Summary
이것은 야생에서 잡힌 박쥐의 게놈, 전사체 및 단백질 분석을위한 최적의 조직 준비를위한 프로토콜입니다. 그것은 박쥐 포획 및 해부, 조직 보존 및 박쥐 조직의 세포 배양을위한 프로토콜을 포함한다.
Abstract
고처리량 시퀀싱 기술이 발전함에 따라 고품질 조직 획득 및 보존을 위한 표준화된 방법을 통해 이러한 방법을 비모델 유기체로 확장할 수 있습니다. 박쥐에서 조직 수집을 최적화하는 일련의 프로토콜은 일련의 고처리량 시퀀싱 접근법을 위해 개발되었습니다. 여기에 설명된 것은 박쥐 포획을 위한 프로토콜, 각 박쥐에 대해 수집할 원하는 인구 통계, 조직 수집 중 박쥐의 스트레스를 최소화하기 위한 최적화된 방법입니다. 구체적으로 설명된 것은 (i) 고분자량 게놈 분석을 위한 DNA, (ii) 조직 특이적 전사체에 대한 RNA 및 (iii) 단백질-수준 분석을 위한 단백질을 얻기 위해 조직을 수집하고 치료하는 방법이다. 마지막으로, 또한 날개 클립에서 실행 가능한 기본 세포 배양을 만들어 치명적인 샘플링을 피하는 방법입니다. 이 방법의 중앙 동기는 각 박쥐에 대한 잠재적 인 분자 및 형태 학적 데이터의 양을 극대화하고 새로운 방법이 미래에 개발로 자신의 가치를 유지하기 위해 조직을 보존하는 최적의 방법을 제안하는 것입니다. 이 표준화는 전 세계 여러 과학 당사자가 다른 분류학의 순서를 주도하고있는 염색체 수준의 오류없는 게놈을 서열화하는 이니셔티브가 등장함에 따라 특히 중요해졌습니다. 그룹. 본 명세서에 설명된 프로토콜은 Bat1K에 대한 이상적인 조직 수집 및 조직 보존 방법을 정의하며, 이는 모든 종의 박쥐의 게놈을 시퀀싱하는 컨소시엄이다.
Introduction
고처리량 시퀀싱(HTS) 방법은 효율성이 급격히 향상되고 비용이 감소했으며, 이제 이러한 접근 방식을 수백 또는 수천 개의 샘플로 확장할 수 있습니다. 이러한 기술의 적용에 의해 얻은 통찰력은 생물 의학에서 진화와 생태에 이르기까지 여러 과학 분야에 걸쳐 엄청난 영향을 미칩니다1,2,3. 그러나 많은 HTS 응용 분야는 살아있는 공급원의 고품질 핵산에 비판적으로 의존합니다. 이러한 제한은 긴 읽기 분자4에기초한 3세대 염기서열 분석의 발달로 점점 더 문제가 될 가능성이 높다. 이러한 이유로, 물질의 유용성을 극대화하고 필요한 개인의 수를 감소 실험실 외부 야생 유기체에서 신선한 조직 샘플을 수집하기위한 모범 사례를 수립에 노력을 집중할 필요가있다 수집.
Bat1K는 모든 종의 박쥐의 게놈을 염색체 수준 어셈블리5로서열화하는 지속적인 이니셔티브를 가진 과학자들의 국제 컨소시엄입니다. 박쥐는 포유류 다양성의 20%를 나타내며 노화, 질병 생태학, 감각 생물학 및 신진 대사를 이해하는 데 영향을 미치는 뛰어난 적응을 가지고있습니다5,6. 많은 박쥐는 또한 인간 착취7 때문에 위협또는 멸종 위기에 처해 있거나 병원체8,9및게놈 수준 염기서열 분석으로 인해 급속히 감소하고 있으며 이러한 종의 보존을 위해 매우 중요합니다. Bat1K는 현재 모든 박쥐 종의 게놈을 서열화하는 것을 목표로하지만, 고품질 의 게놈 염기서열 분석용 조직 샘플 수집의 표준화는 생물 생물학자 커뮤니티 전반에 걸쳐 주요 과제로 남아 있습니다. 게놈 데이터 이외에, 박쥐 적응의 다양성의 기능적인 이해는 조직 특정 전사체 및 단백질 분석을 요구합니다, 수시로 개별적인 수집 프로토콜을 요구합니다. 또한, 모든 분류학 그룹과 마찬가지로 최적의 조직 수집 및 보존은 -omics 분석을 위한 최고 품질의 데이터를 얻기 위해 필수적이지만, 급변하는 기술로 인해 모범 사례를 전달하는 것은 종종 어렵습니다. 여러 연구 팀이 독립적으로 일하고 있습니다.
많은 박쥐 종은 희귀하거나 위협주어진 박쥐 -omics 연구에 대한 모범 사례를 채택 할 필요성은 특히 시급하다. 설치류와 슈루와 같은 다른 작은 포유동물과는 달리 박쥐는 수명이 길며, 뛰어난 DNA 복구 메커니즘10과 느린 번식11에기인하며, 대부분의 종은 1년에 한 마리 또는 (몇 가지 경우) 2마리를 낳습니다. 이러한 이유로, 박쥐 인구는 방해에서 복구 속도가 느릴 수 있습니다., 야생에서 많은 개인을 수집 하는 것이 좋습니다 도 실현. 즉, 단일 시편에 대한 최대 데이터 양을 얻기 위해 프로토콜을 최적화해야 하므로 샘플링 노력을 불필요하게 복제할 필요가 줄어듭니다.
여기서, 이 프로토콜은 게놈 및 전사체 염기서열 분석 및 단백질 분석을 위한 박쥐 조직의 수집 및 샘플링을 위한 표준화된 방법에 특히 초점을 맞추고 있다. 최우선 과제는 박쥐 조직이 윤리적이고 책임감 있게 수집되도록 하는 것이며, 수집 허가 과정, 조직 수출, 동물에 대한 스트레스 최소화, 장기 보관 조건에 이르기까지 다양합니다. 수집된 다양한 재료의 유용성을 미래지향적으로 하기 위해 정교한 해부가 개발되었습니다. 이 원고는 인구에 미치는 영향을 최소화하고 과학적 가치를 극대화하기위한 인도적 인 방법으로 박쥐를 수집하는 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜의 초점은 박쥐에 사용하기 위한 것이지만, 많은 단계는 다른 척추동물 과세, 특히 포유류와 관련이 있습니다.
티슈 컬렉션 개요
저장 온도 및 보존제 선택을 포함한 조직 수집 절차는 계획된 모든 다운스트림 분석의 특성에 따라 결정됩니다. 그러나, 가능한 경우, 조직은 특정 분석이 계획되지 않은 경우에도 미래의 유틸리티를 극대화하기 위해 다양한 방법으로 수집되는 것이 좋습니다. 일반적으로 조직은 핵산 (DNA 및 RNA) 또는 단백질의 후속 분석을 위해 수집되고 보존됩니다. 이러한 각 응용 분야에 대해, 조직은 액체 질소 (LN2)에서 직접 플래시 동결에 의해 최적으로 보존 될 수있다. 그러나 LN2에 즉각적인 침수가 항상 가능한 것은 아닙니다. 기술이 발전함에 따라 DNA와 RNA를 주변 온도에서 저장하는 특수 바이알과 같은 리소스가 더욱 쉽게 이용 가능해지고 있습니다. 이 프로토콜에서 이러한 모든 자료를 검증하지는 않았지만, 다른 연구자들은 여기에 존재하는 것과 비교하여 새로운 물질의 성능을 비교적 분석할 것을 권장합니다. 우리는 LN2에 액세스 할 수없는 상황에서 다른 응용 프로그램에 대한 조직을 이상적으로 보존하는 방법을 제공합니다, 예를 들어, LN2 전송은 아마존에서 작은 비행기를 통해 사이트 액세스로 인해 불가능합니다. 또한, 우리는 살아있는 세포가 성장하고 전파 될 수있는 조직을 수집하는 방법을 제공합니다. 아래에서는 이러한 각 목적에 대한 자료 수집에 대한 주요 고려 사항을 간략하게 설명하고 수집 방법에 대한 개요는 표 1에요약되어 있습니다.
DNA를 위한 조직
수집된 모든 수확 된 조직에 대해, 저장 매체는 표준 또는 높은 분자량 (HMW) DNA 추출에 사용될 수 있는지 여부를 결정합니다. HMW는 긴 읽기 시퀀싱에 필요하며 현재 염색체 수준 게놈 어셈블리 또는 "백금 표준" 게놈을 생성하는 데 필요합니다. 낮은 분자량 (LMW) DNA는 플래시 냉동에서 추출 할 수 있습니다, AllProtect (이제부터 "조직 안정화 용액"이라고함), 또는 RNAlater (이제부터 "RNA 안정화 용액")-보존 된 샘플 (플래시 냉동 샘플은 최적 남아 있지만) ). 표준 실험실 방법(예를 들어, 실리카 겔 막 스핀 컬럼, 페놀-클로로포름)에 의해 단리된 DNA는 여전히 최대 ~20 킬로베이스(kb)의 DNA 단편을 산출할 수 있다. 따라서, 충분한 수율이 제공되면, 이러한 형태의 단리된 DNA는 삽입 크기가 종종 ~500 염기 쌍(bp)이고, ~100 bp의 짧은 서열 판독이 생성되는 단일 삽입 크기 라이브러리 준비에 사용될 수 있다12. 이 DNA는 전체 길이 염색체 데이터가 필요하지 않은 "재열화" 프로젝트 또는 연구에 특히 유용합니다. HMW DNA(10-150 kb)는 수확 후 LN2에서 급속히 증멸되고 추출될 때까지 최대 -80°C에서 유지되는 조직을 사용하여 안정적으로 얻을 수 있습니다.
낮은 분자량 또는 단편화된 DNA는 종종 PCR을 통한 유전자 증폭 및 짧은 읽기 시퀀싱13을포함한 표적 접근법에 충분합니다. 하나 또는 몇 개의 유전자만을 대상으로 하는 LMW DNA를 이용한 PCR 기반 조사는 박쥐 감각 생물학6,14,생리학15,계통유전학의 적응 및 분자 진화에 매우 유익했습니다. 5,16, 보존17,18. 낮은 분자량 및 단편화된 DNA의 성공적인 표적 서열 재캡처는 또한 박쥐19를포함하는 수많은 척추동물 단을 위해 입증되었습니다. 이러한 방법은 종종 박쥐에 비용 효과적이고 최소 침습, 대변 샘플및 비 치명적인 조직 샘플링으로 볼 면봉 또는 날개 생검 펀치는 또한 낮은 분자량 분석20에대한 DNA를 얻는 일반적인방법입니다, 21.
그러나 품질은 샘플이 저장되는 미디어유형(22)에크게 좌우됩니다. 볼 면봉과 생검 펀치의 체계적이고 정량적인 비교 후, 날개 생검 펀치는 DNA의 일관되게 높은 수준을 산출하기 위하여 보였고 수집 도중 박쥐에 더 적은 스트레스가 있었습니다22. 이러한 비교는 또한 날개 펀치가 지표 실리카(즉, 수분이 관찰될 때 색이 변하는 실리카 젤 비드로 만들어진 건조제의 일종)에서 날개 펀치를 보존했을 때 가장 좋은 결과를 얻었다는 것을 보여주었다. 에탄올 또는 DMSO22; 비록, 조직 안정화 용액을 포함하는 다른 저장 매체는 검토되지 않았다. 날개 펀치는 또한 Kacprzyk 외23 및 아래에 기재된 바와 같이 배양에서 섬유아세포 세포를 성장시키는데 사용될 수 있다(섹션 6 참조). 이러한 방법의 경우 날개 또는 우로파파그뮴을 부드럽게 확장해야 하며, 깨끗한 생검 펀치(일반적으로 직경 3mm)를 사용하여 샘플을 수득해야 합니다. 이 접근은 대부분의 경우에24에서주 안에 치유하는 흉터와 함께, 지속적인 손상을 일으키는 원인이 되기 위하여 나타납니다.
HMW DNA(10-150 kb)는 더 까다롭고 현재 수확 후 LN2에서 급속히 증멸되고 추출될 때까지 최대 -80°C에서 유지되는 조직을 사용하여 안정적으로 수득됩니다. HMW DNA (10-150 kb)는 긴 읽기 DNA 염기서열 분석및 따라서 드 노보 게놈 어셈블리에 매우 중요합니다. 실제로 대부분의 상용 키트는 표준 HMW DNA를 분리하는 데 사용할 수 있지만, 생성 된 분자 크기는 종종 3 세대 염기서열 분석 기술의 요구 사항을 충족시키지 못합니다 [예를 들어, 태평양 생물 과학 (PacBio)과 같은 회사에서 출시 한 키트, 옥스포드 나노 포어 기술, 및 10 x 유전체학, 또는 바이오 나노 유전체학 또는 도브 테일 유전체학에 의해 제공되는 조립 방법을 통해]. 이와 같이, "울트라 HMW" DNA (>150 kb)에 대 한 새로운 수요가 있다. 박쥐에서 울트라 HMW DNA를 얻을 때, 간, 뇌, 또는 근육의 신선한 샘플은 모두 적합하지만, 이들은 저장 버퍼 또는 냉동 보호제없이 LN2에서 즉시 플래시 냉동해야합니다. 이러한 단계에 대한 전체 설명은 이 백서의 범위를 벗어나지만다른 25에서사용할 수 있습니다.
RNA를 위한 조직
RNA는 DNA 보다는 보다 적게 안정적 인 단 하나 좌초분자입니다. RNA의 많은 양식이 있더라도, -omics 분석은 mRNA (메신저 RNA) 및 작은 RNA (예를 들면, microRNAs)에 집중하는 경향이 있습니다. 전사 에 이어, mRNA는 인트론을 포함하지 않고 유전자/게놈의 코딩 부분을 나타내는 성숙한 전사체를 형성하도록 접합된다. 코딩 유전자는 게놈 크기 (1%-2)의 작은 분율을 차지합니다, 표적으로 하는 mRNA는 유전자를 위한 서열 데이터를 얻기의 비용 효과적인 수단을 만들기. MicroRNAs는 단백질로 mRNA의 번역 과정을 통제하는 RNA의 부류이고 이렇게 중요한 규정 효력자입니다. RNA 전사체는 전사체의 일부로서 개별적으로, 또는 보다 일반적으로-오믹스 분석26,27,28,29,30; 즉, 주어진 샘플에 존재하는 모든 RNA 전사체의 합계이다.
시퀀싱은 여러 가지 방법(즉, 짧은 읽기 RNA-seq 또는 긴 읽기 전체 이소폼 Seq를 통해)에 따라 수행될 수 있으므로 RNA 풍부도 및 이소폼 사용 모두를 분석할 수 있습니다. mRNA 전사체의 양과 다양성은 세포와 조직 사이에서 변화하기 때문에, RNA 순서는 견본에 걸쳐 유전자 발현 그리고 규정을 공부하고 비교하는 것을 가능하게 합니다. 이러한 방법이 점점 더 생물학적으로 유익해지고 있기 때문에 작은 RNA 및 전체 이소폼 시퀀싱시퀀싱에 대한 관심이 증가하고 있습니다. RNA의 상이한 클래스를 서열화하는 조직 샘플의 제조는 이 원고에 제시된 것과 동일한 방식으로 수행될 수 있으며,31,32의후속 추출 방법만을 갖는다. 마지막으로, 전사체는 단백질 코딩 게놈의 높은 커버리지 서브세트를 제공하기 때문에, 조립된 데이터 세트는 게놈 조립 및 주석에 유용할 수 있으며, 다양한 조직에 걸쳐 RNA-seq 데이터를 수집하여 중요한 구성 요소로 만드는 데 유용할 수 있습니다. Bat1K 이니셔티브.
DNA와 는 대조적으로, RNA는 화학적으로 불안정하고 또한 RNA 기지를 둔 바이러스에 대하여 방어 전략으로 조직에서 유비쿼터스로 존재하는 RNase 효소에 의해 표적으로 합니다. 이러한 이유로, 세포와 조직에 있는 RNA 분획은 샘플링 및/또는 안락사의 점 직후에 저하하기 시작합니다. 따라서 RNA를 보존하려면 분해를 방지하는 단계가 필요합니다. 이것은 전형적으로 조직에 자연적으로 존재하는 RNases를 비활성화하기 위하여 RNA 안정화 해결책과 같은 안정화 에이전트에 있는 4°C에서 갓 수집한 조직을 보존하고, 더 긴 저장을 위해 동결하는 관련시킵니다. 바람직한 대안으로서, 조직은 LN2에서 플래즌 냉동될 수 있다; 위에서 언급했듯이, LN2를 현장으로 운반하고 조직 해동을 방지하기 위해 수준을 유지하는 것은 물류적으로 어려울 수 있습니다.
단백질 조직
단백질 조성 및 상대적 풍부도는 RNA에 대해 논의된 것과 유사한 방식으로 세포 및 조직 간에 다양합니다. 그러나, 단백질은 RNA 보다는 평균적으로 더 안정적입니다. 프로테오믹스를 이용한 단백질 식별은 전형적으로 전체, 단백질 서열이 아닌 분수와 일치하지만, 조직 전반에 걸쳐 발현에 대한 정보를 제공하고 존재하는 병원체를 특성화할 수 있다. 많은 단백질 서열이 포유류에 걸쳐 보존되기 때문에, 프로테오믹스를 위한 박쥐 견본은 쉽게 수집 도중 멸균 프로토콜 (예를 들면, 장갑, 집게)를 요구하는 보존된 인간 단백질로 오염될 수 있습니다. LN2의 플래시 동결은 단백질의 분해를 방지하는 가장 좋은 방법이지만, 드라이 아이스, -20 °C 냉동고, 심지어 얼음은 다른 방법이 없는 경우에 적합합니다. 온도가 증가함에 따라 차동 단백질 분해의 위험도 증가합니다. 조직 안정화 용액과 같은 안정화 제는 실온에서 조직의 단백질 분획을 보존하는 데 효과적이며 플래시 동결이 가능하지 않을 때 단기 보존 (최대 1 주)에 적합합니다.
주어진 조직의 효소 프로파일은 그 안에 있는 단백질의 보존에 직접적인 영향을 미칩니다. 근육과 같은 낮은 효소 활동을 가진 조직은 가정용 냉동고의 더 높은 온도에서도 단백질 프로파일을 보존 할 수 있습니다. 대조적으로, 간 조직은 효소 반응성이고, 그것의 단백질은 준비 도중 저하의 더 높은 확률이 있습니다. 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 샘플에서 인간 단백질 프로파일을 얻기위한 프로토콜의 증가는 조직의 파라 포름 알데히드 고정이 수집시 동결 시 저비용 단백질 보존에 대한 약속을 보유하고 있음을 시사한다. 실현 가능한33,34. 보존 시간 및 상태에 크게 의존하지만, 단백질은 포르말린 고정, 에탄올 보존 박쥐 표본35에서면역 히스토화학을 통해 확인되었습니다. 이 접근법은 프로테오믹스 수준의 샘플링으로 확장할 수 없지만, 플래시 동결을 사용할 수 없고 다른 안정화 제가 너무 비용이 많이 들 때 포르말린 고정 박쥐 조직이 단백질 프로필을 생성할 수 있는 가능성을 강조합니다.
세포 배양을 위한 조직
샘플링 조직 및 플래시 동결은 사용할 재료의 한정된 양을 제공하고, 재료가 사용되면, 그것은 더 이상 사용할 수 없습니다. 또는, 세포 배양은 미래 연구를 위해 즉시 사용되거나 보존될 수 있는 살아있는 세포를 제공합니다. 배양은 또한 조직 견본이 작을 때 수율을 증가시키기 위하여 세포의 확장을 촉진합니다. 비 치명적인 샘플링이 필수적이며 따라서 보존에 대한 광범위한 의미가있는 희귀 종을 실험하는 것과 같이 조직 수집이 제한된 경우에 특히 유용합니다. 기재된 프로토콜은 날개 막 조직의 비치명적인 샘플링을 통해 세포 배양이 가능하지만 다중 조직유형인 36,37로배양이 가능하다. 여기에 제공된 프로토콜은 부착 셀을 선택합니다. 사용된 근원 조직 및 성장 매체의 조합은 이 프로토콜을 섬유아세포를 선택하고 성장시키는 데 적합하지만, 원하는 경우, 다른 세포 유형을 선택하기 위해 대체 프로토콜을 사용할 수 있다. Bat1K 프로젝트의 맥락에서, 희귀하고 위협적인 종의 경우, 날개 막의 비 치명적인 샘플링과 배양을 통한 샘플의 확장이 채택된 여러 기술에 필요한 DNA의 양을 생성하는 데 필수적이라고 예측됩니다5 .
박쥐 포획
박쥐를 다루는 모든 사람들은 박쥐 유능한 연구원에 의해 훈련되고 일련의 사전 노출 주사로 광견병 예방 접종을받아야합니다. 물린 경우, 노출 후 주사의 추가 시리즈는 여전히 필요. 박쥐를 캡처하는 표준 방법은 미스트 그물(그림 1)및 하프 트랩(그림 2)을포함한다. 미스트 네트는 박쥐 고민을 최소화하기 위해 가장 많은 주의를 기울여야 하기 때문에 활동이 적당하여 활동이 적당하지 않는 지역에 가장 많이 사용됩니다. 작은 박쥐는 특히 취약하며 빨리 하지 않으면 스트레스로 죽을 수 있습니다. 빈번한 순 검사는 박쥐 부상과 사망률뿐만 아니라 안개 그물의 손상을 최소화합니다. 적절한 조직 수집은 조직이 신선해야하기 때문에이 세부 사항은 중요하며, 박쥐의 안개 그물에 대한 부적절한주의는 연구원이 샘플을 적절하게 처리하기 전에 불필요한 사망 또는 조기 사망으로 이어질 수 있습니다. 여러 박쥐가 최소한의 고민으로 하프 트랩에 휴식을 취할 수 있기 때문에,이 방법은 동굴이나 큰 닭 근처와 같은 박쥐 활동이 높은 지역에 이상적입니다. 적절한 박쥐 캡처 및 형태 학적 및 인구 통계 적 정보의 수집을위한 데이터 처리에 대한 자세한 지침은 보충 방법에서 사용할 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 스토니 브룩 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 #2013-2034).
1. 안락사
- 이소플루란 마취제 또는 다른 사용 가능한 마취제로 면봉을 적시다.
- 면봉을 재밀봉 가능한 밀폐형 비닐 봉지에 넣습니다. 가방은 천 박쥐 가방에 편안하게 가방을 보관할 수있을만큼 커야합니다.
- 몇 분 후에 가방이 마취제에 스며들도록 허용한 후, 박쥐가 들어있는 박쥐 가방을 비닐 봉지에 넣습니다.
- 박쥐가 안락사 될 때까지 몇 분 기다립니다. 배트 ~ 20g 이하의 무게는 약 5-10 분이 필요합니다. 이보다 큰 박쥐는 최대 20 분이 필요할 수 있습니다. 마취제의 확산을 최대화하기 위해 가능한 가장 얇은 천 소재를 사용하는 것이 좋습니다.
- 해부가 시작되기 전에 박쥐가 안락사되었는지 확인하기 위해 호흡과 심장 박동을 확인하십시오.
2. 해부 준비
- 다음 프로토콜을 사용하여 해부 사이에 모든 계측을 깨끗하게 유지합니다.
- 물과 접시 비누로 악기를 씻으소서. 표백제가 핵산을 분해하기 때문에 해부 부위에서 멀리 떨어진 10 % 표백제로 닦으십시오.
- 70% 에탄올로 닦아냅니다.
- RNAe 오염 제거 시약으로 닦아냅니다.
- 각 해부 후 이 섹션을 반복합니다.
3. 조직 샘플용 바이알 준비
-
RNA의 경우:
- 지연을 피하기 위해 해부를 시작하기 전에 모든 바이알을 준비하십시오.
- 각 시편에 필요한 바이알수를 따로 떼어 놓습니다. 수집될 조직 유형과 표준 표본 식별 정보를 각 튜브에 라벨을 붙입니다. RNA 안정화 용액이 가득 찬 바이알을 50% 채우고 이상적으로 4°C로 식힙니다.
- RNA 안정화 용액으로 바이알을 완전히 채우지 않도록주의하십시오. 조직 샘플을 채취 할 때, 조직의 큰 덩어리가 RNA 안정화 용액에 완전히 침투하지 않을 것이라는 점을 기억하십시오. 따라서 조직을 한 차원에서 0.5 cm 보다 작은 조각으로 자르고 RNA 안정화 용액 : 조직에 대해 적어도 10 :1 부피의 비율을 유지하십시오.
- 최소한, 해부된 조직은 LN2또는 냉장 보관소에 접근할 수 없는 경우에도 RNA 안정화 용액에 배치되어야 합니다.
-
DNA의 경우:
참고 : 핵 DNA 함량은 거의 모든 조직에 대해 동일합니다. 따라서 샘플링은 유연할 수 있습니다. 그러나, 근육 조직에 있는 미토콘드리아의 더 높은 조밀도는 핵 게놈38를위한 읽기의 손실로 이끌어 낼 수 있다는 것을 주의해야 한다.- 저분자 DNA의 경우, 실리카에 저장하기 위해 날개 막의 하나 이상의 복제본을 취하고, RNA 안정화 용액 또는 조직 안정화 용액에 저장하기 위해 근육을 사용하십시오.
- 울트라 HMW DNA의 경우, 저장 시약없이 LN2에서 플래시 동결을 한 다음 -80 °C 또는 추운 장기 저장으로 옮깁니다. 두개골 해부에서, 뇌 조직은 울트라 HMW DNA39를검색하기위한 가장 적합한 조직 유형이지만, 두개내 해부, 간 또는 근육에서 더 적합한반면 40.
- 두개골 해부를 위해, 일부 조직에 대한 RNA 안정화 용액의 5 mL 바이알 (표준 2 mL 바이알과 반대)을 사용하십시오. 모든 바이알은 극저온이어야 합니다. 해부하는 동안 얼음에 유리병을 유지합니다.
4. RNA를 위한 두개골 해부
- 안락사 직후, 큰 가위 또는 뼈 절단기로 표본을 참수하십시오(그림 3).
- 시신경을 분리할 수 있을 만큼 강한 힘을 사용하여 집게로 눈을 제거합니다. RNA 안정화 용액의 2 mL 바이알에 눈을 놓습니다.
- 선택한 도구를 사용하여 코의 피부를 포함하여 머리카락, 근막 및 두개골 근육에서 두개골을 피부로 만드십시오. 코의 앞쪽 끝이 부러지지 않도록 주의하십시오.
- 가위를 사용하여 목에서 시작하여 두개골의 복부 부분에 시상절단을하고뇌를 손상시키지 않도록주의하십시오.
- 집게를 사용하여 두개골이 열리고 뇌가 노출 될 때까지 두개골의 양쪽을 부드럽게 당깁니다.
- 두개골의 꼬리 끝에, 달팽이관은 이제 머리의 각 측면에 측면으로 볼 수 있어야합니다. 그들은 왼쪽과 오른쪽에 있는 작고 구형의 뼈이며, 목과 후방에 장미빛 근육이 있습니다. 집게를 사용하여 달팽이관을 부드럽게 당겨 RNA 안정화 용액의 2 mL 바이알 1 개에 넣습니다.
- 집게로 뇌 (매우 부드러운)를 부드럽게 긁어 냅니다. 후각 전구는 두개골 내부의 복부 부분에 앉아 볼 수 있게됩니다. 후각 전구를 부착된 상태로 유지하십시오.
- 후각 전구가 아직 제거되지 않은 경우 조직을 부드럽게 긁어 내고 cribriform 플레이트가 명백해집니다. 이것은 연구원 의 지향을 유지하는 중요한 뼈입니다. 그것은 여러 포라멘과 후각 전구가 달려있는 두 개의 홈이있는 지점과 두개골의 가장 전방 영역으로 식별 할 수 있습니다.
- 가능하면 뇌 모양을 그대로 유지하고 즉시 드라이 아이스에 놓아 모양을 유지하거나 RNA 안정화 용액의 5 mL 바이알에 보관하십시오. 면역 성 화학이 뇌에서 수행 될 경우, 4 % 파라 포름 알데히드에 배치, 가능한 경우.
- 상단과 하단 턱이 결합된 두 개의 절개를 만들고 하악골을 제거합니다.
- 하악골이 제거되면 두개골의 나머지 부분에서 로스트럼 (위턱)을 제거하십시오. 턱에 크림 플레이트가 포함되어 있는지 확인합니다.
- 코를 RNA 안정화 용액에 놓고 밤새 4 °C에서 보관하십시오. 이것은 조밀한 조직이기 때문에, 전체 조직에 침투하는 RNA 안정화 해결책을 허용하는 시간이 필요합니다.
- RNA 안정화 용액에 하룻밤 담그고 다음 LN2에 코 바이알을 놓습니다.
- 하악골에서, 가위로 혀를 자르고 나중에 RNA의 2 mL 바이알에 놓습니다.
- 이 프로토콜은 두개골의 대부분을 몰수. 치아, 특히 하악골에서 치아는 회복 될 수 있으며 종 진단에 유용 할 수 있습니다. 뼈 조직은 1x 인산완충식염수(PBS)에 보관할 수 있다.
5. RNA에 대한 두개내 해부
- 메스를 사용하여 복강을 관통하여 갈비뼈까지 세로 절개를합니다(그림 3). 이렇게 하면 골격 프레임이 소멸됩니다. 뼈가 보존될 경우, 근육의 피부에서 조심스럽게 해부하고 연조직 해부가 완료된 후 1x PBS에 보관하십시오.
- 가슴 근육을 공개 하는 피부를 스트립, 근육의 적어도 두 샘플을 가지고, RNA 안정화 솔루션에 대 한 하나 HMW DNA에 대 한 냉동 남아 하나, LN2에 넣어 유리병에 즉시 배치.
- 흉골을 잘라 폐에서 샘플을 수집하기 위해 갈비뼈를 당깁니다.
- 전체 로 촬영 할 수 있지만 반으로 단면해야 심장을 수집, 그래서 RNA 안정화 용액은 철저하게 담가.
- 간에서 샘플을 채취하십시오. 적어도 두 개의 간 샘플을 가지고, 하나는 LN2에 넣어 빈 유리병에 즉시 배치, HMW DNA에 대한 냉동 남아 있습니다. 간은 매우 효소이며, RNA 안정화 용액이 완전히 흡수될 수 있도록 샘플을 충분히 작게 만드는 것이 중요합니다.
- 간장에서 담즙을 배출하는 기능을하는 간 관은 간을 췌장과 소장에 연결합니다. 이 혈관은 간열한/후방 부분을 조사하고 혈관을 후방 방식으로 추적하여 쉽게 식별할 수 있습니다. 덕트도 종종 녹색입니다. 췌장과 담낭을 찾아서 별도로 이들을 모으기 위하여 간 덕트를 따르십시오. RNA 안정화 용액의 각 바이알에 놓습니다.
- 위를 모으고, 그 옆에, 그 밑에 보라색의 다른 그늘로 나타나는, 깃털 같은 비장입니다. 췌장은 또한 백색 구조물로 여기에서 볼 수 있어야 합니다(그림 3). RNA 안정화 용액의 각 바이알에 놓습니다.
- 소장과 대장의 작은 샘플을 수집합니다. RNA 안정화 용액의 각 바이알에 놓습니다. 창자는 또한 내분비기생충을 위해 가려질 수 있습니다. 기생충 학자가 현장에있으면 기생충 검사를 수행 할 수 있습니다. 이것이 나중에 행해질 경우, 전체 장은 5 mL 극저온 바이알에서 취할 수 있습니다.
- 신장 중 하나를 가지고 방광에 자신의 덕트를 따르십시오. RNA 안정화 용액의 각 바이알에 놓습니다.
- 고환 (남성 인 경우) 또는 자궁을 찾기 위해 다른 신장을 가이드로 사용하고 이를 통해 난소 (여성인 경우). 가능하면 하나 또는 둘 다 생식을 수집합니다.
- 날개 의 피부의 다양한 부분의 샘플을 별도의 바이알 (근육 대 비 근육 부분)에 보관하십시오.
6. 조직 문화 수집 및 준비
- 20% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 50 μg/mL 젠타마이신을 함유한 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 만들어 세포에 대한 성장 배지를 준비하십시오. 성장 매체의 Aliquots는 프로토콜의 매일 신선하게 만들어야합니다.
- 수집 후, 날개 생검 펀치는 잘 밀봉 된 1.5 mL 원심 분리튜브에 1 mL의 차가운 성장 매체에 직접 배치해야합니다. 튜브를 파라필름으로 감싸 밀봉합니다.
- 튜브는 4 °C에서 샘플을 유지하기 위해 냉각 요소와 폴리스티렌 상자에 수송되어야한다. 전송은 신속해야 합니다. 비록, 건강한 세포는 최대 6 일 동안 이 방법으로 저장되었지만 덜 최적으로23으로저장된 펀치로 만들 수 있습니다.
- 일단 조직 배양 시설로 이송되면, 다음 프로토콜은 세포 배양을 생성하는데 사용될 수 있다. 표준 멸균 기술은프로토콜(41)의나머지 부분에 사용해야 한다.
7. 1 일 조직 배양 : 조직의 해리
- 튜브의 내용물 (날개 막 생검을 포함하는 성장 배지)을 15 mL 원추형 원심 분리관으로 옮니다.
- 성장 매체를 조심스럽게 제거하십시오. 500 μL의 멸균 PBS로 생검을 두 번 부드럽게 씻으십시오.
- 튜브에 콜라게나아제 IV(1 mg/mL)의 500 μL을 넣습니다. 이것은 개별 적인 세포로 조직의 소화를 일으키는 원인이 될 것입니다.
- 교반없이 37 °C에서 밤새 배양 (최대 16 시간).
8. 2 일 조직 배양 : 도금 세포
- 신선한 성장 매체를 구성하고 37 °C로 미리 따뜻하게합니다.
- 사용할 플레이트의 각 웰에 2 mL의 신선하고 미리 온난한 성장 배지를 추가하여 6웰 조직 배양 플레이트를 준비한다(3 mm 날개 생검당 1웰). 이 플레이트를 필요시까지 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에 보관합니다(단계 8.7).
- 인큐베이터로부터 세포를 함유하는 15 mL 튜브를 제거하고 신선한 성장 배지 1 mL을 첨가하여 소화 반응을 담금질한다(37°C로 미리 데운).
- 단일 셀 현탁액을 달성하기 위해 P1000 파이펫 팁으로 용액을 신중하게 세분하여 셀을 재중단시면됩니다.
- 테이블 상단 원심분리기에서 300 x g에서3 분 동안 세포를 부드럽게 회전시다.
참고: 조직의 작은 조각은 여전히 현탁액에서 볼 수 있거나 15 mL 튜브의 벽에 부착 될 수있다. 그러나 이것은 세포 현탁액 준비에 영향을 미치지 않습니다. - P1000 파이펫으로 액체의 80%-90%를 부드럽게 제거하여 상판을 폐기합니다.
참고 : 여전히 보이는 경우, 조직의 조각을 폐기하지 말고, 부드럽게 다음 단계 (8.7)에서 삼분화. - 미리 온난한 성장 배지의 500 μL에서 펠릿을 다시 중단하고, 펠릿또는 큰 조각이 더 이상 보이지 않고 세포가 충분히 현탁되었는지 확인하기 위해 현탁액을 부드럽게 삼분화합니다. 매체는 세포의 존재 때문에 흐린 것처럼 보일 수 있습니다.
참고: 이 단계에서, 생존 가능한 세포 수는 날개 클립으로부터 유래된 세포의 현탁액 및 수율의 품질을 평가하기 위해 수행될 수 있다(자세한 내용은 단계 10.11 참조). - 셀 서스펜션의 전체 부피를 6웰 플레이트의 단일 웰로 부드럽게 피펫합니다.
참고: 상기 단계를 즉시 수행하고 8.7단계 이후에 세포가 침전되는 것을 허용하지 않는다. 파이펫을 사용하여 셀 현탁액을 웰 표면에 부드럽게 분산시. 이 우물의 중간에 응집 세포가 발생할 것 같이, 우물의 중심으로 전체 용액을 피펫하지 마십시오.
참고: 조직의 조각이 여전히 보이는 경우, 잘 배양 용기로 전송하지 마십시오. - 플레이트를 좌우로, 앞에서 뒤로 2x-3x로 부드럽게 흔들어 세포가 단일 레이어의 우물 표면에 분산될 수 있도록 합니다.
- 현미경의 밑에 도금된 세포를 검사하십시오, 그(것)들은 위로 떠 있는 그러나 아주 조밀하게 나타나는 단 하나 세포이어야 하기 때문에.
- 조심스럽게 37 °C 및 5 %CO2로미리 설정 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다.
- ~24h 후, 배양의 건강을 결정하기 위해 현미경으로 세포를 관찰한다. 이제 세포가 플레이트 표면에 부착되어 평평해져야합니다(그림 4A). 상이한 세포 모형은 현미경을 통해서 볼 때 배양에서 보일 수 있습니다.
- 연결되지 않은 부동 셀이 있을 수 있습니다. 이 세포의 비율은 죽었습니다. 웰에 부동 셀의 비율이 높은 경우 미디어를 새로 고쳐야 합니다. 이 경우, 잘에서 배지의 ~50%를 조심스럽게 흡인하고 세포를 방해하지 않도록 미리 온난한 성장 배지의 1 mL을 웰의 측면에 부드럽게 첨가한다.
- 세포를 37°C 및 5%CO2로미리 설정된 인큐베이터에서 유지한다. 세포는 매체 다과 또는 분할을 위한 필요를 결정하기 위하여 현미경의 밑에 정규 (그러나 하루에 한 번 이상) 관찰되어야 합니다.
참고: 세포가 새로 도금되면 빠르게 분열되므로 매일 검사해야합니다. 문화에서 약간의 시간 후, 성장 둔화 됩니다., 그리고 그들은 모든 48-72 시간을 확인할 수 있습니다.
9화 리프레싱 미디어
-
정기적으로 현미경의 밑에 세포를 확인하고 그들의 성장 및 문화의 질을 관찰합니다. 미디어의 품질을 나타내는 지표로 미디어의 색상을 모니터링합니다. 세포는 최대 3 일 동안 동일한 미디어에 남아 있어야하거나 통과가 필요할 때까지(중 먼저 제공).
- 세포가 빠르게 성장하고 매체를 소모하는 경우, 이것은 또한 미디어의 색상이 빨간색에서 노란색으로 바뀌기 때문에 눈에 표시됩니다.
- 필요할 때마다 매질의 ~50%를 잘로부터 조심스럽게 흡인하고 세포를 방해하지 않도록 미리 가열된 성장 배지의 부피를 약 동일한 부피를 웰의 측면에 부드럽게 첨가한다.
- 세포를 37°C 및 5%CO2 인큐베이터로 되돌려 보라고 한다.
10. 세포를 통과하는
- 세포를 통과하는 것은 기존 배양을 취하고 새로운 우물로 분할하는 것을 나타납니다. 세포가 ~80% 동류일 때 통과가 일어난다[즉, 우물 표면의 ~80%를 차지하고 플라스틱의 ~20%만이 여전히 틈으로 볼 수있다(도 4B]]
- 조심스럽게 흡인하고 성장 매체의 ~ 90 %를 폐기하십시오.
- 세포를 방해하지 않도록 웰의 벽에 멸균 PBS 1 mL을 추가하여 세포를 매우 부드럽게 씻는다. 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들고 좌우로 2x-3x로 흔들어 주세요. 조심스럽게 흡인하고 접시에서 모든 PBS를 폐기합니다.
- 10.3단계를 반복하여 세포를 다시 세척한다.
- 250 μL의 트립신-EDTA(시그마 알드리치, 고양이 #T4049)를 웰에 부드럽게 넣고 실온에서 1.5분 동안 배양합니다.
참고: 트립신-EDTA 용액이 플레이트를 부드럽게 흔들어 우물의 전체 표면을 덮는지 확인하십시오. - 신선한 미리 온난한 성장 배지의 1 mL을 추가하여 반응을 담금질.
- 피펫을 위아래 ~5x로 하여 판표면에서 세포를 세척하고 세포가 현탁액에 있는지 확인합니다.
참고: 용액은 셀의 존재로 인해 흐릿해져야합니다. - 셀 현탁액을 15 mL 튜브에 놓고 300 x g에서3 분 동안 탁상 원심 분리기에 세포를 돌십시오.
- P1000 파이펫으로 액체의 80%-90%를 부드럽게 제거하여 상판을 폐기합니다.
- 미리 데온된 성장 배지의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하고 서스펜션을 부드럽게 삼분화합니다. 펠릿 또는 펠릿의 큰 파편이 더 이상 보이지 않는지 확인하고 세포가 단일 세포 현탁액에 있는지 확인하십시오.
- 여기에 설명된 바와 같이 자동화된 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산하거나, 참조비디오(42)에상세히 기재된 바와 같이 혈세포계를 사용하여 수동으로 계산한다. 부유 된 세포의 10 μL aliquot를 Trypan 파란색과 혼합하여 생존 가능한 세포를 검출합니다.
- 1분 동안 인큐베이션하고, 용액의 피펫 10 μL을 계수 슬라이드 상에. 계산 슬라이드를 자동화된 셀 카운터에 삽입하여 적절한 설정을 사용하여 셀을 계산합니다. 수율은 6 웰 플레이트의 단일 웰에서 약 1-2 백만 세포여야하지만, 이것은 세포와 종의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 세포가 단일 셀 현탁액에 없는 경우 셀 수가 정확하지 않습니다.
- 이러한 세포 배양은 일반적으로 1:2 분할을 용인할 것이다[즉, 세포의 하나의 웰웰은 2개의 새로운 웰(total)]으로 분할될 수 있다. 이렇게하려면 세포를 다시 부드럽게 삼각측량한 다음 세포 현탁액을 두 반으로 가져 가서 (각각 730 μL) 두 개의 새로운 우물에 각각 750 μL의 미리 온난화 된 성장 배지를 방울 같은 방식으로 넣습니다.
참고: 2-3 일 후 우물은 수렴하고 다시 분할 에 대한 준비가되어 있어야합니다. 이 시점에서, 유능하게 동결 프로토콜(섹션 11)에 의해 하나의 유정을 보존하는 것이 좋습니다. 세포의 추가 주식은 바람직한 추가 통로 동안 동결 될 수있다.
참고: ~ 6 대대 후, 세포는 노화를 입력하는 경향이 더 이상 분할되지 않습니다. 이것은 세포가 더 이상 분할되거나 확장될 수 없다는 것을 표시합니다. 이것은 또한 세포가 훨씬 더 이상 실행 가능하지 않을 것이라는 표시입니다.
11. 가능한 살아있는 세포를 동결
- DMEM과 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S 및 50 μg/mL 젠타마이신을 결합하여 동결 매체를 준비합니다.
- 동결은 통과 과정에 따라 펠릿 된 세포를 복용하여 수행됩니다. 펠릿은 8.1-8.9 단계에 따라 6 웰 플레이트 (~ 1-2 백만 세포를 나타내는)의 80 % - 90 % 웰에서 제조되어야한다.
- 펠릿을 1.5 mL의 동결 배지로 다시 놓습니다.
- ~ 750 μL의 세포 현탁액을 각각 두 개의 분리된 저온 에 놓습니다.
- 바이알을 극저온 냉동 용기에 넣고 세포가 천천히 얼어 세포 활력을 유지합니다. 즉시 -80 °C에 놓습니다.
- 24-48 시간 후, 장기 저장을 위해 LN2에 세포의 극저온을 전송합니다. 이런 식으로 저장하면 세포가 부활 할 수 있으며 수년 동안 실행 가능할 것입니다.
12. 냉동 세포 해동
- 사용될 각 웰에 미리 온난된 성장 배지 2 mL을 함유하는 6개의 웰 플레이트를 준비한다(해동되는 세포의 유리병 당 1웰). 필요할 때까지 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에서 플레이트를 유지합니다.
- LN2에서 세포의 한 바이알을 가지고 따뜻한 수조 (37 °C)에 배치하여 세포를 빠르게 해동시. 이 데 2-3 분이 소요됩니다.
참고: 동결 매체의 DMSO가 일단 해동되면 세포에 독성이 있기 때문에 바이알을 3-5 분 이상 해동시키지 마십시오. - 바이알내의 용액이 해동되는 즉시, 용액을 균질화하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫을 만들고 즉시 전체 용액(~750 μL)을 6웰 플레이트 중 하나의 웰(12.1단계에서 미리 준비)에 놓습니다.
- 플레이트를 좌우로, 앞뒤로 2-3회 부드럽게 흔들어 세포가 단일 층의 우물 표면에 분배하도록 돕습니다.
- 세포를 인큐베이터에 37°C 및 5%CO2 인큐베이터에 24-48시간 동안 놓는다.
- 상기와 같이 세포를 모니터링하고 통과한다.
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Representative Results
Dna
표준 낮은 분자량 (LMW) 분석을 위해, DNA는 3개의 신열대 박쥐 종에서 추출되었습니다. 조직 샘플은 이 논문에 기재된 프로토콜에 따라 도미니카 공화국 및 코스타리카로부터 현장에서 수집하였다. 해부 후, 혼합 조직 (뇌, 간 및 장)의 작은 조각 (가장 얇은 부분에서 0.5 cm)을 RNA 안정화 용액에 넣고 플래시 냉동 한 다음 -80 °C에서 보관했습니다. 추출은 RNase 처리43을이용한 표준 DNA 추출 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 자동화된 전기 동극 도구를 사용하여 DNA 무결성에 대한 평가는 단편 크기의 다음과 같은 대표적인 샘플 피크를 밝혀냈습니다: 종 1 (2개의 분리된 추출)은 22kb 및 20 kb로 구성되었습니다; 종 2는 25 kb로 구성; 종 3은 24 kb로 구성되었습니다(그림 5, 표 2).
3세대 염기서열 분석용으로 추출된 DNA는 고농도로 수집되고 최소로 단편화되어야 한다. 가나에서 채취한 올드월드 과일박쥐(Eidolon helvum)로부터플래시 냉동 뇌 조직에서 추출한 HMW DNA를 수득하였다. HMW DNA는 Irys 플랫폼에서 후속 분석을 위해 바이오나노 추출 프로토콜을 사용하여 추출되었습니다. 이 DNA는 길이가 607,463 Mb이고 평균 분자 N50이 194.5 Mb였습니다.
Rna
RNA 추출에 대한 성공의 일반적인 지표는 RNA 무결성 번호(RIN) 값입니다. 추출이 RIN 값이 8 미만일 때 RNA-seq 라이브러리 준비 또는 시퀀싱 프로토콜을 수행하기 위해 시퀀싱 시설에서 권장되지 않는 경우가 많으며, 이 임계값 미만의 값은 저하의 높은 시그니처를 입증하기시작하므로 44 ,45. 도 6은 이 프로토콜에 따른 다양한 조직 유형의 RNA 추출에 대한 RIN 값을 나타낸다. 프로토콜로 수집 된 조직의 추출은 필드 샘플링 지역성에 관계없이 고품질의 RNA를 초래했습니다. LN2가 아마존에서 즉시 사용할 수 없을 때, 조직은 RNA 안정화 용액에 넣고 LN2에 배치 될 때까지 1 주 동안 4 °C에서 유지되었습니다. 이러한 경우에도 RIN 값은 RNA 안정화 용액에 즉시 배치되고 LN2로 직접 배치된 것과 비교되었습니다. RNA 안정화 용액은 필수적인 안정화 제입니다.
조직 배양
도금 직후, 세포는 위로 공을 올려 떠다닐 것입니다. 그러나 24 시간 이내, 섬유아세포는 평평해지고 플레이트의 표면에 부착되어야한다(도 4A). 이 시점에서, 세포는 생존을 보장하기 위해 대략 20%-30% 합류에 있어야 합니다. 이보다 낮은 값은 전체 문화의 죽음을 초래할 수 있습니다. 처음에는 세포가 배양에서 분열되고 확장되기 때문에 확장을 허용하기 위해 서로 충분한 공간이 있어야합니다. 그들은 80 %-90 % 합류에 도달 할 때 분할되어야한다 [즉, 그들은 플레이트 표면의 >80 %를 커버(그림 4B)]. 이런 식으로, 세포는 노화를 겪기 전에 다수의 대관(보통 >6 대)에 대한 배양에서 유지될 수 있다. 세포가 이 시간 저쪽에 배양되거나 결합될 때 분할되지 않는 경우에, 그(것)들은 형태를 바꾸고 더 크고 더 길게 될 수 있습니다(그림 4C). 이 형태를 가진 세포는 아직도 분할할 수 있습니다, 그러나 이것은 일반적으로 세포가 곧 노화를 입력하고 더 이상 문화에서 유지되거나 확장될 수 없다는 것을 표시합니다.
그림 1: 숲에서 박쥐를 잡기 위해 안개 그물을 잡는 일반적인 설정입니다. 한 손을 가리고 반대손으로 어지럽히면서 도는 것은 스트레스를 최소화하면서 박쥐를 안전하게 제거하는 방법입니다. 이 사진은 존 플랑드르가 찍은 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 하프 트랩은 종종 외부 동굴, 대형 닭, 또는 플라이 어웨이를 캡처하는 데 사용됩니다. 박쥐는 최소한의 얽힘과 조사관에 의해 쉽게 제거와 함정의 낮은 주머니에 축적됩니다. 이 사진은 스티븐 로시터가 찍은 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RNA 조직 준비를 위한 해부 및 조직 샘플링의 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 식물성 변색의날개 펀치로부터 유래된 박쥐 세포 배양체는 도금 후 24-48시간, 세포가 평평해지고 플레이트 표면에 부착된다. (B)세포는 판 표면의 80%-90%를 커버하고 원래의 형태를 유지한다. 이는 분할을 위한 최적의 단계를 나타냅니다. (C)6 대항 후, 세포는 더 크고 더 길게 자신의 형태를 변경하고, 세포는 노화를 입력합니다. 모든 사진에서 밝고 볼드업 세포는 죽은 세포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 3종의 박쥐 종으로부터 표준 DNA 분석을 위해 보존으로부터 DNA 추출의 대표적인 결과, DNA는 종 1로부터 2회 추출되었다. 단일 큰 밴드는 각 추출에서 최소한의 단편화 및 유사한 크기의 DNA 조각을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 4개의 상이한 지방에서 샘플링된 신열대 박쥐 종으로부터의 13가지 조직 유형으로부터의 RNA 무결성 수치(RIN). 이들 추출은 기재된 프로토콜에 따라 제조된 다음 HiSeq/NextSeq 일루미나 전사체 라이브러리를 제조하는데 사용되었다. MOE는 주요 후각 상피입니다. VNO는 보메로나살 기관입니다. 안데스, 코스타리카 및 도미니카 공화국의 종으로부터 채취된 조직은 밤새 4°C에서 RNA 안정화 용액에 담근 후 LN2에 직접 배치하였다. 아마존에서 종으로부터 채취된 조직을 RNA 안정화 용액에 넣은 후 약 1주일 후에 LN2에 넣고 4°C에서 연속하여 보관하였다. N은 각 조직 추출에 대해 나타내는 개인의 수를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 응용 프로그램 | 플래시 냉동 (L2) | RNAlater | 올프로텍 (올 프로텍스 | FFPE | 미디어 |
| 높은 MW DNA |  |
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| 낮은 MW DNA | |
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| Rna | |
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| 단백질 | |
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| 세포 배양 | |
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표 1: 보존 방법 및 응용 프로그램에 대한 개요입니다. MW = 분자량, FFPE = 포르말린 고정 파라핀 내장 조직. 체크표시는 각 의도된 각 응용 프로그램에 대해 선호하는 보존 방법을 나타냅니다. X 마크는 사용하지 않아야 하는 보존을 나타냅니다.
| 종 ID | 샘플 ID | 농도(ng/μL) | 샘플 조각 피크 크기(bp) |
| 종 1 | 1.1 | 31.8 | 21,885 |
| 1.2 | 22.8 | 19,633 | |
| 종 2 | 2 | 30.4 | 25,198 |
| 종 3 | 3 | 32 | 24,386 |
표 2: 본 프로토콜의 보존 방법에 기초한 DNA 추출에 대한 대표적인 결과. 값은 도 5에서겔 전기 동동 웰에 해당합니다.
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Discussion
이 원고에서 논의된 프로토콜은 박쥐의 다양한 고처리량 분자 분석을 위한 최상의 샘플링 사례를 설명합니다. 모든 성공적인 -omics 연구는 고품질 조직을 필요로하지만, 샘플링 박쥐 조직뿐만 아니라 다른 비 모델 유기체, 종종 제어 실험실 설정과 동일한 표준으로 설정할 수없는 필드 조건에서 발생합니다. 샘플링은 전기 및 냉동고에 대한 제한된 액세스를 포함하여 최소한의 리소스로 원격 위치에서 종종 발생합니다. 완전히 멸균 샘플링 조건을 보장하는 것은 어렵고 종종 불가능합니다. 따라서, 설명된 프로토콜은 다양한 샘플링 지체 및 현장 조건에서 가장 성공적인 프로토콜로 확인된다. Bat1K 이니셔티브및 관련 노력과 프로젝트에 대한 표준화된 샘플링 방법을 갖기 위해 박쥐 생물학자들은 이러한 프로토콜을 따르는 동시에 허용되는 범위까지 현장 탐험을 계획하는 것이 좋습니다.
프로토콜 제안
흉부 압축은 과거에 안락사에 대한 일반적인 접근 방식이었지만, 흉부 압축을 사용하여 박쥐를 수집하지 않는 것이 좋습니다 -omics 분석. 그것은 더 이상 미국46에서안락사의 허용 형태가 아니다, 이 방법은 관심의 종에 관계없이 조직의 범위의 효소 저하로 이어질 수있습니다 47. 동물이 안락사 될 경우, 게놈 및 전사분석 모두에 대한 조직이 수집될 것을 제안합니다. 둘 다 이상적으로 LN2에 있는 플래쉬 냉동 될 신선한 조직을 수확 필요, 하지만 그 또한 DNA를 촉진 하기 위해 다른 매체에 저장 될 수 있습니다., RNA, 또는 단백질 추출. 그것은 조직에 있는 RNA의 분해를 감소시키기 위하여 두개골 과 후 두개골 해부에서 2명의 사람들과 병렬로 일하는 것이 건의됩니다. 한 사람은 두개골을 해부해야하고 다른 사람은 두개골 에서 작동합니다.
해부 프로토콜을 수행하는 주요 제한 사항은 조직 보존에 사용할 수 있는 해부 및 공간에 관여하는 인력(예를 들어, LN2 탱크에서)을 포함한다. 미리 바이알을 준비하고 튜브 라벨링과 수집된 바이알 및 조직을 문서화하는 데 도움을 줄 수 있는 충분한 수의 사람들이 원활한 시료 처리에 기여할 것입니다. 필요한 (내보내기, 가져오기) 프로세스를 얻으려면 샘플의 적절한 문서화가 필수적이라는 점에 유의해야합니다. 예를 들어, 두개내 해부 프로토콜은 동물당 20개 이상의 바이알을 요구합니다.
공간과 시간이 제한된 경우, 다음의 우선 순위를 지정해야합니다 : 1) 종에 대한 하나의 표본에 대한 우선 순위, 또는 최소한, 속 당 하나의 표본; X 및 Y 염색체의 시퀀싱을 허용하고 생식 여성을 샘플링 할 확률의 최소화를 허용하는 남성 표본에 대한 우선 순위; 2) HMW DNA의 경우 : 뇌, 근육 및 간은 시약없이 플래시 냉동되어야합니다. 3) RNA의 경우: 뇌, 소화 조직, 비장 및 감각 기관은 높은 우선 순위입니다. 각 조직 샘플은 RNA 안정화 용액에 저장되어야 합니다. 근육 조직은 또한 전문화한 조직의 발현 분석을 위한 통제로 취해야 합니다; 4) 최소한 조직은 차갑게 유지되어야합니다. 5) LN2의 가용성도 우려될 수 있습니다. LN2 탱크는 최소 2주마다 리필해야 하지만 따뜻한 기후나 탱크가 자주 열리는 경우 더 자주 충전해야 합니다. LN2는 샘플을 운반하기 위해 농업 및 의료 분야에서 자주 사용되기 때문에 모든 국가에서 시판되는 경우가 많습니다. 일반적으로 이러한 서비스는 이산화탄소 나 산소와 같은 다른 가스를 판매하는 회사에서 제공됩니다. 아이스크림 가게는 때때로 드라이 아이스 또는 LN2 (또는 적어도 구매 권장 사항을 제공)에 대한 또 다른 옵션을 제공하며, 이에 대한 지원을 지역 직원에게 요청하는 것이 좋습니다. 6) 도 6은 조건이 제한된 일부 수집 탐험에 대한 성공적인 조직 추출을 설명합니다.
더 많은 사람들과 더 많은 공간으로, 더 많은 조직은 다른 방법으로 수집 될 수있다. 다음은 조사관이 적절한 경험과 자료를 사용할 수 있는지 고려해야 할 다른 곳에서 발표 된 추가 프로토콜입니다 : 1) 박쥐 metabolome, 또는 세포와 조직의 모든 배설 된 저분자 대사 산물, 제공 할 수 있습니다 뛰어난 박쥐 장수 또는 최대 절전 모드 및 대사 비행 요구에 대한 통찰력. 혈액은 발목 정맥과 같이 쉽게 접근 할 수있는 혈관에서 헤파린(48)과함께 유리병으로 수집되어야하며, 대변 샘플은 LN249에서동결되어야한다; 2) 면역학, 또는 병원균에 대한 동물의 반응, 대퇴골과 상혈을 복용하고 하류50에배양 대식세포에 조직 배양 용액에 배치하여 분석 될 수있다; 3) 대변은다이어트(51)를 결정하고 장내 미생물군유전체를 프로빙하는 것과 같은 하류 핵산 기반 분석의 두 가지 유형에 유용할 수 있다(52,53,54) 두 경우 모두, 조직 안정화 용액과 같은 시약은 대변에 존재하는 희귀 변이체의 분해를 감소시다; 4) 조직 형의 지질학 또는 인지질 레퍼토리는, 백색 코 증후군 곰팡이 병원체 를 이해하는 것으로 밝혀지고 있다55,56. 조직의 준비는 해부 직후에 동결될 것을 제안합니다.
Bat1K용 티슈 아카이브
Bat1K는 게놈을 생성하는 데 사용되는 각 개별 박쥐의 조직 뱅크를 유지하는 것을 목표로합니다. 현재, 이러한 조직 은행과 개인당 수집 된 관련 자노티 및 생태 데이터는 Bat1K 기여 회원의 실험실 / 박물관 컬렉션에서 유지됩니다. 프로젝트가 진행됨에 따라 Bat1K는 글로벌 게놈 생물 다양성 네트워크 및 http://www.ggbn.org/ggbn_portal/>와 같은 네트워크 저장소를 통해 조직 수집 및 관련 데이터베이스를 중앙 집중화하고 유지 관리할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
센트로 데 에코로지아 y 바이오다이버시다드 CEBIO, 에리카 팔리자, 밀루스카 산체스, 호르헤 카레라, 에드가 렌기포 바스케스, 해롤드 포로카레로 자리아, 호르헤 루이스 레보, 하이메 페체코 카스티요, 카를로스 텔로, 패니 코넬레호, 패니 페르네즈 에게 감사드립니다. 페루에서 수집 할 수 있습니다. 또한 도미니카 공화국에서 조직 수집을 가능하게 해준 그루포 자라과와 욜란다 레온의 모든 회원과 베르날 로드리게스 에르난데스, 베르날 마타리타, 코스타리카의 라 셀바 생물 연구 센터의 모든 분들께 감사드립니다. 샘플링이 가능합니다. 우리는 세포 배양 생성을위한 필로스토무스 변색 박쥐에서 날개 펀치의 액세스 및 샘플 수집에 대한 엘라 Lattenkamp & Lutz Wiegrebe 감사합니다. 필로스토무스 변색 박쥐는 뮌헨의 루드비히 막시밀리안 대학의 학과 생물학 II의 번식 식민지에서 유래. 박쥐를 유지하고 번식하는 승인은 뮌헨 지역 수의학 사무소에 의해 발행되었다. LMD, SJR, KTJD 및 LRY는 NSF-DEB 1442142의 자금을 지원받았습니다. LMD는 NSF-DEB 1838273에 의해 투자되었다. LRY는 NSF-PRFB 1812035에 의해 투자되었다. SCV와 PD는 막스 플랑크 연구 그룹 상과 인간 국경 과학 프로그램 (HFSP) 연구 보조금 (RGP0058 /2016)에 의해 투자되었다. SJR, JHTP, KTJD는 유럽 연구위원회 (ERC 시작 교부금 310482 [EVOGENO])에 의해 투자되었다, ECT는 유럽 연구위원회 보조금에 의해 투자되었다 (ERC-2012-StG311000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3 mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| Collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
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