att modellera Human bröstcancer hos möss. Den första generationen av CRE/loxP-baserade bröstcancer musmodeller genereras med hjälp av CRE-uttrycker transgena möss under kontroll av MEC-specifika initiativtagare (t. ex. Mmtv-CRE för luminala mecs och en del av basala mecs, WAP-CRE och BLG-CRE för luminala progenitorer och alveolära luminala mecs, k14-CRE för basal och en portion av luminala mecs1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. medan dessa CRE-transgena linjer möjliggör rumslig kontroll av CRE-uttryck (dvs. i olika delmängder av mecs) tillåter de dock inte temporala kontroller av CRE-uttryck och CRE/loxP-medierad genetisk manipulation. Den andra generationen av CRE/loxP-baserade bröstcancer musmodeller använder inducerbara CRE aktivitet/uttryck metoder (t. ex. användning av CRE-östrogen receptor fusion [CreER], som endast kan inducera CRE/loxP rekombination vid administrering av tamoxifen), och som ett resultat, dessa genetiska verktyg tillåter både rumsliga och temporala kontroller av aktiveringen av onkogena händelser i mecs (t. ex., K8-creer-och K5-creer-baserade modeller)10,11,12 . I båda generationerna av bröstcancer musmodeller, som initiativtagare används för att driva CRE eller CreER uttryck (t. ex., Krt8, Krt5) kan också vara aktiv i epitelceller i andra organ (dvs., de är cell-typ-specifika men inte organspecifika) eller har en läckande uttryck i andra celltyper än epitelceller (t. ex., Mmtv, som har läckande aktivitet i benmärgs hematopoietiska celler), dessa metoder kan leda till utveckling av oönskade cancer (s) i andra organ (s). Om dessa oväntade cancerformer orsakar dödlighet hos de drabbade mössen, kan det ursprungliga syftet att modellera bröstcancer hos dessa möss vara förbjudet (t. ex. kan Mmtv-CRE-drivna onkogena händelser leda till hematopoietiska maligniteter och tidig död hos möss , på grund av läckage av Mmtv promotorn i hematopoietiska celler)4.

Här rapporterar vi en modell bröstcancer modellering i möss som tillåter både cell-typ-och organspecifik manipulation av onkogena händelser i ett temporally kontrollerat sätt. Detta tillvägagångssätt är baserat på en intraduktalt injektion av AD-CRE i mus MGS (och är, sålunda, organspecifika). CRE-uttrycket kan kontrolleras med hjälp av olika MEC-specifika projektansvariga som är inbäddade i adenovirala vektor (t. ex. Krt8 för luminala-mecs, Krt5 för basala mecs, vilket uppnår cell typs specificitet). Cancer induktion i MGs kan vara temporally kontrolleras av en injektion av AD-CRE i möss i olika åldrar, med början från 3-4 veckors ålder (pubertal) till vuxen stadiet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Brigham och Women ' s Hospital.

1. generering och underhåll av floxed möss

  1. Få bröstcancer relevant floxed villkorlig knockout (t. ex. Trp53tm1Brn [kallad Trp53l/l], Brca1tm1Aash [Brca1L/l]) eller villkorliga Knock-in-muslinjer (t. ex. Gt (rosa) 26SorTM1 (PIK3CA * H1047R) Egan) från Jackson Laboratory (JAX) eller NCI Mouse modeller av Human cancer Consortium (MMHCC) förråd. Dessutom, för att underlätta jagar av MECs som genomgår CRE-medierad rekombination, en villkorlig CRE-reporter linje kan också erhållas från JAX (t. ex., gt (rosa) 26SorTM1 (eyfp) cos [kallad R26Y]).
  2. Ras Trp53L/l homozygot möss med R26Y homozygot reporter möss eller med homozygot möss som transporterar R26Y reportern alleler och eventuella ytterligare floxed villkorlig knockout eller Knock-in alleler för olika musmodeller, för att få heterozygot F1 hane och kvinnlig avkomma.
  3. Intercross heterozygot F1 manliga och kvinnliga möss för att få F2 sammansatta kvinnliga möss som är homozygot för varje allel (som experimentella möss), samt R26Y-endast homozygot honor (som kontroll möss). Möss av genotyp F2 baserat på de PCR-primers och cyklings förhållanden som anges nedan, genom att ställa in två standard 20 μL PCR-reaktioner (med Taq 5X Master Mix) i två olika PCR-rör, en med R26Y primers och den andra med Trp53L primers. Använd vuxna möss (vanligtvis runt 2 – 4 månaders ålder) för all avel.
    1. För R26Y, utför PCR vid 94 ° c i 3 min, sedan vid 94 ° c för 30 s, 60 ° c för 30 s och 72 ° c i 1 min för 35 cykler, följt av 72 ° c i 3 min, och underhålla vid 14 ° c. Använd primers (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (II) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (III) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
      Anmärkning: ett enda PCR-band på 250 BP indikerar en R26Y homozygote, ett enda PCR-band på 500 BP indikerar en vildtyp (WT), och två PCR-band (R26Y: 250 bp, WT: 500 BP) indikerar en R26Y heterozygot (figur 1a).
      För Trp53L, utför PCR vid 94 ° c i 3 min, sedan vid 94 ° c för 30 s, 60 ° c för 30 s och 72 ° c i 1 min för 35 cykler, följt av 72 ° c i 3 min, och underhåll vid 14 ° c. Använd primers (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC gg TTA AAC CCA G; (II) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
      Anmärkning: ett enda PCR-band på 370 BP indikerar en Trp53l/l homozygote, ett enda PCR-band på 288 BP indikerar en Trp53+/+ WT, och två PCR-band (WT: 288 BP, Trp53L: 370 BP) indikerar en Trp53L /+ heterozygot (figur 1b).

2. preoperativ förberedelse

  1. Autoklav alla kirurgiska verktyg 1 dag före operationen.
  2. Bered 0,1% bromfenolblått i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förvara den vid 4 ° c. Späd den AD-CRE som kommer att användas för intraduktalt injektion i DMEM medium med 0,01 M CaCl2 och bromofenol blå vid ett förhållande av 1:10 (dvs. injektions blandningen).
    Obs: den AD-CRE används här erhölls från University of Iowa viral Vector Core, med ett lager viral titer av ~ 1010-1011 PFU/ml.
  3. Anesthetize den kvinnliga musen (F2 generation som beskrivs i steg 1,2, ålder som sträcker sig från 3 – 4 veckors ålder till vuxen) med hjälp av en isofluran kammare och tillämpa ögonsalva. Under förfarandet, söva musen kontinuerligt genom att se till att den andas in 1% – 2.5% isofluran i syre. Kontrollera djupet av anestesi minst var 15 min genom att utföra en tå nypa. Noggrant övervaka musen för eventuella förändringar i andningsfrekvens, justera nivån av isofluran därefter, om det behövs.
  4. Injicera meloxikam som analgesi subkutant vid en dos på 5 mg/kg, före det kirurgiska ingreppet.
  5. Exponera nippeln kirurgisk webbplats genom att tillämpa flera droppar hårborttagningskräm; ta bort överdriven kräm och löst hår med mjuka pappershanddukar.
    Obs: utför detta steg i ett område skilt från där operationen ska utföras. Rakning rekommenderas inte för att undvika skador på bröstvårtorna. Var försiktig för att ta bort kemisk hårborttagningsmedel i tid. Lämnar agenten på för länge kan resultera i kemisk bränna till huden
  6. Desinficera operationsstället med iodophors först, följt av 70% alkohol, och avslutas med en slutlig tillämpning av Scrub iodophors. Gör detta i en cirkelrörelse från mitten av arbetsområdet mot periferin med hjälp av en gasväv svamp eller bomull-tippad applikator. Upprepa cykeln 3x – 4x.

3. intraductal injektion

  1. Använd aseptisk teknik under hela det kirurgiska ingreppet.
  2. Gör ett snitt plats på huden på en längd av ~ 1 cm mellan de två fjärde ljumsk MGS (figur 2). Noggrant separera huden luckan (med mg) från parietala bukhinnan så att visualisera bröst duktal träd.
  3. Håll försiktigt bröstvårtan med urmakare ' s pincett och ta bort den yttre nippeln utan att skära någon närliggande hud, med hjälp av en mikro-dissektion sax.
  4. Ladda ~ 3 – 5 μL AD-CRE injektion blandning i en 25 μL Hamilton spruta med en 33 G metall nav nål anbringas. Uppskatta volymen av injektions blandningen i sprutan baserat på det blå färgämnet som ingår i blandningen.
    Obs: Använd en mindre volym (t. ex. 3 μL) vid injektion i MGs på 3 – 4 veckor gamla Honor och en större volym (t. ex. 10 μL) vid injektion i MGs hos ammande kvinnor.
  5. Håll försiktigt kanten av huden luckan med en fin böjd pincett och injicera AD-CRE injektion blandningen sakta in i bröstvårtan, under tiden övervaka spridningen av blått färgämne i bröst duktal träd. Håll injektionshastigheten så låg som möjligt för att undvika skador på duktal lumen.
    Anmärkning: injiceras vätska (som illustreras av den medföljande bromofenol blå färgämnet) sprider sig under hela duktal träd utan läcker in i stromacellstumörer facket indikerar en lyckad intraduktalt injektion.
  6. Dra försiktigt ut nålen från nippeln för att undvika läckage av den injicerade vätskan.
  7. Undersök den distala sidan (dvs., bort från bröstvårtan) av MG eller det omgivande området av den injicerade nippeln. Observera att svullnad blå färg (dvs., färgämne sprider sig till den närliggande stroma) indikerar en bröst fett pad injektion snarare än en lyckad intraduktalt injektion.
  8. Stäng de kirurgiska såren (från steg 3,2) i huden med sår klämmor.

4. postoperativ vård

  1. Ta bort musen från anestesi och placera den på en värmedyna inuti en ren bur för återhämtning.
  2. Administrera meloxikam subkutant vid 5 mg/kg igen, 24 timmar efter operationen.
  3. Övervaka de allmänna villkoren för djuret och leta efter tecken på infektion på snittet platsen för 5 dagar.
  4. Sår klämmor avlägsnas ~ 7-10 dagar efter operationen.

5. övervakning av bröst tumörens utveckling

  1. Övervaka de injicerade möss två gånger i veckan av palpation för alla tecken på brösttumör utveckling.
  2. När tumören är påtaglig, övervaka musen dagligen och mäta tumörstorlek tills den når den experimentella slutpunkten, som bestäms av storleken (t. ex., når 10% – 15% av musens kroppsvikt) eller tillstånd (t. ex., ulcererad eller nekrotisk) av tumören, eller av allmänna hälsotillstånd av musen (t. ex., koma, Moribund).
  3. Euthanize musen genom koldioxid kvävning, följt av en sekundär metod (t. ex., cervikal dislokation).
  4. Isolera brösttumör vävnader och analysera dem med flödescytometri, immunofluorescens, eller uttryck profilering (t. ex. genom RNA-sekvensering [RNAseq] eller microarray), som beskrivits tidigare12.
  5. Utför flödescytometrisk analys genom att gating för härstamnings negativa celler (lin-: negativ för LINEAGE markörer CD45 [leukocytmarkör], CD31 [endotelcellmarkör] och TER119 [erytrocytmarkör]), och analysera cellerna i tumören baserat på deras uttryck för YFP, CD24 och CD29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa PCR-genotypresultat för R26Y och Trp53L -alleler visas i figur 1.

Även om, i princip, alla 10 MGS kan utsättas för intraduktalt injektion förfarande, praktiskt taget, de två fjärde ljumsk MGS är typiskt utvalda för injektion, på grund av deras lättare tillgänglighet och större mg storlekar (figur 2). Under operationen är det viktigt att bibehålla en desinficerad och stilren arbetsyta och utföra proceduren med sterila verktyg (figur 3). Under intraduktal injektion hjälper införandet av en blå färg (t. ex. bromfenolblått) i injektions blandningen visualisering av en lyckad injektion av AD-CRE i hela duktal trädet (figur 4). De yngsta kvinnliga möss där intraduktalt injektion (med en mindre volym av injektions blandningen) kan utföras framgångsrikt är de vid ~ 3 veckors ålder (figur 4a), men för de flesta brösttumör induktion experiment, unga vuxna honmöss (t. ex. 2 månaders ålder) används vanligtvis (figur 4b). Dessutom kan intraduktalt injektion (med en större volym av injektions blandningen) också utföras hos honmöss under tidig/medel dräktigning för att rikta alveolära celler (figur 4c).

Enligt vår erfarenhet, hos möss med R26Y reporter och Trp53l/l (med eller utan ytterligare villkorliga alleler) störde CRE-medierad rekombination Trp53 villkorliga knockout-alleler (och eventuella ytterligare villkorlig knockout alleles, om den används) och, under tiden, vände på YFP reporter (från R26Y allele, samt från eventuella ytterligare villkorlig Knock-in allele, om den används). Att rikta olika MEC subpopulationer för brösttumör induktion, AD-CRE virus under kontroll av olika MEC delmängd-specifika initiativtagare användes för injektion (figur 5). Till exempel, AD-CRE under kontroll av keratin 8 (Krt8) promotor (AD-K8-CRE) användes för att rikta luminala mecs. Tidigare, vi rapporterade användningen av AD-CRE under kontroll av keratin 14 (Krt14) promotor (AD-k14-CRE) att rikta basal mecs13. Men som vi rapporterade, intraduktalt injektion av AD-k14-CRE inte bara riktade basal mecs utan också en del av luminala mecs13. Vi testade nyligen en annan AD-CRE under kontroll av keratin 5 (Krt5) promotor (AD-K5-CRE)14 och fann att det kan mer tätt rikta den basala linjen, vilket leder till genetisk märkning av endast basal mecs (figur 5). Den typiska procentsatser av YFP-märkta MECs från antingen AD-K8-CRE eller AD-K5-CRE injektion är ca 0,1%-1%.

För Trp53L/l; R26Y kvinnliga möss under fvb genetiska bakgrunden, den intraduktalt injektion av AD-K8-CRE, som riktar sina luminala mecs, ledde till utvecklingen av brösttumörer flera månader efter injektionen (figur 6a). Möss med en annan genetisk bakgrund (t. ex. C57/B6) kan uppvisa en längre latens för att utveckla brösttumörer efter injektion. På grund av införandet av villkorlig R26Y reporter, tumör epitelceller var typiskt märkt av yfp och kunde upptäckas av flödescytometri (figur 6b); de kan berikas genom flödes sortering av YFP+ celler för vidare analys.

Figure 1
Figur 1: representativa PCR-genotypresultat för R26Y-och Trp53L -alleler. WT = Wild-typ; Homo = homozygote. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematiskt diagram över intraduktalt injektion av AD-CRE-virus till en mg. (A) snitt plats i mittlinjen mellan de två fjärde MGS. (B) intraductal injektion av AD-CRE med en blå färg (för bättre visualisering) till en av de fjärde MGS.Cstängning av snittet i huden genom sår klämmor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: översikt av den aseptiska installationen för gnagare kirurgi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: visualisering av en lyckad intraduktalt injektion i hela bröst duktal-trädet. A) ett exempel på en intraduktalt injektion av 3 μl injektions blandning (med bromfenolblått) i ett mg av en 3 veckor gammal kvinnlig mus. B) intraductal injektion av 5 μl injektions blandning i ett mg av en ung vuxen kvinnlig mus. (C) intraductal injektion av 10 μl injektions blandning i en mg av en kvinnlig mus i början/mitten av dräktig. (D) ett exempel på en mjölkfett pad injektion snarare än en lyckad intraduktalt injektion. Intraductal injektion av 5 μL injektions blandning i en MG av en ung vuxen kvinnlig mus. a) det hudområde som omger den injicerade nippeln. b den andra sidan av hud klaffen som visar mjölkfett plattan. gul cirkel indikerar att färgämnet sprids till fett plattan.  Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: representativa tomter för den flödescytometriska analysen av yfp-märkta celler vid intraduktalt injektion. Yfp+ populationer från MGS av R26Y Virgin Honor 3 dagar efter en intraduktalt injektion av AD-K8-CRE (vänster, injektion på en titer av 7 x 109 PFU/ml) eller AD-K5-CRE (höger, injektion vid en titer av 7,86 x 109 PFU/ mL) virus. Tomter är baserade på en analys av CD24 och CD29 färgning i härstamning-negativ (lin-; dvs negativ för CD45, CD31 och TER119 uttryck) yfp+ celler. Lu = lin-CD24högCD29låg luminala MEC Gate; BA = lin-CD24lågCD29hög basal MEC Gate; den gating strategi för luminala och basal MECs bygger på Shackleton et al.15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: tumörutveckling i Trp53L/l; R26Y kvinnliga möss intraductally injiceras med AD-K8-CRE. (A) en representativ mus som visar tumörtillväxt (pilar) flera månader efter en injektion med AD-K8-CRE. (B) omkring 8,8% av levande celler (baserat på DAPI-färgning) från en representativ tumör var positiva för yfp-uttryck, baserat på flödescytometrisk analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Framgången för detta tillvägagångssätt för att inducera brösttumörer från olika subpopulationer av mecs förlitar sig inte bara på att välja lämpliga cell-typ-specifika initiativtagare (för att driva CRE uttryck) men också på intraduktalt injektionsproceduren själv. Tanken bakom detta tillvägagångssätt är att de injicerade AD-CRE virus bevaras i duktal trädet, som är en dold struktur med lumen, och därför är endast mecs utsätts för virus och är smittade av AD-CRE. På grund av den begränsade lumen utrymme inom mjölk kanaler, det är viktigt att bara injicera en liten volym av injektions blandningen till varje MG (dvs., ~ 3-5 μL). Den injicerade volymen bör också justeras baserat på mössen (dvs. en mindre volym bör användas när den injiceras i 3-till 4-veckors-gamla möss). När volymen av den injicerade vätskan är överdriven på grund av trycket från injektionen och den begränsade duktal lumen utrymme, vätska kan vara "skjuts ut" genom epitelial lagren i stroma, leder till en oönskad virusinfektion i stromaceller.

Eftersom den specifika typen av celltyp uppnås av den promotor som används i adenovirala vektor för att driva CRE-uttrycket, är en begränsning av detta tillvägagångssätt den potentiella avsaknaden av en lämplig promotor att rikta CRE-uttryck mot en specifik MEC-subpopulation. Vi rapporterade tidigare användning av Pan-luminala AD-K8-CRE virus att rikta luminala mecs12,13 och användning av AD-WAP-CRE virus för att rikta alveolära luminala progenitorer5. I denna studie visade vi användningen av AD-K5-CRE- viruset för att rikta basal mecs (figur 5). Vi saknar fortfarande möjlighet att använda denna metod för att rikta den östrogen receptor positiva luminala MEC subpopulation. Den adenovirala vektor vi använde här kunde rymma en insats på upp till 8 KB. För att utveckla MEC-delmängd-specifika AD-CRE, kan promotorn som används för att köra CRE-uttryck endast vara mindre än 7 KB. Praktiskt taget, en stor promotor fragment, även om mindre än 7 KB i storlek, kan vara svårt att subclone. För att passa in i adenovirala vektor, även om en stympad promotor kan användas, det kan inte troget recapitulate uttrycket mönstret av dess motsvarande gen när under kontroll av endogena, full promotor.

Den R26Y villkorlig reporter ingår i musmodellen här som ett sätt att markera cellerna i Origin och spåra deras progression till cancerceller. Notera, andelen YFP-märkta cancerceller i den resulterande tumören verkade vara ganska låg (figur 6b). Detta kan bero på en möjlighet att, förutom de YFP-märkta tumör epitelceller, tumören också ingår många immunceller och stromaceller, som utgjorde huvuddelen av tumör massan.

Jämfört med andra musmodeller av bröstcancer, detta tillvägagångssätt leder till brösttumör initiering från ett litet antal MECs endast (t. ex., luminala mecs när AD-K8-CRE injiceras), ofta på en klon nivå12. Eftersom initiering av mänskliga uppkomst sannolikt kommer att vara klonala, rekapitulerar denna aspekt av mänsklig cancerutveckling mer troget. Dessutom, även när p53 störs i endast ett fåtal MECs, leder förlusten av p53 till sin klon expansion, vilket leder till att en större pool av muterade MECs skapas. Detta skulle möjliggöra ytterligare klon utveckling från de p53-bristfälliga MECs (vid förvärv av ytterligare somatiska mutationer)12. Som TP53 är den vanligaste muterade genen i human bröstcancer16 och som TP53 mutation är en tidig händelse i mänskliga bröst uppkomst17,18, genom att kombinera Trp53 floxed musmodell med mus modeller för andra onkogena händelser, kan vi studera hur dessa onkogena händelser samverkar med p53 förlust och hur de tillsammans bidrar till brösttumör utveckling från ett definierat cellulärt ursprung. Dessutom, som mindre avel behövs för att sätta flera alleler tillsammans, detta tillvägagångssätt skulle minimera avel kostnad och tid, vilket bör underlätta bröstcancer modellering studier i större skala, i en kortare period.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Grant R01 CA222560 och av Department of Defense genombrott Award W81XWH-18-1-0037.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-gauge needle Hamilton 7803-05 point style 3 blunt
7mm Reflex Clip Braintree Scientific RF7 CS
Adenovirus, Ad-K5-Cre University of Iowa Viral Vector Core Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)
Adenovirus, Ad-K8-Cre University of Iowa Viral Vector Core Ad5mK8-nlsCre
Alcohol Fisher HC800-1GAL Prepare to 70% in use
biotinylated CD31 eBiosciences 13-0311-85
biotinylated CD45 eBiosciences 13-0451-85
biotinylated TER119 eBiosciences 13-5921-85
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
CD24-AF-700 BD Pharmingen 564237
CD24-PE eBiosciences 12-0242-83
CD29-APC eBiosciences 17-0291-82
CD29-PE eBiosciences 12-0291-82
Hair Remover Lotion Nair 9 Oz
Hamilton syringe Hamilton 7636-01 0.025 mL
Iodophors Betadine 10% Povidone-iodine
Isoflurane Baxter NDC 10019-360-40 1-2.5%
Loxicam Norbrook NDC 55529-040-10 5 mg/ml
Lubricant Eye Ointment Akorn NDC 17478-062-35
Micro-dissecting scissors Pentair 9M Watchmaker's Forceps
Micro-dissecting tweezers Dumont M5
Taq 5X Master Mix New England Biolabs M0285L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
  2. Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
  3. Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
  4. van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
  5. Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
  6. Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
  7. Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
  8. Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
  9. Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
  10. Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
  11. Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
  12. Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
  13. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
  14. Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
  15. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  16. The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  17. Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
  18. Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).

Tags

Cancer forskning bröstcancer brösttumör mus modellering intraduktalt injektion bröstkörteln cellulärt ursprung bröst epitelcell CRE/loxP rekombination adenovirus
Modellering bröst cancer via en intraductal injektion av CRE-uttrycker adenovirus i musen bröstkörteln
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiang, D., Tao, L., Li, Z. ModelingMore

Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland. J. Vis. Exp. (148), e59502, doi:10.3791/59502 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter