Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ткань Коллекция летучих мышей для -Омики анализ и первичной культуры клеток

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59505
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 4, 5, *3,6, *2,7
1Department of Geology & Geophysics, Yale University, 2Department of Ecology & Evolution, Stony Brook University, 3Neurogenetics of Vocal Communication, Max Planck Institute for Psycholinguistics, 4School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London, 5School of Biology & Environmental Science, University College Dublin, 6Donders Institute for Brain, Cognition and Behavior, 7Consortium for Inter-Disciplinary Environmental Research, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Summary

Это протокол для оптимальной подготовки тканей для геномных, транскриптомических и протеомных анализов летучих мышей, пойманных в дикой природе. Она включает в себя протоколы для захвата летучих мышей и вскрытия, сохранения тканей, и клеточной культивирования ткани летучих мышей.

Abstract

По мере продвижения технологий секвенирования высокой пропускной способности стандартизированные методы приобретения и сохранения тканей высокого качества позволяют распространить эти методы на немоделированные организмы. Для ряда подходов к секвенированию высокой пропускной способности была разработана серия протоколов для оптимизации сбора тканей летучих мышей. Здесь описаны протоколы для захвата летучих мышей, желаемой демографии, которые будут собраны для каждой летучей мыши, и оптимизированные методы, чтобы свести к минимуму нагрузку на летучую мышь во время сбора тканей. Конкретно изложены методы сбора и лечения тканей для получения (i) ДНК для геномного анализа высокого молекулярного веса, (ii) РНК для транскриптомов, специфических тканей, и (iii) белков для протеомического уровня анализа. Наконец, также изложен ы метод, чтобы избежать смертельной выборки путем создания жизнеспособных первичных культур клеток из крыла клипов. Центральной мотивацией этих методов является максимизация количества потенциальных молекулярных и морфологических данных для каждой летучей мыши и предложить оптимальные способы сохранения тканей, чтобы они сохраняли свою ценность по мере развития новых методов в будущем. Эта стандартизация стала особенно важной, поскольку появились инициативы по секвенированию хромосомного уровня, безошибочным геномам видов во всем мире, в которых несколько научных партий возглавляют секвенирование различных таксономических Группы. Протоколы, изложенные в настоящем проекте, определяют идеальные методы сбора тканей и сохранения тканей для Bat1K, консорциума, который секвенирует геномы каждого вида летучих мышей.

Introduction

Методы секвенирования высокой пропускной способности (HTS) быстро продвинулись в эффективности и снизили стоимость, и теперь можно масштабировать эти подходы до сотен или тысяч образцов. Исследования, полученные в результате применения этих технологий имеют огромное влияние на несколько научных дисциплин, от биомедицины до эволюции и экологии1,2,3. Тем не менее, многие приложения HTS в решающей степени полагаются на высококачественные нуклеидные кислоты из живого источника. Это ограничение, вероятно, будет становиться все более проблематичным с развитием секвенирования третьего поколения на основе долгочитаемых молекул4. По этим причинам необходимо сосредоточить усилия на установлении наилучшей практики сбора образцов свежих тканей диких организмов за пределами лаборатории, что максимизирует полезность материала и сокращает число лиц, которые должны быть Собранные.

Bat1K является международным консорциумом ученых с постоянной инициативой по последовательности генома каждого вида летучих мышей на уровне хромосом сборки5. Летучие мыши представляют 20% разнообразия млекопитающих и имеют исключительные адаптации, которые имеют последствия для понимания старения, экологии заболеваний, сенсорной биологии и метаболизма5,6. Многие летучие мыши также находятся под угрозой или находятся под угрозой из-за эксплуатации человека7 или быстро снижается из-за патогенных микроорганизмов8,9, и секвенирование на уровне генома имеет большое значение для сохранения этих видов. Хотя Bat1K в настоящее время направлена на секвенирование геномов всех видов летучих мышей, стандартизация сбора образцов тканей для высококачественного геномного секвенирования остается ключевой проблемой для сообщества биологов организмов. В дополнение к геномным данным, функциональное понимание разнообразия адаптации летучих мышей требует анализа транскриптома и белка, часто требующего отдельных протоколов сбора. Кроме того, как и во всех таксономических группах, в то время как оптимальный сбор и сохранение тканей имеет важное значение для получения данных о высшем качестве для анализа -омики, передача передового опыта часто затруднена из-за быстро меняющихся технологий и несколько исследовательских групп, работающих независимо друг от начала.

Необходимость внедрения передовой практики для исследований летучих мышей особенно актуальна, учитывая, что многие виды летучих мышей встречаются редко или находятся под угрозой. В отличие от других мелких млекопитающих, таких как грызуны и землеройки, летучие мыши являются долгоживущими, что объясняется исключительными механизмами репарации ДНК10 и медленным размножением11,при этом большинство видов рожают только одного или (в некоторых случаях) двух молодых в год. По этим причинам, летучие мыши населения может быть медленным, чтобы оправиться от беспорядков, и сбор многих людей из дикой природы не является ни целесообразным, ни возможным. Другими словами, протоколы должны быть оптимизированы для получения максимального объема данных для одного образца, что снизит необходимость излишней репликации усилий по отбору проб.

Здесь этот протокол конкретно посвящен стандартизированным методам сбора и отбора проб тканей летучих мышей для геномного и транскриптомического секвенирования и анализа белка. Его главным приоритетом является обеспечение того, чтобы ткани летучих мышей собирались этически и ответственно, начиная от процесса выдачи разрешений на сбор, экспорта тканей и минимизируя стресс животному, и длительные условия хранения. Разработаны сложные вскрытия с целью будущей проверки полезности различных собранных материалов. Данная рукопись представляет собой пошаговое руководство по сбору летучих мышей гуманным способом, которое призвано свести к минимуму воздействие на население и максимизировать научную ценность. Хотя в центре внимания этого протокола специально для использования в летучих мышей, многие шаги имеют отношение к другим позвоночных таксон, особенно млекопитающих.

Обзор коллекции тканей
Процедура сбора тканей, включая температуру для хранения и выбор консервирующего агента, будет определяться характером запланированных анализов. Тем не менее, настоятельно рекомендуется, чтобы, когда это возможно, ткани собираются в рамках целого ряда методов, чтобы максимизировать свою будущую полезность, даже если не планируется конкретный анализ. В целом, ткани собираются и сохраняются для последующего анализа либо нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), либо белка. Для каждого из этих применений ткани могут быть оптимально сохранены путем прямого замораживания вспышки в жидком азоте (LN2). Тем не менее, немедленное погружение в LN2 не всегда возможно в поле. По мере развития технологий ресурсы, такие как специализированные флаконы для хранения ДНК и РНК при температурах окружающей среды, становятся все более доступными. Хотя мы не подтвердили все такие материалы в этом протоколе, мы призываем других исследователей сравнительно проанализировать производительность новых материалов относительно того, что мы представляем здесь. Мы предоставляем методы для идеального сохранения ткани для различных приложений в ситуациях, когда LN2 не может быть доступна, например, когда LN2 транспорт не представляется возможным из-за доступа к сайту через небольшой самолет в Амазонии. Кроме того, мы предоставляем метод сбора тканей, из которых можно выращивать и размножаться живые клетки. Ниже мы излагаем основные соображения для сбора материалов для каждой из этих целей и обзор методов сбора приведен в таблице 1.

Ткань для ДНК
Для всех собранных тканей, средства хранения будут определять, если он может быть использован для стандартного или высокого молекулярного веса (HMW) ДНК экстракции. HMW необходим для длительного секвенирования и в настоящее время требуется для генерации сборок генома уровня хромосомы, или генома "платинового стандарта". Низкомолекулярный вес (LMW) ДНК могут быть извлечены из флэш-замороженных, AllProtect (отныне называют "ткани стабилизирующий раствор"), или даже РНК-стабилизатор (отсюда "РНК стабилизирующий раствор") сохраненные образцы (хотя флэш замороженные образцы остаются оптимальными ). ДНК, выделенная стандартными лабораторными методами (например, колонны шпиненок кремнезема геля, фенол-хлороформ), все еще может давать фрагменты ДНК до 20 килобаз (кб). Таким образом, при наличии достаточной урожайности, эта форма изолированной ДНК может быть использована для подготовки библиотеки размером одной вставки, в которой размер вставки часто составляет 500 базовых пар (bp), а короткая последовательность считывает 100 bp, генерируется12. Эта ДНК особенно полезна для "резеконно-редактирующих" проектов или исследований, в которых полноразмерные хромосомные данные не требуются. ДНК HMW (10-150 кб) является более сложной и может быть надежно получена только с помощью ткани, которая была быстро флэш-заморожена в LN2 после сбора урожая и поддерживается на максимуме -80 градусов по Цельсию до экстракции.

Низкий молекулярный вес или фрагментированная ДНК часто достаточна для целевых подходов, включая усиление генов с помощью ПЦР и краткое секвенирование13. ПЦР основе исследований с использованием ДНК LMW, которые нацелены только один или несколько генов были весьма информативными в понимании адаптации и молекулярной эволюции летучих мышей сенсорной биологии6,14, физиологии15, филогенетики 5,16, и сохранение17,18. Успешное целевое последовательность повторного захвата низкой молекулярной массы и фрагментированной ДНК также было продемонстрировано для многочисленных групп позвоночных, в том числе летучих мышей19. Эти методы часто экономически эффективными и минимально инвазивных летучих мышей, как фекальные образцы и нелетальной ткани выборки через buccal тампоны или крыла биопсии удары также общие способы получения ДНК для анализа низкого молекулярного веса20, 21.

Тем не менее, качество сильно зависит от типа носителей, в которых хранится образец22. После систематических и количественных сравнений буккальных тампонов и бипсии биопсии, крыло биопсии удары были показаны, чтобы дать последовательно более высокие уровни ДНК и были менее напряженными для летучей мыши во время сбора22. Эти сравнения также показали, что лучшие результаты были получены, когда крыло удар был сохранен в индикатор кремнезема (т.е. тип desiccant из сварлийного геля бисера, который меняет цвет, когда влага наблюдается), а не в других популярных средств хранения, таких как этанол или DMSO22; хотя, другие средства хранения, включая решение стабилизации тканей, не были изучены. Удары крыла можно также использовать для того чтобы вырасти клетки fibroblast в культуре, such as в Kacprzyk et al.23 и как описано ниже (см. раздел 6). Для этих методов, крыло или uropatagium должны быть расширены мягко, и чистый удар биопсии, как правило, 3 мм в диаметре, должны быть использованы для получения образца. Этот подход, как представляется, не вызывают прочного ущерба, со шрамами заживления в течение нескольких недель в большинстве случаев24.

ДНК HMW (10-150 кб) является более сложной и в настоящее время только надежно получены с помощью ткани, которая была быстро флэш заморожены в LN2 после сбора урожая и поддерживается на максимуме -80 градусов по Цельсию до экстракции. ДНК HMW (10-150 кб) имеет решающее значение для длительного секвенирования ДНК и, следовательно, для сборки генома de novo. Действительно, в то время как большинство коммерческих комплектов могут быть использованы для изоляции некоторых стандартных ДНК HMW, в результате размеры молекул часто не отвечают требованиям технологий секвенирования третьего поколения, например, тех, которые были запущены такими компаниями, как Pacific Biosciences (PacBio), Оксфорд Нанопор технологий, и 10x геномики, или с помощью методов сборки, предлагаемых Bionano Genomics или Dovetail Genomics. Таким образом, существует новый спрос на ДНК "ultra HMW" (Зтт;150 кб). При получении ультра HMW ДНК из летучих мышей, свежие образцы печени, мозга или мышц все подходят, но они должны быть немедленно флэш заморожены в LN2 без каких-либо буфера хранения или криопротектора. Полное описание этих шагов выходит за рамки настоящего документа, но доступны в других25.

Ткань для РНК
РНК представляет собой одноцепочечную молекулу, которая менее стабильна, чем ДНК. Хотя существует много форм РНК, анализы-омики, как правило, сосредоточены на мРНК (мессенджер РНК) и малых РНК (например, микроРНК). После транскрипции мРНК сращивается, образуя зрелый транскрипт, который не содержит интронов и представляет собой кодирующую часть генов/геномов. Гены кодирования составляют крошечную долю размера генома (1%-2%), что делает таргетинг мРНК экономически эффективным средством получения данных о последовательности генов. МикроРНК представляют собой класс РНК, которые регулируют процесс перевода мРНК в белки и, таким образом, являются важными регуляторными эффекторами. РНК транскрипты могут быть секвенированы индивидуально, или чаще для -омики анализы26,27,28,29,30, как часть транскриптома; то есть, в общей сложности все транскрипты РНК, присутствующие в данной выборке.

Секвенирование может быть выполнено с помощью нескольких методов (т.е. с помощью короткого чтения РНК-сек или долгочитания всего изоформы Seq), что позволяет анализировать как изобилие РНК, так и использование изоформ. Поскольку количество и разнообразие транскриптов мРНК варьируется между клетками и тканями, секвенирование РНК позволяет изучать и сравнивать экспрессию генов и регулирование в различных образцах. Растет интерес к секвенированию малых РНК и целому изоформированию, поскольку эти методы становятся все более биологически информативными. Подготовка образцов тканей к последовательности различных классов РНК может быть выполнена таким же образом, как представлено в данной рукописи, и только последующие методы извлечения отличаются31,32. Наконец, поскольку транскриптомы предлагают высокий охват подмножество генома кодирования белка, собранный набор данных может быть полезен в сборке и аннотации генома, что делает сбор данных РНК-сек в различных тканях важным компонентом Инициатива Bat1K.

В отличие от ДНК, РНК химически нестабильна, а также ориентирована на ферменты RNase, которые повсеместно присутствуют в лизатах тканей в качестве оборонительной стратегии против РНК-вирусов. По этим причинам фракция РНК в клетках и тканях начинает деградировать вскоре после момента отбора проб и/или эвтаназии. Таким образом, сохранение РНК требует принятия мер по предотвращению ее деградации. Это обычно включает в себя сохранение свежесобранной ткани при температуре 4 градусов по Цельсию в стабилизирующем агенте, таком как РНК стабилизирующий раствор для инактивирования RNases, естественно присутствующих в тканях, а затем замораживание для долгосрочного хранения. В качестве предпочтительной альтернативы, ткани могут быть флэш-замороженных в LN2; хотя, как отмечалось выше, транспортировка LN2 в поле и поддержание уровней для предотвращения таяния тканей может быть логистически сложной задачей.

Ткань для белка
Состав белка и относительное изобилие различаются между клетками и тканями по аналогии с тем, что обсуждалось для РНК; однако, белки в среднем более стабильны, чем РНК. Идентификация протеинов с использованием протеомики обычно соответствует фракции, а не всей последовательности белков, но она может предоставить информацию о экспрессии в тканях и охарактеризовать присутствующие патогенные микроорганизмы. Поскольку многие белковые последовательности сохраняются среди млекопитающих, образцы летучих мышей для протеомики могут быть легко загрязнены консервированными человеческими белками, требующими стерильных протоколов (например, перчатки, щипцы) во время сбора. В то время как флэш-замораживание в LN2 является лучшим способом предотвратить деградацию белков, использование сухого льда, -20 qC морозильники, и даже лед подходят, если нет других средств. По мере повышения температуры повышается и риск дифференциального распада белка. Стабилизирующие средства, такие как решение стабилизации тканей, эффективны в сохранении белковой фракции тканей при комнатной температуре и подходят для кратковременного сохранения (до одной недели), когда замораживание вспышки нежизнеспособно.

Ферментативный профиль данной ткани непосредственно влияет на сохранение белка в ней. Ткани с низкой ферментативной активностью, такие как мышцы, могут сохранять белковые профили даже при более высоких температурах в бытовой морозильной камере. В отличие от этого, ткань печени ферментативно реактивна, и ее белки имеют более высокую вероятность деградации во время подготовки. Растущее число протоколов для получения протеомических профилей человека из формально-фиксированных парафина встроенных (FFPE) образцов предполагает, что параформальдегид фиксации тканей обещает для недорогой сохранения белка при замораживании при сборе не является возможно33,34. Хотя сильно зависит от времени сохранения и состояния, белки были определены с помощью иммуногистохимии от формилина фиксированной, этанол-сохраненные образцы летучей мыши35. Этот подход не масштабируется для протеомного уровня выборки, но подчеркивает потенциал для формилина фиксированной ткани летучих мышей для получения белковых профилей, когда флэш-замораживания недоступна и другие стабилизирующие агенты являются слишком дорогостоящими.

Ткань для клеточной культуры
Отбор проб ткани и флэш-замораживания предлагает конечное количество материала, который будет использоваться, и как только материал используется, он больше не доступен. Кроме того, клеточные культуры обеспечивают живые клетки, которые могут быть немедленно использованы или сохранены для будущих исследований. Культуры также способствуют расширению клеток, чтобы увеличить урожайность, когда образцы тканей малы. Это особенно полезно в тех случаях, когда сбор тканей ограничен, например эксперименты с редкими видами, в которых нелетальный отбор проб имеет важное значение и, следовательно, имеет широкие последствия для сохранения. Описанный протокол, в котором клеточная культура возможна с помощью нелетального отбора проб ткани мембраны крыла, но культивирование возможно с несколькими типами тканей36,37. Протокол, представленный здесь, выбирает для адептов ячейки. Сочетание исходной ткани и используемых носителей роста делает этот протокол подходящим для выбора и выращивания фибробластов, но при желании, альтернативные протоколы могут быть использованы для выбора для других типов клеток. В контексте проекта Bat1K прогнозируется, что для редких и находящихся под угрозой исчезновения видов нелетальный отбор проб оболочек крыла и расширение образцов через культивирование имеет важное значение для создания объема ДНК, необходимого для нескольких технологий, используемых5 .

Захват летучих мышей
Все люди обработки летучих мышей должны быть обучены летучей мыши компетентный исследователь и вакцинированы против бешенства с серией предварительного воздействия инъекций. Если укусил, еще ряд послеэкспозиционных инъекций по-прежнему необходимо. Стандартные методы для захвата летучих мышей включают туман сетей(рисунок 1) и арфы ловушки(рисунок 2). Туманные сети наиболее часто используются и идеально подходят для районов с низкой и умеренной активностью, так как они требуют наибольшей заботы для минимизации дистресса летучих мышей. Малые летучие мыши особенно уязвимы и могут умереть от стресса, если не, как правило, быстро. Частые чистые инспекции свести к минимуму травмы летучих мышей и смертности, а также повреждения сетки тумана. Эта деталь важна потому что правильная коллекция ткани требует ткани быть свежей, и неправильное внимание к сетям тумана в летучих мышей может вести к ненужной смертности или преждевременной смертности прежде чем исследователь может правильно обработать образцы. Поскольку несколько летучих мышей могут отдыхать в арфистовой ловушке с минимальным исчисляемым диагнозом, этот подход идеально подходит для районов с высокой активностью летучих мышей, таких как возле пещеры или большого насест. Подробные инструкции по надлежащему захвату летучих мышей и обработке данных для сбора морфологической и демографической информации доступны в дополнительных методах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные здесь методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Стоуни-Брук (протокол #2013-2034).

1. Эвтаназия

  1. Смочите ватный шарик с изофрураном анестезии или другой доступной анестезии.
  2. Поместите ватный шарик в запечатываемый, герметичный полиэтиленовый пакет. Мешок должен быть достаточно большим, чтобы держать мешок в мешке летучей мыши ткани удобно.
  3. После нескольких минут позволяет мешок проникать с анестезией, поместите битой мешок, содержащий летучую мышь в полиэтиленовый пакет.
  4. Подождите несколько минут, пока летучая мышь усыплена. Летучие мыши весом 20 г или менее требуют примерно 5-10 мин. Летучие мыши больше, чем это может потребоваться до 20 мин. Обратите внимание, что продолжительность времени может также зависеть от проницаемости мешка летучей мыши. Рекомендуется использовать самый тонкий из возможных тканей для максимального распространения анестетика.
  5. Проверьте дыхание и сердцебиение, чтобы убедиться, летучая мышь была усыплена до начала вскрытия.

2. Препарат вскрытия

  1. Держите все приборы чистыми между вскрытиями, используя следующий протокол.
  2. Вымойте инструменты водой и мылом для посуды. Протрите их вниз с 10% отбеливателя, вдали от области вскрытия, как отбеливатель будет сломать нуклеиновых кислот.
  3. Протрите 70% этанола.
  4. Протрите с помощью реагента обеззараживания РНК.
  5. Повторите этот раздел после каждого вскрытия.

3. Подготовка виали для образцов тканей

  1. Для РНК:
    1. Подготовьте все флаконы перед началом вскрытия, чтобы избежать задержек.
    2. Отложите в сторону количество флаконов, необходимых для каждого образца. Этикетка каждой трубки с типом ткани, которые будут собраны, а также стандартные идентификационные данные образца. Заполните флаконы 50% полный РНК стабилизирующего раствора, и в идеале охладить до 4 градусов по Цельсию.
    3. Позаботьтесь, чтобы не заполнить флаконы полностью с РНК стабилизирующее решение, в противном случае трубка может взорваться при размещении его в LN2. При взятии образцов тканей помните, что большие куски ткани не будут полностью пронизаны раствором стабилизации РНК. Поэтому разрежьте ткань на более мелкие кусочки размером не более 0,5 см в одном измерении и сохраняйте соотношение не менее 10:1 объема для стабилизирующего раствора РНК:ткани.
    4. Как минимум, расчлененные ткани должны быть помещены в РНК стабилизирующий раствор, даже если доступ к LN2 или холодильные хранилища в недоступном.
  2. Для ДНК:
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Содержание ядерной ДНК одинаково почти для всех тканей; поэтому выборка может быть гибкой. Однако следует отметить, что более высокая плотность митохондрий в мышечной ткани может привести к потере считывателей для ядерного генома38.
    1. Для низкомолекулярного веса ДНК, принять один или несколько репликации мембраны крыла для хранения в кремнеземе, и / или мышцы для хранения в РНК стабилизации решения или раствор стабилизации тканей.
    2. Для ультра HMW ДНК, флэш-заморозка в LN2 без каких-либо реагентов хранения, а затем передать на длительное хранение при -80 градусов по Цельсию или холоднее. Из черепного вскрытия, ткани мозга является наиболее подходящим типом ткани для извлечения ультра HMW ДНК39, в то время как от посткраниальных вскрытий, печени или мышц являются болееподходящими 40.
    3. Для вскрытия черепа используйте флаконы 5 мл (в отличие от стандартных флаконов 2 мл) стабилизаторного раствора РНК для некоторых тканей. Все флаконы должны быть криогенными. Держите флаконы на льду при вскрытии.

4. Рассечения черепа для РНК

  1. Сразу же после эвтаназии обезглавить образец большими ножницами или костными резцами(рисунок 3).
  2. Удалите глаза с помощью щипц, используя достаточно сильную силу, чтобы отделить зрительный нерв. Поместите глаза в 2 мл флакона РНК стабилизирующего раствора.
  3. Используя ваш инструмент выбора, кожа черепа от волос, фасции и мышц черепа, в том числе кожи на носу. Позаботьтесь, чтобы не сломать переднюю часть носа.
  4. Используя ножницы, сделать sagittal вырезать на брюшной части (Рисунок 3) черепа, начиная с шеи, заботясь, чтобы не повредить мозг.
  5. Используя щипц, осторожно отодвинуть обе стороны черепа, пока он не трещины открытыми и мозг подвергается.
  6. На каудальном конце черепа, улитки теперь должны быть сквозно видны по обе стороны головы. Они маленькие, сферические кости на левой и правой стороне, просто ростраль к шее и задней мышцмассы. Используя щипточки, аккуратно потяните улички и положите их в один флакон 2 мл стабилизаторного раствора РНК.
  7. Аккуратно соскребите мозг (который будет очень мягким) с помощью щипков. Обонятельная лампа станет видимой, сидя на брюшной части интерьера черепа. Старайтесь держать обонятельную лампу прилагается.
  8. Если обонятельная лампа еще не удалена, аккуратно соскребите ткани, и крибриформная пластина станет очевидной. Это критическая кость, чтобы держать исследователя ориентированы. Его можно определить как наиболее переднюю область черепа с несколькими фораминов и точки, в которой два канавки, где обонятельная лампа лежит.
  9. Если это возможно, сохранить форму мозга нетронутыми и сразу же поместите на сухой лед, чтобы сохранить форму или в 5 мл флакон РНК стабилизирующего раствора. Если иммуногистохимия должна быть сделана на мозг, место в 4% параформальдегида, если таковым.
  10. Сделайте два разреза, где верхняя и нижняя челюсть соединить, и удалить нижнюю челюсть.
  11. После того, как челюсть была удалена, удалить трибуну (верхняя челюсть) из оставшейся части черепа. Убедитесь, что челюсть включает в себя крибриформную пластину.
  12. Поместите нос в RNA стабилизирующее решение и хранить при 4 градусах Цельсия на ночь. Потому что это плотная ткань, она требует времени, чтобы РНК стабилизирующий раствор пронизывать всю ткань.
  13. Поместите нос флакон в LN2 после ночного замочить в РНК стабилизирующего раствора.
  14. Из нижней нижней челюсти, вырезать язык ножницами и место в 2 мл флакон РНК на потом.
  15. Этот протокол теряет большую часть черепа. Зубы, особенно из ягод, могут быть восстановлены и могут быть полезны для диагностики видов. Костная ткань может храниться в 1x фосфат-буферизированных солен (PBS).

5. Посткраниальные рассечения РНК

  1. Используйте скальпель, чтобы проколоть брюшную полость, делая продольное разрез до ребер(рисунок 3). Это лишает скелетной рамы. Если кость должна быть сохранена, тщательно вскрыть из кожи в мышцах и хранить в 1x PBS после вскрытия мягких тканей завершена.
  2. Стрип кожи выявить грудной мышцы, принять по крайней мере два образца мышц, один для РНК стабилизирующего решения и один оставаться замороженным для HMW ДНК, размещение сразу в флакон положить в LN2.
  3. Вырезать грудину и вытащить ребра для сбора образцов из легких.
  4. Соберите сердце, которое может быть принято целиком, но должны быть разделены пополам, так что РНК стабилизирующий раствор впитывает тщательно.
  5. Возьмите образцы из печени. Возьмите по крайней мере два образца печени, один, чтобы остаться замороженным для ДНК HMW, поместив сразу в пустой флакон, чтобы положить в LN2. Печень очень ферментатична, и важно сделать образцы достаточно небольшими для РНК стабилизирующего раствора, чтобы полностью впитаться.
  6. Печеночный проток, который действует для слива желчи из печени, соединяет печень с поджелудочной железой и тонкой кишкой. Этот сосуд легко идентифицировать путем зондирования нижней / задней части печени и отслеживания судна в задней образом. Проток часто зеленоватого цвета, а также. Следуйте печеночного протока, чтобы найти поджелудочной железы и желчного пузыря и собирать их отдельно. Поместите в соответствующие флаконы стабилизаторного раствора РНК.
  7. Соберите желудок и, рядом с ним, у его основания и появляются как другой оттенок фиолетового, является перо, как селезенка. Поджелудочная железа также должна быть видна здесь как белая структура(рисунок 3). Поместите в соответствующие флаконы стабилизаторного раствора РНК.
  8. Соберите небольшие образцы тонкой и толстой кишки. Поместите в соответствующие флаконы стабилизаторного раствора РНК. Кишечник также может быть проверен на эндопаразит. Если паразитолог находится в поле, осмотр паразитов может быть выполнена. Если это должно быть сделано в более позднее время, весь кишечник может быть принято в 5 мл криогенного флакона.
  9. Возьмите одну из почек и следуйте их протоков в мочевой пузырь. Поместите в соответствующие флаконы стабилизаторного раствора РНК.
  10. Используйте другую почку в качестве руководства, чтобы найти яички (если мужчина) или матки и через него яичников (если женщина). Соберите один или оба гонады, если это возможно.
  11. Храните образцы различных частей кожи крыла в отдельных флаконах (мышечная против немышечной части).

6. Коллекция и подготовка тканей

  1. Подготовка среды роста для клеток, соизувающее Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM), содержащий 20% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS), 1% пенициллин / стрептомицин (P / S), и 50 мкг / мЛ гентамицин. Aliquots средств роста должны быть сделаны свежими каждый день протокола.
  2. После сбора, крыло биопсии удары должны быть непосредственно помещены в 1 мл холода среды роста в хорошо запечатанном 1,5 мл центрифуги трубки. Оберните трубку в парафильм для уплотнения.
  3. Трубки следует затем транспортировать в полистирол поле с элементами охлаждения, чтобы сохранить образцы на 4 градусов по Цельсию. Транспортные перевозки должны быть ускорены; хотя, здоровые клетки могут быть сделаны из ударов, которые были сохранены таким образом на срок до 6 дней, но менее оптимально23.
  4. После транспортировки в объект культуры тканей, следующий протокол может быть использован для генерации клеточных культур. Стандартные стерильные методы должны использоваться для остальной части протокола41.

7. День 1 Ткань культуры: Диссоциация ткани

  1. Перенесите содержимое трубки (среды роста, содержащей биопсию мембраны крыла) в коническую центриконную трубку 15 мл.
  2. Тщательно удалите среду роста. Аккуратно промыть биопсию два раза с 500 зл стерильных PBS.
  3. Добавьте в трубку 500 кЛ коллагеназа IV (1 мг/мл). Это приведет к перевариванию тканей в отдельные клетки.
  4. Инкубировать ночь (максимум 16 ч) при 37 градусах Цельсия без агитации.

8. День 2 Ткань культуры: Покрытие клеток

  1. Составьте свежий средний рост и предварительно разогреть его до 37 градусов по Цельсию.
  2. Подготовьте 6 хорошо ткани культуры пластины, добавив 2 мл свежих, предварительно разогретых среды роста в каждой скважине пластины для использования (1 хорошо на 3 мм биопсии крыла). Храните эту пластину в инкубаторе 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 до необходимости (шаг 8.7).
  3. Удалите трубку 15 мл, содержащую клетки из инкубатора, и утолите реакцию пищеварения, добавив 1 мл свежей среды роста (предварительно подогретой до 37 градусов По Цельсию).
  4. Resuspend клетки тщательно triturating решение с P1000 пипетка отзыв для достижения одной подвески ячейки.
  5. Аккуратно вращайте клетки в центрифуге столешницы в течение 3 мин при 300 х г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие кусочки ткани все еще могут быть видны либо в подвеске, либо прикреплены к стенке трубки 15 мл. Однако это не влияет на подготовку клеточной подвески
  6. Откажитесь от супернатанта, аккуратно удалив 80%-90% жидкости с помощью пипетки P1000.
    ПРИМЕЧАНИЕ: если все еще видны, не отбрасывайте кусок ткани, и осторожно triturate его на следующем шаге (8,7).
  7. Приостановите гранулы в 500 л предварительно разогретой среды роста, аккуратно стригните подвеску, чтобы гранулы или большие фрагменты гранулы больше не были видны и чтобы клетки были достаточно взвешены. Средства массовой информации могут выглядеть облачно из-за присутствия клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно провести жизнеспособное количество клеток для оценки качества подвески клеток и урожайности клеток, полученных из зажима крыла (см. шаг 10.11 для получения дополнительной информации).
  8. Аккуратно пипетка весь объем клеточной подвески в один колодец из 6 хорошо пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните выше шаг немедленно и не позволяйте клеткам осесть после шага 8.7. Используйте пипетку, чтобы аккуратно распределить клеточную подвеску по поверхности колодца в dropwise моды. Не пайпы весь раствор в центре скважины, так как это приведет к клеткам слипания в середине скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: если кусок ткани все еще виден, не перенесите его в сосуд культуры хорошо.
  9. Аккуратно раскачивать пластину из стороны в сторону и спереди-назад 2x-3x, чтобы помочь клеткам распределить по поверхности скважины в одном слое.
  10. Проверьте покрынные клетки под микроскопом, так как они должны быть одиночными клетками, которые кажутся сжатыми и плавающими, но очень плотными.
  11. Аккуратно поместите тарелку в инкубатор, предварительно установленный до 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
  12. После 24 ч, наблюдать клетки под микроскопом, чтобы определить здоровье культуры. Клетки теперь должны быть прикреплены к поверхности пластины и появляются сплющенные(рисунок 4A). Различные типы клеток могут быть видны в культуре при взгляде через микроскоп.
  13. Там, вероятно, будут некоторые плавающие клетки, которые не присоединены. Часть этих клеток мертва. Если в колодце видна высокая доля плавающих ячеек, средства массовой информации должны обновляться. В этом случае тщательно аспирируйте 50% среды из колодца и аккуратно добавьте 1 мл предварительно разогретой среды роста в сторону колодца, чтобы не беспокоить клетки.
  14. Поддержание клеток в инкубаторе предварительно установлен до 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Клетки должны наблюдаться под микроскопом регулярно (но не более одного раза в день), чтобы определить необходимость медиа освежения или расщепления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда клетки недавно покрыли, они будут делиться быстро и поэтому должны быть проверены каждый день. Через некоторое время в культуре, рост будет замедляться, и они могут быть проверены каждые 48-72 ч.

9. Освежающие средства массовой информации

  1. Регулярно проверяйте клетки под микроскопом, чтобы наблюдать за их ростом и качеством культуры. Мониторинг цвета носителя как индикатора его качества. Клетки должны оставаться в тех же носителях в течение максимум 3 дней или до тех пор, пока пропуск не требуется, в зависимости от того, что приходит первым.
    1. Если клетки быстро растут и изнуряют носители, это также будет видно глазу, так как цвет носителя превратится из красного в желтый.
  2. Всякий раз, когда необходимо тщательно аспирировать 50% от среды из колодца и осторожно добавить примерно такой же объем предварительно подогретого роста среды в сторону хорошо, чтобы не беспокоить клетки.
  3. Верните клетки в инкубатор 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.

10. Проходные ячейки

  1. Проходя клетки относится к принятию существующей культуры и расщепления его на новые скважины. Проходдолжен должен происходить, когда клетки стыковые 80% конфлируют, когда они занимают 80% поверхности скважины и только 20% пластика все еще видны в виде зазоров(рисунок 4B).
  2. Тщательно аспирируйте и отбрасывайте 90% среды роста.
  3. Вымойте клетки очень осторожно, добавив 1 мл стерильных PBS к стене колодца, чтобы не беспокоить клетки. Аккуратно раскачивать тарелку взад-вперед и вперед и из стороны в сторону 2x-3x. Тщательно аспирируйте и отбросьте все PBS из пластины.
  4. Повторите шаг 10.3, чтобы снова вымыть клетки.
  5. Аккуратно добавьте 250 л трипсина-ЭДТА (Сигма Олдрич, Кот #T4049) в колодец и инкубируйте в течение 1,5 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор трипсин-EDTA покрывает всю поверхность колодца, мягко раскачивая пластину.
  6. Утолить реакцию, добавив 1 мл свежей предварительно разогретой среды роста.
  7. Пипетка вверх и вниз по 5x, чтобы вымыть клетки с поверхности пластины и обеспечить клетки находятся в подвеске.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен стать облачным из-за присутствия клеток.
  8. Поместите суспензию клетки в трубку 15 мл и вращайте клетки в центрифуге столешницы в течение 3 мин при 300 х г.
  9. Откажитесь от супернатанта, аккуратно удалив 80%-90% жидкости с помощью пипетки P1000.
  10. Приостановите гранулы в 1 мл предварительно разогретого роста среды и аккуратно тритурировать подвеску. Убедитесь, что гранулы или большие фрагменты гранул больше не видны, а клетки находятся в одноклеточной подвеске.
  11. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток, как описано здесь, или вручную с помощью гемоцитометра, как описано подробно в справочном видео42. Смешайте 10 qL aliquot взвешенных клеток 1:1 с трипан синим для обнаружения жизнеспособных клеток.
  12. Инкубировать в течение 1 мин, и пипетка 10 злитрона раствора на счет слайд. Вставьте слайд подсчета в автоматизированный счетчик ячейки для подсчета ячеек с помощью соответствующих настроек. Урожайность должна быть около 1-2 миллионов клеток из слияния одного колодца 6 хорошо пластины, хотя это может варьироваться в зависимости от размера клеток и видов. Если клетки не находятся в одной подвеске ячейки, количество клеток не будет точным.
  13. Эти клеточные культуры, как правило, переносят сплит 1:2 (т.е., один слив оков клеток может быть разделен на две новые скважины (всего)». Для этого аккуратно тритуруйте клетки снова, затем возьмите клеточную подвеску в две половинки (730 евро каждая) и поместите их в каждую из двух новых скважин, содержащих 750 л предварительно разогретого роста среды в dropwise моды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2-3 дня скважины должны быть сливочные и снова готовы к расщеплению. На этом этапе рекомендуется сохранить один колодец клеток по протоколу о замораживании (раздел 11). Дальнейшие запасы клеток могут быть заморожены во время дальнейших проходов по мере желательности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 6-го места клетки, как правило, вступают в сенесценцию и больше не будут делиться. Это свидетельствует о том, что клетки больше не могут быть разделены или расширены для увеличения числа клеток. Это также свидетельствует о том, что клетки не будут жизнеспособными в течение длительного времени.

11. Замораживание жизнеспособных живых клеток

  1. Подготовка замораживания средств массовой информации путем объединения DMEM с 20% FBS, 10% DMSO, 1% P / S, и 50 мкг / мл гентамицина.
  2. Замораживание осуществляется путем принятия клеток pelleted в зависимости от процесса прохода. Гранулы должны быть подготовлены из 80%-90% слияния хорошо пластины 6 скважин (представляющих 1-2 миллиона клеток), в зависимости от шагов 8,1-8,9.
  3. Отрежь гранулу в 1,5 мл замораживания среды.
  4. Поместите 750 евро клеточной суспензии в каждом из двух отдельных криовиалов.
  5. Поместите флаконы в криогенный замораживание контейнера, что приводит к клеткам замораживания медленно поддерживать жизнеспособность клеток. Немедленно поместите их в -80 градусов по Цельсию.
  6. После 24-48 ч, передача криовиалы клеток на LN2 для длительного хранения. Сохраненные таким образом, клетки могут быть возрождены и будут жизнеспособными в течение многих лет.

12. Оттаивание замороженных клеток

  1. Подготовьте 6 хорошо пластины, содержащие 2 мл предварительно подогретой среды роста в каждой скважине, которая будет использоваться (1 хорошо на флакон клеток размораживаются). Поддерживайте тарелку в инкубаторе 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 до необходимости.
  2. Возьмите один флакон клеток из LN2 и поместите его в теплую водяную ванну (37 градусов по Цельсию) для быстрой оттепели клеток. Это должно занять 2-3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте флаконы оттаивания дольше, чем 3-5 мин, как DMSO в замораживании средств является токсичным для клеток после оттаяния.
  3. Как только раствор в флаконе разморажено, аккуратно пипетка вверх и вниз, чтобы гомогензировать раствор и сразу же поместите весь раствор (750 евро) в один колодец из 6 хорошо пластины (предварительно подготовленный в шаге 12.1).
  4. Аккуратно раскачивать пластину из стороны в сторону и спереди назад 2-3 раза, чтобы помочь клеткам распределить по поверхности скважины в одном слое.
  5. Поместите клетки в инкубатор при 37-C и 5% CO2 инкубатор для 24-48 ч.
  6. Мониторинг и прохождение клеток, как описано выше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Днк
Для анализа низкого молекулярного веса (LMW) ДНК была извлечена из трех видов неотропических летучих мышей. Образцы тканей были собраны в поле из Доминиканской Республики и Коста-Рики в соответствии с протоколами, описанными в настоящем документе. После вскрытия, мелкие кусочки (0,5 см в самом тонком разделе) смешанных тканей (мозг, печень и кишечник) были помещены в РНК стабилизирующий раствор, вспышки заморожены, а затем хранится при -80 градусов по Цельсию. Извлечения были проведены с использованием стандартных протоколов экстракции ДНК с RNase лечения43. Оценка целостности ДНК с помощью автоматизированного инструмента электрофореза выявила следующие репрезентативные пики образцов размеров фрагментов: вид 1 (две отдельные экстракции) состоял из 22 кб и 20 кб; вид 2 состоял из 25 кБ; и виды 3 состояли из 24 кБ(рисунок 5, Таблица 2).

ДНК, извлеченная для секвенирования третьего поколения, должна быть собрана в высоких концентрациях и минимально фрагментирована. HMW ДНК, извлеченные из флэш-замороженных тканей мозга из Старого Света фруктовые летучая мышь (Eidolon helvum), собранные в Гане был получен. ДНК HMW была извлечена с помощью протокола экстракции Bionano для последующего анализа на платформе Irys. Эта ДНК была 607,463 Мб в длину и имела средний молекулярный N50 194,5 Мб.

Рнк
Общим показателем успеха для извлечений РНК является значение значения целостности РНК (RIN). Часто не рекомендуется посеканию средств для выполнения подготовки библиотеки РНК-сек или протокол аквенции, когда извлечения имеют значение RIN менее восьми, так как значения ниже этого порога начинают демонстрировать высокие подписи деградации44 ,45. На рисунке 6 показаны значения RIN для экстракций РНК различных типов тканей после этого протокола. Извлечение тканей, собранных с помощью протоколов, привело к высокому качеству РНК, независимой от места отбора проб. Когда LN2 не был немедленно доступен в Амазонии, ткани были помещены в РНК стабилизирующее решение и держали на 4 кв С в течение 1 недели, пока не помещены в LN2. Даже в таких случаях значения RIN были сопоставимы с значениями, непосредственно помещенными в стабилизаторное решение РНК и непосредственно в LN2. Рнкстабилизирующий раствор является важным стабилизирующим средством.

Ткань культуры
Сразу после покрытия, клетки будут сжаты и плавающие. Однако в течение 24 ч фибробласты должны сгладить и прикрепить к поверхности пластины(рисунок 4А). На данный момент, клетки должны быть примерно на 20%-30% слияния для обеспечения выживания. Значение ниже, чем это может привести к смерти всей культуры. Первоначально они должны иметь достаточно места между собой, чтобы позволить расширение, так как клетки будут делиться и расширяться в культуре. Они должны быть разделены, когда они достигают 80%-90% слияния , т.е., они покрывают 80% поверхности пластины(рисунок 4B)». Таким образом, клетки могут быть сохранены в культуре для ряда проходов (как правило, 6 проходов), прежде чем пройти сенесценции. Если клетки поддерживаются в культуре после этого времени или не разделены, когда они становятся слияния, они могут изменить морфологию и стать больше и длиннее (Рисунок 4C). Клетки с этой морфологией все еще могут делиться, но это обычно указывает на то, что клетки находятся или скоро вступят в сенесценцию и больше не смогут поддерживаться или расширяться в культуре.

Figure 1
Рисунок 1: Общий набор для тумана сетей для захвата летучих мышей в лесу. Держать одну руку покрывую пока disentangling с противоположной рукой путь безопасно извлечь летучую мышь пока минимизируя усилие. Эта фотография была сделана Джоном Фландрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Ловушка арфы часто используется для захвата за пределами пещер, больших насесты, или летать-aways. Летучие мыши будут накапливаться в нижней сумке ловушки с минимальным запутанность и легкое удаление следователем. Эта фотография была сделана Стивеном Росситером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Рабочий процесс вскрытий и выборки тканей для подготовки РНК ткани.

Figure 4
Рисунок 4: Культуры клеток летучих мышей, полученные из крыльев, обесцвечивают phyllostomus. (A) 24-48 ч после покрытия, клетки будут сплющены и прикрепляются к поверхности пластины. (B) Клетки покрывают 80%-90% поверхности пластины и поддерживают оригинальную морфологию. Это представляет собой оптимальную стадию для расщепления. (C) После того, как 6 проходов, клетки изменят свою морфологию, чтобы стать больше и длиннее, и клетки войдут в сенесценцию. На всех снимках яркие, зажатые клетки представляют мертвые клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные результаты днк-извлечений из сохранности для стандартного анализа ДНК трех видов летучих мышей, ДНК была извлечена дважды из видов 1. Одна большая полоса указывает на минимальную фрагментацию и аналогичные размеры фрагментов ДНК от каждой соответствующей добычи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Номера целостности РНК (RIN) извлечения РНК из 13 различных типов тканей из неотропических видов летучих мышей, отобранных в четырех различных населенных пунктах. Эти извлечения были подготовлены в соответствии с описанным протоколом, а затем были использованы для подготовки библиотек транскриптома HiSeq/NextSeq Illumina. МЧС является основным обонятельным эпителием. VNO является vomeronasal орган. Ткани, взятые из видов в Андах, Коста-Рике и Доминиканской Республике, были помещены непосредственно в LN2 после замачивания в стабилизаторном растворе РНК при 4 градусах Цельсия в одночасье. Ткани, взятые из видов в Амазонии, были помещены в LN2 примерно через 1 неделю после размещения в стабилизаторном растворе РНК и постоянно хранятся при 4 градусах Цельсия. N представляет количество особей, представленных для каждой экстракции ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Приложения Вспышка заморожена (L2) РНЛАТЕР AllProtect FFPE Носителя
Высокая МВт ДНК Y X Y X X
Низкая МВт ДНК Y Y Y X X
Рнк Y Y Y X X
Белка Y X Y Y X
Культура сотовой связи X X X X Y

Таблица 1: Обзор методов и приложений сохранения. МВт - молекулярный вес, FFPE - формальная парафиновая ткань. Проверки указывают на предпочтительный метод сохранения для каждого соответствующего предназначенного приложения. X-знаки указывают на сохранение, которое не должно использоваться.

Идентификатор вида Идентификатор образца Концентрация (нг/Л) Пиковый размер фрагмента образца (bp)
Виды 1 1.1 31.8 21,885
1.2 22.8 19,633
Виды 2 2 30.4 25,198
Виды 3 3 32 24,386

Таблица 2: Репрезентативные результаты для извлечений ДНК на основе методов сохранения в этом протоколе. Значения соответствуют гелевым электрофорусным скважинам с рисунка 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В протоколе, обсуждаемом в данной рукописи, описываются лучшие методы отбора проб для различных высокопроизводительных молекулярных анализов летучих мышей. Все успешные исследования требуют высокого качества тканей, но отбор проб тканей летучих мышей, а также других немодельных организмов, часто происходит в полевых условиях, которые не могут быть установлены в тех же стандартах, что и контролируемые лабораторные установки. Выборка часто происходит в отдаленных районах с минимальными ресурсами, включая ограниченный доступ к электричеству и морозильным камерам. Трудно, а зачастую невозможно обеспечить полностью стерильные условия отбора проб. Таким образом, изложены протоколы, которые были определены как наиболее успешные в различных местах отбора проб и условиях на местах. Для того чтобы стандартизированные методы отбора проб для инициативы Bat1K и связанных с ней усилий и проектов, предлагается, чтобы летучие мыши биологи следовать этим протоколам при планировании полевых экспедиций в той мере, в какой это разрешено.

Предложения по протоколу
В то время как торакальная сжатие была распространенным подходом для эвтаназии в прошлом, предлагается никогда не использовать грудное сжатие для сбора летучих мышей для -омичи анализы. Это уже не является приемлемой формой эвтаназии в Соединенных Штатах46, и этот метод может привести к ферментативной деградации целого ряда тканей независимо от вида интереса47. Если животное будет усыплено, предлагается собрать ткани как для геномного, так и для транскриптомического анализа. Оба требуют сбора свежей ткани, которая в идеале будет флэш-заморожены в LN2, но которые также могут храниться в различных средствах массовой информации для облегчения ДНК, РНК, или экстракции белка. Предлагается работать параллельно с двумя людьми на черепных и посткраниальных вскрытий, чтобы уменьшить деградацию РНК в тканях. Один человек должен вскрыть череп, в то время как другой работает на пост-краниум.

Основные ограничения при проведении протоколов вскрытия включают персонал, участвующий в вскрытии и пространство для сохранения тканей (например, в баке LN2). Подготовка флаконов заранее и достаточное количество людей для оказания помощи с маркировки труб и документирования флаконов и тканей собраны будет способствовать гладкой обработки образцов. Следует отметить, что надлежащая документация образцов имеет важное значение для получения необходимых (экспортных, импортных) процессов. Например, протокол посткранального вскрытия требует более 20 флаконов на животное.

Если пространство и время ограничены, следует расставить приоритеты: 1) приоритеты для одного образца для вида или, как минимум, одного образца на род; приоритеты для мужского образца, чтобы обеспечить секвенирование х и Y хромосомы и минимизация вероятности отбора проб репродуктивной самки; 2) для ДНК HMW: мозг, мышцы и печень должны быть заморожены без какого-либо реагента; 3) для РНК: мозг, пищеварительные ткани, селезенка, и органы чувств имеют высокий приоритет. Каждый образец ткани должен храниться в растворе стабилизации РНК. Мышечная ткань также должна быть взята в качестве контроля для анализа экспрессии специализированных тканей; 4) как минимум, ткани должны быть холодными; 5) наличие LN2 также может вызывать озабоченность. LN2 танки должны быть пополнены как минимум каждые две недели, но чаще в более теплом климате или если танк часто открыт. LN2 часто коммерчески доступен во всех странах, так как он часто используется в сельском хозяйстве и здравоохранении для транспортировки образцов. Обычно эти услуги предоставляются компаниями, которые также продают другие газы, такие как двуокись углерода или кислород. Магазины мороженого иногда предлагают другой вариант для сухого льда или LN2 (или, по крайней мере, предоставить рекомендацию для покупки), и предлагается обратиться за помощью к местному персоналу с этим; 6) Рисунок 6 описывает успешные извлечения тканей для некоторых экспедиций по сбору, в которых условия были ограничены.

С большим количеством людей и больше места, больше ткани могут быть собраны по-разному. Ниже приведены дополнительные протоколы, опубликованные в другом месте, что следователи должны рассмотреть, если надлежащий опыт и материалы имеются: 1) летучая мышь метаболом, или все выведенные низкомолекулярные метаболиты веса клеток и тканей, может обеспечить понимание исключительной долголетия летучей мыши или спячки и метаболических требований полета. Кровь должна быть собрана из легко доступного кровеносных сосудов, таких как лодыжки вены, в флакон с гепарином48, и фекальные образцы должны быть заморожены в LN249; 2) иммуномика, или реакция животного на патогенные микроорганизмы, могут быть проанализированы, принимая бедренной кости и humeri и размещение их в ткани культуры решение культуры макрофагов вниз по течению50; 3) фекалии могут быть полезны для двух типов ниже по течению нуклеиновой кислоты на основе анализов, таких как определение диеты51 и зондирования микрофлоры кишечника52,53,54. В обоих случаях реагенты, такие как тканевый стабилизирующий раствор, уменьшают деградацию редких вариантов, присутствующих в кале; 4) липидомика, или фосфолипид репертуара ткани типа, был выявление в понимании белоноса синдром грибкового патогена55,56. Препарат ткани предлагается заморозить сразу после вскрытия.

Ткань архивы для Bat1K
Bat1K стремится поддерживать банк тканей каждой отдельной летучей мыши, который используется для генерации геномов. В настоящее время эти банки тканей и соответствующие фенотипические и экологические данные, собранные на одного человека, хранятся в лабораториях/музейных коллекциях участников Bat1K. По мере продвижения проекта, Bat1K будет централизовать и поддерживать коллекции тканей и соответствующие базы данных через сетевые хранилища, такие как Глобальная сеть биоразнообразия генома

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Центр о экологии у Биодиверсидад CEBIO, Эрика Пализа, Милуска Санчес, Хорхе Каррера, Эдгар Ренгифо Васкес, Гарольд Порокарреро Зарриа, Хорхе Руис Лево, Хайме Печеко Кастильо, Карлос Тельо, Фанни Корнехо, и Фанни Фернандес коллекции в Перу возможно. Мы также благодарим всех членов Grupo Jaragua и Иоланда Леон для принятия сбора тканей в Доминиканской Республике возможно, а также Бернал Родригес Эрнандес, Бернал Matarrita, и все в Ла-Сельва биологических исследований станции в Коста-Рике, для принятия выборка возможна. Мы благодарим Элла Lattenkamp и Лутц Wiegrebe для доступа и выборки коллекции крыльев ударов от Phyllostomus обесцвечивать летучих мышей для генерации клеточной культуры. Филлостома разложенные летучие мыши возникли из племенной колонии на кафедре биологии II Университета Людвига-Максимилиана в Мюнхене. Разрешение на хранение и разведение летучих мышей было выдано Мюнхенской районной ветеринарной службой. LMD, SJR, KTJD и LRY финансировались NSF-DEB 1442142. LMD финансировался NSF-DEB 1838273. LRY финансировался NSF-PRFB 1812035. SCV и PD финансировались премией исследовательской группы Макса Планка и научно-исследовательской программой «Человеческие границы» (HFSP) (RGP0058/2016). SJR, JHTP и KTJD финансировались Европейским исследовательским советом (ERC Starting grant 310482 «EVOGENO»), присужденном SJR, ECT финансировалась за счет гранта Европейского исследовательского совета (ERC-2012-StG311000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes Fischer Scientific 10509691 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes Sarstedt 62,554,002 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials Thomas Scientific 1154P75 cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punch Medline MIL3332 wing biopsy punch for cell culture
6 well plate Greiner 83,392 Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent Qiagen 76405 for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber Bio-Rad 145-0011 Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IV Stemcell Technologies 7909 For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-5X5ML Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 12491-015 culture media
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190169 Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS) Fischer Scientific 10270106 Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt Sigma Aldrich G1264-250MG Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0050 Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILM Sigma P7793 Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x Invitrogen 15140130 Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 Thermo Fisher 10010023 salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlater Thermo Fisher AM7021 RNA stabilizing solution
RNAse away Genetech 83931-250mL breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel Fisher Scientific 7631-86-9 dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102 Automated cell counter
Trypan blue Bio-Rad 145-0013 Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4049 For dissociation of cells during splitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
  2. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
  3. Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
  4. Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
  5. Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
  6. Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
  7. Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
  8. Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen? Science. 323 (5911), 227 (2009).
  9. Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
  10. Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
  11. Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
  12. Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
  13. Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  14. Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
  15. Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
  16. Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
  17. Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
  18. Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
  19. Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
  20. Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
  21. Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
  22. Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
  23. Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
  24. Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
  26. Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
  27. Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
  28. Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  29. Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
  30. Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
  31. Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
  32. Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
  33. Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
  34. Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
  35. Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
  36. Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
  37. Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , Museum of Texas Tech University. (2003).
  38. Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
  39. Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
  40. Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
  41. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
  42. Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
  43. Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
  44. Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
  45. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
  46. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Schaumburg, IL. (2013).
  47. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
  48. Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  49. Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
  50. Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
  51. Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
  52. Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
  53. Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
  54. Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity? PeerJ. 6, e4174 (2018).
  55. Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
  56. Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).

Tags

Биология Выпуск 152 летучие мыши геномика транскриптомика выборка тканей сохранение тканей вскрытие клеточная культура
Ткань Коллекция летучих мышей для -Омики анализ и первичной культуры клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. … More

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. T. J., Potter, J. H. T., Rossiter, S. J., Teeling, E. C., Vernes, S. C., Dávalos, L. M. Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (152), e59505, doi:10.3791/59505 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter