Summary
これは、野生で捕獲されたコウモリのゲノム、トランスクリプトーミクス、およびプロテオミクス分析のための最適な組織調製のためのプロトコルです。これは、コウモリの捕獲および解剖、組織保存、およびコウモリ組織の細胞培養のためのプロトコルを含む。
Abstract
ハイスループットシーケンシング技術が進歩するにつれて、高品質の組織の取得と保存のための標準化された方法は、非モデル生物へのこれらの方法の拡張を可能にします。コウモリからの組織収集を最適化する一連のプロトコルは、一連のハイスループットシーケンシングアプローチのために開発されました。ここでは、コウモリの捕獲のためのプロトコル、各コウモリに対して収集する必要な人口統計、および組織収集中のコウモリへのストレスを最小限に抑えるために最適化された方法を示します。具体的には、(i)高分子ゲノム解析用の(i)DNA、組織特異的転写物用のRNA、および(iii)プロテオミクスレベル分析用のタンパク質を得るための組織を収集および処理する方法を概説する。最後に、ウィングクリップから生存可能な一次細胞培養物を作成することによって致命的なサンプリングを回避する方法も概説する。これらの方法の中心的な動機は、各コウモリの潜在的な分子および形態学的データの量を最大化し、組織を保存する最適な方法を提案し、将来的に新しい方法が開発されるにつれてその価値を維持することです。この標準化は、染色体レベルのエラーのない種のゲノムを世界中で配列するイニシアチブが出現し、複数の科学当事者が異なる分類のシーケンシングを先導しているので、特に重要になっています。グループ。ここに概説されるプロトコルは、Bat1Kの理想的な組織収集および組織保存方法を定義し、コウモリのあらゆる種のゲノムを配列するコンソーシアムである。
Introduction
ハイスループットシーケンシング(HTS)方式は、効率が急速に向上し、コストが削減され、これらのアプローチを数百または数千のサンプルに拡張できるようになりました。これらの技術の応用によって得られた洞察は、生物医学から進化と生態学に至る複数の科学分野に大きな影響を及ぼします1,2,3.しかし、多くのHTSアプリケーションは、生きている源からの高品質の核酸に批判的に依存しています。この制限は、長読み分子4に基づく第3世代シーケンシングの開発に伴い、ますます問題となる可能性が高い。そのため、研究室外の野生生物から新鮮な組織サンプルを採取するためのベストプラクティスの確立に注力する必要があり、材料の有用性を最大化し、必要な個体数を減らす必要があります。収集。
Bat1Kは、染色体レベルのアセンブリ5にコウモリのすべての種のゲノムを配列するための継続的なイニシアチブを持つ科学者の国際的なコンソーシアムです。コウモリは哺乳類の多様性の20%を表し、老化、疾患生態学、感覚生物学、代謝5、6を理解するための影響を持つ例外的な適応を有する。多くのコウモリはまた、人間の搾取7のために脅かされたり、絶滅の危機に瀕しているか、病原体8、9、およびゲノムレベルのシーケンシングがこれらの種の保全のために非常に重要であるために急速に減少しています。Bat1Kは現在、すべてのコウモリ種のゲノムを配列することを目指していますが、高品質のゲノムシーケンシングのための組織サンプルの収集の標準化は、組織生物学者のコミュニティ全体で重要な課題のままです。ゲノムデータに加えて、コウモリの適応の多様性を機能的に理解するには、組織特異的な転写物およびタンパク質分析が必要であり、多くの場合、別個の収集プロトコルが必要です。さらに、すべての分類グループと同様に、最適な組織の収集と保存は-omics分析のための最高品質のデータを得るために不可欠ですが、技術が急速に変化するため、ベストプラクティスの伝達は困難であることが多く、独立して取り組む複数の研究チーム。
コウモリの研究のためのベストプラクティスを採用する必要性 - オミクス研究は、多くのコウモリ種がまれまたは脅かされていることを考えると、特に緊急です。げっ歯類やシュルーなどの他の小型哺乳類とは異なり、コウモリは長生きしており、優れたDNA修復メカニズム10と遅い繁殖11に起因し、ほとんどの種は1年に1つまたは(少数の場合)2人の若者を出産する。これらの理由から、コウモリの集団は妨害から回復するのが遅く、野生から多くの個体を集めることは望ましくも実現可能でもありません。言い換えれば、プロトコルを最適化して単一の試料のデータ量を取得し、不必要にサンプリング作業を複製する必要性を減らす必要があります。
ここでは、このプロトコルは、ゲノムおよびトランスクリプトームシーケンシングおよびタンパク質分析のためのコウモリ組織の収集およびサンプリングのための標準化された方法に特に焦点を当てています。その最優先事項は、コウモリ組織が収集の許可プロセス、組織の輸出、動物へのストレスの最小化、および長期保存条件に至るまで、倫理的かつ責任を持って収集されることを保証することです。収集した異なる材料の有用性を将来的に防除することを目的として、精巧な解剖が開発されました。この原稿は、集団への影響を最小限に抑え、科学的価値を最大化することを目的とした人道的な方法でコウモリを収集するためのステップバイステップガイドを提供します。このプロトコルの焦点はコウモリでの使用のために特に、ステップの多くは、他の脊椎動物のタキサ、特に哺乳類に関連しています。
組織収集の概要
貯蔵のための温度および保存剤の選択を含む組織集のためのプロシージャは計画された下流の分析の性質によって決定される。しかし、可能であれば、特定の分析が計画されていない場合でも、その将来の有用性を最大化するために、組織を様々な方法で収集することを強くお勧めします。一般に、組織は、核酸(DNAおよびRNA)、またはタンパク質のいずれかのその後の分析のために収集され、保存されます。これらの各用途について、液体窒素(LN2)で直接フラッシュ凍結することにより、組織を最適に保存することができる。ただし、LN2 の即時浸漬は、常に現場で可能であるとは限りません。技術の進歩に伴い、周囲温度でDNAやRNAを保存する特殊なバイアルなどのリソースが容易に利用できるようになってきています。このプロトコルでは、このような材料のすべてを検証していませんが、他の研究者は、我々がここで提示するものに対して、新しい材料の性能を比較的分析することを奨励します。私たちは、LN2にアクセスできない状況で、例えば、アマゾンの小さな平面を介してサイトアクセスのためにLN2輸送が不可能な場合に、異なるアプリケーションのための組織を理想的に保存する方法を提供しています。また、生細胞を増殖・増殖させることができる組織を採取する方法を提供しています。以下に、これらのそれぞれの目的の材料を収集するための主な考慮事項の概要と、収集方法の概要を表 1に示します。
DNA用組織
採取されたすべての採取された組織について、貯蔵培地は、標準または高分子量(HMW)DNA抽出に使用できるかどうかを決定します。HMWは、長い読み取りシーケンシングに必要であり、現在染色体レベルのゲノムアセンブリ、または「プラチナ標準」ゲノムを生成するために必要とされます。低分子量(LMW)DNAは、フラッシュ凍結、AllProtect(今後は「組織安定化溶液」と呼ばれる)、またはRNAlater(以下「RNA安定化溶液」)保存サンプル(フラッシュ凍結サンプルは最適なままであるが)から抽出することができる).標準的な実験方法(例えば、シリカゲル膜スピンカラム、フェノールクロロホルム)によって単離されたDNAは、依然として〜20キロ塩基(kb)までのDNA断片を得ることができる。したがって、十分な収率がある場合、この形態の単一インサートサイズライブラリー調製物に使用してもよいし、挿入サイズがしばしば〜500塩基対(bp)であり、〜100bpの短い配列読み取りが生成される12。このDNAは、全長染色体データが必要ない「再配列」プロジェクトや研究に特に有用です。HMW DNA(10-150 kb)はより困難であり、収穫後にLN2で急速に凍結され、抽出されるまで最大-80°Cで維持された組織を使用してのみ確実に得ることができます。
低分子量または断片化されたDNAは、多くの場合、PCRによる遺伝子増幅および短読シーケンシング13を含む標的アプローチに対して十分である。1つまたは少数の遺伝子のみを標的とするLMW DNAを用いてのPCRベースの調査は、コウモリ感覚生物学6,14、生理学15、系統学の適応と分子進化を理解する上で非常に有益であった5,16, および保全17,18.低分子量および断片化されたDNAの標的配列再捕捉に成功したはまた、コウモリ19を含む多数の脊椎動物群のために実証されている。これらの方法は、多くの場合、費用対効果が高く、コウモリに対して最小限に侵襲的であり、口腔綿棒または翼生検パンチを介した胎児サンプルおよび非致死的組織サンプリングも低分子量分析のためのDNAを得る一般的な方法である20、 21.
ただし、品質は、サンプルが格納されているメディアの種類22に大きく依存します。ブッカ綿棒と生検パンチの系統的および定量的比較の後、翼生検パンチは一貫して高いレベルのDNAを生み出し、コレクション22の間にコウモリにストレスが少なかったことが示された。これらの比較はまた、翼のパンチが指標シリカ(すなわち、水分が観察されたときに色を変化するシリカゲルビーズで作られた乾燥剤の一種)で保存されたときに最良の結果が得られたことを示した。エタノールまたはDMSO22;しかし、組織安定化溶液を含む他の貯蔵媒体は検査されなかった。翼パンチは、Kacprzykら23および以下に説明するように培養中の線維芽細胞を増殖させるためにも使用することができる(セクション6参照)。これらの方法では、翼またはウロパタギウムを穏やかに拡張し、サンプルを得るために、クリーンな生検パンチ(通常は直径3mm)を使用する必要があります。このアプローチは、ほとんどの場合24で数週間以内に治癒する傷跡で、永続的な損傷を引き起こさないようです。
HMW DNA(10-150 kb)はより困難であり、現在、収穫後にLN2で急速に凍結され、抽出されるまで最大-80°Cで維持された組織のみを使用して確実に得られる。HMW DNA(10-150 kb)は、長読みDNAシーケンシング、したがってデノボゲノムアセンブリに不可欠です。実際、ほとんどの市販キットは標準的なHMW DNAを単離するために使用できますが、得られる分子サイズは、多くの場合、第3世代シーケンシング技術(例えば、パシフィックバイオサイエンス(PacBio)などの企業が立ち上げたもの)の要件を満たしていません。オックスフォードナノポア技術、および10倍ゲノミクス、またはバイオナノゲノミクスまたはダヴテールゲノミクスによって提供される組み立て方法を介して」。そのため、「ウルトラHMW」DNA(>150 kb)の新たな需要があります。コウモリから超HMW DNAを得る場合、肝臓、脳、筋肉の新鮮なサンプルはすべて適していますが、これらは貯蔵バッファーまたは凍結保護剤なしでLN2で直ちに凍結フラッシュする必要があります。これらの手順の詳細は、このホワイト ペーパーの範囲を超えていますが、他の場所で25で入手できます。
RNA用組織
RNAはDNAよりも安定性の低い一本鎖分子です。RNAには多くの形態がありますが、-omics分析はmRNA(メッセンジャーRNA)と小さなRNA(例えば、マイクロRNA)に焦点を当てる傾向があります。転写後、mRNAは、イントロンを含んでおらず、遺伝子/ゲノムのコード部分を表す成熟した転写物を形成するためにスプライスされる。コード遺伝子はゲノムサイズのごく一部(1%~2%)を占めており、mRNAを標的化することで、遺伝子の配列データを得る費用対効果の高い手段となります。マイクロRNAは、mRNAをタンパク質に変換するプロセスを調節するRNAのクラスであり、したがって重要な調節エフェクタです。RNA転写物は、転写物の一部として、個別に、または-omics分析26、27、28、29、30のために、より一般的に配列することができます。つまり、所定のサンプルに存在するすべてのRNA転写物の合計です。
シーケンシングは、いくつかの方法(すなわち、短読RNA-seqまたは長読み全体アイソフォームSeqを介して)に従って行うことができ、RNAの豊富さとアイソフォームの使用法の両方の分析を可能にする。mRNA転写物の量と多様性は細胞や組織によって異なるため、RNAシーケンシングにより、サンプル間での遺伝子発現および調節を研究および比較することが可能になります。これらの方法はますます生物学的に有益になりつつあるので、小さなRNAおよびアイソフォームシーケンシング全体のシーケンシングに対する関心が高まっています。RNAの異なるクラスを配列する組織サンプルの調製は、この原稿に提示されるのと同じ方法で行うことができ、その後の抽出方法のみが31、32と異なる。最後に、トランスクリプトームはタンパク質コードゲノムの高カバレッジサブセットを提供するので、組み立てられたデータセットはゲノム組み立ておよび注釈に有用であり、異なる組織の範囲にわたるRNA-seqデータの収集を重要な構成要素にするBat1K イニシアチブ。
DNAとは対照的に、RNAは化学的に不安定であり、RNAベースのウイルスに対する防御戦略として組織リサテスに普遍的に存在するRNase酵素によって標的とされています。これらの理由から、細胞および組織におけるRNA画分は、サンプリングおよび/または安楽死の点の直後に分解し始める。したがって、RNAを保存するには、その劣化を防ぐためのステップが必要です。これは典型的には、組織に自然に存在するRNasesを不活性化するRNA安定化溶液などの安定化剤で4°Cで新たに採取した組織を保存し、続いて長期保存のために凍結することを含む。好ましい代替として、組織はLN2でフラッシュ凍結され得る。前述したように、LN2を現場に輸送し、組織の解凍を防ぐためにレベルを維持することは、ロジスティックに困難な場合があります。
タンパク質用組織
タンパク質組成物と相対的な存在量は、RNA について議論されたものと同様の方法で細胞や組織の間で変化します。しかし、タンパク質は平均的にRNAよりも安定しています。プロテオミクスを用いたタンパク質同定は、通常、全体ではなく、タンパク質配列の一部に一致するが、組織間の発現に関する情報を提供し、存在する病原体を特徴付けることができる。多くのタンパク質配列が哺乳類全体で保存されているので、プロテオミクスのコウモリサンプルは、保存されたヒトタンパク質で容易に汚染され、採取中に無菌プロトコル(例えば、手袋、鉗子)を必要とする。LN2のフラッシュ凍結はタンパク質の分解を防ぐ最良の方法ですが、ドライアイス、-20°C冷凍庫、さらには氷を使用する場合は、他の手段がない場合に適しています。温度が上昇するにつれて、差動タンパク質の分解のリスクも上昇します。組織安定化液などの安定化剤は、組織のタンパク質分率を室温で保存するのに有効であり、フラッシュ凍結が生存できない場合の短期保存(最大1週間)に適しています。
所定の組織の酵素プロファイルは、その中のタンパク質の保存に直接影響を与える。筋肉などの酵素活性の低い組織は、家庭用冷凍庫の高温でもタンパク質プロファイルを保持することができます。対照的に、肝臓組織は酵素的に反応性であり、そのタンパク質は調製中に分解する確率が高い。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)サンプルからヒトプロテオミクスプロファイルを得るためのプロトコルの増加は、組織のパラホルムアルデヒド固定が、採取時に凍結する際に低コストのタンパク質保存の約束を保持することを示唆している。実現可能な33,34.保存時間および状態に大きく依存するが、タンパク質はホルマリン固定、エタノール保存コウモリ標本35から免疫組織化学によって同定されている。このアプローチはプロテオミックレベルのサンプリングにスケーラブルではありませんが、フラッシュ凍結が利用できず、他の安定化剤が高価すぎる場合にホルマリン固定コウモリ組織がタンパク質プロファイルを生成する可能性を強調しています。
細胞培養組織
サンプリング組織とフラッシュ凍結は、使用する材料の有限量を提供し、材料が使用されると、それはもはや利用できません。あるいは、細胞培養は、将来の研究のためにすぐに使用または保存することができる生細胞を提供する。培養はまた、組織サンプルが小さいときに収量を増加させるために細胞の膨張を促進する。非致死的サンプリングが不可欠であり、したがって保全に広い意味を持つ希少種の実験など、組織採取が限られている場合に特に有用である。記載されているのは、翼膜組織の非致死的サンプリングを介して細胞培養が可能であるが、培養は複数の組織タイプ36、37で可能であるプロトコルである。ここで提供されるプロトコルは、付着細胞を選択します。使用されるソース組織と成長培養媒体の組み合わせは、このプロトコルを選択し、線維芽細胞を増殖するのに適していますが、必要に応じて、代替プロトコルを使用して他の細胞タイプを選択することができます。Bat1Kプロジェクトの文脈では、希少種や絶滅危惧種の場合、翼膜の非致死的サンプリングと培養によるサンプルの膨張が、5を採用する複数の技術に必要なDNAの量を生成するために不可欠であると予測されています5.
バットキャプチャ
コウモリを扱うすべての人々は、コウモリの有能な研究者によって訓練され、一連の露出前注射で狂犬病に対して予防接種を受けるべきです。噛まれた場合は、さらなる一連の露出後注射が必要です。コウモリを捕獲する標準的な方法には、ミストネット(図1)とハープトラップ(図2)があります。ミストネットは、コウモリの苦痛を最小限に抑えるために最も注意を必要とするので、最も一般的に使用され、中程度の活動を持つ領域に最適です。小さなコウモリは特に脆弱であり、すぐにする傾向がない場合はストレスで死ぬことがあります。頻繁なネット検査は、コウモリの損傷や死亡率だけでなく、ミストネットへの損傷を最小限に抑えます。適切な組織採取は組織を新鮮にする必要があり、コウモリのミストネットに対する不適切な注意は、研究者がサンプルを適切に処理する前に不必要な死亡率または早期死亡につながる可能性があるため、この詳細は重要です。いくつかのコウモリは最小限の苦痛でハープトラップで休むことができるので、このアプローチは、洞窟や大きなねぐらのような高いコウモリの活動を持つ領域に最適です。形態学的および人口統計的情報を収集するための適切なコウモリのキャプチャとデータ処理の詳細な手順は、補足的な方法で利用可能です。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、ストーニーブルック大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています(プロトコル#2013-2034)。
1. 安楽死
- イゾルラン麻酔薬または別の利用可能な麻酔薬で綿のボールを湿らせます。
- 綿のボールを再密封可能な気密性のビニール袋に入れます。袋は、布のバットバッグに快適にバッグを保持するのに十分な大きさでなければなりません。
- 袋が麻酔薬で浸透することを数分後、バットを含むバットバッグをビニール袋に入れます。
- コウモリが安楽死するまで数分待ちます。コウモリの重量~20g以下は、これより大きいコウモリが約5〜10分を必要とし、最大20分を必要とする場合があります。麻酔薬の拡散を最大化するために、可能な限り最も薄い布素材を使用することをお勧めします。
- 解剖が始まる前にバットが安楽死したことを確認するために、呼吸と心拍を確認してください。
2. 解剖準備
- 次のプロトコルを使用して、解剖間のすべてのインストルメンテーションを清潔に保ちます。
- 水と皿石鹸で楽器を洗います。漂白剤が核酸を分解するように、解剖領域から離れて、10%の漂白剤でそれらを拭き取ります。
- 70%のエタノールで拭き取り下げます。
- RNAse除染試薬で拭き取り下ろします。
- 解剖のたびにこのセクションを繰り返します。
3. 組織サンプル用バイアルの準備
-
RNA の場合:
- 遅延を避けるために解剖を開始する前に、すべてのバイアルを準備します。
- 各標本に必要なバイアルの数を脇に置いてください。収集されるティッシュタイプ、および標準的な標本の同一証明の情報と各管にラベルを付ける。RNA安定化溶液を50%満たし、理想的には4°Cまで冷やします。
- RNA安定化溶液でバイアルを完全に充填しないように注意してください、そうでなければ、チューブはLN2に置くときに爆発する可能性があります。組織サンプルを採取する際には、組織の大きな塊がRNA安定化溶液によって完全に浸透しないことを覚えておいてください。したがって、組織を1次元で0.5cm以下の小さな断片に切断し、RNA安定化溶液:組織に対して少なくとも10:1の体積の比率を維持する。
- 少なくとも、解剖された組織は、LN2またはコールドストレージにアクセスできない場合でも、RNA安定化溶液に配置する必要があります。
-
DNAの場合:
注:核DNA含有量は、ほぼすべての組織で同じです。したがって、サンプリングは柔軟に行うことができます。しかしながら、筋肉組織におけるミトコンドリアの密度が高いほど、核ゲノム38に対する読み取り値の喪失につながる可能性があることに留意すべきである。- 低分子量DNAの場合、シリカ中の貯蔵のための翼膜の1つ以上の複製、および/または筋肉をRNA安定化溶液または組織安定化溶液中に貯蔵する。
- 超HMWDNAの場合、貯蔵試薬なしでLN2でフラッシュフリーズし、-80°Cまたはより低い期間の長期保存に移します。頭蓋解剖から、脳組織は、超HMW DNA39を取得するのに最も適した組織型であり、頭蓋後解剖から、肝臓または筋肉はより適した40である。
- 頭蓋解剖の場合は、一部の組織に対してRNA安定化溶液の5mLバイアル(標準的な2mLバイアルとは対照的)を使用してください。すべてのバイアルは低温でなければなりません。解剖しながら、バイアルを氷の上に置いてください。
4. RNAの頭蓋切除
- 安楽死の直後に、大きなはさみまたは骨カッターで標本を切断する(図3)。
- 視神経を取り外すのに十分な強い力を使って鉗子で目を取り除きます。RNA安定化溶液の2mLバイアルに目を置きます。
- 選択したツールを使用して、鼻の皮膚を含む毛髪、筋膜、頭蓋骨の筋肉から頭蓋骨を皮膚にします。鼻の前端を壊さないように注意してください。
- はさみを使って、頭蓋骨の腹部部分(図3)を首から切り取り、脳にダメージを与えないように注意する。
- 鉗子を使用して、頭蓋骨の両側をゆっくりと引き戻し、ひび割れ、脳が露出するまで。
- 頭蓋骨の側側では、頭の両側にコクレアが横に見えるはずです。彼らは左右の小さな球状の骨で、首に骨を突き、マッサージ師の筋肉に後部します。鉗子を使用して、穏やかにコクレアを引っ張り、RNA安定化溶液の1つの2 mLバイアルに入れる。
- 鉗子で脳をそっと掻く(非常に柔らかい)。嗅球が見えるようになり、頭蓋骨の内部の腹部部に座っている。嗅覚電球を取り付けたままにしておいてください。
- 嗅球がまだ取り除かれていない場合は、組織をそっとこすり取り、クリブリーフォームプレートが明らかになります。これは、研究者の指向を維持するための重要な骨です。これは、複数のフォアメンを持つ頭蓋骨の最も前の領域と、嗅球が休む2つの溝のポイントとして識別することができます。
- 可能であれば、脳の形状をそのままに保ち、直ちにドライアイスの上に置き、形状を保つか、RNA安定化溶液の5mLバイアルにします。免疫組織化学が脳上で行われる場合は、4%のパラホルムアルデヒド(可能な場合)に置きます。
- 上部と下部の顎が結合する2つの切開を行い、マンダブルを取り除きます。
- マンダブルを取り除いたら、頭蓋骨の残りの部分からrostrum(上顎)を取り除きます。顎にクリブリフォームプレートが含まれていることを確認します。
- 鼻をRNA安定化液に入れ、一晩4°Cに保存します。これは密な組織であるため、RNA安定化溶液が組織全体に浸透することを可能にする時間が必要です。
- 鼻バイアルをLN2に入れ、一晩浸した後にRNA安定化溶液に浸す。
- 下半身からはさみで舌を切り、後でRNAの2mLバイアルに入れなさい。
- このプロトコルは頭蓋骨の大部分を没収する。歯、特にマンダブルからのものは、回復することができ、種の診断に有用でありうっていう。骨組織は、1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)に保存することができる。
5. RNAの頭蓋切除術
- メスを使って腹腔を貫通し、肋骨まで縦切り切開を行う(図3)。これは、骨格フレームを没収します。骨を保存する場合は、筋肉の皮膚から慎重に解剖し、軟部組織解剖が完了した後に1x PBSに保存します。
- 胸筋を明らかにするために皮膚を剥離し、少なくとも2つの筋肉のサンプルを採取し、1つはRNA安定化溶液用、もう1つはHMW DNAのために凍結したままにし、直ちにバイアルに入れてLN2に入れる。
- 胸骨を切り取り、肋骨を引き抜いて肺からサンプルを採取する。
- 心臓を採取し、全体を取ることができるが、半分に分割する必要があるので、RNA安定化溶液は完全に浸漬します。
- 肝臓からサンプルを取る。少なくとも2つの肝臓のサンプルを採取し、1つはHMW DNAのために凍結したままにし、直ちにLN2に入れる空のバイアルに入れる。肝臓は非常に酵素的であり、RNA安定化溶液が完全に浸漬するのに十分な小さなサンプルを作ることが重要です。
- 肝臓から胆汁を排出する機能を持つ肝管は、肝臓を膵臓と小腸に接続します。この容器は、肝臓の劣った/後部部分を調べて、後部方法で血管をトレースすることによって容易に識別可能です。ダクトは、多くの場合、同様に緑がかった色です。肝管に従って膵臓と胆嚢を見つけ、これらを別々に収集します。RNA安定化溶液の各バイアルに置きます。
- 胃を収集し、その隣に、そのベースに、紫色の異なる色合いとして表示され、羽のような脾臓です。膵臓も白い構造として表示する必要があります (図 3)。RNA安定化溶液の各バイアルに置きます。
- 小腸と大腸の小さなサンプルを収集します。RNA安定化溶液の各バイアルに置きます。腸はまた、エンドパラサイトのためにスクリーニングされてもよい。寄生虫学者が現場にいる場合は、寄生虫の検査を行うことができます。これが後で行われる場合は、腸全体を5mLの低温バイアルで採取することができる。
- 腎臓の1つを取り、膀胱に彼らの管に従ってください。RNA安定化溶液の各バイアルに置きます。
- 他の腎臓をガイドとして使用して精巣(男性の場合)または子宮を見つけ、それを通して卵巣(女性の場合)を見つけます。可能であれば、一方または両方の生殖腺を収集します。
- 別々のバイアル(筋肉対非筋肉部分)で翼の皮膚の様々な部分のサンプルを保管してください。
6. 組織培養と調製
- 20%の胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、および50 μg/mLゲンタマイシンを含むダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)を構成することにより、細胞の増殖培地を調製する。成長メディアのアリコートは、プロトコルの毎日新鮮にする必要があります。
- コレクションの後、翼生検パンチは、十分に密封された1.5 mL遠心管内の冷間成長培地の1 mLに直接配置する必要があります。チューブをパラフィルムで包んで密封します。
- チューブは、4 °Cでサンプルを保つために冷却要素を持つポリスチレンボックスに輸送する必要があります。輸送を迅速化する必要があります。しかし、健康な細胞は、最大6日間この方法で保存されているパンチから作ることができますが、最適ではない23.
- 組織培養施設に輸送されると、以下のプロトコルを使用して細胞培養物を生成することができます。標準的な滅菌技術は、プロトコル41の残りの部分に使用されるべきである。
7. 1日目組織培養:組織の解離
- チューブの内容物(翼膜生検を含む成長培地)を15mLの円錐遠心管に移す。
- 成長培地を慎重に取り除きます。無菌PBSの500 μLで生検を2回静かに洗浄します。
- コラーゲナーゼIV(1mg/mL)をチューブに500μLを加えます。これは、個々の細胞に組織の消化を引き起こす.
- 攪拌することなく37°Cで一晩(最大16時間)インキュベートします。
8. 2日目組織培養:めっき細胞
- 新鮮な成長培地を作り、37°Cに事前に温めます。
- 使用するプレートの各ウェルに2mLの新鮮な、予め温められた成長培地を加えて6ウェル組織培養プレートを調製する(3mm翼生検当たり1ウェル)。このプレートは、必要になるまで37°Cおよび5%CO2インキュベーターに保管してください(ステップ8.7)。
- 細胞を含む15mLチューブをインキュベーターから取り出し、新鮮な成長培地の1mLを加えて消化反応を消し取る(予め37°Cに温める)。
- P1000ピペット先端で溶液を慎重にトリビューして、単一のセル懸濁液を達成することにより、細胞を再懸濁します。
- 300 x gで3分間、テーブルトップ遠心分離機の細胞をゆっくりとスピンダウンします。
注:組織の小さな部分はまだ懸濁液または15 mLチューブの壁に取り付けられて見えるかもしれません。しかし、これは細胞懸濁液の準備に影響を与えません - P1000ピペットで液体の80%~90%を静かに取り除いて上清を廃棄します。
注:まだ見える場合は、組織の一部を破棄し、次のステップ(8.7)で穏やかにトリビュートしないでください。 - 予め温められた成長培地の500 μLでペレットを再懸濁し、ペレットのペレットまたは大きな断片がもはや見えなくなり、細胞が十分に懸濁されていることを確認するために懸濁液を穏やかにトリプする。セルの存在により、メディアが曇って見える場合があります。
注:この段階では、翼クリップに由来する細胞の懸濁液および収率を評価するために生存可能な細胞数を実行することができる(詳細についてはステップ10.11を参照)。 - セル懸濁液の全容積を6ウェルプレートの単一のウェルにそっとピペットします。
注:上記の手順を直ちに実行し、ステップ 8.7 の後にセルが解決しないようにします。ピペットを使用して、セルサスペンションを井戸の表面にそっと滴下して分配します。これは、ウェルの真ん中に集まりになる細胞の結果として、ウェルの中心に全体の溶液を配管しないでください。
注:組織の一部がまだ見える場合は、培養容器にうまく移さないようにしてください。 - プレートを左右にゆっくりと揺さぶり、2x~3xを前後に動かして、細胞が単一の層で井戸表面に分散するのを助けます。
- 彼らはボールアップし、浮遊しているが、非常に密に表示される単一の細胞である必要がありますので、顕微鏡の下でめっきされた細胞をチェックしてください。
- プレートを37°Cと5%CO2にあらかじめセットしたインキュベーターに慎重に入れます。
- 〜24時間後、顕微鏡下の細胞を観察し、培養の健康状態を判定する。セルをプレート表面に取り付け、フラットに表示する必要があります (図 4A)。顕微鏡を通して見ると、異なる細胞タイプが培養中に見えてくる場合があります。
- 接続されていない浮動セルが存在する可能性があります。これらの細胞の割合は死んでいる。ウェルに可視浮動セルの割合が高い場合は、メディアを更新する必要があります。この場合、ウェルから培地の約50%を慎重に吸引し、細胞を乱さないようにウェルの側面に予め温めた増殖培地の1mLを静かに加える。
- 細胞を37°Cおよび5%CO2にあらかじめ設定したインキュベーターで維持する。細胞は、メディアのリフレッシュまたは分割の必要性を決定するために、定期的に顕微鏡下で観察する必要があります(ただし、1日に1回以上)。
注:細胞が新たにめっきされると、それらはすぐに分裂するので、毎日チェックする必要があります。文化のいくつかの時間の後、成長が遅くなり、彼らは48-72時間ごとにチェックすることができます。
9. メディアの更新
-
定期的に顕微鏡下の細胞をチェックして、培養の成長と品質を観察してください。メディアの色を品質の指標として監視します。セルは、最大 3 日間、または通過が必要になるまで、同じメディアに残る必要があります。
- 細胞が急速に成長し、メディアを使い果たしている場合、メディアの色が赤から黄色に変わるので、これはまた、目に見えます。
- 必要に応じて、ウェルから培地の約50%を慎重に吸引し、細胞を乱さないように、温める前に加育培地のほぼ同じ量をウェルの側面に穏やかに加える。
- 細胞を37°Cおよび5%CO2インキュベーターに戻します。
10. パッセージングセル
- 通過細胞は、既存の培養物を取り込み、それを新しい井戸に分割することを指します。通過は、細胞が約80%のコンフルエントである場合に起こるべきである[すなわち、彼らが井戸の表面の〜80%を占め、プラスチックの〜20%だけがギャップとしてまだ見える場合(図4B)。
- 成長培地の約90%を慎重に吸引し、廃棄する。
- 細胞を乱さないように、生殖不能PBSの1 mLをウェルの壁に加えて非常に穏やかに細胞を洗います。プレートを前後にゆっくりと揺らし、左右2x-3xを振ります。慎重に吸引し、プレートからすべてのPBSを破棄します。
- ステップ10.3を繰り返し、細胞を再度洗います。
- 250 μLのトリプシン-EDTA(シグマ・アルドリッヒ、キャット#T4049)をウェルにゆっくりと加え、室温で1.5分間インキュベートします。
注:トリプシン-EDTA溶液がプレートをそっと揺らして井戸の表面全体を覆っていることを確認してください。 - 新鮮な予め温められた成長培地の1 mLを加えて反応をクエンチする。
- プレートの表面から細胞を洗浄し、細胞が懸濁液内にあることを確認するために、上下〜5倍のピペット。
注:溶液は、細胞の存在のために曇りになる必要があります。 - セルサスペンションを15 mLチューブに入れ、300 x gで3分間テーブルトップ遠心分離機でセルをスピンダウンします。
- P1000ピペットで液体の80%~90%を静かに取り除いて上清を廃棄します。
- 予め温められた成長媒体の1 mLでペレットを再懸濁し、懸濁液を穏やかにトリビュートする。ペレットのペレットまたは大きな断片が表示されなくなり、細胞が単一の細胞懸濁液内にあることを確認します。
- ここで説明するように自動セルカウンタを使用して細胞をカウントするか、または参照ビデオ42で詳しく説明するようにヘモサイトメーターを使用して手動でセルをカウントする。懸濁細胞1:1の10μLアリコートをトリパンブルーと混合して、生存可能な細胞を検出します。
- 1分間インキュベートし、ピペット10μLの溶液を計数スライドに入れます。カウント スライドを自動セル カウンタに挿入して、適切な設定を使用してセルをカウントします。収量は、6ウェルプレートのコンフルエント単一井戸から約1-200万細胞でなければなりませんが、これは細胞および種の大きさによって異なる場合があります。セルが単一のセル懸濁液に含まれていない場合、セル数は正確ではありません。
- これらの細胞培養物は、一般に1:2分割を許容する[すなわち、細胞の1つのコンフルエントウェルは、2つの新しいウェル(合計)に分割することができる]。これを行うには、細胞を再び穏やかにトリビュートし、細胞懸濁液を2つの半分(それぞれ約730μL)に取り、750 μLの予め温められた成長培地を滴下的に含む2つの新しいウェルのそれぞれに入れなければなりません。
注:2-3日後、井戸はコンフルエントであり、再び分割の準備ができている必要があります。この時点で、生存可能な凍結プロトコル(セクション11)によって細胞の1つのウェルを保持することをお勧めします。細胞のさらなるストックは、望ましいように、さらなる通路の間に凍結することができる。
注:~6経過後、細胞は老化に入る傾向があり、もはや分裂しない。これは、セル数を増やすためにセルを分割または展開できなくなっていることを示します。これはまた、細胞が長い間実行可能ではないことを示しています。
11. 生存細胞の凍結
- DMEMを20%FBS、10%DMSO、1%P/S、および50 μg/mLゲンタマイシンと組み合わせて凍結培った培源を調作します。
- 凍結は、通過プロセスに起用された細胞をペレットに取ることによって行われる。ペレットは、ステップ8.1〜8.9に従って、6ウェルプレート(約1〜200万細胞を表す)の80%~90%のコンフルエントウェルから調製する必要があります。
- ペレットを凍結培地の1.5mLで再ステージングします。
- 2つの別々の凍結液のそれぞれに約750 μLの細胞懸濁液を置きます。
- バイアルを極低温凍結容器に入れ、細胞の活性化を維持するために細胞がゆっくりと凍結します。直ちに-80°Cに置きます。
- 24〜48時間後、細胞の凍結物をLN2に移し、長期保存する。このように保存すると、細胞は復活することができ、何年も実行可能になります。
12. 冷凍細胞の解凍
- 使用される各ウェルに2mLの予め温められた成長培地を含む6ウェルプレートを調製する(解凍される細胞のバイアル当たり1ウェル)。必要になるまで37°Cおよび5%CO2インキュベーターでプレートを維持します。
- LN2から細胞のバイアルを1つ取り、急速に解凍するために温水浴(37°C)に入れます。これには 2 ~ 3 分かかります。
注:凍結媒体中のDMSOは一度解凍した細胞に有毒であるので、バイアルを3~5分以上解凍したままにしないでください。 - バイアル内の溶液が解凍されるとすぐに、溶液を均質化するために上下にゆっくりとピペットし、溶液全体(約750 μL)を6ウェルプレートの1つの井戸にすぐに置きます(ステップ12.1で予め調製)。
- プレートを左右に、前後に2~3回ゆっくりと揺らし、細胞が単一の層で井戸表面に分散するのを助けます。
- 細胞を37°C、5%CO2インキュベーターに24~48時間置きます。
- 上述したように細胞を監視し、通過する。
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Representative Results
Dna
標準的な低分子量(LMW)分析のために、DNAは3つの新熱帯コウモリ種から抽出された。組織サンプルは、この論文に記載されたプロトコルに従って、ドミニカ共和国とコスタリカから現場で収集されました。解剖後、混合組織(脳、肝臓、腸)の小片(<0.5cm)をRNA安定化溶液に入れ、フラッシュ凍結し、-80°Cで保存した。抽出は、RNase処理43を用いて標準的なDNA抽出プロトコルを用いて行った。自動化された電気泳動ツールによるDNA完全性の評価は、フラグメントサイズの次の代表的なサンプルピークを明らかにしました:種1(2つの別々の抽出)は22 kbと20kbで構成されていました。種2は25 kbで構成された。種3は24kb(図5、表2)で構成された。
第3世代シーケンシング用に抽出されたDNAは、高濃度で収集し、最小限に断片化する必要があります。ガーナで採取した旧世界フルーツバット(アイドロンヘルフム)からフラッシュ凍結脳組織から抽出したHMW DNAを得た。HMW DNAをバイオナノ抽出プロトコルを用いて抽出し、その後のIrysプラットフォーム上での解析を行った。このDNAの長さは607,463Mbで,平均分子N50は194.5Mbであった.
Rna
RNA 抽出の成功の一般的な指標は、RNA 整合性数 (RIN) 値です。この閾値を下回る値が劣化44の高いシグネチャを示し始めるので、抽出がRIN値が8未満の場合にRNA-seqライブラリ調製またはシーケンスプロトコルを実行するシーケンシング機能では、多くの場合推奨されません。 、45.図6は、このプロトコルに続く様々な組織タイプのRNA抽出に対するRIN値を示す。プロトコルで収集された組織の抽出は、フィールドサンプリング局所性とは無関係に、高品質のRNAをもたらしています。LN2がアマゾンですぐに利用できなかった場合、組織をRNA安定化溶液中に入れ、LN2に入れるまで1週間4°Cに保った。このような場合でも、RIN値は、直ちにRNA安定化溶液に投入され、LN2に直接配置されたものと同等であった。RNA安定化溶液は、必須の安定化剤である。
組織培養
めっき直後に、細胞はボールを上げて浮かます。しかし、24時間以内に、線維芽細胞は平坦化し、プレートの表面に取り付ける必要があります(図4A)。この時点で、細胞は生存を確保するために約20%-30%の合流点でなければなりません。これより低い値は、文化全体の死につながる可能性があります。最初は、細胞が培養中に分裂し、膨張するので、膨張を可能にするために、互いに十分なスペースを持つ必要があります。それらは80%-90%の合流に達したときに分割されるべきである[すなわち、それらは板表面の>80%をカバーする(図4B)]。このようにして、細胞は老化を受け入れる前に、多くの通路(通常>6の通路)のために培養中に維持することができる。この時間を超えて培養中に細胞が維持されたり、コンフルエントになったときに分裂しなかったりすると、形態が変化し、より大きくなり、長くなる可能性があります(図4C)。この形態を持つ細胞はまだ分裂する可能性がありますが、これは通常、細胞が老化に入るか、すぐに老化し、培養中に維持または拡張できなくなることを示しています。
図 1: 森の中でコウモリを捕獲するためのミストネットの共通の設定。反対の手で分かりながら片手を覆い、ストレスを最小限に抑えながら安全にバットを取り除く方法です。この写真はジョン・フランダースによって撮影されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ハープトラップは、多くの場合、洞窟、大きなねぐら、またはフライアウェイの外側をキャプチャするために使用されます。コウモリは、研究者による最小限の絡みと簡単な除去でトラップの下部袋に蓄積します。この写真はスティーブン・ロクサーによって撮影されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RNA組織調製のための解剖と組織サンプリングのワークフロー。
図4:フィロストムス変色の翼パンチに由来するコウモリ細胞培養物.(A)めっき後24〜48時間、細胞が平坦化し、プレート表面に付着する。(B)細胞はプレート表面の80%~90%を覆い、元の形態を維持します。これは、分割に最適なステージを表します。(C)>6 の経過後、細胞は形態を大きく長く変え、細胞は老化に入ります。すべての写真では、明るい、ボールアップされた細胞は死んだ細胞を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:3種のコウモリ種からの標準的なDNA分析のための保存からのDNA抽出の代表的な結果は、種1から2回抽出した。単一の大きなバンドは、それぞれの抽出からのDNAの断片化と類似したサイズの断片を最小限に示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:4つの異なる局所でサンプリングされたネオトロピカルコウモリ種からの13種類の組織タイプからのRNA抽出のRNA完全性数(RIN)。これらの抽出は、記載されたプロトコルに従って調製され、次いでHiSeq/NextSeqイルミナトランスクリプトームライブラリを調製するために使用された。MOEは主な嗅覚上皮である。VNOはボメロナサル器官です。アンデス、コスタリカ、ドミニカ共和国の種からサンプリングした組織を、一晩4°CでRNA安定化溶液に浸した後、LN2に直接配置した。アマゾンの種から採取した組織を、RNA安定化溶液に入れた約1週間後にLN2に入れ、連続して4°Cに保った。Nは、各組織抽出について表される個体数を表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| アプリケーション | フラッシュフリーズ (L2) | RNAlater | オールプロテクト | FFPE | メディア |
| 高MW DNA |  |
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| 低MW DNA | |
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| Rna | |
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| タンパク質 | |
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| 細胞培養 | |
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表 1: 保存方法とアプリケーションの概要MW=分子量、FFPE=ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織。チェックマークは、それぞれの意図されたアプリケーションに対して推奨される保存方法を示します。X マークは、使用すべきでない保存を示します。
| 種 ID | サンプル ID | 濃度(ng/μL) | サンプルフラグメントピークサイズ(bp) |
| 種 1 | 1.1 | 31.8 | 21,885 |
| 1.2 | 22.8 | 19,633 | |
| 種 2 | 2 | 30.4 | 25,198 |
| 種 3 | 3 | 32 | 24,386 |
表2:このプロトコルにおける保存方法に基づくDNA抽出の代表的な結果。値は図5のゲル電気泳動ウェルに対応しています。
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Discussion
この原稿で議論されるプロトコルは、コウモリの様々なハイスループット分子解析のための最良のサンプリングプラクティスを説明する。すべての成功した-omics研究は、高品質の組織を必要としますが、コウモリ組織だけでなく、他の非モデル生物は、多くの場合、制御された実験室の設定と同じ基準に設定することができないフィールド条件で発生します。サンプリングは、多くの場合、電気や冷凍庫へのアクセスが制限されるなど、最小限のリソースで遠隔地で発生します。完全に無菌サンプリング条件を確保することは困難であり、しばしば不可能です。したがって、概説されているのは、様々なサンプリング局所およびフィールド条件において最も成功したと特定されたプロトコルである。Bat1Kイニシアチブと関連する取り組みやプロジェクトの標準化されたサンプリング方法を持つためには、コウモリ生物学者がこれらのプロトコルに従い、許可される範囲でフィールド探検を計画することが示唆される。
プロトコルの提案
胸部圧迫は過去に安楽死の一般的なアプローチであったが、胸部圧迫を使用してコウモリを採取することは決して推奨されている -オミクス分析。米国ではもはや安楽死の許容可能な形態ではなく、この方法は、対象の種にかかわらず、組織の範囲の酵素分解につながる可能性があります47。動物が安楽死させる場合は、ゲノム解析と経皮分析の両方の組織を採取することを示唆している。どちらも、LN2でフラッシュ凍結される可能性のある新鮮な組織を収穫する必要がありますが、DNA、RNA、またはタンパク質抽出を容易にするために異なる培養媒体に保存することもできます。組織内のRNAの分解を減らすために頭蓋および頭蓋後解剖で2人と並行して働くことを示唆される。一人は頭蓋を解剖し、もう一人は頭蓋後に働くべきです。
解剖プロトコルを実施する主な制限は、解剖に関与する人員および組織保存のために利用可能なスペース(例えば、LN2タンク内)を含む。事前にバイアルを調製し、チューブの標識や収集したバイアルや組織の文書化を支援する十分な数の人々が、サンプル処理の円滑化に貢献します。必要な(エクスポート、インポート)プロセスを取得するには、サンプルの適切な文書化が不可欠です。例えば、頭蓋後解剖プロトコルは、動物1匹につき20本以上のバイアルを要求する。
スペースと時間が限られている場合は、以下を優先する必要があります:1)種のための1つの標本、または少なくとも、属ごとに1つの標本の優先順位付け。X染色体とY染色体の両方のシーケンシングと生殖雌のサンプリングの確率の最小化を可能にする男性標本の優先順位付け;2)HMW DNAの場合:脳、筋肉、肝臓は、任意の試薬なしでフラッシュ凍結する必要があります。3)RNAの場合:脳、消化器組織、脾臓、感覚器官が優先度が高い。各組織試料は、RNA安定化溶液中に保存する必要があります。筋肉組織はまた、特殊な組織の発現分析のためのコントロールとして取られるべきです;4)非常に少なくとも、組織は冷たく保たれるべきです。5)LN2の可用性も懸念されるかもしれません。LN2タンクは、少なくとも2週間ごとに補充する必要がありますが、より暖かい気候の場合、またはタンクが頻繁に開いている場合は、より頻繁に補充する必要があります。LN2は、多くの場合、サンプルを輸送するために農業やヘルスケアで使用されているように、すべての国で市販されています。通常、これらのサービスは、二酸化炭素や酸素などの他のガスを販売する企業によって提供されます。アイスクリーム店は時々ドライアイスやLN2のための別のオプションを提供しています(または少なくとも購入のための推奨事項を提供します)、これは地元のスタッフに支援を求することをお勧めします。6)図6は、条件が限られたいくつかのコレクション探検のための成功した組織抽出の概要を説明する。
より多くの人々とより多くのスペースで、より多くの組織は異なった方法で集めることができる。以下は、研究者が適切な経験と材料が利用可能であるかどうかを考慮すべき他の場所で公開された追加のプロトコルです:1)コウモリメタボローム、または細胞や組織のすべての排泄された低分子量代謝物を提供することができます例外的なコウモリの長寿または冬眠および代謝飛行の要求への洞察。血液は、足首静脈などの容易にアクセス可能な血管からヘパリン48のバイアルに採取し、胎児サンプルはLN249で凍結されるべきである。2)免疫学、または病原体に対する動物の応答は、大腿骨とフメリを服用し、下流のマクロファージを培養する組織培養溶液に入れることによって分析することができる。3)フェスは、食事51を決定し、腸内微生物叢52、53、54を調べたような2種類の下流核酸ベースの分析に有用でありうる。いずれの場合も、組織安定化溶液などの試薬は、便に存在する希少変異体の分解を減少させる。4)リピドミクス、または組織型のリン脂質レパートリーは、白鼻症候群真菌病原体55、56を理解する上で明らかにされている。組織の調製は、解剖直後に凍結することが示唆される。
Bat1Kの組織アーカイブ
Bat1Kは、ゲノムの生成に使用される個々のコウモリの組織バンクを維持することを目指しています。現在、これらの組織バンクと個人ごとに収集された関連する言記念物および生態学的データは、Bat1K貢献メンバーの研究室/博物館コレクションに維持されています。プロジェクトが進むにつれて、Bat1Kは、グローバルゲノム生物多様性ネットワーク
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
セントロ・デ・エコロディア・イ・バイオディバーシダード・セビオ、エリカ・パリザ、ミルスカ・サンチェス、ホルヘ・カレラ、エドガー・レンギフォ・バスケス、ハロルド・ポロカレロ・ザリア、ホルヘ・ルイス・レヴォー、ジェイミー・ペチェコ・カスティージョ、カルロス・テロ、ファニー・コルネホ、ファニー・ファニー・ファニ・ファニ・ファニェ可能なペルーでの収集。また、グルポ・ジャラグアとヨランダ・レオンのメンバー全員に対し、ドミニカ共和国での組織採取を可能にし、ベルナル・ロドリゲス・ヘルナンデス、ベルナル・マタリタ、コスタリカのラ・セルバ生物研究ステーションの皆さんに感謝します。サンプリングが可能です。我々は、細胞培養生成のためのフィロストムス変色コウモリからの翼パンチのアクセスとサンプルコレクションのためのエラ・ラッテンカンプ&ルッツ・ヴィーグレベに感謝します。フィロストムス変色コウモリは、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学の生物学II科の繁殖コロニーに由来する。コウモリを維持し、繁殖するための承認は、ミュンヘン地区獣医局によって発行されました。LMD、SJR、KTJD、およびLRYはNSF-DEB 1442142によって資金提供されました。LMDはNSF-DEB 1838273によって資金提供されました。LRYはNSF-PRFB 1812035によって資金提供されました。SCVとPDは、マックス・プランク・リサーチ・グループ賞とヒューマン・フロンティア・サイエンス・プログラム(HFSP)研究助成金(RGP0058/2016)によって資金提供されました。SJR、JHTP、およびKTJDは、SJRに授与された欧州研究評議会(ERC開始助成金310482[EVOGENO])によって資金提供され、ECTは欧州研究評議会の助成金(ERC-2012-StG311000)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3 mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| Collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
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