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Biology

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59505
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 4, 5, *3,6, *2,7
1Department of Geology & Geophysics, Yale University, 2Department of Ecology & Evolution, Stony Brook University, 3Neurogenetics of Vocal Communication, Max Planck Institute for Psycholinguistics, 4School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London, 5School of Biology & Environmental Science, University College Dublin, 6Donders Institute for Brain, Cognition and Behavior, 7Consortium for Inter-Disciplinary Environmental Research, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Summary

Questo è un protocollo per la preparazione ottimale dei tessuti per analisi genomiche, trascrittomiche e proteomiche di pipistrelli catturati in natura. Esso comprende protocolli per la cattura pipistrello e la dissezione, la conservazione dei tessuti, e la coltura cellulare del tessuto pipistrello.

Abstract

Con l'avanzare delle tecnologie di sequenziamento ad alto consumo, i metodi standardizzati per l'acquisizione e la conservazione di tessuti di alta qualità consentono l'estensione di questi metodi agli organismi non modellati. Una serie di protocolli per ottimizzare la raccolta dei tessuti dai pipistrelli è stata sviluppata per una serie di approcci di sequenziamento ad alta velocità. Qui sono descritti i protocolli per la cattura dei pipistrelli, i dati demografici desiderati da raccogliere per ogni pipistrello e metodi ottimizzati per ridurre al minimo lo stress su un pipistrello durante la raccolta dei tessuti. In particolare sono descritti metodi per la raccolta e il trattamento dei tessuti per ottenere (i) DNA per analisi genomiche ad alto peso molecolare, (ii) RNA per trascrittomi specifici dei tessuti e (iii) proteine per analisi a livello proteomico. Infine, anche delineato è un metodo per evitare il campionamento letale creando colture cellulari primarie praticabili da clip ali. Una motivazione centrale di questi metodi è quella di massimizzare la quantità di potenziali dati molecolari e morfologici per ogni pipistrello e suggerire modi ottimali per preservare i tessuti in modo che mantengano il loro valore man mano che in futuro si sviluppano nuovi metodi. Questa standardizzazione è diventata particolarmente importante con l'emergere di iniziative volte a sequenziare i genomi delle specie a livello cromosomico e privo di errori, in cui sono emerse più parti scientifiche che guidano il sequenziamento di diversi livelli tassonomici, in cui sono emerse più parti scientifiche che guidano il sequenziamento di diversi livelli tassonomici. Gruppi. I protocolli qui descritti definiscono i metodi ideali per la raccolta dei tessuti e la conservazione dei tessuti per Bat1K, il consorzio che sta sequenziando i genomi di ogni specie di pipistrello.

Introduction

I metodi di sequenziamento ad alta velocità (HTS) sono progrediti rapidamente in termini di efficienza e costi ridotti ed è ora possibile scalare questi approcci a centinaia o migliaia di campioni. Le intuizioni ottenute dall'applicazione di queste tecnologie hanno un impatto enorme in diverse discipline scientifiche, dalla biomedicina all'evoluzione e all'ecologia1,2,3. Tuttavia, molte applicazioni HTS si basano in modo critico su acidi nucleici di alta qualità provenienti da una fonte vivente. Questa limitazione è destinata a diventare sempre più problematica con lo sviluppo del sequenziamento di terza generazione basato su molecole di lettura lunga4. Per questi motivi, è necessario concentrare gli sforzi per stabilire le migliori pratiche per la raccolta di campioni di tessuto freschi da organismi selvatici al di fuori del laboratorio, che massimizza l'utilità del materiale e riduce il numero di individui che devono essere raccolto.

Bat1K è un consorzio internazionale di scienziati con un'iniziativa in corso per sequenziare il genoma di ogni specie di bat to cromosomiassembly a livello di cromosomico5. I pipistrelli rappresentano il 20% della diversità dei mammiferi e hanno adattamenti eccezionali che hanno implicazioni per comprendere l'invecchiamento, l'ecologia delle malattie, la biologia sensoriale e il metabolismo5,6. Molti pipistrelli sono anche minacciati o in pericolo a causa dello sfruttamento umano7 o sono in rapido declino a causa di patogeni8,9, e il sequenziamento a livello di genoma è di grande importanza per la conservazione di queste specie. Anche se Bat1K attualmente mira a sequenziare i genomi di tutte le specie di pipistrelli, la standardizzazione della raccolta di campioni di tessuto per il sequenziamento genomico di alta qualità rimane una sfida chiave in tutta la comunità dei biologi dell'organismo. Oltre ai dati genomici, la comprensione funzionale della diversità degli adattamenti dei pipistrelli richiede trascrittoma specifico del tessuto e analisi delle proteine, spesso che richiedono protocolli di raccolta separati. Inoltre, come per tutti i gruppi tassonomici, mentre la raccolta e la conservazione ottimali dei tessuti sono essenziali per ottenere dati di altissima qualità per le analisi -omice, comunicare le migliori pratiche è spesso difficile a causa delle tecnologie in rapida evoluzione e più gruppi di ricerca che lavorano in modo indipendente.

La necessità di adottare le migliori pratiche per la ricerca sui pipistrelli è particolarmente urgente, dato che molte specie di pipistrelli sono rare o minacciate. A differenza di altri piccoli mammiferi come roditori e toporagni, i pipistrelli sono longevi, attribuibili a eccezionali meccanismi di riparazione del DNA10 e riproduzione lenta11, con la maggior parte delle specie che danno alla luce solo uno o (in alcuni casi) due giovani all'anno. Per questi motivi, le popolazioni di pipistrelli possono essere lente a riprendersi dai disturbi, e raccogliere molti individui dal selvaggio non è né consigliabile né fattibile. In altre parole, i protocolli devono essere ottimizzati per ottenere la massima quantità di dati per un singolo campione, riducendo così la necessità di replicare inutilmente gli sforzi di campionamento.

In questo caso, questo protocollo si concentra specificamente sui metodi standardizzati per la raccolta e il campionamento dei tessuti batifori per il sequenziamento genomico e trascrittomico e le analisi delle proteine. La sua priorità assoluta è quella di garantire che i tessuti di pipistrello siano raccolti eticamente e responsabilmente, che vanno dal processo di autorizzazione per la raccolta, all'esportazione dei tessuti alla minimizzazione dello stress verso l'animale e alle condizioni di conservazione a lungo termine. Sono state sviluppate dissezioni elaborate con l'obiettivo di a prova di futuro l'utilità dei diversi materiali raccolti. Questo manoscritto fornisce una guida passo-passo per raccogliere i pipistrelli in modo umano che ha lo scopo di ridurre al minimo l'impatto sulle popolazioni e massimizzare il valore scientifico. Mentre l'obiettivo di questo protocollo è specificamente per l'uso nei pipistrelli, molti dei passaggi sono rilevanti per altri taxa vertebrati, in particolare i mammiferi.

Panoramica della raccolta dei tessuti
La procedura per la raccolta dei tessuti, compresa la temperatura per lo stoccaggio e la scelta dell'agente di conservazione, sarà determinata dalla natura di eventuali analisi a valle pianificate. Tuttavia, si raccomanda vivamente che, quando possibile, il tessuto venga raccolto in una serie di metodi per massimizzare la sua utilità futura anche se non è prevista alcuna analisi specifica. In generale, il tessuto viene raccolto e conservato per le successive analisi degli acidi nucleici (DNA e RNA), o delle proteine. Per ciascuna di queste applicazioni, il tessuto può essere preservato in modo ottimale congelandolo direttamente in azoto liquido (LN2). Tuttavia, l'immersione immediata in LN2 non è sempre possibile sul campo. Con l'avanzare della tecnologia, risorse come fiale specializzate per memorizzare DNA e RNA a temperature ambientali stanno diventando sempre più facilmente disponibili. Anche se non abbiamo convalidato tutti questi materiali in questo protocollo, incoraggiamo altri ricercatori ad analizzare relativamente le prestazioni dei nuovi materiali rispetto a ciò che presentiamo qui. Forniamo metodi per preservare idealmente i tessuti per diverse applicazioni in situazioni in cui LN2 non è accessibile, ad esempio, quando il trasporto LN2 non è possibile a causa dell'accesso al sito tramite piccolo aereo in Amazon. Inoltre, forniamo un metodo per la raccolta del tessuto da cui le cellule vive possono essere coltivate e propagate. Di seguito vengono descritte le considerazioni chiave per la raccolta di materiale per ciascuno di questi rispettivi scopi e una panoramica dei metodi di raccolta è riportata nella Tabella 1.

Tessuto per DNA
Per tutti i tessuti raccolti, il supporto di stoccaggio determinerà se può essere utilizzato per l'estrazione del DNA standard o ad alto peso molecolare (HMW). L'HMW è necessario per il sequenziamento a lunga lettura e attualmente necessario per generare assemblaggi genomici del livello cromosomico, o un genoma "standard di platino". Il DNA a basso peso molecolare (LMW) può essere estratto dal flash congelato, AllProtect (d'ora in poi indicato come "soluzione stabilizzante del tessuto"), o anche RNAlater (da ora in poi "soluzione di stabilizzazione dell'RNA") campioni conservati (anche se i campioni congelati flash rimangono ottimali ). Il DNA isolato con metodi di laboratorio standard (ad esempio, colonne di spin della membrana di gel di silice, fenolo-cloroformio), può ancora produrre frammenti di DNA fino a 20 kilobase (kb). Pertanto, a condizione che vi sia una resa sufficiente, questa forma di DNA isolato può essere utilizzata per la preparazione della libreria di dimensioni a inserto singolo, in cui la dimensione dell'inserto è spesso di 500 coppie di base (bp) e vengono generate brevi letture di sequenze di 100bp. Questo DNA è particolarmente utile per progetti di "riconcisio" o studi in cui non sono richiesti dati cromosomici a lunghezza intera. Il DNA HMW (10-150 kb) è più impegnativo e può essere ottenuto in modo affidabile solo utilizzando tessuti che sono stati rapidamente congelati flash in LN2 dopo il raccolto e mantenuti ad un massimo di -80 gradi centigradi fino all'estrazione.

Il peso molecolare basso o il DNA frammentato sono spesso sufficienti per approcci mirati, tra cui l'amplificazione genica tramite PCR e il sequenziamento a lettura breve13. Indagini basate su PCR utilizzando DNA LMW che prendono di mira solo uno o pochi geni sono stati altamente informativi nella comprensione dell'adattamento e dell'evoluzione molecolare della biologia sensoriale dei pipistrelli6,14, fisiologia15, la filogenetica 5,16, e conservazione17,18. È stata inoltre dimostrata una riuscita riconquista di sequenze mirate di basso peso molecolare e DNA frammentato per numerosi gruppi di vertebrati, tra cui i pipistrelli19. Questi metodi sono spesso convenienti e minimamente invasivi per il pipistrello, poiché campioni fecali e campionamento di tessuti non letali tramite tamponi buccali o punzoni di biopsia delle ali sono anche modi comuni per ottenere il DNA per analisi a basso peso molecolare20, 21.

Tuttavia, la qualità dipende fortemente dal tipo di supporto in cui è memorizzato il campione22. Dopo confronti sistematici e quantitativi di tamponi bucchi e punzoni biopsia, è stato dimostrato che i punzoni per biopsia delle ali producono livelli di DNA costantemente più elevati ed erano meno stressanti per il pipistrello durante la raccolta22. Questi confronti hanno anche mostrato che i migliori risultati sono stati ottenuti quando il punzone alare è stato conservato in silice indicatore (cioè, un tipo di desiccante fatto di perline di gel di silice che cambia colore quando si osserva l'umidità) piuttosto che in altri supporti di stoccaggio popolari come etanolo o DMSO22; anche se non sono stati esaminati altri supporti di memorizzazione, tra cui la soluzione di stabilizzazione dei tessuti. I pugni ali possono essere utilizzati anche per far crescere le cellule fibroblaste nella coltura, come in Kacprzyk et al.23 e come descritto di seguito (vedere la sezione 6). Per questi metodi, l'ala o l'uropatagium devono essere estesi delicatamente e per ottenere il campione deve essere utilizzato un punzone di biopsia pulito, in genere di 3 mm di diametro. Questo approccio sembra non causare danni duraturi, con cicatrici che guariscono entro settimane nella maggior parte dei casi24.

Il DNA HMW (10-150 kb) è più impegnativo ed è attualmente ottenuto solo in modo affidabile utilizzando tessuto che è stato rapidamente congelato flash in LN2 dopo il raccolto e mantenuto ad un massimo di -80 gradi centigradi fino all'estrazione. Il DNA HMW (10-150 kb) è fondamentale per il sequenziamento del DNA a lunga lettura e quindi per l'assemblaggio del genoma de novo. Infatti, mentre la maggior parte dei kit commerciali può essere utilizzata per isolare alcuni DNA HMW standard, le dimensioni delle molecole risultanti spesso non soddisfano i requisiti delle tecnologie di sequenziamento di terza generazione [ad esempio, quelle lanciate da aziende come Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, e 10x Genomica, o attraverso metodi di assemblaggio offerti da Bionano Genomics o Dovetail Genomics]. Come tale, c'è una nuova domanda di DNA "ultra HMW" (>150 kb). Quando si ottiene ultra HMW DNA da pipistrelli, campioni freschi di fegato, cervello, o muscolo sono tutti adatti, ma questi devono essere immediatamente flash congelati in LN2 senza alcun buffer di stoccaggio o crioprotectant. Una descrizione completa di questi passaggi esula dall'ambito di questo documento, ma sono disponibili altrove25.

Tessuto per RNA
L'RNA è una molecola a filamento singolo che è meno stabile del DNA. Sebbene esistano molte forme di RNA, le analisi -omiche tendono a concentrarsi sull'mRNA (RNA messaggero) e sui piccoli RNA (ad esempio, i microRNA). Dopo la trascrizione, l'mRNA viene unito per formare una trascrizione matura che non contiene introni e rappresenta la porzione di codifica di geni/genomi. I geni codificanti rappresentano una piccola frazione della dimensione del genoma (1%-2%), rendendo l'mRNA mirato un mezzo conveniente per ottenere dati di sequenza per i geni. I microRNA sono una classe di RNA che regolano il processo di traduzione dell'mRNA nelle proteine e sono quindi importanti fattori normativi. Le trascrizioni dell'RNA possono essere sequenziate singolarmente, o più comunemente per le analisi -omiche26,27,28,29,30, come parte di un trascrittoma; vale a dire, il totale di tutte le trascrizioni di RNA presenti in un dato campione.

Il sequenziamento può essere eseguito seguendo diversi metodi (ad esempio, tramite RNA-seq a lettura breve o seq isoforme intero a lettura prolungata), consentendo l'analisi sia dell'abbondanza di RNA che dell'uso isoforme. Poiché la quantità e la diversità delle trascrizioni dell'mRNA variano tra cellule e tessuti, il sequenziamento dell'RNA consente di studiare e confrontare l'espressione e la regolazione genica tra i campioni. Cresce l'interesse per il sequenziamento di piccoli RNA e il sequenziamento isoforme intero, poiché questi metodi stanno diventando sempre più biologicamente informativi. La preparazione di campioni di tessuto per sequenziare diverse classi di RNA può essere eseguita nello stesso modo presentato in questo manoscritto, con solo i metodi di estrazione successivi diversi31,32. Infine, poiché i trascrittomi offrono un sottoinsieme ad alta copertura del genoma codificante delle proteine, il set di dati assemblato può essere utile nell'assemblaggio e nell'annotazione del genoma, rendendo la raccolta di dati RNA-seq in una serie di tessuti diversi un componente importante del Iniziativa Bat1K.

A differenza del DNA, l'RNA è chimicamente instabile e anche preso di mira dagli enzimi RNae, che sono onnipresentismente presenti nei lismi tisati come strategia difensiva contro i virus basati sull'RNA. Per questi motivi, la frazione di RNA nelle cellule e nei tessuti inizia a degradarsi poco dopo il punto di campionamento e/o eutanasia. Conservare l'RNA richiede quindi dei passi per prevenirne la degradazione. Questo in genere comporta la conservazione del tessuto appena raccolto a 4 gradi in un agente stabilizzante come la soluzione di stabilizzazione dell'RNA per inattivare le RNane naturalmente presenti nei tessuti, seguita dal congelamento per lo stoccaggio a lungo termine. Come alternativa preferita, il tessuto può essere congelato flash in LN2; anche se come osservato in precedenza, il trasporto di LN2 sul campo e il mantenimento dei livelli per prevenire lo scongelamento dei tessuti può essere logisticamente impegnativo.

Tessuto per proteine
La composizione delle proteine e l'abbondanza relativa variano tra le cellule e i tessuti in modo simile a quello discusso per l'RNA; tuttavia, le proteine sono in media più stabili dell'RNA. L'identificazione delle proteine con la proteomica in genere corrisponde a una frazione della sequenza proteica e non all'intera, ma può fornire informazioni sull'espressione tra i tessuti e caratterizzare gli agenti patogeni presenti. Poiché molte sequenze proteiche sono conservate tra i mammiferi, i campioni di pipistrello per la proteomica possono essere facilmente contaminati da proteine umane conservate, richiedendo protocolli sterili (ad esempio, guanti, pinze) durante la raccolta. Mentre il congelamento dei flash in LN2 è il modo migliore per prevenire la degradazione delle proteine, l'uso di ghiaccio secco, congelatori -20 gradi centigradi e persino il ghiaccio sono adatti se non ci sono altri mezzi. Con l'aumentare delle temperature, aumenta anche il rischio di ripartizione differenziale delle proteine. Gli agenti stabilizzanti come la soluzione di stabilizzazione dei tessuti sono efficaci nel preservare la frazione proteica dei tessuti a temperatura ambiente e sono adatti per la conservazione a breve termine (fino a una settimana) quando il flash-congelamento non è praticabile.

Il profilo enzimatico di un dato tessuto influenza direttamente la conservazione delle proteine in esso contenuto. Tessuti a bassa attività ezimatica come il muscolo possono preservare i profili proteici anche alle temperature più elevate in un congelatore domestico. Al contrario, il tessuto epatico è enzimaticamente reattivo e le sue proteine hanno maggiori probabilità di degradare durante la preparazione. Il crescente numero di protocolli per ottenere profili proteomici umani da campioni di paraffina -embedded (FFPE) fissati in formalina suggerisce che il fissaggio della paraformaldeide dei tessuti promette per la conservazione delle proteine a basso costo quando il congelamento al momento della raccolta non è fattibile33,34. Sebbene fortemente dipendenti dai tempi e dalle condizioni di conservazione, le proteine sono state identificate tramite immunohistochimica da esemplari di pipistrelli fissati in formalina e conservati con etanolo35. Questo approccio non è scalabile per il campionamento a livello proteomico, ma evidenzia il potenziale dei tessuti pipistrello fissati in formalina per produrre profili proteici quando il congelamento flash non è disponibile e altri agenti stabilizzanti sono troppo costosi.

Tessuti per coltura cellulare
Il campionamento del tessuto e il flash-congelamento offrono una quantità finita di materiale da utilizzare, e una volta che il materiale viene utilizzato, non è più disponibile. In alternativa, le colture cellulari forniscono cellule vive che possono essere immediatamente utilizzate o conservate per studi futuri. Le colture facilitano anche l'espansione delle cellule per aumentare la resa quando i campioni di tessuto sono piccoli. È particolarmente utile nei casi in cui la raccolta dei tessuti è limitata, come gli esperimenti con specie rare in cui il campionamento non letale è essenziale e ha quindi ampie implicazioni per la conservazione. Descritto è un protocollo in cui la coltura cellulare è possibile attraverso il campionamento non letale del tessuto della membrana alare, ma la coltura è possibile con più tipi di tessuto36,37. Il protocollo qui fornito seleziona per le cellule aderenti. La combinazione di tessuto di origine e mezzi di crescita utilizzati rende questo protocollo adatto a selezionare e far crescere i fibroblasti, ma se lo si desidera, protocolli alternativi possono essere utilizzati per selezionare per altri tipi di cellule. Nel contesto del progetto Bat1K, si prevede che per le specie rare e minacciate, il campionamento non letale di membrane alari e l'espansione dei campioni attraverso la coltura sia essenziale per generare il volume di DNA necessario per le molteplici tecnologie impiegate5 .

Cattura bat
Tutte le persone che maneggiano i pipistrelli devono essere addestrate da un ricercatore competente e vaccinate contro la rabbia con una serie di iniezioni pre-esposizione. Se morso, è ancora necessaria un'ulteriore serie di iniezioni post-esposizione. I metodi standard per l'acquisizione dei pipistrelli includono le reti di nebbia (Figura 1) e le trappole dell'arpa (Figura 2). Le reti a nebbia sono più comunemente utilizzate e ideali per le aree con un'attività da bassa a moderata, in quanto richiedono la massima cura per ridurre al minimo il disagio del pipistrello. I pipistrelli piccoli sono particolarmente vulnerabili e possono morire a fini di stress se non tendono rapidamente. Frequenti ispezioni nette riducono al minimo le lesioni e la mortalità dei pipistrelli, nonché i danni alla rete nebbiosa. Questo dettaglio è importante perché una corretta raccolta dei tessuti richiede che il tessuto sia fresco, e un'attenzione impropria alle reti della nebbia nei pipistrelli può portare a mortalità non necessaria o mortalità prematura prima che il ricercatore possa elaborare correttamente i campioni. Poiché diversi pipistrelli possono riposare in una trappola per arpa con disagio minimo, questo approccio è ideale per le aree con un'elevata attività dei pipistrelli, come vicino a una grotta o a un grande posatoio. Istruzioni dettagliate per una corretta cattura dei pipistrelli e l'elaborazione dei dati per la raccolta di informazioni morfologiche e demografiche sono disponibili nei metodi supplementari.

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Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stony Brook University (protocollo #2013-2034).

1. Eutanasia

  1. Inumidire un batuffolo di cotone con anestetico isoflurano o un altro anestetico disponibile.
  2. Mettere il batuffolo di cotone in un sacchetto di plastica resialable ermetico. La borsa dovrebbe essere abbastanza grande da contenere comodamente una borsa in un sacchetto di pipistrello di stoffa.
  3. Dopo alcuni minuti di lasciare che il sacchetto permeare con anestetico, posizionare un sacchetto di pipistrello contenente il pipistrello nel sacchetto di plastica.
  4. Attendere alcuni minuti fino a quando il pipistrello è eutanasia. I pipistrelli 20 g o meno di peso richiedono circa 5-10 min. I pipistrelli più grandi di questo possono richiedere fino a 20 min. Si consiglia di utilizzare il più sottile materiale panno possibile per massimizzare la diffusione dell'anestetico.
  5. Controllare il respiro e il battito cardiaco per assicurarsi che il pipistrello sia stato eutanasia prima dell'inizio della dissezione.

2. Preparazione della dissezione

  1. Mantenere tutta la strumentazione pulita tra le dissezioni, utilizzando il protocollo seguente.
  2. Lavare gli strumenti con acqua e sapone per piatti. Pulirli con il 10% di candeggina, lontano dall'area di dissezione, poiché la candeggina scomandrà gli acidi nucleici.
  3. Pulire con il 70% di etanolo.
  4. Pulire con il reagente di decontaminazione degli RNA.
  5. Ripetere questa sezione dopo ogni dissezione.

3. Preparazione delle fiale per i campioni di tessuto

  1. Per l'RNA:
    1. Preparare tutte le fiale prima di iniziare eventuali dissezioni per evitare ritardi.
    2. Mettere da parte il numero di fiale necessarie per ogni campione. Etichettare ogni tubo con il tipo di tessuto che verrà raccolto, nonché le informazioni standard di identificazione del campione. Riempire le fiale 50% pieno di soluzione di stabilizzazione dell'RNA, e idealmente raffreddare a 4 gradi centigradi.
    3. Fare attenzione a non riempire completamente le fiale con la soluzione di stabilizzazione dell'RNA, altrimenti il tubo potrebbe esplodere quando lo si posiziona in LN2. Quando si prelevano campioni di tessuto, ricordate che grandi grumi di tessuto non saranno completamente permeati dalla soluzione di stabilizzazione dell'RNA. Pertanto, tagliare il tessuto in pezzi più piccoli di non più grande di 0,5 cm in una dimensione e mantenere un rapporto di almeno 10:1 volume per la soluzione di stabilizzazione dell'RNA: tessuto.
    4. Come minimo, i tessuti sezionati devono essere collocati in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA, anche se l'accesso a LN2 o ai depositi a freddo non sono disponibili.
  2. Per il DNA:
    NOTA:     Il contenuto di DNA nucleare è lo stesso per quasi tutti i tessuti; pertanto, il campionamento può essere flessibile. Tuttavia, va notato che densità più elevate di mitocondri nel tessuto muscolare possono portare a una perdita di letture per il genoma nucleare38.
    1. Per il DNA a basso peso molecolare, prendere una o più repliche di membrana alare per lo stoccaggio in silice, e /o muscolo per lo stoccaggio in soluzione di stabilizzazione dell'RNA o soluzione di stabilizzazione del tessuto.
    2. Per il DNA ultra HMW, si blocca il flash in LN2 senza alcun reagente di stoccaggio, quindi trasferire in un deposito a lungo termine a -80 gradi centigradi o più freddo. Dalla dissezione cranica, il tessuto cerebrale è il tipo di tessuto più adatto per il recupero di DNA ultra HMW39, mentre dalle dissezioni postcraniche, fegato o muscolo sono più adatti40.
    3. Per la dissezione cranica, utilizzare fiale da 5 mL (a differenza delle fiale standard da 2 mL) di soluzione di stabilizzazione dell'RNA per alcuni tessuti. Tutte le fiale dovrebbero essere criogeniche. Tenere le fiale sul ghiaccio mentre si dissocia.

4. Dissezioni craniali per L'RNA

  1. Subito dopo l'eutanasia, decapitare l'esemplare con un grande paio di forbici o frese ossee (Figura 3).
  2. Rimuovere gli occhi con pinze usando una forza abbastanza forte da staccare il nervo ottico. Mettere gli occhi in una fiala da 2 mL di soluzione stabilizzante dell'RNA.
  3. Utilizzando il tuo strumento di scelta, scuoia il cranio dai muscoli dei capelli, della fascia e del cranio, inclusa la pelle sul naso. Fare attenzione a non rompere l'estremità anteriore del naso.
  4. Utilizzando le forbici, fare un taglio sagittale sulla porzione ventrale (Figura 3) del cranio a partire dal collo, avendo cura di non danneggiare il cervello.
  5. Usando le pinze, tira delicatamente indietro entrambi i lati del cranio fino a quando non si è aperto e il cervello è esposto.
  6. Sull'estremità caudale del cranio, le cocleari ora devono essere visibili lateralmente su ogni lato della testa. Sono piccole ossa sferiche sul lato sinistro e destro, appena rostrali al collo e posteriori ai muscoli masseteri. Usando le pinze, tirare delicatamente le cocleari e metterle in una fiala da 2 mL di soluzione stabilizzante dell'RNA.
  7. Raschiare delicatamente il cervello (che sarà molto morbido) con pinze. Il bulbo olfattivo diventerà visibile, seduto nella parte ventrale dell'interno del cranio. Cercate di tenere attaccata la lampadina olfattiva.
  8. Se il bulbo olfattivo non è già stato rimosso, raschiare delicatamente via il tessuto e la piastra cribriforme diventerà evidente. Questo è un osso critico per mantenere il ricercatore orientato. Può essere identificato come la regione più anteriore del cranio con più foramen e il punto in cui riposano due scanalature dove riposa il bulbo olfattivo.
  9. Se possibile, mantenere intatta la forma del cervello e posizionare immediatamente sul ghiaccio secco per mantenere la forma o in una fiala da 5 mL di soluzione di stabilizzazione dell'RNA. Se l'immunohistochimica deve essere eseguita sul cervello, inserire in 4% paraformaldeide, se disponibile.
  10. Fare due incisioni dove la mascella superiore e inferiore si uniscono, e rimuovere la mandibola.
  11. Una volta rimossa la mandibola, rimuovere il rostro (mascella superiore) dalla parte rimanente del cranio. Assicurarsi che la mascella includa la piastra del presepe.
  12. Mettere il naso in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA e conservare a 4 gradi centigradi durante la notte. Poiché questo è un tessuto denso, richiede tempo per consentire all'RNA soluzione stabilizzante per permeare l'intero tessuto.
  13. Mettere la fiala del naso in LN2 dopo il bagno notturno in soluzione stabilizzante dell'RNA.
  14. Dalla mandiboriera inferiore, tagliare la lingua con le forbici e metterla in una fiala di RNA da 2 mL per dopo.
  15. Questo protocollo perfora la maggior parte del cranio. I denti, in particolare quelli della mandibile, possono essere recuperati e possono essere utili per la diagnostica delle specie. Il tessuto osseo può essere immagazzinato in una soluzione salina con buffer di fosfato (PBS) 1x.

5. Dissezioni postcraniali per l'RNA

  1. Utilizzare un bisturi per perforare attraverso la cavità addominale, facendo un'incisione longitudinale fino alle costole (Figura 3). Questo perfora il telaio scheletrico. Se l'osso deve essere conservato, sezionare con attenzione dalla pelle nel muscolo e conservare in 1x PBS dopo che la dissezione dei tessuti molli è completa.
  2. Strisciare la pelle per rivelare il muscolo pettorale, prendere almeno due campioni di muscolo, uno per la soluzione di stabilizzazione dell'RNA e uno per rimanere congelati per il DNA HMW, mettendo immediatamente in una fiala per mettere in LN2.
  3. Tagliare lo sterno e togliere le costole per raccogliere campioni dal polmone.
  4. Raccogliere il cuore, che può essere preso intero, ma deve essere sezionato a metà, in modo che la soluzione di stabilizzazione dell'RNA assorbe accuratamente.
  5. Prendi dei campioni dal fegato. Prendere almeno due campioni di fegato, uno per rimanere congelati per il DNA HMW, mettendo immediatamente in una fiala vuota per mettere in LN2. Il fegato è molto enzimatico, ed è importante rendere i campioni abbastanza piccoli per la soluzione stabilizzante dell'RNA per immergersi completamente.
  6. Il condotto epatico, che funziona per drenare la bile dal fegato, collega il fegato al pancreas e all'intestino tenue. Questo vaso è facilmente identificabile sondando la porzione inferiore/posteriore del fegato e tracciando il vaso in modo posteriore. Il condotto è spesso un colore verdastro, pure. Seguire il condotto epatico per trovare il pancreas e la cistifellea e raccoglierli separatamente. Mettere nelle rispettive fiale di RNA stabilizzato soluzione.
  7. Raccogliere lo stomaco e, accanto ad esso, alla sua base e apparire come una diversa tonalità di viola, è la milza piuma-come. Il pancreas dovrebbe anche essere visibile qui come una struttura bianca (Figura 3). Mettere nelle rispettive fiale di RNA stabilizzato soluzione.
  8. Raccogliere piccoli campioni di intestino piccolo e grande. Mettere nelle rispettive fiale di RNA stabilizzato soluzione. Gli intestini possono anche essere sottoposti a screening per l'endoparassita. Se un parassitologo è sul campo, può essere eseguita un'ispezione per i parassiti. Se questo deve essere fatto in un secondo momento, l'intero intestino può essere assunto in una fiala criogenica 5 mL.
  9. Prendi uno dei reni e segui i loro condotti fino alla vescica. Mettere nelle rispettive fiale di RNA stabilizzato soluzione.
  10. Utilizzare l'altro rene come guida per trovare i testicoli (se maschili) o l'utero e attraverso di esso le ovaie (se femminili). Raccogliere uno o entrambi i gonadi, se possibile.
  11. Conservare i campioni di varie parti della pelle dell'ala in fiale separate (parte muscolare o non muscolare).

6. Raccolta e preparazione della cultura dei tessuti

  1. Preparare il mezzo di crescita per le cellule montando il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 20% di siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina/streptomicina (P/S) e 50 g/mL di gentamicina. Le aliquote dei mezzi di crescita dovrebbero essere rese fresche ogni giorno del protocollo.
  2. Dopo la raccolta, i pugni di biopsia dell'ala devono essere posizionati direttamente in 1 mL di mezzo di crescita fredda in un tubo di centrifuga di 1,5 mL ben sigillato. Avvolgere il tubo in parafilm per sigillare.
  3. I tubi devono quindi essere trasportati in una scatola di polistirolo con elementi di raffreddamento per mantenere i campioni a 4 gradi centigradi. Il trasporto deve essere accelerato; anche se, le cellule sane possono essere fatte da punzoni che sono stati memorizzati in questo modo per un massimo di 6 giorni, ma meno in modo ottimale23.
  4. Una volta trasportato in struttura di coltura tissutale, il seguente protocollo può essere utilizzato per generare colture cellulari. Per il resto del protocollo41si devono utilizzare tecniche sterili standard.

7. Cultura dei tessuti del giorno 1: dissociazione dei tessuti

  1. Trasferire il contenuto del tubo (mezzo di crescita contenente la biopsia della membrana alare) in un tubo di centrifuga conica da 15 mL.
  2. Rimuovere con attenzione il mezzo di crescita. Lavare delicatamente la biopsia due volte con 500 gradi di PBS sterile.
  3. Aggiungere al tubo 500 l di collagenae IV (1 mg/mL). Questo causerà la digestione del tessuto in singole cellule.
  4. Incubare durante la notte (massimo 16 h) a 37 gradi senza agitazione.

8. Giorno 2 Tessuto Coltura: Cellule di placcatura

  1. Recuperare il mezzo di crescita fresco e pre-riscaldarlo a 37 gradi centigradi.
  2. Preparare una piastra di coltura dei tessuti a 6 pozzetti aggiungendo 2 mL di mezzo fresco di crescita preriscaldato in ogni pozzo della piastra da utilizzare (1 ben per 3 mm di biopsia alare). Conservare questa piastra in un'incubatrice di 37 e 5% di CO2 fino a quando necessario (passaggio 8.7).
  3. Rimuovere il tubo da 15 mL contenente le cellule dell'incubatrice e dissetare la reazione di digestione aggiungendo 1 mL di mezzo di crescita fresco (preriscaldato a 37 gradi centigradi).
  4. Risospendere le cellule triturando con attenzione la soluzione con una punta di pipetta P1000 per ottenere una sospensione a cella singola.
  5. Ruotare delicatamente verso il basso le cellule in una centrifuga superiore del tavolo per 3 min a 300 x g.
    NOT: Piccoli pezzi di tessuto possono essere ancora visibili in sospensione o attaccati alla parete del tubo da 15 mL. Tuttavia questo non influisce sulla preparazione della sospensione cellulare
  6. Scartare il supernatante rimuovendo delicatamente l'80–90% del liquido con una pipetta P1000.
    NOTA: se ancora visibile, non scartare il pezzo di tessuto e triturarlo delicatamente nel passaggio successivo (8.7).
  7. Risospendere il pellet a 500 gradi di mezzo di crescita preriscaldato, triturare delicatamente le sospensioni per garantire che il pellet o grandi frammenti del pellet non siano più visibili e che le cellule siano sufficientemente sospese. I supporti possono sembrare torbidi a causa della presenza di cellule.
    NOT: In questa fase, è possibile eseguire un conteggio delle cellule praticabile per valutare la qualità della sospensione delle celle e la resa delle cellule derivate dalla clip alare (vedere il passaggio 10.11 per ulteriori dettagli).
  8. Pipette delicatamente l'intero volume di sospensione cellulare in un unico pozzo di un 6 pozzo.
    NOT: Eseguire immediatamente il passaggio precedente e non consentire alle celle di stabilirsi dopo il passaggio 8.7. Utilizzare una pipetta per distribuire delicatamente la sospensione cellulare sulla superficie del pozzo in modo dropwise. Non convogliare l'intera soluzione nel centro del pozzo, in quanto ciò comporterebbe l'agglomerazione delle cellule al centro del pozzo.
    NOTA: se il pezzo di tessuto è ancora visibile, non trasferirlo bene nel recipiente di coltura.
  9. Per ottenere un'azione leggermente culla tra un lato e un 2x e un 2x da un lato all'altro, le cellule si dissolvano sulla superficie del pozzo in un unico strato.
  10. Controllare le cellule placcate al microscopio, in quanto dovrebbero essere singole cellule che appaiono sballate e galleggianti ma molto dense.
  11. Collocare con cura la piastra in un'incubatrice preimpostata a 37 e 5% di CO2.
  12. Dopo 24 h, osservare le cellule al microscopio per determinare la salute della coltura. Le celle dovrebbero ora essere attaccate alla superficie della piastra e apparire appiattite (Figura 4A). Diversi tipi di cellule possono essere visibili nella coltura quando si guarda attraverso il microscopio.
  13. Ci saranno probabilmente alcune cellule fluttuanti che non hanno attaccato. Una parte di queste cellule è morta. Se c'è un'alta percentuale di celle mobili visibili nel pozzo, il supporto deve essere aggiornato. In questo caso, aspirare con cura il 50% del mezzo dal pozzo e aggiungere delicatamente 1 mL di mezzo di crescita preriscaldato al lato del pozzo in modo da non disturbare le cellule.
  14. Mantenere le cellule in un'incubatrice preimpostata a 37 e 5% di CO2. Le cellule devono essere osservate regolarmente al microscopio (ma non più di una volta al giorno) per determinare la necessità di un rinfresco o di una divisione dei media.
    NOT: Quando le cellule sono appena placcate, si divideranno rapidamente e quindi dovrebbero essere controllate ogni giorno. Dopo qualche tempo nella cultura, la crescita rallenterà e può essere controllata ogni 48-72 h.

9. Aggiornamento dei supporti

  1. Controllare regolarmente le cellule al microscopio per osservarne la crescita e la qualità della coltura. Monitorare il colore del supporto come indicatore della sua qualità. Le cellule devono rimanere nello stesso supporto per un massimo di 3 giorni o fino a quando non è necessario passare, a seconda di quale viene prima.
    1. Se le cellule crescono rapidamente ed esauriscono il supporto, anche questo sarà visibile all'occhio, poiché il colore del supporto si trasformerà da rosso a giallo.
  2. Quando necessario aspirare con attenzione il 50% del mezzo dal pozzo e aggiungere delicatamente approssimativamente approssimativamente lo stesso volume di mezzo di crescita preriscaldato al lato del pozzo in modo da non disturbare le cellule.
  3. Riportare le cellule all'incubatore di CO2 a 37 e 5%.

10. Cellule passaging

  1. Le cellule passanti si intendono prendere una coltura esistente e dividerla in nuovi pozzi. Il passaggio dovrebbe avvenire quando le cellule sono confluenti all'80% [cioè, quando occupano l'80% della superficie del pozzo e solo il 20% della plastica è ancora visibile come spazi vuoti (Figura 4B)].
  2. Aspirare con cura e scartare il 90% del mezzo di crescita.
  3. Lavare le cellule molto delicatamente aggiungendo 1 mL di PBS sterile alla parete del pozzo in modo da non disturbare le cellule. Scossa delicatamente il piatto avanti e indietro e da un lato all'altro 2x–3x. Aspirare con attenzione e scartare tutti i PBS dalla piastra.
  4. Ripetere il passaggio 10.3 per lavare nuovamente le celle.
  5. Aggiungere delicatamente al pozzo 250 gradi di tripsina-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) e incubare per 1,5 min a temperatura ambiente.
    NOT: Assicurarsi che la soluzione trypsin-EDTA copra l'intera superficie del pozzo dondolando delicatamente la piastra.
  6. Suscitare la reazione aggiungendo 1 mL di fresco mezzo di crescita preriscaldato.
  7. Pipetta su e giù 5x per lavare le cellule dalla superficie della piastra e garantire che le cellule sono in sospensione.
    NOT: La soluzione dovrebbe diventare nuvolosa a causa della presenza delle cellule.
  8. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL e ruotare verso il basso le cellule in una centrifuga da tavolo per 3 min a 300 x g.
  9. Scartare il supernatante rimuovendo delicatamente l'80–90% del liquido con una pipetta P1000.
  10. Risospendere il pellet in 1 mL di mezzo di crescita preriscaldato e triturare delicatamente la sospensione. Assicurarsi che il pellet o grandi frammenti del pellet non siano più visibili e che le celle siano in una sospensione a cella singola.
  11. Contare le celle utilizzando un contatore cellulare automatizzato come descritto di seguito, o manualmente utilizzando un emocitometro come descritto in dettaglio nel video di riferimento42. Mescolare un'aliquota di 10 l-l delle cellule sospese 1:1 con Trypan blu per rilevare le cellule vitali.
  12. Incubare per 1 min e pipetta 10 l della soluzione sul vetrino di conteggio. Inserire la diapositiva di conteggio in un contatore di celle automatico per contare le celle utilizzando le impostazioni appropriate. La resa dovrebbe essere di circa 1-2 milioni di cellule da un singolo pozzo confluente di un pozzo 6 pozzo, anche se questo può variare a seconda delle dimensioni delle cellule e delle specie. Se le celle non sono in una singola sospensione di cella, il conteggio delle celle non sarà accurato.
  13. Queste colture cellulari generalmente tollereranno una divisione 1:2 [cioè, un pozzo confluente di cellule può essere diviso in due nuovi pozzi (totale)]. Per fare questo, triturare delicatamente le cellule di nuovo, quindi prendere la sospensione cellulare in due metà (730 dollari l'uno) e metterle in ciascuno dei due nuovi pozzi contenenti 750 l di mezzo di crescita preriscaldato in modo dropwise.
    NOT: Dopo 2-3 giorni i pozzi dovrebbero essere confluenti e di nuovo pronti per la scissione. A questo punto, si consiglia di preservare un pozzo di cellule dal protocollo di congelamento viably (sezione 11). Ulteriori scorte di cellule possono essere congelate durante ulteriori passaggi come desiderabile.
    NOT: Dopo 6 passaggi, le cellule tendono a entrare nella senescenza e non si divideranno più. Questa è un'indicazione che le celle non possono più essere divise o espanse per aumentare il numero di celle. Questa è anche un'indicazione che le cellule non saranno vitali per molto più tempo.

11. Congelamento delle cellule viventi vitali

  1. Preparare i supporti di congelamento combinando DMEM con 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S, e 50 g/ mL gentamycin.
  2. Il congelamento viene eseguito prendendo le cellule pelletizzate in base al processo di passaggio. Il pellet deve essere preparato da un pozzo confluente dell'80%-90% di una piastra 6 (che rappresenta 1–2 milioni di cellule), secondo i passi 8,1–8,9.
  3. Risospendere il pellet in 1,5 mL di mezzo di congelamento.
  4. Collocare 750 litri di sospensione cellulare in ciascuno dei due crioviali separati.
  5. Posizionare le fiale in un contenitore di congelamento criogenico, che si traduce nel congelamento delle cellule lentamente per mantenere la vitalità delle cellule. Mettetele immediatamente a -80 gradi centigradi.
  6. Dopo 24-48 h, trasferire i crioviali delle cellule a LN2 per lo stoccaggio a lungo termine. Memorizzati in questo modo, le cellule possono essere rianimate e saranno vitali per anni.

12. Scongelamento delle celle congelate

  1. Preparare una piastra 6 po ' contenente 2 mL di mezzo di crescita preriscaldato in ogni pozzo che verrà utilizzato (1 bene per fiala di cellule scongelate). Mantenere la piastra nell'incubatrice di CO2 del 5% e del 5% fino a quando necessario.
  2. Prendere una fiala di cellule da LN2 e metterla in un bagno d'acqua calda (37 gradi centigradi) per scongelare rapidamente le cellule. Questo dovrebbe richiedere 2-3 min.
    NOT: Non lasciare le fiale scongelate per più di 3-5 min, in quanto il DMSO nei mezzi di congelamento è tossico per le cellule una volta scongelato.
  3. Non appena la soluzione nella fiala viene scongelata, pipette delicatamente su e giù per omogeneizzare la soluzione e posizionare immediatamente l'intera soluzione (750 dollari l') in un pozzo di un pozzo 6 (pre-preparato al passo 12.1).
  4. Per fare oscillare delicatamente la piastra da un lato all'altro e da una parte anteriore all'altra 2-3 volte, per aiutare le cellule a distribuire sulla superficie del pozzo in un unico strato.
  5. Collocare le cellule nell'incubatrice a 37 e 5% di incubatrice di CO2 per 24-48 h.
  6. Monitorare e passare le celle come descritto sopra.

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Representative Results

Dna
Per le analisi standard a basso peso molecolare (LMW), il DNA è stato estratto da tre specie di pipistrelli neotropicali. Campioni di tessuti sono stati raccolti sul campo dalla Repubblica Dominicana e dal Costa Rica, seguendo i protocolli descritti in questo documento. A seguito della dissezione, piccoli pezzi (<0,5 cm nella sezione più sottile) di tessuti misti (cervello, fegato e intestino) sono stati collocati in soluzione stabilizzante dell'RNA, congelati flash, quindi immagazzinati a -80 gradi centigradi. Le estrazioni sono state effettuate utilizzando protocolli standard di estrazione del DNA con trattamento RNase43. La valutazione dell'integrità del DNA con uno strumento automatico di elettroforesi ha rivelato i seguenti picchi di campioni rappresentativi di dimensioni dei frammenti: la specie 1 (due estrazioni separate) consisteva di 22 kb e 20 kb; Specie 2 consisteva di 25 kb; e la specie 3 consisteva di 24 kb (Figura 5, Tabella 2).

Il DNA estratto per il sequenziamento di terza generazione deve essere raccolto in alte concentrazioni e frammentato minimamente. È stato ottenuto il DNA HMW estratto dal tessuto cerebrale congelato da un pipistrello della frutta del Vecchio Mondo (Eidolon helvum). Il DNA HMW è stato estratto utilizzando il protocollo di estrazione Bionano per successive analisi sulla piattaforma Irys. Questo DNA era lungo 607.463 Mb e aveva una media molecolare N50 di 194,5 Mb.

Rna
Un indicatore comune del successo per le estrazioni di RNA è il valore del numero di integrità dell'RNA (RIN). Spesso non è raccomandato dalle strutture di sequenziamento di eseguire un protocollo di preparazione della libreria RNA-seq o di sequenziamento quando le estrazioni hanno un valore RIN inferiore a otto, poiché i valori al di sotto di questa soglia iniziano a dimostrare alte firme di degradazione44 ,45. La figura 6 mostra i valori di RIN per le estrazioni di RNA di vari tipi di tessuto che seguono questo protocollo. L'estrazione dei tessuti raccolti con i protocolli ha portato ad RNA di alta qualità, indipendentemente dalla località di campionamento sul campo. Quando LN2 non era immediatamente disponibile in Amazzonia, i tessuti sono stati messi in soluzione di stabilizzazione dell'RNA e tenuti a 4 gradi centigradi per 1 settimana fino a quando sono stati messi in LN2. Anche in questi casi, i valori di RIN erano paragonabili a quelli immediatamente posizionati in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA e direttamente in LN2. La soluzione di stabilizzazione dell'RNA è un agente stabilizzante essenziale.

Cultura dei tessuti
Subito dopo la placcatura, le cellule saranno ballate e galleggianti. Tuttavia, entro 24 h, i fibroblasti devono appiattirsi e attaccarsi alla superficie della piastra (Figura 4A). A questo punto, le cellule dovrebbero essere a circa 20%-30% confluenza per garantire la sopravvivenza. Un valore inferiore a questo può provocare la morte dell'intera cultura. Inizialmente, devono avere ampio spazio tra di loro per consentire l'espansione, in quanto le cellule si divideranno ed espanderanno in coltura. Dovrebbero essere divisi quando raggiungono l'80%-90% di confluenza [cioè, coprono >80% della superficie della piastra (Figura 4B)]. In questo modo, le cellule possono essere mantenute in coltura per una serie di passaggi (di solito >6 passaggi) prima di subire la senescenza. Se le cellule vengono mantenute in coltura oltre questo periodo o non vengono divise quando diventano confluenti, possono cambiare morfologia e diventare più grandi e più lunghe (Figura 4C). Le cellule con questa morfologia possono ancora dividersi, ma questo di solito indica che le cellule sono o entreranno presto in senescenza e non saranno più in grado di essere mantenute o espanse nella coltura.

Figure 1
Figura 1: Un set comune per le reti di nebbia per catturare i pipistrelli nella foresta. Mantenere una mano coperta mentre districare con la mano opposta è un modo per rimuovere in modo sicuro il pipistrello riducendo al minimo lo stress. Questa foto è stata scattata da Jon Flanders. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Una trappola per arpa viene spesso utilizzata per catturare grotte esterne, grandi posatoi o fly-away. I pipistrelli si accumulano nella sacca inferiore della trappola con un intrappolamento minimo e una facile rimozione da parte dell'investigatore. Questa foto è stata scattata da Stephen Rossiter. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Flusso di lavoro di dissezioni e campionamento dei tessuti per la preparazione del tessuto dell'RNA.

Figure 4
Figura 4: Colture di cellule bative derivate da punzoni ali di Phyllostomus scolorire. (A) 24-48 h dopo la placcatura, le cellule diventeranno appiattite e si attaccano alla superficie della piastra. (B) Le cellule coprono l'80%-90% della superficie della piastra e mantengono la morfologia originale. Questo rappresenta la fase ottimale per la divisione. (C) Dopo >6 passaggi, le cellule cambieranno la loro morfologia per diventare più grandi e più a lungo, e le cellule entreranno nella senescenza. In tutte le immagini, le cellule luminose e sballate rappresentano cellule morte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Risultati rappresentativi delle estrazioni di DNA dalla conservazione per analisi standard del DNA da tre specie di pipistrelli, il DNA è stato estratto due volte dalla specie 1. Una singola grande banda indica una minima frammentazione e frammenti di DNA di dimensioni simili da ogni rispettiva estrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Numeri di integrità dell'RNA (RIN) di estrazioni di RNA da 13 diversi tipi di tessuti da specie di pipistrelli neotropicali campionati in quattro località diverse. Queste estrazioni sono state preparate seguendo il protocollo descritto e quindi sono state utilizzate per preparare le librerie di trascrizioni HiSeq/NextSeq Illumina. MOE è il principale epitelio olfattivo. Il VNO è l'organo vomeronasale. I tessuti campionati da specie nelle Ande, costa rica e Repubblica Dominicana sono stati collocati direttamente in LN2 dopo aver ammollo in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA a 4 gradi durante la notte. I tessuti campionati da specie nell'Amazzonia sono stati collocati in LN2 circa 1 settimana dopo l'immissione in una soluzione stabilizzante dell'RNA e mantenuti continuamente a 4 gradi centigradi. N rappresenta il numero di individui rappresentati per ogni estrazione tissutale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

domanda Flash congelato (L2) RnAlater AllProtect FFPE medio
DNA ad alto MW Y X Y X X
BASSO DNA MW Y Y Y X X
Rna Y Y Y X X
proteina Y X Y Y X
Cultura cellulare X X X X Y

Tabella 1: Panoramica dei metodi e delle applicazioni di conservazione. MW - peso molecolare, FFPE - tessuto incorporato in paraffina-fissato in formalina. I segni di spunta indicano il metodo di conservazione preferito per ogni applicazione prevista. I segni X indicano le conservazioni che non devono essere utilizzate.

ID Specie ID di esempio Concentrazione (ng/L) Dimensione di picco frammento campione (bp)Sample fragment peak size (bp)
Specie 1 1.1 31.8 21,885
1.2 22.8 19,633
Specie 2 2 30.4 25,198
Specie 3 3 32 24,386

Tabella 2: Risultati rappresentativi per le estrazioni di DNA basate sui metodi di conservazione in questo protocollo. I valori corrispondono ai pozzi di elettroforesi gel dalla figura 5.

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Discussion

Il protocollo discusso in questo manoscritto descrive le migliori pratiche di campionamento per varie analisi molecolari ad alto throughput di pipistrelli. Tutti gli studi -omics di successo richiedono tessuto di alta qualità, ma il campionamento del tessuto pipistrello, così come altri organismi non modellati, si verifica spesso in condizioni di campo che non possono essere fissate agli stessi standard di quelli di un ambiente di laboratorio controllato. Il campionamento avviene spesso in postazioni remote, con risorse minime, tra cui un accesso limitato all'elettricità e ai congelatori. È difficile, e spesso impossibile, garantire condizioni di campionamento completamente sterili. Così, delineati sono i protocolli identificati come i più efficaci in una varietà di località di campionamento e condizioni di campo. Al fine di avere metodi di campionamento standardizzati per l'iniziativa Bat1K e relativi sforzi e progetti, si suggerisce che i biologi pipistrello seguano questi protocolli durante la pianificazione delle spedizioni sul campo nella misura consentita.

Suggerimenti per il protocollo
Mentre la compressione toracica era un approccio comune per l'eutanasia in passato, si suggerisce di non usare mai la compressione toracica per raccogliere pipistrelli per le analisiomiche. Non è più una forma accettabile di eutanasia negli Stati Uniti46, e questo metodo può portare alla degradazione ezimatica di una serie di tessuti, non importa la specie di interesse47. Se un animale sarà eutanasia, si suggerisce che il tessuto sia per le analisi genomiche che per quelle trascrittomiche venga raccolto. Entrambi richiedono la raccolta di tessuto fresco che idealmente sarebbe flash congelato in LN2, ma che può anche essere immagazzinato in diversi supporti per facilitare l'estrazione di DNA, RNA o proteine. Si suggerisce di lavorare in parallelo con due persone a dissezioni craniche e postcraniche per ridurre la degradazione dell'RNA nei tessuti. Una persona dovrebbe sezionare il cranio mentre l'altra lavora sul post-cranio.

Le principali limitazioni dell'esecuzione dei protocolli di dissezione comprendono il personale coinvolto nella dissezione e lo spazio disponibile per la conservazione dei tessuti (ad esempio, nel serbatoio LN2). La preparazione anticipata delle fiale e un numero sufficiente di persone per assistere con tubi di etichettatura e documentazione fiale e tessuti raccolti contribuirà a facilitare l'elaborazione del campione. Va notato che una corretta documentazione dei campioni è essenziale per ottenere i processi necessari (esportazione, importazione). Il protocollo di dissezione postcranica, ad esempio, richiede più di 20 fiale per animale.

Se lo spazio e il tempo sono limitati, è necessario dare priorità a quanto segue: 1) priorità per un esemplare per le specie, o al minimo, un esemplare per genere; priorità per un esemplare maschio per consentire il sequenziamento del cromosoma X e Y e la minimizzazione della probabilità di campionamento di una femmina riproduttiva; 2) per il DNA HMW: cervello, muscoli e fegato devono essere congelati flash senza alcun reagente; 3) per l'RNA: cervello, tessuti digestivi, milza e organi sensoriali sono ad alta priorità. Ogni campione di tessuto deve essere conservato in soluzione di stabilizzazione dell'RNA. Il tessuto muscolare dovrebbe anche essere preso come un controllo per le analisi di espressione del tessuto specializzato; 4) come minimo, i tessuti devono essere mantenuti freddi; 5) anche la disponibilità di LN2 può destare preoccupazione. I serbatoi LN2 devono essere riempiti al minimo ogni due settimane, ma più frequentemente in climi più caldi o se il serbatoio è spesso aperto. LN2 è spesso disponibile in commercio in tutti i paesi, in quanto viene spesso utilizzato in agricoltura e sanità per il trasporto di campioni. Di solito questi servizi sono forniti da aziende che vendono anche altri gas, come l'anidride carbonica o l'ossigeno. Le gelaterie a volte offrono un'altra opzione per il ghiaccio secco o LN2 (o almeno forniscono una raccomandazione per l'acquisto), e si consiglia di chiedere assistenza al personale locale con questo; 6) La figura 6 delinea il successo delle estrazioni di tessuti per alcune spedizioni di raccolta in cui le condizioni erano limitate.

Con più persone e più spazio, più tessuto può essere raccolto in modi diversi. I seguenti sono protocolli aggiuntivi pubblicati altrove che gli investigatori dovrebbero considerare se sono disponibili l'esperienza e i materiali adeguati: 1) il metaboloma del pipistrello, o tutti i metaboliti del peso molecolare ridotto di cellule e tessuti, possono fornire l'eccezionale longevità o ibernazione dei pipistrelli e le esigenze di volo metabolico. Il sangue deve essere raccolto da un vaso sanguigno facilmente accessibile, come le vene della caviglia, in una fiala con eparina48, e i campioni fecali devono essere congelati in LN249; 2) l'immunomica, o la risposta dell'animale agli agenti patogeni, può essere analizzata prendendo femore e humeri e collocandoli in soluzione di coltura tissutale ai macrofagi di coltura a valle50; 3) le feci possono essere utili per due tipi di analisi a base nucleica a valle, come determinare la dieta51 e sondare il microbioma intestinale52,53,54. In entrambi i casi, i reagenti come la soluzione di stabilizzazione dei tessuti riducono la degradazione delle varianti rare presenti nelle feci; 4) la lipidomica, o i repertori di fosfolipidi di un tipo di tessuto, ha rivelato nella comprensione della sindrome fungina della sindrome del naso bianco55,56. La preparazione del tessuto è suggerito per essere congelato immediatamente dopo la dissezione.

Archivi di tessuti per Bat1K
Bat1K mira a mantenere una banca di tessuti di ogni singolo pipistrello che viene utilizzato per generare i genomi. Attualmente, queste banche del tessuto e i relativi dati fenotipici ed ecologici raccolti per individuo sono mantenuti nelle collezioni laboratori/museo dei membri che contribuiscono Bat1K. Man mano che il progetto progredisce, Bat1K centralizzerà e manterrà le collezioni di tessuti e le banche dati pertinenti attraverso archivi in rete come la Global Genome Biodiversity Network .

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Centro de Ecologàa y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sonchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Visquez, Harold Porocarrero sarria, Jorge Ruàz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, il tessuto Fanny Cornejo e Fanny Fernànez Melo per la realizzazione di raccolta in Perù possibile. Ringraziamo anche tutti i membri del Grupo Jaragua e di Yolanda Leàn per aver reso possibile la raccolta dei tessuti nella Repubblica Dominicana, così come a Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, e tutti alla Stazione di Ricerca Biologica La Selva in Costa Rica, per aver reso campionamento possibile. Ringraziamo Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe per l'accesso e la raccolta di campioni di punzoni sulle ali di Phyllostomus scolorire i pipistrelli per la generazione della coltura cellulare. Phyllostomus scolorire pipistrelli provenienti da una colonia riproduttiva nel Dipartimento Biologia II del Ludwig-Maximilians-Università di Monaco. L'ottenimento e la rivasa dei pipistrelli è stato rilasciato dall'ufficio veterinario del distretto di Monaco. LMD, SJR, KTJD e LRY sono stati finanziati da NSF-DEB 1442142. LMD è stato finanziato da NSF-DEB 1838273. LRY è stato finanziato dalla NSF-PRFB 1812035. SCV e PD sono stati finanziati da un Max Planck Research Group Award e da una borsa di ricerca Human Frontiers Science Program (HFSP) Research (RGP0058/2016). SJR, JHTP e KTJD sono stati finanziati dal Consiglio europeo della ricerca (ERC Starting grant 310482 [EVOGENO]) assegnato al SJR, ECT è stato finanziato dalla sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca (ERC-2012-StG311000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes Fischer Scientific 10509691 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes Sarstedt 62,554,002 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials Thomas Scientific 1154P75 cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punch Medline MIL3332 wing biopsy punch for cell culture
6 well plate Greiner 83,392 Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent Qiagen 76405 for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber Bio-Rad 145-0011 Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IV Stemcell Technologies 7909 For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-5X5ML Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 12491-015 culture media
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190169 Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS) Fischer Scientific 10270106 Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt Sigma Aldrich G1264-250MG Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0050 Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILM Sigma P7793 Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x Invitrogen 15140130 Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 Thermo Fisher 10010023 salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlater Thermo Fisher AM7021 RNA stabilizing solution
RNAse away Genetech 83931-250mL breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel Fisher Scientific 7631-86-9 dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102 Automated cell counter
Trypan blue Bio-Rad 145-0013 Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4049 For dissociation of cells during splitting

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References

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  4. Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
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Biologia Numero 152 pipistrelli genomica trascrittomica campionamento dei tessuti conservazione dei tessuti dissezione coltura cellulare
Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture
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Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. … More

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. T. J., Potter, J. H. T., Rossiter, S. J., Teeling, E. C., Vernes, S. C., Dávalos, L. M. Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (152), e59505, doi:10.3791/59505 (2019).

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