Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tissue innsamling av ball for-omics analyser og primær Cell kultur

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59505
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 4, 5, *3,6, *2,7
1Department of Geology & Geophysics, Yale University, 2Department of Ecology & Evolution, Stony Brook University, 3Neurogenetics of Vocal Communication, Max Planck Institute for Psycholinguistics, 4School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London, 5School of Biology & Environmental Science, University College Dublin, 6Donders Institute for Brain, Cognition and Behavior, 7Consortium for Inter-Disciplinary Environmental Research, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Summary

Dette er en protokoll for optimal vev forberedelse for genomisk, transcriptomic, og Proteomikk analyser av ball fanget i naturen. Det inkluderer protokoller for bat fangst og disseksjon, vev bevaring, og celle dyrking av bat vev.

Abstract

Som høy gjennomstrømming sekvensering teknologier forhånd, standardiserte metoder for høy kvalitet vev oppkjøp og bevaring tillate forlengelse av disse metodene til ikke-modell organismer. En rekke protokoller for å optimalisere vev samling fra ball er utviklet for en rekke høy gjennomstrømming sekvensering tilnærminger. Skissert her er protokoller for fangst av ball, ønsket demografi skal samles for hver bat, og optimaliserte metoder for å minimere stress på en bat under vev samling. Spesielt skissert er metoder for innsamling og behandling av vev for å oppnå (i) DNA for høy molekylvekt genomisk analyser, (II) RNA for vevs spesifikke transcriptomes, og (III) proteiner for Proteomikk-analyser. Til slutt, også skissert er en metode for å unngå dødelige prøvetaking ved å skape levedyktig primær cellekulturer fra vingen klipp. En sentral motivasjon av disse metodene er å maksimere mengden av potensielle molekylære og morfologiske data for hver bat og foreslå optimale måter å bevare vev slik at de beholder sin verdi som nye metoder utvikles i fremtiden. Dette standardisering har blitt spesielt viktig som initiativer for å sekvens kromosom nivå, feilfri genomer av arter over hele verden har dukket opp, der flere vitenskapelige partier er spissen sekvensering av ulike taksonomisk Grupper. Protokollene skissert her definerer den ideelle vev innsamling og vev bevaring metoder for Bat1K, konsortiet som er sekvensering av genomer av alle arter av bat.

Introduction

Metoder for høy gjennomstrømming sekvensering (HTS) har raskt Avansert i effektivitet og redusert i kostnader, og det er nå mulig å skalere disse tilnærmingene til hundrevis eller tusenvis av prøvene. Innsikt innhentet av anvendelsen av disse teknologiene har enorme virkninger på tvers av flere vitenskapelige disipliner, fra biomedisin til evolusjon og økologi1,2,3. Likevel, mange HTS-programmer stole kritisk på høy kvalitet nukleinsyre syrer fra en levende kilde. Denne begrensningen vil trolig bli stadig mer problematisk med utviklingen av tredje generasjons sekvensering basert på lang-Les molekyler4. Av disse grunner er det behov for å fokusere arbeidet med å etablere beste praksis for å samle ferske vevsprøver fra ville organismer utenfor laboratoriet, noe som maksimerer nytten av materiale og reduserer antall individer som må Samlet.

Bat1K er et internasjonalt konsortium av forskere med et pågående initiativ for å sekvens de Genova av alle arter av bat til kromosom nivå montering5. Ball representerer 20% av pattedyr mangfold og har eksepsjonelle tilpasninger som har implikasjoner for å forstå aldring, sykdoms økologi, sensorisk biologi og metabolisme5,6. Mange ball er også truet eller truet på grunn av menneskelig utnyttelse7 eller er raskt fallende på grunn av patogener8,9, og Genova-nivå sekvensering er av stor betydning for bevaring av disse artene. Selv om Bat1K tiden har som mål å sekvens genomer av alle bat arter, er standardisering av samling av vevsprøver for høy kvalitet genomisk sekvensering en viktig utfordring over fellesskapet av organismal biologer. I tillegg til å genomisk data, krever funksjonell forståelse av mangfoldet av bat-tilpasninger vevs spesifikke transcriptome-og protein analyser, som ofte krever separate innsamlings protokoller. Videre, som med alle taksonomisk grupper, mens optimal vev innsamling og bevaring er avgjørende for å oppnå den høyeste kvalitetsdata for-omics analyser, kommuniserer beste praksis er ofte vanskelig på grunn av raskt skiftende teknologier og flere forskergrupper som arbeider selvstendig.

Behovet for å vedta beste praksis for bat-omics forskning er spesielt presserende, gitt at mange bat arter er sjeldne eller truet. I motsetning til andre små pattedyr som gnagere og shrews, er ball lang levetid, tilskrives eksepsjonell DNA reparasjon mekanismer10 og langsom reproduksjon11, med de fleste arter som føder bare én eller (i noen tilfeller) to unge per år. Av disse grunner, kan bat populasjoner være trege til å gjenopprette fra forstyrrelser, og samle mange individer fra naturen er verken tilrådelig eller gjennomførbart. Med andre ord, protokoller må optimaliseres for å få den maksimale mengden data for en enkelt prøve, og dermed redusere behovet for unødvendig replikere prøvetaking innsats.

Her fokuserer denne protokollen spesifikt på standardiserte metoder for innsamling og prøvetaking av bat vev for genomisk og transcriptomic sekvensering og protein analyser. Den øverste prioritet er å sikre at bat vev er samlet etisk og ansvarlig, alt fra tillatelsesprosessen for innsamling, eksport av vev til minimering av stress til dyret, og langsiktige lagringsforhold. Forseggjort dissections har blitt utviklet med sikte på å fremtids-Proofing nytten av ulike materialer samlet. Dette manuskriptet gir en steg-for-steg guide til å samle ball på en human måte som er ment å minimere innvirkning på populasjoner og maksimere vitenskapelig verdi. Mens fokus for denne protokollen er spesielt for bruk i ball, mange av trinnene er relevante for andre virveldyr dyr, spesielt pattedyr.

Oversikt over vevs innkreving
Prosedyren for vev samling, inkludert temperaturen for lagring og valg av bevare agent, vil bli bestemt av arten av eventuelle nedstrøms analyser planlagt. Men, det anbefales sterkt at, når det er mulig, er vev samlet under en rekke metoder for å maksimere sin fremtidige nytte selv om ingen spesifikk analyse er planlagt. Generelt er vev samlet og bevart for senere analyser av enten nukleinsyre syrer (DNA og RNA), eller protein. For hver av disse programmene, kan vevet bli optimalt bevart ved direkte blits frysing i flytende nitrogen (LN2). Men umiddelbar nedsenking i LN2 er ikke alltid mulig i feltet. Etter hvert som teknologien utvikler seg, blir ressurser som spesialiserte hetteglass for å lagre DNA og RNA ved omgivelsestemperaturer lettere tilgjengelige. Selv om vi ikke har validert alle slike materialer i denne protokollen, oppfordrer vi andre forskere til å forholdsvis analysere resultatene av nye materialer i forhold til det vi presenterer her. Vi gir metoder for å ideelt bevare vev for ulike applikasjoner i situasjoner der LN2 ikke kan nås, for eksempel når LN2 transport er ikke mulig på grunn av tilgang til nettstedet via lite fly i Amazonas. I tillegg gir vi en metode for å samle vev som levende celler kan dyrkes og spres. Nedenfor skisserer vi viktige hensyn for innsamling av materiale for hver av disse respektive formål og en oversikt over innsamlings metoder er gitt i tabell 1.

Vev for DNA
For alle høstet vev samlet, vil lagringsmediet avgjøre om det kan brukes til enten standard eller høy molekylvekt (HMW) DNA-ekstraksjon. HMW er nødvendig for lang lese sekvenser og for tiden kreves for å generere kromosom nivå Genova samlinger, eller en "platina standard" Genova. Lav molekylvekt (LMW) DNA kan utvinnes fra Flash frosset, AllProtect (heretter referert til som "vev stabilisere løsning"), eller til og med RNAlater (heretter "RNA stabilisere løsning")-bevarte prøver (selv om Flash frosne prøvene forbli optimal ). DNA isolert av standard laboratorie metoder (f. eks silica gel membran spin kolonner, fenol-kloroform), kan fortsatt gi DNA-fragmenter på opptil ~ 20 kilobases (KB). Derfor forutsatt at det er tilstrekkelig utbytte, kan denne formen for isolert DNA brukes til enkelt sette størrelse bibliotek forberedelse, der innsatsen størrelsen er ofte ~ 500 base-par (BP), og kort sekvens leser av ~ 100 BP er generert12. Dette DNA er spesielt nyttig for "resequencing" prosjekter eller studier der full lengde kromosom data er ikke nødvendig. HMW DNA (10-150 kB) er mer utfordrende og kan bare bli pålitelig innhentet ved hjelp av vev som har blitt raskt blinke frosset i LN2 etter innhøsting og opprettholdt på maksimalt-80 ° c til ekstraksjon.

Lav molekylvekt eller fragmentert DNA er ofte tilstrekkelig for målrettede tilnærminger, inkludert gen forsterkning via PCR og kortleser sekvenser13. PCR-baserte undersøkelser ved hjelp av LMW DNA som mål bare én eller noen få gener har vært svært informativ i forståelsen tilpasning og molekylær evolusjon av bat sensorisk biologi6,14, fysiologi15, phylogenetics 5,16og bevaring17,18. Vellykket målrettet sekvens gjenerobre av lav molekylvekt og fragmentert DNA har også blitt demonstrert for mange virveldyr grupper, inkludert ball19. Disse metodene er ofte kostnadseffektive og minimalt invasiv til bat, som avføringsprøver og ikke-dødelige vev prøvetaking via bukkal pensle eller vinge biopsi slag er også vanlige måter å få DNA for lav molekylvekt analyser20, 21i denne.

Imidlertid avhenger kvaliteten sterkt på hvilken type medier der prøven er lagret22. Etter systematisk og kvantitativ sammenligninger av bukkal servietter og biopsi slag, har vinge biopsi slag vist å gi gjennomgående høyere nivåer av DNA og var mindre stressende til balltre under samlingen22. Disse sammenligningene viste også at de beste resultatene ble oppnådd når vingen punch ble bevart i indikator silika (dvs. en type tørkemiddel laget av silika gel perler som skifter farge når fuktighet er observert) i stedet for i andre populære lagringsmedier som etanol eller DMSO22; Selv om andre lagringsmedier, inkludert vevs stabiliserings løsning, ikke ble undersøkt. Vinge slag kan også brukes til å dyrke Fibroblast celler i kulturen, slik som i Kacprzyk et al.23 og som beskrevet nedenfor (se pkt. 6). For disse metodene bør vingen eller uropatagium utvides forsiktig, og en ren biopsi punch, vanligvis 3 mm i diameter, bør brukes til å få prøven. Denne tilnærmingen ser ut til å forårsake ingen varig skade, med arr healing over i løpet av uker i de fleste tilfeller24.

HMW DNA (10-150 kB) er mer utfordrende og er foreløpig bare pålitelig innhentet ved hjelp av vev som har vært raskt blinke frosset i LN2 etter innhøsting og opprettholdt på maksimalt-80 ° c til ekstraksjon. HMW DNA (10-150 kB) er avgjørende for lang-lese DNA sekvensering og derfor for de Novo Genova montering. Faktisk, mens de fleste kommersielle kits kan brukes til å isolere noen standard HMW DNA, den resulterende molekylet størrelser ofte ikke oppfyller kravene i tredje generasjons sekvensering teknologier [f. eks de lansert av selskaper som Pacific biovitenskap (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, og 10x Genomics, eller gjennom montering metoder som tilbys av Bionano Genomics eller Svalehale Genomics]. Som sådan, det er en ny etterspørsel etter "Ultra HMW" DNA (> 150 kB). Når oppnå ultra HMW DNA fra ball, friske prøver av leveren, hjernen, eller muskelen er alle egnet, men disse må umiddelbart blinke frosset i LN2 uten lagrings buffer eller kryoprotektant. En fullstendig beskrivelse av disse trinnene er utenfor omfanget av dette papiret, men er tilgjengelig andre steder25.

Vev for RNA
RNA er en enkelt-strandet molekyl som er mindre stabilt enn DNA. Selv om det er mange former for RNA,-omics analyser har en tendens til å fokusere på mRNA (Messenger RNA) og små RNAs (f. eks, microRNAs). Etter transkripsjon, er mRNA skjøtes å danne en moden transkripsjon som inneholder ingen introns og representerer koding del av gener/genomer. Coding gener utgjør en liten brøkdel av Genova størrelse (1%-2%), noe som gjør målretting mRNA en kostnadseffektiv måte å skaffe sekvens data for gener. MicroRNAs er en klasse av RNAs som regulerer prosessen med oversettelse av mRNA til proteiner og er således viktige regulatoriske effekt Orer. RNA-transkripsjoner kan være sekvensielt individuelt, eller mer vanlig for-omics analyser26,27,28,29,30, som en del av en transcriptome; det vil si summen av alle RNA-transkripsjoner som finnes i et gitt utvalg.

Sekvensering kan utføres følgende flere metoder (dvs. via Short-Les RNA-SEQ eller lang-lese hele isoformen SEQ), slik at analyse av både RNA overflod og isoformen bruk. Ettersom mengden og mangfoldet av mRNA transkripsjoner varierer mellom celler og vev, gjør RNA sekvensering det mulig å studere og sammenligne genuttrykk og regulering på tvers av prøvene. Interessen for sekvensering små RNAs og hele isoformen sekvensering vokser, da disse metodene blir stadig mer biologisk informative. Utarbeidelse av vevsprøver for å sekvens forskjellige klasser av RNA kan utføres på samme måte som presentert i dette manuskriptet, med bare de påfølgende utvinnings metodene ulik31,32. Til slutt, fordi transcriptomes tilbyr en høy dekning undergruppe av protein-koding Genova, det sammensatte datasettet kan være nyttig i Genova montering og merknader, noe som gjør innsamling av RNA-SEQ data på tvers av en rekke ulike vev en viktig del av Bat1K initiativ.

I motsetning til DNA, er RNA kjemisk ustabil og også målrettet av RNase-enzymer, som er overalt til stede i vev lysater som en defensiv strategi mot RNA-baserte virus. Av disse grunner begynner RNA-fraksjonen i celler og vev å brytes ned kort tid etter det punktet av prøvetaking og/eller døds aktiv. Å bevare RNA-en krever derfor trinn for å hindre nedbrytning. Dette innebærer vanligvis å bevare ferskt samlet vev ved 4 ° c i et stabiliserende middel som RNA stabiliserende løsning for å deaktivere RNases naturlig tilstede i vev, etterfulgt av frysing for lengre tids lagring. Som et foretrukket alternativ, kan vevet blinke frosset i LN2; men som nevnt ovenfor, transport LN2 inn i feltet og opprettholde nivåer for å hindre at vevet tine kan være logistisk utfordrende.

Vev for protein
Protein sammensetning og relativ overflod varierer mellom celler og vev på en lignende måte som det som ble diskutert for RNA; men proteiner er i gjennomsnitt mer stabile enn RNA. Protein identifisering bruker Proteomikk vanligvis samsvarer med en brøkdel av, og ikke hele, protein sekvensen, men det kan gi informasjon om uttrykk på tvers av vev og karakterisere patogener stede. Så mange protein sekvenser er bevart på tvers av pattedyr, kan bat prøver for Proteomikk lett bli forurenset med bevarte menneskelige proteiner, krever sterile protokoller (f. eks, hansker, tang) under innsamling. Mens Flash-frysing i LN2 er den beste måten å hindre degradering av proteiner, bruk av tørr is,-20 ° c frysere, og selv isen er egnet hvis det ikke er andre midler. Ettersom temperaturene øker, stiger også risikoen for differensial protein sammenbrudd. Stabiliserende midler som vev stabilisering løsning er effektive i å bevare protein brøkdel av vev ved romtemperatur og er egnet for kortsiktig bevaring (opptil en uke) når Flash-frysing er ikke levedyktig.

Enzymatisk profil av et gitt vev direkte påvirker bevaring av protein deri. Vev med lav enzymatisk aktivitet som muskel kan bevare protein profiler selv ved høyere temperaturer i en husholdning fryser. Til sammenligning er leveren vev enzymatisk reaktive, og dens proteiner har høyere sannsynlighet for nedverdigende under forberedelse. Det økende antallet protokoller for innhenting av menneskelige Proteomikk profiler fra formalin para fin-innebygde (FFPE) prøver tyder på at paraformaldehyde innfesting av vev holder løftet om rimelig protein bevaring når frysing ved oppsamling ikke er gjennomførbart33,34. Selv om det er svært avhengig av bevaring tid og tilstand, har proteiner blitt identifisert via immunhistokjemi fra formalin-faste, etanol-bevarte bat eksemplarer35. Denne tilnærmingen er ikke skalerbar til Proteomikk-nivå prøvetaking, men fremhever potensialet for formalin-fast bat vev å gi protein profiler når Flash-frysing er utilgjengelig og andre stabiliserende agenter er for kostbare.

Vev for cellekultur
Prøvetaking vev og Flash-frysing tilbyr en begrenset mengde materiale som skal brukes, og når materialet er brukt, er det ikke lenger tilgjengelig. Alternativt, cellen kulturen skaffe bo celler det kan med det samme anvendt eller bevart for fremtid studier. Kulturer også lette utvidelse av celler for å øke utbyttet når vevsprøver er små. Det er spesielt nyttig i tilfeller der vev samling er begrenset, for eksempel eksperimenter med sjeldne arter der ikke-dødelige prøvetaking er viktig og derfor har bred implikasjoner for bevaring. Beskrevet er en protokoll der cellekultur er mulig via ikke-dødelige prøvetaking av vinge membran vev, men dyrking er mulig med flere vevstyper36,37. Protokollen som er angitt her, velger for tilhenger celler. Kombinasjonen av kilde vev og vekst medier som brukes gjør denne protokollen egnet til å velge og vokse fibroblaster, men hvis ønskelig, kan alternative protokoller brukes til å velge for andre celletyper. I sammenheng med Bat1K prosjektet, er det spådd at for sjeldne og truede arter, ikke-dødelige prøvetaking av vinge membraner og utvidelse av prøvene via dyrking er avgjørende for å generere volumet av DNA som trengs for flere teknologier ansatt5 .

Bat-opptak
Alle mennesker håndtering av ball bør trenes av en bat-kompetent forsker og vaksinert mot rabies med en rekke pre-eksponering injeksjoner. Hvis bitt, en ytterligere serie av post-eksponering injeksjoner er fortsatt nødvendig. Standard metoder for å fange opp ball inkluderer tåke garn (figur 1) og harpe feller (figur 2). Mist garn er mest brukt og ideelt for områder med lav til moderat aktivitet, som de krever mest forsiktighet for å minimere bat nød. Små ball er spesielt sårbare og kan dø av stress hvis ikke en tendens til å raskt. Hyppige netto inspeksjoner minimerer bat skader og dødelighet, samt skade på tåke nettet. Denne detaljen er viktig fordi riktig vev samlingen krever vevet å være frisk, og uriktig oppmerksomhet til tåke garn i ball kan føre til unødvendig dødelighet eller tidlig dødelighet før forskeren kan riktig prosess prøver. Fordi flere ball kan hvile i en harpe felle med minimal nød, er denne tilnærmingen ideell for områder med høy bat aktivitet, for eksempel i nærheten av en hule eller store hønsehus. Detaljerte instruksjoner for riktig bat fangst og databehandling for innsamling av morfologiske og demografisk informasjon er tilgjengelig i supplerende metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Stony Brook University (protokoll #2013-2034).

1. døds aktiv

  1. Fukt en bomullsdott med en isoflurane bedøvelse eller en annen tilgjengelig bedøvelse.
  2. Plasser bomulls kulen i en resealable, lufttett plastpose. Posen skal være stor nok til å holde en pose i en klut bat bag komfortabelt.
  3. Etter flere minutter med å la posen til å trenge gjennom bedøvelse, plasserer en bat pose som inneholder bat i plastposen.
  4. Vent noen minutter til balltreet er euthanized. Ball ~ 20 g eller mindre i vekt krever ca 5-10 min. bat større enn dette kan kreve opptil 20 min. Merk at lengden på tiden kan også avhenge av permeabilitet i balltre posen. Det anbefales å bruke den tynneste mulig klut materiale for å maksimere spredningen av bedøvelse.
  5. Sjekk for pust og hjerterytme å sikre det bat er blitt euthanized tidligere disseksjon begynner.

2. disseksjon forberedelse

  1. Hold alle instrumentering rene mellom dissections, ved hjelp av følgende protokoll.
  2. Vask instrumenter med vann og oppvasksåpe. Tørk dem ned med 10% blekemiddel, vekk fra disseksjon området, som blekemiddel vil bryte ned nukleinsyre syrer.
  3. Tørk ned med 70% etanol.
  4. Tørk ned med RNAse rense reagens.
  5. Gjenta dette avsnittet etter hver disseksjon.

3. klargjøre hetteglassene for vevsprøver

  1. For RNA:
    1. Forbered alle hetteglass før du starter en dissections for å unngå forsinkelser.
    2. Sett til sideantall hetteglass som trengs for hver prøve. Merk hvert rør med vevs typen som skal samles inn, i tillegg til standard identifikasjonsinformasjon for prøver. Fyll hetteglassene 50% fulle av RNA stabiliserings løsning, og ideelt sett chill to 4 ° c.
    3. Pass på å ikke fylle hetteglassene helt med RNA stabiliserings løsning, ellers kan slangen eksplodere når den plasseres i LN2. Når du tar vevsprøver, husk at store klumper av vev vil ikke være fullt gjennomsyret av RNA stabilisere løsningen. Derfor, skjær vevet i mindre biter av ikke større enn 0,5 cm i en dimensjon, og opprettholde et forhold på minst 10:1 volum for RNA stabilisere løsningen: vev.
    4. I det minste må dissekert vev plasseres i RNA stabiliserings løsning, selv om tilgang til LN2 eller kalde lagre er utilgjengelige.
  2. For DNA:
    Merk:     det KJERNEFYSISKE DNA-innholdet er det samme for nesten alle vev; Derfor kan prøvetaking være fleksible. Men, det bør bemerkes at høyere tettheten av mitokondrier i muskel vev kan føre til tap av leser for kjernefysiske Genova38.
    1. For lav molekylvekt DNA, ta en eller flere replikerer av vinge membran for lagring i silika, og/eller muskel for lagring i RNA stabilisering løsning eller vev stabilisering løsning.
    2. For ultra HMW DNA, Flash-fryse i LN2 uten lagrings reagens, deretter overføre til langtidslagring ved-80 ° c eller kaldere. Fra skallen disseksjon, er hjernevevet den mest egnede vevs typen for å hente ultra HMW DNA39, mens fra postcranial dissections, lever eller muskel er mer egnet40.
    3. For skallen disseksjon, bruk 5 mL hetteglass (i motsetning til standard 2 mL hetteglass) av RNA stabiliserende løsning for noe vev. Alle hetteglass bør være kryogene. Hold hetteglassene på isen mens du dissekere.

4. skallen dissections for RNA

  1. Umiddelbart etter dødshjelp, halshugge prøven med et stort par saks eller bein cutters (Figur 3).
  2. Fjern øynene med tang bruker sterk nok kraft til å løsne optisk nerve. Plasser øynene i 2 mL hetteglass med RNA stabiliserings løsning.
  3. Bruke verktøyet til valg, huden skallen fra hår, konsept og hodeskallen muskler, inkludert huden på nesen. Pass på å ikke bryte fremre ende av nesen.
  4. Bruke saks, lage en sagittal kutt på ventrale delen (Figur 3) av skallen starter i nakken, ta vare ikke å skade hjernen.
  5. Ved hjelp av tang, trekk forsiktig tilbake begge sider av skallen til den har sprukket åpen og hjernen er eksponert.
  6. På den caudal enden av hodeskallen skal cochleae nå være sideveis synlig på hver side av hodet. De er små, sfæriske bein på venstre og høyre side, bare rostral til halsen og bakre til masseter musklene. Bruk tang, trekk forsiktig i cochleae og legg dem i ett 2 mL hetteglass med RNA stabiliserings løsning.
  7. Forsiktig skrape hjernen (som vil være svært myk) med tang. Den olfactory pære vil bli synlig, sitter på den ventrale delen av det indre av skallen. Prøv å holde olfactory pære festet.
  8. Hvis olfactory pære ikke allerede er fjernet, forsiktig skrape bort vevet, og cribriform platen vil bli klart. Dette er en kritisk bein å holde forskeren orientert. Det kan identifiseres som den mest fremre regionen av skallen med flere foramen og punktet der to grooves der olfactory pære hviler.
  9. Hvis mulig, hold hjernens form intakt og plasser umiddelbart på tørr is for å holde formen eller i et 5 mL hetteglass med RNA stabiliserings løsning. Hvis immunhistokjemi skal gjøres på hjernen, plass i 4% paraformaldehyde, hvis tilgjengelig.
  10. Lag to snitt der toppen og bunnen kjeven delta, og fjerne kjeven.
  11. Når kjeven er fjernet, Fjern talerstolen (øvre kjeve) fra den gjenværende delen av hodeskallen. Sørg for at kjeven inneholder cribriform plate.
  12. Plasser nesen i RNA stabiliserende løsning og oppbevar ved 4 ° c over natten. Fordi dette er et tett vev, krever det tid for å tillate RNA stabiliserende løsning for å trenge gjennom hele vevet.
  13. Plasser nese flasken i LN2 etter den over natten som er bløt i RNA stabiliserings løsningen.
  14. Fra den nedre kjeven, skjær tungen med saks og Legg i et 2 mL hetteglass med RNA for senere.
  15. Denne protokollen mister det meste av skallen. Tenner, særlig dem fra det kjeven, kan kommet til hektene og kanskje være nyttig for Art Diagnostics. Benvev kan oppbevares i 1x fosfat-bufret saltvann (PBS).

5. Postcranial dissections for RNA

  1. Bruk en skalpell å Pierce gjennom bukhulen, noe som gjør en langsgående snitt opp til ribbeina (Figur 3). Dette mister skjelett RAM men. Hvis Ben er å bli bevart, forsiktig analysere fra hud inne muskelen og lager inne 1x PBS etter bløt tissue disseksjon er fullstendig.
  2. Strip huden for å avdekke pectoral muskelen, ta minst to prøver av muskel, en for RNA stabiliserende løsning og en til å forbli frosset for HMW DNA, plassere umiddelbart i et hetteglass for å sette inn LN2.
  3. Skjær gjennom brystbenet og dra bort ribbeina for å samle prøver fra lungene.
  4. Samle hjertet, som kan tas helt, men bør være delt i halvdeler, slik at RNA stabilisere løsningen soaks grundig.
  5. Ta prøver fra leveren. Ta minst to prøver av leveren, en å forbli frosset for HMW DNA, plassere umiddelbart i et tomt hetteglass for å sette inn LN2. Leveren er svært enzymatisk, og det er viktig å gjøre prøvene små nok til at RNA stabiliserings løsningen kan suge helt inn.
  6. Hepatic duct, hvilke funksjoner for å drenere galle fra leveren, forbinder leveren til bukspyttkjertelen og tynntarmen. Dette fartøyet er lett identifiserbare ved å identifisere den underlegne/bakre delen av leveren og spore fartøyet i en bakre måte. Kanalen er ofte en grønn farge, så vel. Følg hepatic duct å finne bukspyttkjertel og galleblæren og samle disse separat. Plasser i respektive hetteglass med RNA stabiliserings løsning.
  7. Samle magen, og ved siden av det, på sin base og vises som en annen nyanse av lilla, er fjær-lignende milt. Bukspyttkjertelen bør også være synlig her som en hvit struktur (Figur 3). Plasser i respektive hetteglass med RNA stabiliserings løsning.
  8. Samle små prøver av små og store tarmen. Plasser i respektive hetteglass med RNA stabiliserings løsning. Tarmen kan også bli vist for endoparasite. Hvis en parasittolog er i feltet, kan en inspeksjon for parasitter utføres. Hvis dette skal gjøres på et senere tidspunkt, kan hele tarmen tas i et 5 mL kryogene hetteglass.
  9. Ta en av nyrene og følge deres kanaler til blæren. Plasser i respektive hetteglass med RNA stabiliserings løsning.
  10. Bruk den andre nyre som en guide for å finne testiklene (hvis hann) eller livmor og gjennom det eggstokkene (hvis hunn). Samle en eller begge gonader, hvis mulig.
  11. Hold prøver av ulike deler av huden på vingen i separate hetteglass (muskel vs ikke-muskuløs del).

6. tissue kultur innsamling og forberedelse

  1. Forbered vekstmedium for cellene ved å gjøre opp Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) inneholdende 20% fosterets storfe serum (FBS), 1% penicillin/Streptomycin (P/S), og 50 μg/mL Gentamycin. Alikvoter av vekst medier bør gjøres friskt hver dag av protokollen.
  2. Etter oppsamling må vinge vevs slag plasseres direkte i 1 mL med kaldt vekstmedium i et godt forseglet 1,5 mL sentrifugerør. Vikle røret i parafilm å forsegle.
  3. Rør skal deretter transporteres i en polystyren boks med kjøleelementer for å holde prøvene ved 4 ° c. Transport bør være rask; Men, sunne celler kan være laget av slag som har vært lagret på denne måten i opptil 6 dager, men mindre optimalt23.
  4. Når transportert til vev kultur anlegget, kan følgende protokoll brukes til å generere cellekulturer. Standard sterile teknikker bør brukes for resten av protokollen41.

7. dag 1 vev kultur: dissosiasjon av vev

  1. Overfør innholdet i røret (vekstmedium som inneholder vinge membranen biopsi) i en 15 mL konisk sentrifugerør.
  2. Forsiktig fjerne vekstmedium. Vask biopsi forsiktig to ganger med 500 μL av steril PBS.
  3. Tilsett 500 μL av kollagenase IV (1 mg/mL) til slangen. Dette vil føre til fordøyelsen av vevet i individuelle celler.
  4. Ruge over natten (maks. 16 timer) ved 37 ° c uten agitasjon.

8. dag 2 tissue kultur: plating celler

  1. Make up frisk vekstmedium og pre-varme den til 37 ° c.
  2. Forbered en 6 brønn vev kultur plate ved å legge til 2 mL fersk, pre-varmet vekstmedium i hver brønn av platen som skal brukes (1 brønn per 3 mm vinge biopsi). Oppbevar denne platen i en 37 ° c og 5% CO2 inkubator til nødvendig (trinn 8,7).
  3. Fjern 15 mL rør som inneholder cellene fra inkubator og slukke fordøyelsen reaksjonen ved å legge 1 mL fersk vekstmedium (forvarmet til 37 ° c).
  4. Resuspend cellene ved å nøye triturating løsningen med en P1000 pipette spissen for å oppnå en enkelt celle suspensjon.
  5. Forsiktig spinne ned cellene i en bordplate sentrifuger for 3 min på 300 x g.
    Merk: Små biter av vev kan fortsatt være synlig enten i suspensjon eller festet til veggen av 15 mL røret. Men dette påvirker ikke celle suspensjon forberedelse
  6. Kast supernatanten ved forsiktig å fjerne 80% – 90% av væsken med en P1000 pipette.
    Merk: hvis den fortsatt er synlig, må du ikke forkaste vevet og triturate det forsiktig i neste trinn (8,7).
  7. Resuspend pellet i 500 μL av pre-varmet vekstmedium, forsiktig triturate suspensjonen for å sikre at pellet eller store fragmenter av pellet er ikke lenger synlig og at cellene er tilstrekkelig suspendert. Mediene kan se skyet på grunn av tilstedeværelsen av celler.
    Merk: På dette stadiet kan en levedyktig celle telling utføres for å vurdere kvaliteten på cellene suspensjon og utbytte av celler avledet fra vingen klippet (se trinn 10,11 for ytterligere detaljer).
  8. Forsiktig pipette hele volumet av celle suspensjon i en enkelt brønn av en 6 brønn plate.
    Merk: Utfør trinnene ovenfor umiddelbart og ikke la celler til å bosette seg etter trinn 8,7. Bruk en pipette til forsiktig å fordele celle fjæringen over overflaten av brønnen på en dråpevis måte. Ikke Pipet hele løsningen inn i midten av brønnen, da dette vil resultere i at cellene klumper midt i brønnen.
    Merk: Hvis stykke vev er fortsatt synlig, ikke overføre den inn i kulturen fartøyet godt.
  9. Rist platen forsiktig fra side til side, og front-til-back 2x – 3x for å hjelpe cellene til å fordele seg over brønn flaten i et enkelt lag.
  10. Sjekk de belagte cellene under mikroskopet, som de skal være enkeltceller som vises balled opp og flytende, men svært tett.
  11. Sett platen forsiktig inn i en inkubator forhåndsinnstilt til 37 ° c og 5% CO2.
  12. Etter ~ 24 h, observere cellene under mikroskopet for å bestemme helsen til kulturen. Celler skal nå festes til plateoverflaten og vises sammenslått (figur 4a). Forskjellige celletyper kan være synlige i kulturen når man ser gjennom mikroskopet.
  13. Det vil trolig være noen flytende celler som ikke har festet. En andel av disse cellene er døde. Hvis det er en høy andel av flytende celler som er synlige i brønnen, bør mediene oppdateres. I dette tilfellet nøye aspirer ~ 50% av mediet fra brønnen og forsiktig legge til 1 mL pre-varmet vekstmedium til siden av brønnen for ikke å forstyrre cellene.
  14. Oppretthold cellene i en inkubator forhåndsinnstilt til 37 ° c og 5% CO2. Celler bør observeres under mikroskopet regelmessig (men ikke mer enn en gang om dagen) for å bestemme behovet for Media forfriskning eller splitting.
    Merk: Når cellene er nylig belagt, vil de dele raskt og så bør sjekkes hver dag. Etter en tid i kulturen, vil veksten avta, og de kan kontrolleres hver 48-72 h.

9. forfriskende Media

  1. Kontroller cellene under mikroskopet regelmessig for å observere veksten og kvaliteten på kulturen. Overvåk fargen på mediene som en indikator på kvaliteten. Celler skal forbli i samme Media i maksimalt 3 dager eller til passaging er nødvendig, avhengig av hva som kommer først.
    1. Hvis cellene vokser raskt og utmattende mediene, vil dette også være synlig for øyet, som fargen på Media vil slå fra rødt til gult.
  2. Når det er nødvendig nøye aspirer ~ 50% av mediet fra brønnen og forsiktig legge til omtrent samme volum pre-varmet vekstmedium til siden av brønnen for ikke å forstyrre cellene.
  3. Returner cellene til 37 ° c og 5% CO2 inkubator.

10. Passaging celler

  1. Passaging celler refererer til å ta en eksisterende kultur og dele den inn i nye brønner. Passaging bør skje når cellene er ~ 80% confluent [dvs. når de opptar ~ 80% av overflaten av brønnen og bare ~ 20% av plasten er fortsatt synlig som hull (figur 4b)].
  2. Nøye aspirer og forkaste ~ 90% av veksten medium.
  3. Vask cellene svært forsiktig ved å legge 1 mL sterilt PBS til veggen av brønnen for ikke å forstyrre cellene. Rist platen forsiktig frem og tilbake og fra side til side 2x – 3x. Forsiktig aspirer og forkaste alle PBS fra platen.
  4. Gjenta trinn 10,3 for å vaske cellene på nytt.
  5. Legg forsiktig 250 μL av Trypsin-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) til brønnen og ruge for 1,5 minutter ved romtemperatur.
    Merk: Kontroller at Trypsin-EDTA løsningen dekker hele overflaten av brønnen ved forsiktig rocking platen.
  6. Slukke reaksjonen ved å legge til 1 mL fersk pre-varmet vekstmedium.
  7. Pipetter opp og ned ~ 5x å vaske cellene fra overflaten av platen og sikre at cellene er i suspensjon.
    Merk: Løsningen skal bli skyet på grunn av tilstedeværelsen av cellene.
  8. Plasser celle fjæringen i et 15 mL rør og snurr ned cellene i et bord-topp sentrifuger for 3 min ved 300 x g.
  9. Kast supernatanten ved forsiktig å fjerne 80% – 90% av væsken med en P1000 pipette.
  10. Resuspend pellet i 1 mL pre-varmet vekstmedium og forsiktig triturate suspensjonen. Sørg for at pellet eller store fragmenter av pellet ikke lenger er synlige, og cellene er i en enkelt celle suspensjon.
  11. Tell cellene ved hjelp av en automatisert celle teller som beskrevet her, eller manuelt ved å bruke en hemocytometer som beskrevet i detalj i referanse video42. Bland en 10 μL alikvot av de suspenderte cellene 1:1 med Trypan blå for å oppdage levedyktige celler.
  12. Ruge i 1 min, og Pipetter 10 μL av oppløsningen på telle lysbildet. Sett inn telle lysbildet i en automatisert celle teller for å telle cellene med de riktige innstillingene. Avkastningen bør være rundt 1-2 millioner celler fra en confluent enkelt brønn av en 6 brønn plate, selv om dette kan variere avhengig av størrelsen på celler og arter. Hvis celler ikke er i en enkelt celle suspensjon, vil celle tellingen ikke være nøyaktig.
  13. Disse cellekulturer vil generelt tolerere en 1:2 delt [dvs., en confluent brønn av celler kan deles inn i to nye brønner (totalt)]. For å gjøre dette, forsiktig triturate cellene igjen, deretter ta celle suspensjonen i to halvdeler (~ 730 μL hver) og plassere dem i hver av to nye brønner som inneholder 750 μL av pre-varmet vekstmedium i dråpevis måte.
    Merk: Etter 2 – 3 dager skal brønnene confluent og igjen være klar for splitting. På dette punktet er det anbefalt å bevare en brønn av celler av viably frysing protokollen (§ 11). Videre bestander av celler kan fryses under ytterligere passasjer som ønskelig.
    Merk: Etter ~ 6 passasjer, cellene har en tendens til å gå inn senescence og vil ikke lenger dele. Dette er en indikasjon på at cellene ikke lenger kan deles eller utvides for å øke celle tallene. Dette er også en indikasjon på at cellene ikke vil være levedyktig for mye lenger.

11. frysing levedyktig levende celler

  1. Klargjør fryse medier ved å kombinere DMEM med 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S og 50 μg/mL Gentamycin.
  2. Frysing utføres ved å ta celler pelleted i henhold til passaging prosessen. Pellet bør tilberedes fra en 80%-90% confluent brønn av en 6 brønn plate (som representerer ~ 1-2 millioner celler), som per trinn 8.1 – 8.9.
  3. Resuspend pellet i 1,5 mL frysing medium.
  4. Plasser ~ 750 μL av celle oppheng i hver av to separate cryovials.
  5. Plasser hetteglassene i en kryogene fryseboks, noe som resulterer i at cellene fryser langsomt for å opprettholde celle vitalitet. Plasser dem umiddelbart i-80 ° c.
  6. Etter 24 – 48 timer overfører du cryovials til LN2 for langtidslagring. Lagret på denne måten, kan cellene bli gjenopplivet og vil være levedyktig i årevis.

12. tine frosne celler

  1. Forbered en 6 brønn plate som inneholder 2 mL pre-varmet vekstmedium i hver brønn som skal brukes (1 brønn per hetteglass med celler blir tint). Oppretthold plate i 37 ° c og 5% CO2 inkubator til nødvendig.
  2. Ta en hetteglass med celler fra LN2 og legg den i et varmt vannbad (37 ° c) for å raskt tine celler. Dette bør ta 2 – 3 min.
    Merk: Ikke la hetteglassene tine lenger enn 3 – 5 min, da DMSO i fryse mediet er giftig for cellene en gang tint.
  3. Så snart oppløsningen i hetteglasset er tint, forsiktig pipette opp og ned for å homogenisere løsningen og umiddelbart plassere hele løsningen (~ 750 μL) i en brønn av en 6 brønn plate (pre-forberedt i trinn 12,1).
  4. Forsiktig rock platen fra side til side og foran til bak 2-3 ganger for å hjelpe cellene fordele over brønnen overflaten i et enkelt lag.
  5. Plasser cellene i inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 inkubator for 24 – 48 h.
  6. Overvåk og passasje cellene som beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dna
For standard lav molekylvekt (LMW) analyser, ble DNA Hentet fra tre Neotropical bat arter. Vevsprøver ble samlet inn i feltet fra den dominikanske republikk og Costa Rica, etter protokollene beskrevet i dette papiret. Etter disseksjon, ble små biter (< 0,5 cm i den tynneste delen) av blandet vev (hjerne, lever og tarm) plassert i RNA stabiliserings løsning, blits frosset, deretter lagret ved-80 ° c. Utdrag ble utført ved hjelp av standard DNA utvinnings protokoller med RNase behandling43. Vurdering av DNA-integritet med et automatisert elektroforese verktøy avdekket følgende representative prøve topper av fragment størrelser: Art 1 (to separate utdrag) besto av 22 KB og 20 KB; arter 2 besto av 25 KB; og arter 3 besto av 24 KB (figur 5, tabell 2).

DNA ekstrahert for tredje generasjons sekvensering er nødvendig for å bli samlet i høye konsentrasjoner og minimalt fragmentert. HMW DNA utvunnet fra Flash-frosne hjernevev fra en gammel verden frukt bat (Eidolon helvum) samlet i Ghana ble innhentet. HMW DNA ble ekstrahert ved hjelp av Bionano utvinnings protokoll for påfølgende analyse på Irys-plattformen. Dette DNA var 607 463 MB i lengde og hadde en gjennomsnittlig molekylær N50 på 194,5 MB.

Rna
En vanlig indikator på suksess for RNA-utdrag er verdien for RNA-integriteten (RIN). Det er ofte ikke anbefalt av sekvensering anlegg for å utføre en RNA-SEQ biblioteket forberedelse eller sekvensering protokollen når utdrag har en RIN verdi mindre enn åtte, som verdier under denne terskelen begynner å demonstrere høye signaturer av fornedrelse44 ,45. Figur 6 viser Rin-VERDIENE for RNA-utdrag for ulike vevstyper etter denne protokollen. Ekstraksjon av vev innhentet med protokollene har resultert i høy kvalitet RNA, uavhengig av felt prøvetaking lokalitet. Da LN2 ikke var umiddelbart tilgjengelig i Amazonas, ble vevet plassert i RNA stabiliserings løsning og holdt ved 4 ° c i 1 uke til den ble PLASSERT i LN2. Selv i slike tilfeller var RIN-verdier sammenlignbare med de som umiddelbart ble plassert i RNA stabiliserings løsning og direkte inn i LN2. RNA stabiliserings løsningen er et essensielt stabiliseringsmiddel.

Vev kultur
Umiddelbart etter plating, vil cellene bli balled opp og flytende. Men innen 24 h, bør fibroblaster flate og festes til overflaten av platen (figur 4a). På dette punktet, bør cellene være på omtrent 20%-30% samløpet for å sikre overlevelse. En verdi lavere enn dette kan føre til død av hele kulturen. I utgangspunktet må de ha god plass mellom hverandre for å tillate ekspansjon, som cellene vil dele og ekspandere i kultur. De bør splittes når de når 80%-90% samløpet [dvs. de dekker > 80% av plateoverflaten (figur 4b)]. På denne måten kan celler opprettholdes i kultur for en rekke passasjer (vanligvis > 6 passasjer) før gjennomgår senescence. Hvis cellene blir opprettholdt i kultur utover denne tiden eller ikke deles når de blir confluent, kan de endre morfologi og bli større og lengre (figur 4c). Celler med denne morfologi kan fortsatt dele, men dette indikerer vanligvis at cellene er eller vil snart gå inn senescence og vil ikke lenger være i stand til å bli opprettholdt eller utvidet i kultur.

Figure 1
Figur 1: en vanlig satt opp for tåke garn å fange ball i skogen. Holder ettall hånd belagt stund disentangling med det opposite hånd er en vei å trygg fjerne det bat stund minimere trykk. Dette bildet ble tatt av Jon Flanders. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: en harpe Trap er ofte brukt til å fange utenfor grotter, store roosts, eller fly-away. Ball vil akkumuleres i den nedre posen av fellen med minimal forviklinger og enkel fjerning av etterforsker. Dette bildet ble tatt av Stephen Rossiter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: arbeidsflyt av dissections og vevsprøver for å forberede RNA-vevet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: bat Cell kulturer avledet fra vinge slag av Phyllostomus misfarges. (A) 24-48 h etter plating, vil cellene bli flatet ut og festes til plateoverflaten. (B) celler dekker 80%-90% av plateoverflaten og opprettholde den opprinnelige morfologi. Dette representerer det optimale stadiet for splitting. (C) etter > 6 passasjer, vil cellene endre sin morfologi til å bli større og lengre, og cellene vil gå inn senescence. I alle bilder, lyse, balled celler representerer døde celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: REPRESENTATIVE resultater av DNA-utdrag fra bevaring av standard DNA-analyser fra tre bat-arter, ble DNA ekstrahert to ganger fra Art 1. Et enkelt stort band indikerer minimal fragmentering og lignende størrelse fragmenter av DNA fra hver respektive ekstraksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: RNA Integrity tall (Rin) av RNA-utdrag fra 13 forskjellige vevstyper fra Neotropical bat-arter samplet på fire ulike lokaliteter. Disse utdrag ble utarbeidet etter den beskrevne protokollen og deretter ble brukt til å forberede HiSeq/NextSeq Illumina transcriptome biblioteker. MOE er det viktigste olfactory epitel. VNO er vomeronasal organ. Vev samplet fra arter i Andesfjellene, Costa Rica og den dominikanske republikk ble plassert direkte i LN2 etter soaking i RNA stabilisere løsningen ved 4 ° c over natten. Vev samplet fra arter i Amazonas ble plassert i LN2 ca 1 uke etter plassering i RNA stabilisere løsningen og holdt på 4 ° c kontinuerlig. N representerer antall personer representert for hver vevs trekking. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Programmet Blits frosset (L2) RNAlater AllProtect FFPE Media
Høy MW DNA Y X Y X X
Lav MW DNA Y Y Y X X
Rna Y Y Y X X
Protein Y X Y Y X
Cell kultur X X X X Y

Tabell 1: oversikt over bevarings metoder og-applikasjoner. MW = molekylvekt, FFPE = formalin-fast parafin-innebygd vev. Merket av indikerer foretrukket bevarings metode for hvert respektive tiltenkte bruksformål. X-merker angir bevaringer som ikke skal brukes.

Arter ID Eksempel-ID Konsentrasjon (ng/μL) Eksempel på fragment topp størrelse (BP)
Arter 1 1,1 31,8 21 885
1,2 22,8 19 633
Arter 2 2 30,4 25 198
Arter 3 3 32 24 386

Tabell 2: representative resultater for DNA-utdrag basert på bevarings metoder i denne protokollen. Verdier tilsvarer gel elektroforese brønner fra figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som omtales i dette manuskriptet beskriver den beste sampling-praksisen for forskjellige molekylære analyser av høy gjennomstrømming av ball. Alle vellykkede-omics studier krever høy kvalitet vev, men prøvetaking bat vev, samt andre ikke-modell organismer, ofte oppstår i feltet forhold som ikke kan settes til samme standarder som de av en kontrollert laboratorium innstilling. Prøvetaking skjer ofte på avsidesliggende steder, med minimale ressurser, inkludert begrenset tilgang til elektrisitet og frysere. Det er vanskelig, og ofte umulig, å sikre helt sterile sampling forhold. Således, skissert er protokollene identifisert som den mest vellykkede i en rekke prøvetaking lokaliteter og feltforhold. For å ha standardisert Prøvetaking metoder for Bat1K initiativ og relaterte tiltak og prosjekter, er det antydet at bat biologer følge disse protokollene mens planlegging feltet ekspedisjoner i den utstrekning det er tillatt.

Protokoll-forslag
Mens brystkompresjon var en vanlig tilnærming for dødshjelp i det siste, er det foreslått å aldri bruke brystkompresjon for å samle inn ball for-omics analyser. Det er ikke lenger en akseptabel form for døds aktiv i USA46, og denne metoden kan føre til enzymatisk degradering av en rekke vev uansett arten av interesse47. Hvis et dyr vil bli euthanized, er det foreslått at vev for både genomisk og transcriptomic analyser skal samles inn. Begge krever høsting friskt vev som ville ideelt sett være flash frosset i LN2, men som også kan lagres i forskjellige medier for å lette DNA, RNA, eller protein utvinning. Det foreslås å arbeide parallelt med to personer på skallen og postcranial dissections for å redusere nedbrytning av RNA i vev. Ettall personen burde analysere det kraniet stund det annet arbeider på stolpe-kraniet.

Store begrensninger ved å utføre de disseksjon protokollene omfatter personell som er involvert i disseksjon og tilgjengelig plass for vevs bevaring (f.eks. i LN2-tanken). Utarbeidelse av hetteglass på forhånd og tilstrekkelig antall personer til å bistå med merking av rør og dokumentere hetteglass og vev innsamlet vil bidra til jevn prøve behandling. Det bør bemerkes at riktig dokumentasjon av prøvene er avgjørende for å få de nødvendige (eksport, import) prosesser. Postcranial disseksjon-protokoll krever for eksempel mer enn 20 hetteglass per dyr.

Hvis plass og tid er begrenset, bør følgende prioriteres: 1) prioritering for en prøve for arter, eller minimum, ett eksemplar per slekt; prioritering for en mannlig prøve å tillate sekvensering av både X og Y kromosom og minimering av sannsynligheten for prøvetaking en reproduktiv kvinne; 2) for HMW DNA: hjerne, muskel, og leveren skal blinke frosset uten reagens; 3) for RNA: hjernen, fordøyelsessystemet vev, milt, og Sanseorganer er av høy prioritet. Hvert Vevsprøve skal oppbevares i RNA stabiliserings løsning. Muskel vev bør også tas som en kontroll for uttrykks analyser av spesialisert vev; 4) på det minste, bør vev holdes kaldt; 5) tilgjengeligheten av LN2 kan også være av bekymring. LN2-tanks må etterfylles minst annenhver uke, men oftere i varmere klima eller hvis tanken ofte åpnes. LN2 er ofte kommersielt tilgjengelig i alle land, da det ofte brukes i landbruk og helsevesen til å transportere prøver. Vanligvis er disse tjenestene er levert av selskaper som også selger andre gasser, for eksempel karbondioksid eller oksygen. Iskrem butikker noen ganger tilbyr et annet alternativ for tørr is eller LN2 (eller i det minste gi en anbefaling for kjøp), og det er foreslått å be lokale personell for å få hjelp med dette; 6) figur 6 skisserer vellykket vev utdrag for noen samling ekspedisjoner der forholdene var begrenset.

Med flere mennesker og mer plass, kan mer vev samles på forskjellige måter. Følgende er flere protokoller publisert andre steder som etterforskere bør vurdere om riktig erfaring og materialer er tilgjengelige: 1) bat metabolome, eller alle utskilles lav molekylvekt metabolitter av celler og vev, kan gi innblikk i eksepsjonell bat levetid eller dvalemodus og metabolske fly krav. Blod skal samles fra en lett tilgjengelig blodkar, slik som ankelen årer, i et hetteglass med heparin48, og avføring bør FRYSES i LN249; 2) immunomics, eller responsen av dyret til patogener, kan analyseres ved å ta femurs og humeri og plassere dem i vev kultur løsning til kultur makrofager nedstrøms50; 3) avføring kan være nyttig for to typer nedstrøms nukleinsyre-syre basert analyser, for eksempel bestemme kosthold51 og undersøkelser tarmen mikrobiomet52,53,54. I begge tilfeller reduserer reagenser som stabiliserings løsning for vev nedbrytning av sjeldne varianter som finnes i avføringen; 4) lipidomics, eller fosfolipid repertoarer av en vev type, har vært avslørende i forståelsen av hvit-nese syndrom fungal patogen55,56. Utarbeidelse av vev er foreslått å være frosset umiddelbart etter disseksjon.

Tissue arkiver for Bat1K
Bat1K har som mål å opprettholde en vev bank av hver enkelt bat som brukes til å generere genomer. For tiden er disse vevs bankene og relevante fenotypiske og økologiske data samlet inn per individ opprettholdes i laboratorier/Museums samlinger av Bat1K medvirkende medlemmer. Som prosjektet skrider frem, vil Bat1K sentralisere og vedlikeholde vev samlinger og relevante databaser gjennom nettverk repositories som global Genova biologisk mangfold nettverk < http://www.ggbn.org/ggbn_portal/>.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Centro de Ecología y mangfold CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo, og Fanny Fernández Melo for å lage vev samling i Peru mulig. Vi takker også alle medlemmer av Grupo Jaragua og Yolanda León for å lage vev samling i den dominikanske republikk mulig, så vel som til Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, og alle på La Selva biological Research Station i Costa Rica, for å gjøre prøvetaking mulig. Vi takker Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe for tilgang og prøve samling av vinge slag fra Phyllostomus misfarges ball for cellekultur generasjon. Phyllostomus misfarges ball stammer fra en avl koloni i DEPARTMENT Biology II av Ludwig-Maximilians-Universitetet i München. Godkjennelse til å holde og avle ball ble utstedt av München-distriktet veterinær kontor. LMD, SJR, KTJD og LRY ble finansiert av NSF-DEB 1442142. LMD ble finansiert av NSF-DEB 1838273. LRY ble finansiert av NSF-PRFB 1812035. SCV og PD ble finansiert av en Max Planck Research Group Award, og en menneskelig grenser Science program (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016). SJR, JHTP og KTJD ble finansiert av European Research Council (ERC starter Grant 310482 [EVOGENO]) tildelt SJR, ble ECT finansiert av European Research Council Grant (ERC-2012-StG311000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes Fischer Scientific 10509691 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes Sarstedt 62,554,002 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials Thomas Scientific 1154P75 cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punch Medline MIL3332 wing biopsy punch for cell culture
6 well plate Greiner 83,392 Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent Qiagen 76405 for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber Bio-Rad 145-0011 Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IV Stemcell Technologies 7909 For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-5X5ML Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 12491-015 culture media
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190169 Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS) Fischer Scientific 10270106 Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt Sigma Aldrich G1264-250MG Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0050 Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILM Sigma P7793 Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x Invitrogen 15140130 Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 Thermo Fisher 10010023 salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlater Thermo Fisher AM7021 RNA stabilizing solution
RNAse away Genetech 83931-250mL breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel Fisher Scientific 7631-86-9 dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102 Automated cell counter
Trypan blue Bio-Rad 145-0013 Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4049 For dissociation of cells during splitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
  2. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
  3. Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
  4. Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
  5. Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
  6. Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
  7. Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
  8. Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen? Science. 323 (5911), 227 (2009).
  9. Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
  10. Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
  11. Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
  12. Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
  13. Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  14. Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
  15. Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
  16. Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
  17. Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
  18. Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
  19. Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
  20. Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
  21. Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
  22. Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
  23. Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
  24. Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
  26. Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
  27. Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
  28. Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  29. Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
  30. Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
  31. Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
  32. Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
  33. Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
  34. Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
  35. Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
  36. Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
  37. Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , Museum of Texas Tech University. (2003).
  38. Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
  39. Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
  40. Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
  41. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
  42. Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
  43. Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
  44. Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
  45. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
  46. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Schaumburg, IL. (2013).
  47. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
  48. Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  49. Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
  50. Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
  51. Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
  52. Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
  53. Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
  54. Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity? PeerJ. 6, e4174 (2018).
  55. Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
  56. Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).

Tags

Biologi ball Genomics transcriptomics vev prøvetaking vev bevaring disseksjon cellekultur
Tissue innsamling av ball for-omics analyser og primær Cell kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. … More

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. T. J., Potter, J. H. T., Rossiter, S. J., Teeling, E. C., Vernes, S. C., Dávalos, L. M. Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (152), e59505, doi:10.3791/59505 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter