Summary
这是一种方案，用于对在野外捕获的蝙蝠进行基因组、转录组和蛋白组分析的最佳组织制备。它包括蝙蝠捕获和解剖、组织保存和蝙蝠组织细胞培养的协议。
Abstract
随着高通量测序技术的进步，高质量组织采集和保存的标准化方法允许将这些方法扩展到非模型生物体。为一系列高通量测序方法开发了一系列优化蝙蝠组织收集的方案。这里概述了捕获蝙蝠的协议、为每个蝙蝠收集所需的人口统计数据，以及优化方法，以在组织采集过程中将蝙蝠的压力降至最低。具体概述的方法用于收集和治疗组织，以获得 （i） 用于高分子量基因组分析的 DNA，（ii） 组织特异性转录组RNA和 （iii） 蛋白质组级分析的蛋白质。最后，还概述了一种通过从翼夹创建可行的原细胞培养物来避免致命采样的方法。这些方法的一个中心动机是最大化每只蝙蝠的潜在分子和形态数据量，并提出保存组织的最佳方式，以便它们随着新方法在未来的发展而保持其价值。随着世界各地出现了对染色体级、无误差的物种基因组进行测序的倡议，这种标准化变得尤为重要，其中多个科学方正在带头对不同的分类学进行测序。组。此处概述的协议定义了 Bat1K 的理想组织收集和组织保存方法，该联合体负责对每种蝙蝠的基因组进行测序。
Introduction
高通量测序 （HTS） 方法在效率上迅速提高，成本降低，现在可以将这些方法扩展到数百或数千个样本。这些技术的应用所获得的见解在从生物医学到进化和生态学1、2、3等多个科学学科中有着巨大的影响。然而，许多HTS应用严重依赖来自活源的高质量核酸。随着基于长读分子4的第三代测序的发展，这种限制可能会变得越来越成问题。出于这些原因，需要集中力量建立从实验室外的野生生物中收集新鲜组织样本的最佳做法，从而最大限度地发挥材料的效用，减少需要收集。
Bat1K是一个国际科学家联盟，目前正在将每种蝙蝠的基因组测序到染色体级集合5。蝙蝠代表了哺乳动物多样性的20%，具有特殊的适应，对理解衰老、疾病生态学、感官生物学和新陈代谢有影响。许多蝙蝠也由于人类剥削而受到威胁或濒危，或由于病原体8、9而迅速减少，基因组测序对于保护这些物种非常重要。尽管 Bat1K 目前的目标是对所有蝙蝠物种的基因组进行测序，但为高质量基因组测序收集组织样本的标准化仍然是整个生物体生物学家群体面临的一项关键挑战。除了基因组数据外，对蝙蝠适应多样性的功能理解还需要组织特定的转录组和蛋白质分析，通常需要单独的采集方案。此外，与所有分类组一样，虽然最佳组织收集和保存对于获得最高质量的数据进行-组学分析至关重要，但由于技术和快速变化，交流最佳做法往往很困难。多个研究团队独立工作。
鉴于许多蝙蝠物种很少或受到威胁，需要采用蝙蝠-组学研究的最佳做法尤为迫切。与其他小型哺乳动物（如啮齿动物和精明动物）不同，蝙蝠寿命长，由于特殊的DNA修复机制10和缓慢繁殖11，大多数物种每年只产一只或（少数）两只幼。由于这些原因，蝙蝠种群可能缓慢地从干扰中恢复，从野外采集许多个体既不可取，也不可行。换句话说，必须优化协议，以获得单个样本的最大数据量，从而减少不必要地复制采样工作的需求。
在这里，该协议特别侧重于用于基因组和转录组测序和蛋白质分析的蝙蝠组织的收集和采样的标准化方法。其最高优先事项是确保蝙蝠组织以合乎道德和负责任的方式收集，从采集许可程序、组织出口到尽量减少对动物的压力，以及长期储存条件。精心剖面，目的是面向未来，证明所收集不同材料的有用性。本手稿提供了一个分步指南，以人道的方式收集蝙蝠，旨在尽量减少对人口的影响，并最大化科学价值。虽然该协议的重点是专门用于蝙蝠，但许多步骤是相关的其他脊椎动物分类，特别是哺乳动物。
组织收集概述
组织收集程序，包括储存温度和选择保存剂，将由计划的任何下游分析的性质决定。然而，强烈建议在可能的情况下，在一系列方法下收集组织，以最大限度地发挥其未来效用，即使没有计划进行具体分析。一般来说，组织被收集和保存，以便随后分析核酸（DNA和RNA）或蛋白质。对于每种应用，通过直接在液氮 （LN2） 中快速冻结，可以最佳地保存组织。然而，在现场并不总是能够立即浸入 LN2。随着技术的进步，在环境温度下储存DNA和RNA的专用小瓶等资源越来越容易获得。虽然我们还没有验证本协议中的所有此类材料，但我们鼓励其他研究人员相对地分析新材料相对于我们这里的性能。在无法访问 LN2 的情况下，例如，由于在亚马逊的小型平面进行站点访问而无法进行 LN2 传输时，我们确实提供了为不同应用提供理想的保存组织的方法。此外，我们还提供了一种收集组织的方法，从中可以生长和繁殖活细胞。下面我们概述了为上述每个目的收集材料的关键注意事项，表1概述了收集方法。
脱氧核糖核酸组织
对于采集的所有采集组织，存储介质将确定其是否可用于标准或高分子量 （HMW） DNA 提取。HMW 是长读测序所必需的，目前需要生成染色体级基因组组件或"白金标准"基因组。低分子量 （LMW） DNA 可以从闪存冷冻、AllProtect（因此称为"组织稳定溶液"），甚至 RNAlater（因此"RNA 稳定溶液"）保存的样品中提取（尽管闪光冷冻样品保持最佳).通过标准实验室方法（例如，硅胶膜旋转柱、苯酚氯仿）分离的DNA仍可能产生高达20千基（kb）的DNA片段。因此，只要有足够的产量，这种形式的分离DNA可用于单刀片大小库制备，其中插入大小通常为+500基对（bp），并生成±100 bp的短序列读取12。这种DNA对于不需要全长染色体数据的"重新测序"项目或研究特别有用。HMW DNA （10-150 kb） 更具挑战性，只能使用收获后在 LN2 中快速闪光冻结的组织可靠地获得，并在-80°C中保持至-80°C，直到提取。
低分子量或支离破碎的DNA通常足以用于靶向方法，包括通过PCR和短读测序13进行基因扩增。基于PCR的研究使用LMWDNA，只针对一个或几个基因已经高度信息，了解适应和分子进化蝙蝠感官生物学6，14，生理学15，植物遗传学5，16，和保存17，18。成功靶向序列重获低分子量和碎片DNA也已证明为许多脊椎动物群，包括蝙蝠19。这些方法通常具有成本效益，对蝙蝠具有微微侵入性，因为粪便样本和非致命组织通过拭子或翼活检打孔进行取样也是获得低分子量分析DNA的常用方法。 21.
但是，质量在很大程度上取决于存储样本的介质类型22。经过对buccal拭子和活检冲孔的系统定量比较，机翼活检液的拳头已经证明能持续产生更高的DNA水平，在采集22过程中对蝙蝠的压力较小。这些比较还表明，当翼冲剂保存在指示器二氧化硅（即一种由硅胶珠制成的干燥剂，在观察到水分时改变颜色）时，而不是在其他流行的储存介质（如乙醇或DMSO22;但是，其他存储介质，包括组织稳定溶液没有被检查。翼冲也可用于在培养中生长成纤维细胞，如在Kacprzyk等人23和下述（见第6节）。对于这些方法，应轻轻扩展机翼或尿毒症，并应使用直径为 3 mm 的清洁活检冲床来获取样品。这种方法似乎不会造成持久的伤害，在大多数情况下，疤痕在几周内愈合。
HMW DNA （10-150 kb） 更具挑战性，目前仅使用收获后在 LN2 中快速闪光冻结的组织获得可靠，并在 -80°C 中保持至 -80°C，直到提取。HMW DNA （10-150 kb） 对于长期读取的 DNA 测序至关重要，因此对于 de novo 基因组组装至关重要。事实上，虽然大多数商业试剂盒可用于分离一些标准的HMW DNA，但产生的分子尺寸往往不符合第三代测序技术的要求，例如太平洋生物科学（PacBio）等公司推出的技术，牛津纳米孔技术，和10x基因组学，或通过生物纳米基因组学或多尾基因组学提供的组装方法*。因此，对"超 HMW"DNA（>150 kb）有新的需求。当从蝙蝠获得超HMWDNA时，肝脏、大脑或肌肉的新鲜样本都适合，但这些样本必须立即在LN2中闪光冷冻，没有任何存储缓冲液或冷冻保护剂。这些步骤的完整描述超出了本文的范围，但可在其他部分25提供。
RNA组织
RNA是一种单链分子，其稳定性低于DNA。虽然有多种形式的RNA，-组分分析往往侧重于mRNA（信使RNA）和小型RNA（例如微RNA）。转录后，mRNA被拼接成一个成熟的转录本，其中不包含内创体，并代表基因/基因组的编码部分。编码基因只占基因组大小的一小部分（1%-2%），使靶向mRNA成为获取基因序列数据的具有成本效益的方法。微RNA是一类RNA，用于调节mRNA转化为蛋白质的过程，因此是重要的调节效应者。RNA转录本可以单独排序，或者更常见地用于-omics分析26，27，28，29，30，作为转录本的一部分;即给定样本中存在的所有RNA转录本的总数。
排序可以按照多种方法执行（即，通过短读RNA-seq或长读全异形Seq），允许分析RNA丰度和异形使用。由于mRNA转录本的数量和多样性在细胞和组织之间不同，RNA测序使得研究和比较不同样本的基因表达和调控成为可能。随着这些方法在生物学上越来越丰富，对小型RNA和全等形测序测序的兴趣正在增长。组织样本的制备，以序列不同类别的RNA可以执行的方式，如本手稿中介绍，只有随后的提取方法不同31，32。最后，由于转录组提供了蛋白质编码基因组的高覆盖率子集，因此组装的数据集在基因组组装和注释方面可能有用，因此跨一系列不同组织收集RNA-seq数据是Bat1K 计划。
与DNA相比，RNA在化学上不稳定，并且也是RNase酶的目标，这些酶在组织裂解物中普遍存在，作为对抗RNA病毒的防御策略。由于这些原因，细胞和组织中的RNA分数在取样和/或安乐死后不久开始降解。因此，保存RNA需要采取措施防止其降解。这通常涉及在稳定剂（如RNA稳定溶液）中保存4°C下新收集的组织，以灭活组织中自然存在的RNases，然后冷冻以进行长期储存。作为首选的替代方案，组织可在LN2中闪光冷冻;虽然如上所述，将LN2运送到现场并保持水平以防止组织解冻在后勤上可能具有挑战性。
蛋白质组织
蛋白质组成和相对丰度在细胞和组织之间以与RNA讨论的方式相似;然而，蛋白质平均比RNA更稳定。使用蛋白质组学进行蛋白质鉴定通常与蛋白质序列的一小部分（而不是整个蛋白质序列）相匹配，但它可以提供有关组织间表达的信息，并表征存在病原体。由于许多蛋白质序列在哺乳动物中保存，蛋白质组学的蝙蝠样本很容易被保存的人类蛋白质污染，在采集过程中需要无菌方案（例如手套、钳子）。虽然LN2中的闪冻结是防止蛋白质降解的最好方法，但如果没有其他方法，使用干冰、-20°C冰柜，甚至冰是合适的。随着温度的升高，蛋白质分裂的风险也会增加。组织稳定溶液等稳定剂在室温下有效保存组织的蛋白质部分，适合在闪光冷冻不可行时进行短期保存（最多一周）。
给定组织的酶轮廓直接影响其中蛋白质的保存。具有低酶活性的组织（如肌肉）即使在家庭冰柜的较高温度下也能保留蛋白质的轮廓。相比之下，肝脏组织是酶反应的，其蛋白质在制备过程中有更高的降解概率。越来越多的协议从甲苯固定石蜡嵌入（FFPE）样品获取人类蛋白质组谱，这表明，当采集时冷冻时，组织甲醛固定有望实现低成本蛋白质保存可行33，34.虽然高度依赖于保存时间和条件，蛋白质已经通过免疫性化学从形式固定，乙醇保存蝙蝠标本35鉴定。这种方法无法扩展到蛋白质组级采样，但突出表明，当闪存冻结不可用且其他稳定剂成本过高时，正式固定蝙蝠组织可能产生蛋白质配置文件。
细胞培养组织
取样组织和闪光冷冻提供了有限的材料可供使用，一旦材料被使用，它不再可用。或者，细胞培养物提供活细胞，可以立即用于或保存用于未来的研究。培养也促进细胞的膨胀，当组织样本较小时提高产量。在组织收集有限的情况下，它特别有用，例如对稀有物种进行实验，其中非致命性取样至关重要，因此对养护具有广泛影响。描述是一种方案，其中细胞培养可以通过翼膜组织的非致命采样，但培养是可能的与多种组织类型36，37。此处提供的协议为粘附单元选择。源组织和生长介质的组合使该协议适合选择和生长成纤维细胞，但如果需要，替代协议可用于选择其他细胞类型。在Bat1K项目的背景下，据预测，对于稀有和受威胁的物种，对翼膜进行非致命性取样和通过培养扩大样品对于产生采用多种技术所需的DNA数量至关重要。.
蝙蝠捕获
所有处理蝙蝠的人都应接受蝙蝠能力研究人员的培训，并接种一系列接触前注射疫苗，以预防狂犬病。如果被咬伤，还需要再注射一系列暴露后注射。捕捉蝙蝠的标准方法包括雾网（图1）和竖琴陷阱（图2）。雾网是最常用的，非常适合低到中度活动的地区，因为它们需要最小心，以尽量减少蝙蝠的苦恼。小蝙蝠特别脆弱，如果不迅速死亡，可能会因压力而死亡。频繁的净检查最大限度地减少了蝙蝠伤害和死亡率以及雾网损坏。这个细节很重要，因为适当的组织收集需要组织是新鲜的，对蝙蝠的雾网的不当关注可能导致不必要的死亡或过早死亡，研究人员才能正确处理样本。由于几只蝙蝠可以以最小的痛苦在竖琴陷阱中休息，因此这种方法非常适合蝙蝠活动量高的区域，如洞穴附近或大型栖息区。补充方法中提供了关于适当捕获蝙蝠和数据处理以收集形态和人口信息的详细说明。
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Protocol
这里描述的所有方法都已获得石溪大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（#2013-2034年协议）。
1. 安乐死
- 用异透麻醉剂或其他可用的麻醉剂润湿棉球。
- 将棉球放入可重新密封的密封塑料袋中。袋子应该足够大，可以舒适地放在布蝙蝠袋中。
- 几分钟后，让袋子中弥漫着麻醉剂，将装有蝙蝠的蝙蝠袋放入塑料袋中。
- 等待几分钟，直到蝙蝠被安乐死。蝙蝠重量约20克或更短，大约需要5~10分钟。大于这个重量的蝙蝠可能需要长达20分钟。 请注意，时间长度可能还取决于蝙蝠袋的渗透性。建议使用最薄的布料，以最大限度地扩散麻醉剂。
- 检查呼吸和心跳，确保蝙蝠在解剖开始前已被安乐死。
2. 解剖准备
- 使用以下协议，在解剖之间保持所有仪器的清洁。
- 用水和洗碗皂清洗乐器。用10%的漂白剂擦拭它们，远离解剖区域，因为漂白剂会分解核酸。
- 用70%乙醇擦拭。
- 用RNA酶净化试剂擦拭。
- 每次解剖后重复此部分。
3. 为组织样品准备瓶
-
对于RNA：
- 在开始任何解剖之前，请准备好所有小瓶，以避免延误。
- 留出每个试样所需的小瓶数量。标记每个管与将收集的组织类型，以及标准标本识别信息。将小瓶中充满 50% 的 RNA 稳定溶液，理想地冷却至 4°C。
- 小心不要用RNA稳定溶液完全填充小瓶，否则管在LN2中放置时可能会爆炸。在采集组织样本时，请记住，RNA 稳定溶液不会完全渗透大块组织。因此，在一个维度中将组织切成不超过0.5厘米的小块，并保持至少10：1体积的RNA稳定溶液：组织的比例。
- 至少，解剖组织需要放置在RNA稳定溶液中，即使无法进入LN2或冷库。
-
对于DNA：
注：几乎所有组织的核DNA含量都相同;因此，采样可以灵活。然而，应该指出的是，肌肉组织中线粒体的密度越高，可能导致核基因组38的读取丢失。- 对于低分子量 DNA，请采用一种或多份翼膜复制，以储存在二氧化硅和/或肌肉中，以储存在RNA稳定溶液或组织稳定溶液中。
- 对于超 HMW DNA，在 LN2 中闪烁冻结，无需任何存储试剂，然后转移到-80°C或更冷的长期存储中。从颅内解剖，脑组织是最适合检索超HMW DNA39的组织类型，而从颅后解剖，肝脏或肌肉是更合适的40。
- 对于颅内解剖，使用5 mL小瓶（相对于标准2 mL小瓶）的RNA稳定溶液为某些组织。所有小瓶都应该是低温的。解剖时，将小瓶放在冰上。
4. RNA的颅内解剖
- 安乐死后，立即用一把大剪刀或切骨器将标本斩首（图3）。
- 用足够强大的力用钳子去除眼睛以分离视神经。将眼睛放入2 mL的RNA稳定溶液小瓶中。
- 使用您选择的工具，从头发、筋膜和头骨肌肉（包括鼻子上的皮肤）上剥下头骨。小心不要折断鼻子的前端。
- 使用剪刀，从颈部开始，在颅骨的腹腔部分（图3）上做下垂，注意不要损伤大脑。
- 使用钳子，轻轻地拉回头骨的两侧，直到它破裂和大脑暴露。
- 在头骨的骨端，耳蜗现在应该横向可见头部的每一侧。它们是左右两侧的小球形骨骼，只是颈部和后方的肌肉。使用钳子，轻轻拉耳蜗，并把它们放入一个2mL的RNA稳定溶液小瓶中。
- 用钳子轻轻刮擦大脑（非常软）。嗅球将变得可见，坐在头骨内部的腹腔部分。尽量把嗅球灯泡连在一起。
- 如果嗅球尚未取出，轻轻刮去组织，婴儿床板将变得明显。这是保持研究人员导向的关键骨骼。它可以被确定为头骨最前部区域，具有多个前臂和嗅球所在的两个凹槽。
- 如果可能的话，保持大脑形状完整，并立即放置在干冰上，以保持形状或5mL小瓶的RNA稳定溶液。如果要在大脑中进行免疫性化学，则放入4%的甲醛（如果有的话）。
- 在顶部和底部钳口连接处进行两个切口，并取出下颌骨。
- 取出下颌骨后，从头骨的剩余部位取下讲台（上颚）。确保钳口包括婴儿床板。
- 将鼻子放入RNA稳定溶液中，在4°C处储存过夜。由于这是一个密集的组织，它需要时间，让RNA稳定溶液渗透到整个组织。
- 在一夜之间浸泡在RNA稳定溶液中后，将鼻小瓶放入LN2中。
- 从下颌，用剪刀切割舌头，并放置在2mL的RNA小瓶中，以供以后使用。
- 该协议将放弃大部分头骨。牙齿，特别是下颌的牙齿，可以恢复，并可能有用的物种诊断。骨组织可储存在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
5. RNA颅后解剖
- 使用手术刀刺穿腹腔，使纵向切口至肋骨（图3）。这将丧失骨骼框架。如果要保存骨骼，请仔细从肌肉中的皮肤解剖，并在软组织解剖完成后储存在 1x PBS 中。
- 剥去皮肤以揭示胸肌，至少采集两个肌肉样本，一个用于RNA稳定溶液，一个用于HMW DNA冷冻，立即放入小瓶中放入LN2中。
- 切穿胸骨，拔下肋骨，从肺部采集样本。
- 收集心脏，可以采取整体，但应切成两半，使RNA稳定溶液彻底浸泡。
- 从肝脏中取样。至少采集两个肝脏样本，一个为HMW DNA冷冻，立即放入空小瓶中放入LN2中。肝脏是非常酶，重要的是要使样品足够小，RNA稳定溶液完全浸泡。
- 肝导管，其功能是从肝脏排出胆汁，连接肝脏胰腺和小肠。通过探测肝脏的劣质/后部分，以后向的方式追踪容器，很容易识别该容器。管道通常是绿色的，以及。按照肝导管找到胰腺和胆囊，并收集这些分别。放置在各自的RNA稳定溶液小瓶中。
- 收集胃，旁边，在它的基础和显示为不同的紫色阴影，是羽毛般的脾脏。胰腺也应该是可见的白色结构（图3）。放置在各自的RNA稳定溶液小瓶中。
- 收集小肠和大肠的小样本。放置在各自的RNA稳定溶液小瓶中。肠道也可以被筛查为内生。如果寄生虫学家在现场，可以检查寄生虫。如果稍后完成此操作，整个肠道可在 5 mL 低温小瓶中取走。
- 取一个肾脏，并遵循他们的导管到膀胱。放置在各自的RNA稳定溶液小瓶中。
- 使用另一个肾脏作为指南，找到睾号（如果是男性）或子宫，并通过它的卵巢（如果是女性）。如果可能，收集一个或两个格子。
- 将机翼皮肤各部位的样本保存在单独的小瓶中（肌肉与非肌肉部分）。
6. 组织培养的收集和准备
- 通过组成Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM），含有20%的胎儿牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和50μg/mL根霉素，为细胞制备生长培养基。增长介质的等分应该每天在协议中变得新鲜。
- 收集后，机翼活检冲孔必须直接放置在密封良好的1.5 mL离心管中的1mL冷生长培养基中。将管子包裹在副膜中以密封。
- 然后，管子应运输在含有冷却元件的聚苯乙烯盒中，以保持样品在4°C。应加快运输;虽然，健康细胞可以由这种方式储存长达6天的冲孔制成，但效果较差23天。
- 一旦运送到组织培养设施，以下协议可用于生成细胞培养物。在协议41的其余部分，应使用标准的无菌技术。
7. 第1天组织培养：组织分离
- 将管（含有翼膜活检的生长介质）的含量转移到15 mL锥形离心管中。
- 小心地去除生长介质。用500 μL无菌PBS轻轻清洗活检两次。
- 在管中加入500 μL的胶原酶IV（1毫克/mL）。这将导致组织消化到单个细胞。
- 在37°C下孵育过夜（最长16小时），无搅拌。
8. 第2天组织培养：电镀细胞
- 组成新鲜的生长介质，预热至37°C。
- 通过在要使用的板的每个孔中加入 2 mL 的新鲜预加热生长介质（每 3 mm 翼活检 1 孔），制备 6 孔组织培养板。将此板存放在 37°C 和 5%CO2培养箱中，直到需要为止（步骤 8.7）。
- 从培养箱中取出含有细胞的15 mL管，通过加入1 mL的新鲜生长培养基（预热至37°C）来淬火消化反应。
- 通过用P1000移液器尖端仔细对溶液进行三聚，以达到单个细胞悬浮液，重新悬浮细胞。
- 在300 x g下轻轻旋转桌面离心机中的细胞3分钟。
注：在悬浮液或附着在15 mL管壁上的小块组织可能仍然可见。然而，这不会影响细胞悬浮液制备 - 用 P1000 移液器轻轻去除 80%-90% 的液体，丢弃上清液。
注意：如果仍然可见，请勿丢弃组织，并在下一步 （8.7） 中轻轻三聚它。 - 在预加热生长介质的 500 μL 中重新悬浮颗粒，轻轻三聚悬浮液，以确保颗粒或颗粒的大碎片不再可见，并且细胞充分悬浮。由于存在细胞，介质可能看起来浑浊。
注：在此阶段，可以执行可行的细胞计数，以评估细胞悬浮的质量和从翼夹衍生的细胞的产生（有关进一步详情，请参阅步骤 10.11）。 - 轻轻将整个细胞悬浮液体积移入 6 孔板的单孔。
注：立即执行上述步骤，不允许单元格在步骤 8.7 后结算。使用移液器以滴落的方式将细胞悬浮液轻轻分布在井面上。不要将整个溶液移入井的中心，因为这将导致细胞聚集在井的中间。
注：如果组织仍然可见，请勿将其很好地转移到培养容器中。 - 从一侧到一侧和前后 2x_3x 轻轻摇动板，以帮助细胞在单层中分布在井面上。
- 检查显微镜下的镀层细胞，因为它们应该是单个细胞，它们看起来是球形的，漂浮的，但非常致密。
- 小心地将板放入预置至 37°C 和 5% CO2的培养箱中。
- +24小时后，在显微镜下观察细胞以确定培养的健康。细胞现在应连接到板表面，并出现扁平 （ 图4A）。通过显微镜观察时，在培养基中可能可以看到不同的细胞类型。
- 可能会有一些浮动细胞没有连接。这些细胞的一部分已经死亡。如果井中可见的浮动细胞比例很高，则应刷新介质。在这种情况下，小心地从井中吸出±50%的介质，并轻轻地将1 mL的预加热生长培养基加入井侧，以免干扰细胞。
- 将细胞保持在培养箱预置至37°C和5%CO2。应在显微镜下定期观察细胞（但每天不超过一次），以确定是否需要进行介质更新或分裂。
注：当细胞被新镀制时，它们会迅速分裂，因此应该每天进行检查。经过一段时间的文化，增长将放缓，他们可以检查每48-72小时。
9. 刷新媒体
-
定期检查显微镜下的细胞，观察其生长和培养质量。监视介质的颜色，作为其质量的指示器。细胞应在同一介质中最多停留 3 天，或直到需要通过，以先到者为准。
- 如果细胞生长迅速，使介质耗尽，眼睛也会看到，因为媒体的颜色将从红色变为黄色。
- 必要时，从井中小心吸出约50%的介质，并轻轻地将大约相同体积的预加热生长培养基加入井侧，以免干扰细胞。
- 将细胞返回到 37°C 和 5%CO2培养箱。
10. 传交细胞
- 传交细胞是指取现有培养，并将其分解成新井。当细胞是[80%的交流]时，应发生传递，即当它们占据井表面的[80%]，只有[20%的塑料仍可见为间隙]（图4B）]。
- 小心吸出并丢弃+90%的生长介质。
- 在井壁上加入1 mL无菌PBS，轻轻清洗细胞，以免干扰细胞。轻轻摇动板来回和侧对侧 2x×3x。小心吸气，从盘子中丢弃所有 PBS。
- 重复步骤 10.3 再次清洗细胞。
- 轻轻地向井中加入 250 μL 的胰蛋白酶-EDTA（西格玛·奥尔德里希，猫#T4049），并在室温下孵育 1.5 分钟。
注：通过轻轻摇动板，确保胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖油井的整个表面。 - 加入1 mL的新鲜预加热生长介质，使反应淬火。
- 上下移液 +5x，从板表面清洗细胞，并确保细胞处于悬浮状态。
注：由于细胞的存在，溶液应变得浑浊。 - 将细胞悬浮液放入15mL管中，在台式离心机中旋转细胞3分钟，300 x g。
- 用 P1000 移液器轻轻去除 80%-90% 的液体，丢弃上清液。
- 将颗粒悬浮在预加热生长介质的 1 mL 中，并轻轻三聚悬浮液。确保颗粒或大片段不再可见，并且细胞处于单个细胞悬浮液中。
- 使用此处描述的自动细胞计数器对细胞进行计数，或使用血细胞计手动计数，如参考视频42中所述。将悬浮细胞1：1的10μL等分与Trypan蓝色混合，以检测可存活的细胞。
- 孵育1分钟，将溶液的移液器10μL移液到计数幻灯片上。将计数幻灯片插入自动单元格计数器，以便使用适当的设置对单元格进行计数。产量应约为1-200万个细胞从6孔板的汇流单孔，虽然这可能因细胞和物种的大小而异。如果细胞不在单个细胞悬浮液中，则细胞计数将不准确。
- 这些细胞培养物通常能容忍1：2分裂[即，一个细胞的汇井可以分裂成两个新井（总）]。为此，再次轻轻对细胞进行三聚，然后将细胞悬浮液分成两半（每节约730 μL），然后以滴入的方式将它们放入含有750μL预加热生长培养基的两个新井中的每口。
注：2~3天后，井口应汇入，并再次做好分井准备。此时，建议通过可冷冻协议（第 11 节）保存一口细胞井。进一步储存的细胞可以在进一步通过期间冻结，作为可取的。
注：+6通道后，细胞倾向于进入衰老，不再分裂。这表明单元格不能再拆分或展开以增加单元格数。这也表明细胞在更长的时间内将不能存活。
11. 冷冻活细胞
- 通过将 DMEM 与 20% FBS、10% DMSO、1% P/S 和 50 μg/mL gentamycin 相结合来制备冷冻介质。
- 冷冻是通过根据通过处理过程进行颗粒化的细胞来执行的。根据步骤 8.1-8.9，颗粒应从 6 孔板（表示 1-200 万个细胞）的 80%-90% 汇井中制备。
- 在1.5 mL的冷冻介质中重新悬浮颗粒。
- 将+750 μL的细胞悬浮液置于两个独立的冷冻室中。
- 将小瓶放入低温冷冻容器中，导致细胞缓慢冷冻以保持细胞活力。立即将它们置于-80°C。
- 24~48小时后，将细胞的冷冻液转移到LN2进行长期储存。以这种方式储存，细胞可以复活，并可以存活多年。
12. 解冻冷冻细胞
- 准备一个6孔板，每口井中含有2 mL的预加热生长培养基，将使用（每瓶被解冻的细胞1孔）。在 37°C 和 5%CO2培养箱中保持板，直到需要为止。
- 从LN2中取一小瓶细胞，并将其放入温水浴（37°C）中，以快速解冻细胞。这应该需要2~3分钟。
注：不要将小瓶解冻超过3~5分钟，因为冷冻介质中的DMSO在解冻后对细胞有毒。 - 一旦小瓶中的溶液解冻，轻轻上下移液，使溶液均质化，并立即将整个溶液（±750 μL）放入6孔板的一口井中（步骤12.1中预先准备）。
- 轻轻地将板从一侧到一侧，前后摇动 2⁄3 次，以帮助细胞在单层中分布在井面上。
- 将细胞置于孵化器中的37°C和5%CO2培养箱，24-48小时。
- 如上所述，监视和通过细胞。
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Representative Results
Dna
对于标准低分子量 （LMW） 分析，从三个新热带蝙蝠物种中提取了 DNA。根据本文件所述的协议，从多米尼加共和国和哥斯达黎加的实地采集了组织样本。解剖后，将混合组织（脑、肝、肠）的小块（最薄部分为<0.5cm）放入RNA稳定溶液中，闪速冷冻，然后储存在-80°C。提取使用标准DNA提取协议与RNase处理43。使用自动电泳工具评估DNA完整性后发现以下具有代表性的片段大小的样本峰：物种1（两次单独提取）包括22 kb和20 kb;物种2包括25 kb;和物种3包括24 kb（图5，表2）。
提取用于第三代测序的DNA需要以高浓度和最小碎片收集。从在加纳采集的旧世界水果蝙蝠（Eidolon helvum）中从闪光冷冻脑组织中提取的HMWDNA得到。HMW DNA 是使用生物纳米提取协议提取的，用于后续在 Irys 平台上的分析。这种DNA的长度为607，463Mb，平均分子N50为194.5Mb。
Rna
RNA提取成功的一个常见指标是RNA完整性数（RIN）值。当萃取的RIN值小于8时，测序机构通常不建议执行RNA-seq库制备或测序协议，因为低于此阈值的值开始显示降解的高特征44 ， 45.图 6显示了遵循此协议的各种组织类型的 RNA 提取的 RIN 值。提取与协议采集的组织，产生了高质量的RNA，与现场取样区域无关。当LN2在亚马逊中不能立即可用时，组织被置于RNA稳定溶液中，并在4°C保存1周，直到放入LN2。即使在这种情况下，RIN值也与立即放入RNA稳定溶液并直接放入LN2值值相当。RNA稳定溶液是一种必不可少的稳定剂。
组织培养
电镀后，细胞将立即球化并浮动。然而，在24小时内，成纤维细胞应平展并附着在板的表面（图4A）。此时，细胞应在大约20%-30%的汇合处，以确保生存。低于此值可能会导致整个文化的死亡。最初，它们之间必须有足够的空间来允许扩展，因为细胞将在培养中分裂和扩展。当它们达到 80%-90% 汇合时，它们应被分割 [即，它们覆盖了板表面的 >80%（图 4B）]。这样，细胞可以维持在培养中若干通道（通常>6通道）之前进行衰老。如果细胞在培养中保持超过这个时间，或者当细胞发生汇入时没有分裂，它们可能会改变形态，变得更大，变长（图4C）。具有这种形态的细胞可能仍然分裂，但这通常表明细胞正在或即将进入衰老状态，并且不再能够在培养中保持或扩大。
图1：用于雾网捕捉森林中蝙蝠的常见设置。保持一只手覆盖，同时与另一只手分离是一种安全去除蝙蝠，同时尽量减少压力的方法。这张照片是乔恩·弗兰德斯拍的。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：竖琴陷阱通常用于捕捉洞穴外、大型栖息或飞离。蝙蝠将堆积在陷阱的下袋中，最小的纠缠和容易被调查人员移除。这张照片是斯蒂芬·罗西特拍的。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：RNA组织制备的解剖和组织取样工作流程。请点击这里查看此图的较大版本。
图4：蝙蝠细胞培养物源自纤维质变色的翅膀冲孔. （A） 24-48 h 电镀后， 细胞将变平并附着在板表面.（B） 细胞覆盖板表面的80%-90%，保持原始形态。这表示拆分的最佳阶段。（C） >6通道后，细胞的形态会变大、变长，细胞进入衰老。在所有图片中，明亮的球形细胞代表死细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：从三种蝙蝠物种的标准DNA分析中保存的DNA提取的代表性结果，从物种1中提取了两次DNA。单个大带表示从每个提取中分离最小和大小相似的 DNA 片段。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：从4个不同地点取样的新热带蝙蝠物种中抽取13种不同组织类型的RNA完整性数（RIN）。这些提取按照所述协议进行制备，然后用于准备 HiSeq/NextSeq Illumina 转录本库。MOE是主要的嗅觉上皮。VNO 是沃美诺的器官。从安第斯、哥斯达黎加和多米尼加共和国的物种中取样的组织在4°C浸泡RNA稳定溶液后，直接置于LN2中。从亚马逊物种中取样的组织在置于RNA稳定溶液后约1周被放入LN2中，并连续保持在4°C。N表示每个组织提取所代表的个体数。请点击此处查看此图的较大版本。
| 应用 | 闪光冻结 （L2） | RNAlater | 所有保护 | FFPE | 媒体 |
| 高MW DNA |  |
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| 低MW DNA | |
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| Rna | |
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| 细胞培养 | |
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表1：保存方法和应用程序概述。MW = 分子量，FFPE = 形式固定石蜡嵌入组织。复选标记表示每个目标应用程序的首选保留方法。X 标记表示不应使用的保留。
| 物种 ID | 样本 ID | 浓度（纳克/μL） | 样本片段峰值大小 （bp） |
| 物种 1 | 1.1 | 31.8 | 21,885 |
| 1.2 | 22.8 | 19,633 | |
| 物种2 | 2 | 30.4 | 25,198 |
| 物种 3 | 3 | 32 | 24,386 |
表2：基于本协议中保存方法的DNA提取代表性结果。值对应于图 5中的凝胶电泳井。
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Discussion
本手稿中讨论的协议描述了蝙蝠各种高通量分子分析的最佳采样实践。所有成功的-组质研究都需要高质量的组织，但取样蝙蝠组织以及其他非模型生物，往往发生在无法设定为与受控实验室环境相同的标准的现场条件下。取样通常发生在偏远地区，资源很少，包括使用电力和冰柜的机会有限。很难，而且往往不可能确保完全无菌的取样条件。因此，概述的是在各种取样地点和现场条件下被确定为最成功的协议。为了对Bat1K倡议和相关努力和项目采用标准化的取样方法，建议蝙蝠生物学家在允许的范围内规划野外考察时遵循这些协议。
协议建议
虽然胸腔压缩是过去安乐死的常见方法，但建议永远不要使用胸腔压缩来收集蝙蝠进行- 组学分析。它不再是一种可以接受的安乐死形式在美国46，这种方法可能导致一系列组织的酶降解，无论感兴趣的物种47。如果动物将被安乐死，建议收集基因组和转录组分析的组织。两者都需要收获新鲜组织，理想情况下会以LN2闪光冷冻，但也可以储存在不同的介质中，以方便DNA、RNA或蛋白质提取。建议与两名颅内和颅后解剖患者同时工作，以减少组织RNA的降解。一个人应该解剖颅骨，而另一个人在颅后工作。
执行解剖协议的主要限制包括参与解剖的人员和组织保存空间（例如，在 LN2 罐中）。提前制备小瓶和足够数量的人，以协助标记管和记录收集的小瓶和组织将有助于顺利的样品处理。应当指出，对样品进行适当记录对于获得必要的（出口、进口）流程至关重要。例如，颅后解剖协议要求每只动物超过20小瓶。
如果空间和时间有限，应优先考虑以下事项：1） 确定一个物种标本的优先级，或至少确定每个属一个标本的优先级;确定男性标本的优先次序，以便对X和Y染色体进行测序，并尽量减少对生殖女性进行取样的可能性;2） 对于HMW DNA：大脑、肌肉和肝脏应在无试剂的情况下闪冻;3）对于RNA：大脑、消化组织、脾脏和感觉器官是重中之重。每个组织样本应储存在RNA稳定溶液中。肌肉组织也应作为专门组织表达分析的控制;4）在最低限度，组织应保持冷;5） LN2的可用性可能也值得关注。LN2 储罐必须至少每两周重新加注一次，但在较温暖的气候下或如果储罐经常打开，则必须更频繁地重新加注。LN2 通常在所有国家/地区都上市，因为它经常用于农业和医疗保健，用于运输样品。通常这些服务由销售其他气体（如二氧化碳或氧气）的公司提供。冰淇淋店有时为干冰或LN2提供另一种选择（或至少提供购买建议），建议向当地人员寻求帮助;6）图 6概述了一些在条件有限的采集考察中成功的组织提取。
随着更多的人和更多的空间，更多的组织可以以不同的方式收集。以下是在其他地方发布的附加协议，调查人员应考虑是否有适当的经验和材料：1） 蝙蝠甲体，或细胞和组织的所有排泄低分子量代谢物，可以提供洞察特殊的蝙蝠寿命或休眠和代谢飞行需求。血液应从容易接触的血管（如脚踝静脉）收集到含有肝素48的瓶中，粪便样本应冷冻在LN249中;2）免疫学，或动物对病原体的反应，可以通过服用股骨和胡美来进行分析，并将其放入组织培养溶液中，以培养下游的巨噬细胞50;3） 粪便可用于两种类型的下游核酸分析，如确定饮食51和探测肠道微生物群52，53，54。在这两种情况下，组织稳定溶液等试剂可减少粪便中罕见变异的降解;4）脂质学，或组织类型的磷脂表，在理解白鼻综合征真菌病原体55，56中一直揭示。组织制剂建议在解剖后立即冷冻。
Bat1K 的组织存档
Bat1K 旨在维护用于生成基因组的每个蝙蝠的组织库。目前，这些组织库以及每个人收集的相关型板和生态数据保存在 Bat1K 贡献成员的实验室/博物馆收藏中。随着项目的进展，Bat1K 将通过全球基因组生物多样性网络等网络存储库集中和维护组织收集和相关数据库。"
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢CEBIO、埃里卡·帕利扎、米卢斯卡·桑切斯、豪尔赫·卡雷拉、埃德加·伦吉福·巴斯克斯、哈罗德·波罗卡雷罗·扎里亚、豪尔赫·鲁埃兹·莱沃、海梅·佩切科·卡斯蒂略、卡洛斯·特洛、范尼·科内霍和范尼·费尔南德斯·梅洛制作纸巾收集在秘鲁可能。我们还感谢JaraguaGrupo Jaragua和Yolanda León的所有成员在多米尼加共和国进行组织采集，并感谢伯纳尔·罗德里格斯·埃尔南德斯、伯纳尔·马塔里塔和哥斯达黎加拉塞尔瓦生物研究站的每个人采样可能。我们感谢Ella Lattenkamp和Lutz Wiegrebe为细胞培养生成提供从Phyllostomus变色蝙蝠的翅膀冲头的获取和样本收集。细菌变色蝙蝠起源于慕尼黑路德维希-马克西米利安大学生物系II的繁殖地。慕尼黑地区兽医办公室批准了饲养和繁殖蝙蝠。LMD、SJR、KTJD 和 LRY 由 NSF-DEB 1442142 提供资金。LMD 由 NSF-DEB 1838273 提供资金。LRY 由 NSF-PRFB 1812035 提供资金。SCV 和 PD 由马克斯·普朗克研究小组奖和人类前沿科学计划 （HFSP） 研究资助 （RGP0058/2016） 资助。SJR、JHTP和KTJD由欧洲研究理事会（ERC启动赠款310482[EVOGENO]）资助给SJR，ECT由欧洲研究理事会赠款（ERC-2012-StG311000）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3 mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| Collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
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