Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vävnads insamling av fladdermöss för-omics-analyser och primär cell kultur

Published: October 23, 2019 doi: 10.3791/59505
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 4, 5, *3,6, *2,7
1Department of Geology & Geophysics, Yale University, 2Department of Ecology & Evolution, Stony Brook University, 3Neurogenetics of Vocal Communication, Max Planck Institute for Psycholinguistics, 4School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London, 5School of Biology & Environmental Science, University College Dublin, 6Donders Institute for Brain, Cognition and Behavior, 7Consortium for Inter-Disciplinary Environmental Research, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Summary

Detta är ett protokoll för optimal vävnads beredning för genomisk, transkriptomisk och proteomisk analys av fladdermöss som fångats i naturen. Den innehåller protokoll för BAT fånga och dissektion, vävnad bevarande, och cellodling av BAT vävnad.

Abstract

I och med att sekvenstekniker med hög kapacitet avancerar kan standardiserade metoder för vävnads anskaffning och bevarande av hög kvalitet möjliggöra en utvidgning av dessa metoder till icke-modellorganismer. En serie protokoll för att optimera vävnads insamling från fladdermöss har utvecklats för en rad sekvenserings metoder med höga dataflöden. Beskrivs här är protokoll för fångst av fladdermöss, önskad demografi som ska samlas in för varje bat, och optimerade metoder för att minimera stress på en fladdermus vid vävnads insamling. Specifikt beskrivs metoder för att samla in och behandla vävnad för att erhålla (i) DNA för högmolekylära genomiska analyser, (II) RNA för vävnadsspecifika transkriptomer, och (III) proteiner för proteomisk nivå analyser. Slutligen, också beskrivs är en metod för att undvika dödliga provtagning genom att skapa livskraftiga primära cellkulturer från Wing klipp. En central motivation av dessa metoder är att maximera mängden potentiella molekylära och morfologiska data för varje bat och föreslå optimala sätt att bevara vävnader så att de behåller sitt värde som nya metoder utvecklas i framtiden. Denna standardisering har blivit särskilt viktig eftersom initiativ för att sekvensera kromosomnivå, felfria genomar av arter över hela världen har uppstått, där flera vetenskapliga partier går i spetsen för sekvenseringen av olika taxonomiska Grupper. De protokoll som beskrivs häri definierar den idealiska vävnad insamling och vävnads Bevarandemetoder för Bat1K, konsortiet som sekvenserar genomen av varje art av fladdermus.

Introduction

Hög dataflöde sekvensering (HTS) metoder har snabbt avancerade i effektivitet och minskade i kostnad, och det är nu möjligt att skala dessa metoder till hundratals eller tusentals exempel. Insikter erhållna genom tillämpning av dessa tekniker har enorma effekter över flera vetenskapliga discipliner, från biomedicin till evolution och ekologi1,2,3. Men många HTS applikationer förlitar sig kritiskt på hög kvalitet nukleinsyror från en levande källa. Denna begränsning kommer sannolikt att bli alltmer problematiskt med utvecklingen av tredje generationens sekvensering baserad på långlästa molekyler4. Av dessa skäl finns det ett behov av att inrikta insatserna på att fastställa bästa praxis för insamling av färska vävnadsprover från vilda organismer utanför laboratoriet, vilket maximerar nyttan av materialet och minskar antalet individer som behöver Samlas in.

Bat1K är ett internationellt konsortium av forskare med ett pågående initiativ för att sekvensera genomet av varje art av fladdermus till kromosomnivå församling5. Fladdermöss representerar 20% av däggdjurs mångfalden och har exceptionella anpassningar som har betydelse för förståelsen av åldrande, sjukdoms ekologi, sensorisk biologi och metabolism5,6. Många fladdermöss är också hotade eller hotade på grund av mänsklig exploatering7 eller snabbt minskar på grund av patogener8,9, och genom-nivå sekvensering är av stor betydelse för bevarandet av dessa arter. Även om Bat1K för närvarande syftar till att sekvensera arvsmassan hos alla fladdermöss, är standardiseringen av insamling av vävnadsprover för högkvalitativ genomisk sekvensering fortfarande en central utmaning i hela gemenskapen av organismers biologer. Förutom genomiska data kräver funktionell förståelse av mångfalden av BAT-anpassningar vävnadsspecifika transkriptome-och protein analyser, som ofta kräver separata insamlings protokoll. Dessutom, liksom för alla taxonomiska grupper, samtidigt som optimal vävnads insamling och bevarande är avgörande för att erhålla data av högsta kvalitet för-omics-analyser, är det ofta svårt att kommunicera bästa praxis på grund av snabbt föränderliga teknologier och flera forskargrupper som arbetar självständigt.

Behovet av att anta bästa praxis för forskning om BAT-omics är särskilt brådskande med tanke på att många fladdermusarter är sällsynta eller hotade. Till skillnad från andra små däggdjur som gnagare och nävar, fladdermöss är långlivade, som hänför sig till exceptionella mekanismer DNA-reparation10 och långsam reproduktion11, med de flesta arter som föder bara en eller (i några fall) två unga per år. Av dessa skäl, fladdermöss populationer kan vara långsam att återhämta sig från störningar, och samla in många individer från naturen är varken tillrådligt eller genomförbart. Med andra ord måste protokollen optimeras för att erhålla den maximala mängden data för ett enda prov, vilket minskar behovet av att i onödan replikera provtagnings insatserna.

Här fokuserar detta protokoll specifikt på standardiserade metoder för insamling och provtagning av BAT-vävnad för genomisk och transkriptomisk sekvensering och protein analyser. Dess högsta prioritet är att se till att bat-vävnaderna samlas in på ett etiskt och ansvarsfullt sätt, alltifrån tillståndsprocessen för insamling, export av vävnader till minimering av stress till djuret och långtidslagring. Utarbetade dissektioner har utvecklats i syfte att framtidssäkra nyttan av olika material som samlats in. Detta manuskript ger en steg-för-steg-guide för att samla fladdermöss på ett humant sätt som är avsett att minimera påverkan på populationer och maximera vetenskapligt värde. Medan fokus för detta protokoll är specifikt för användning i fladdermöss, är många av stegen relevanta för andra arter av ryggradsdjur, särskilt däggdjur.

Översikt över vävnads insamling
Förfarandet för insamling av vävnader, inklusive temperaturen för lagring och valet av konserveringsmedel, kommer att bestämmas av arten av de planerade analyser som planeras i efterföljande led. Det rekommenderas dock starkt att, när det är möjligt, vävnad samlas in under en rad metoder för att maximera dess framtida nytta även om ingen specifik analys planeras. I allmänhet, vävnad samlas in och bevaras för efterföljande analyser av antingen nukleinsyror (DNA och RNA), eller protein. För vart och ett av dessa tillämpningar kan vävnaden bevaras optimalt genom direkt blixt nedfrysning i flytande kväve (LN2). Dock är omedelbar nedsänkning i LN2 inte alltid möjligt på fältet. Som teknik framsteg, resurser såsom specialiserade flaskor för att lagra DNA och RNA vid omgivningstemperaturer blir mer lättillgängliga. Även om vi inte har validerat alla sådana material i detta protokoll, uppmuntrar vi andra forskare att jämförelsevis analysera resultatet av nya material i förhållande till vad vi presenterar här. Vi tillhandahåller metoder för att helst bevara vävnad för olika tillämpningar i situationer där LN2 inte kan nås, till exempel när LN2 transport inte är möjlig på grund av platsåtkomst via litet flygplan i Amazonas. Dessutom tillhandahåller vi en metod för att samla in vävnad från vilka levande celler kan odlas och spridas. Nedan beskriver vi viktiga överväganden för insamling av material för vart och ett av dessa respektive ändamål och en översikt över insamlingsmetoder ges i tabell 1.

Vävnad för DNA
För all skördad vävnad som samlats in, kommer lagringsmediet avgöra om det kan användas för antingen standard eller hög molekylvikt (HMW) DNA-extraktion. HMW krävs för lång läsning sekvensering och för närvarande krävs för att generera kromosomnivå arvsmassa sammansättningar, eller en "Platinum standard" genomet. Låg molekylvikt (LMW) DNA kan extraheras från Flash fryst, AllProtect (hädanefter kallad "Tissue stabiliserande lösning"), eller till och med RNAlater (hädanefter "RNA stabiliserande lösning")-konserverade prover (även om Flash frysta prover förblir optimala ). DNA som isolerats av standardiserade laboratoriemetoder (t. ex. kiselgel membran spinn pelare, fenol-kloroform) kan fortfarande ge DNA-fragment på upp till ~ 20 kilobaser (KB). Därför, förutsatt att det finns tillräcklig avkastning, denna form av isolerade DNA kan användas för enstaka skär storlek bibliotek förberedelse, där insatsen storlek är ofta ~ 500 Base-par (BP), och kort sekvens läsningar av ~ 100 BP genereras12. Detta DNA är särskilt användbart för "resekvensering" projekt eller studier där fullängds kromosomala data inte krävs. HMW DNA (10-150 kB) är mer utmanande och kan endast fås på ett tillförlitligt sätt med hjälp av vävnad som snabbt har Blixts fryst i LN2 efter skörd och underhålls vid ett maximum av-80 ° c till extraktion.

Låg molekylvikt eller fragmenterat DNA är ofta tillräckligt för riktade metoder, inklusive genamplifiering via PCR och kortläst sekvensering13. PCR-baserade undersökningar som använder LMW-DNA som endast riktar sig till en eller några få gener har varit mycket informativa i förståelsen av anpassning och den molekylära utvecklingen av fladdermussensorisk biologi6,14, fysiologi15, fylogenetik 5,16, och bevarande17,18. Framgångsrik riktad sekvens återbildning av låg molekylvikt och fragmenterad DNA har också visats för många ryggradsdjur grupper, inklusive fladdermöss19. Dessa metoder är ofta kostnadseffektiva och minimalt invasiva till bat, som fekal prover och icke-dödande vävnad provtagning via buckala svabbbarna eller vingar biopsi stansar är också vanliga sätt att få DNA för låg molekylvikt analyser20, 21.

Kvaliteten beror dock i hög grad på vilken typ av media som provet är lagrat i22. Efter systematiska och kvantitativa jämförelser av buckala kompresser och biopsi stansar, vinge biopsi stämplingar har visat sig ge genomgående högre nivåer av DNA och var mindre stressande att bat under samling22. Dessa jämförelser visade också att de bästa resultaten erhölls när vingslag var bevarad i indikator kiseldioxid (dvs, en typ av torkmedel av kiselgel pärlor som ändrar färg när fukt observeras) snarare än i andra populära lagringsmedia såsom etanol eller DMSO22; även andra lagringsmedia inklusive vävnads stabilisering lösning inte undersökts. Wing stansar kan också användas för att odla fibroblastceller i kulturen, såsom i Kacprzyk et al.23 och som beskrivs nedan (se avsnitt 6). För dessa metoder bör vinge eller uropatagium utökas försiktigt, och en ren biopsi Punch, typiskt 3 mm i diameter, bör användas för att få provet. Detta tillvägagångssätt verkar orsaka någon bestående skada, med ärr läkning över inom veckor i de flesta fall24.

HMW DNA (10-150 kB) är mer utmanande och är för närvarande endast tillförlitligt erhålls med hjälp av vävnad som har snabbt blinkar fryst i LN2 efter skörd och upprätthålls vid ett maximum av-80 ° c till extraktion. HMW DNA (10-150 kB) är avgörande för lång-läsa DNA-sekvensering och därför för de Novo genommontering. I själva verket, medan de flesta kommersiella Kit kan användas för att isolera vissa standard HMW DNA, de resulterande molekyl storlekar ofta inte uppfyller kraven i tredje generationens sekvenserings teknik [t. ex. de som lanserades av företag som Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, och 10X genomik, eller genom monteringsmetoder som erbjuds av Bionano Genomics eller dovetail Genomics]. Som sådan, det finns en ny efterfrågan på "Ultra HMW" DNA (> 150 kB). När du skaffar Ultra HMW DNA från fladdermöss, färska prover av lever, hjärna, eller muskler är alla lämpliga, men dessa måste omedelbart blinka fryst i LN2 utan någon lagringbuffert eller cryoprotectant. En fullständig beskrivning av dessa steg ligger utanför tillämpningsområdet för detta dokument, men finns på andra ställen25.

Vävnad för RNA
RNA är en enkelsträngad molekyl som är mindre stabil än DNA. Även om det finns många former av RNA,-omics analyser tenderar att fokusera på mRNA (Messenger RNA) och små RNAs (t. ex. microRNAs). Efter transkription, är mRNA skarvas för att bilda en mogen avskrift som inte innehåller några introner och representerar kodnings delen av gener/genomer. Kodninggener står för en bråkdel av genomets storlek (1%-2%), vilket gör målgruppen mRNA till ett kostnadseffektivt sätt att erhålla sekvensdata för gener. MicroRNAs är en klass av RNAs som reglerar processen för översättning av mRNA till proteiner och är därmed viktiga regulatoriska effektorer. RNA-utskrifter kan sekvenseras individuellt, eller mer allmänt för-omics analyser26,27,28,29,30, som en del av en transkriptome; det vill, summan av alla RNA-transkriptioner som finns i ett givet prov.

Sekvensering kan utföras efter flera metoder (dvs. via kortlästa RNA-SEQ eller långlästa hela isoform SEQ), vilket möjliggör analys av både RNA-överflöd och isoform-användning. Eftersom mängden och mångfalden av mRNA-transkriptioner varierar mellan celler och vävnader gör RNA-sekvenseringen det möjligt att studera och jämföra genuttryck och reglering över prover. Intresset för att sekvensera små RNAs och hela isoform sekvensering växer, eftersom dessa metoder blir allt mer biologiskt informativ. Beredning av vävnadsprover för att sekvensera olika klasser av RNA kan utföras på samma sätt som presenteras i detta manuskript, med endast de efterföljande extraktionsmetoderna skiljer31,32. Slutligen, eftersom transkriptom erbjuder en hög täckning delmängd av protein-kodning arvsmassan, den sammansatta datauppsättningen kan vara användbar i genommontering och anteckning, vilket gör insamling av RNA-SEQ data över en rad olika vävnader en viktig del av Bat1K initiativ.

I motsats till DNA, RNA är kemiskt instabil och även riktad av RNase enzymer, som är ubiquitously närvarande i vävnad celllysat som en defensiv strategi mot RNA-baserade virus. Av dessa skäl börjar RNA-fraktionen i celler och vävnader att brytas ned kort efter provtagnings-och/eller dödshjälp. Att bevara RNA kräver därför åtgärder för att förhindra dess nedbrytning. Detta innebär vanligtvis att bevara nyinsamlad vävnad vid 4 ° c i ett stabiliserande medel såsom RNA stabiliserande lösning för att inaktivera de RNases naturligt i vävnader, följt av frysning för längre sikt lagring. Som ett föredras alternativ, kan vävnad vara Flash fryst i LN2; även som nämnts ovan, transporterar LN2 in i fältet och bibehålla nivåer för att förhindra att vävnaden upptinning kan vara logistiskt utmanande.

Vävnad för protein
Protein sammansättning och relativ överflöd varierar mellan celler och vävnader på ett liknande sätt som diskuterades för RNA; proteiner är dock i genomsnitt stabilare än RNA. Protein identifiering med proteomik matchar vanligtvis en bråkdel av, och inte hela, proteinsekvensen, men den kan tillhandahålla information om uttryck över vävnader och karakterisera patogener närvarande. Eftersom många proteinsekvenser bevaras över däggdjur, kan bat prover för proteomik lätt kontamineras med bevarade mänskliga proteiner, kräver sterila protokoll (t. ex. handskar, pincett) under insamling. Medan Flash-frysning i LN2 är det bästa sättet att förhindra nedbrytning av proteiner, användning av torris,-20 ° c frysar, och även is är lämpliga om det inte finns några andra medel. När temperaturerna ökar stiger också risken för differential proteinnedbrytning. Stabiliserande medel såsom vävnads stabilisering lösning är effektiva för att bevara proteinfraktion av vävnader vid rumstemperatur och är lämpliga för korttids bevarande (upp till en vecka) när blixten fryser inte är lönsamt.

Den enzymatiska profilen för en given vävnad påverkar direkt bevarandet av proteinet däri. Vävnader med låg enzymatisk aktivitet såsom muskler kan bevara protein profiler även vid högre temperaturer i ett hushåll frys. Däremot är levervävnad enzymatiskt reaktiv, och dess proteiner har högre sannolikheter för förnedrande under beredning. Det ökande antalet protokoll för att erhålla mänskliga proteomiska profiler från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) prover tyder på att PARAFORMALDEHYD fastställande av vävnader har löfte om låg kostnad protein bevarande när frysning vid insamling är inte genomförbar33,34. Även om det är mycket beroende av bevarandetid och tillstånd, proteiner har identifierats via immunohistokemi från formalin-fasta, etanol-konserverade bat exemplar35. Denna metod är inte skalbar till proteomic-nivåprovtagning men belyser potentialen för formalin-fasta bat-vävnader att ge protein profiler när blixt nedfrysningen inte är tillgänglig och andra stabiliserande medel är för kostsamma.

Vävnad för cellodling
Provtagning vävnad och blixt-frysning erbjuder en ändlig mängd material som skall användas, och när materialet används, är det inte längre tillgänglig. Alternativt, cellkulturer ger levande celler som omedelbart kan användas eller bevaras för framtida studier. Kulturer underlättar också expansion av celler för att öka avkastningen när vävnadsprover är små. Det är särskilt användbart i fall där vävnads insamling är begränsad, såsom experiment med sällsynta arter där icke-dödande provtagning är viktigt och därför har stora konsekvenser för bevarandet. Beskrivs är ett protokoll där cellkultur är möjligt via icke-dödande provtagning av Ving membran vävnad, men odling är möjlig med flera vävnadstyper36,37. Det protokoll som anges här väljer för adherenta celler. Kombinationen av källa vävnad och tillväxt medier som används gör detta protokoll lämpar sig för att välja och odla fibroblaster, men om så önskas, kan alternativa protokoll användas för att välja för andra celltyper. I samband med projektet Bat1K förutspås det att för sällsynta och hotade arter, är icke-dödande provtagning av Ving membran och expansion av prover genom odling viktigt att generera den volym av DNA som behövs för de många tekniker som används5 .

Bat Capture
Alla som hanterar fladdermöss bör utbildas av en bat-kompetent forskare och vaccineras mot rabies med en serie före exponerings injektioner. Om biten, en ytterligare serie av efter exponering injektioner är fortfarande nödvändigt. Standard metoder för att fånga fladdermöss är bland annat dim nät (figur 1) och Harpan (figur 2). Mist Nets används oftast och är idealiska för områden med låg till måttlig aktivitet, eftersom de kräver mest omsorg för att minimera bat nöd. Små fladdermöss är särskilt sårbara och kan dö av stress om de inte tenderade att snabbt. Täta netto inspektioner minimerar bat-skador och dödlighet samt skador på dimnätet. Denna detalj är viktig eftersom en ordentlig vävnads uppsamling kräver att vävnaden är fräsch, och olämplig uppmärksamhet på dimnäten i fladdermöss kan leda till onödig dödlighet eller förtida dödlighet innan forskaren kan bearbeta prover på rätt sätt. Eftersom flera fladdermöss kan vila i en harpa fälla med minimal nöd, är denna metod idealisk för områden med hög fladdermus aktivitet, såsom nära en grotta eller stor hönshus. Detaljerade instruktioner för korrekt hantering av fladdermöss och databehandling för insamling av morfologisk och demografisk information finns i kompletterande metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Stony Brook University (protokoll #2013-2034).

1. dödshjälp

  1. Fukta en bomullstuss med en isofluran bedövningsmedel eller annan tillgänglig bedövningsmedel.
  2. Placera bomullstuss i en återförslutningsbar, lufttät plastpåse. Påsen bör vara tillräckligt stor för att hålla en påse i en trasa bat väska bekvämt.
  3. Efter flera minuter att låta påsen att genomtränga med bedövningsmedel, placera en bat påse som innehåller bat i plastpåsen.
  4. Vänta flera minuter tills bat är euthanized. Fladdermöss ~ 20 g eller mindre i vikt kräver cirka 5 – 10 min. fladdermöss större än detta kan kräva upp till 20 min. Observera att längden på tiden kan också bero på permeabiliteten i BAT påsen. Det rekommenderas att använda tunnaste möjliga tyg material för att maximera spridningen av bedövningsmedlet.
  5. Kontrollera för andetag och hjärtslag för att säkerställa bat har euthanized innan dissektion börjar.

2. beredning av dissektion

  1. Behåll all instrumentering ren mellan dissektioner, med hjälp av följande protokoll.
  2. Tvätta instrument med vatten och diskmedel. Torka ner dem med 10% blekmedel, bort från dissektion området, som blekmedel kommer att bryta ner nukleinsyror.
  3. Torka ner med 70% etanol.
  4. Torka av med RNAse dekontamineringsreagens.
  5. Upprepa detta avsnitt efter varje dissektion.

3. beredning av injektionsflaskorna för vävnadsprover

  1. För RNA:
    1. Förbered alla flaskor innan du påbörjar en dissektion för att undvika förseningar.
    2. Avsätta det antal injektionsflaskor som behövs för varje preparat. Märk varje tub med den vävnadstyp som ska samlas in, samt standard identifieringsinformation för preparatet. Fyll flaskorna 50% full av RNA-stabiliserande lösning, och helst kyla till 4 ° c.
    3. Var noga med att inte fylla injektionsflaskorna helt med RNA-stabiliserande lösning, annars kan röret explodera när du placerar det i LN2. När du tar vävnadsprover, kom ihåg att stora klumpar av vävnad inte kommer att vara helt genomsyras av RNA-stabiliserande lösningen. Därför klippa vävnaden i mindre bitar av inte större än 0,5 cm i en dimension, och upprätthålla ett förhållande på minst 10:1 volym för RNA stabiliserande lösning: vävnad.
    4. Minst, dissekerade vävnader måste placeras i RNA-stabiliserande lösning, även om tillgång till LN2 eller kallt lager i otillgänglig.
  2. För DNA:
    Anmärkning:     kärn-DNA-halten är densamma för nästan alla vävnader; Därför kan sampling vara flexibelt. Det bör dock noteras att högre densiteter av mitokonbenerna i muskelvävnad kan leda till en förlust av läsningar för nukleär arvsmassa38.
    1. För DNA med låg molekylvikt, ta en eller flera replikat av Ving membranet för lagring i kiseldioxid, och/eller muskel för lagring i RNA stabiliserings lösning eller vävnads stabilisering lösning.
    2. För Ultra HMW DNA, Flash-frysa i LN2 utan någon lagring reagens, sedan överföra till långtidslagring vid-80 ° c eller kallare. Från kranial dissektion, hjärnvävnad är den lämpligaste vävnadstyp för att hämta Ultra HMW DNA39, medan från olika dissektioner, lever eller muskler är mer lämpliga40.
    3. För kranialdissektion, Använd 5 mL injektionsflaskor (i motsats till de vanliga 2 mL-flaskorna) av RNA-stabiliserande lösning för vissa vävnader. Alla injektionsflaskor ska vara kryogena. Förvara flaskorna på isen medan du dissekera.

4. kraniala dissektioner för RNA

  1. Omedelbart efter dödshjälp, halshugga preparatet med ett stort par saxar eller benskärare (figur 3).
  2. Ta bort ögonen med tång med stark nog kraft för att lossa synnerven. Placera ögonen i 2 mL injektionsflaska med RNA-stabiliserande lösning.
  3. Med hjälp av ditt verktyg för val, hud skallen från hår, fascia, och skalle muskler, inklusive huden på näsan. Var noga med att inte bryta den främre änden av näsan.
  4. Använda sax, göra en sagittal skära på den ventrala delen (figur 3) av skallen börjar vid halsen, noga med att inte skada hjärnan.
  5. Med hjälp av pinkoppar, dra försiktigt tillbaka båda sidor av skallen tills den har knäckt öppen och hjärnan är exponerad.
  6. Vid den kaudala änden av skallen bör cochleae nu vara synlig på vardera sidan av huvudet. De är små, sfäriska ben på vänster och höger sida, bara rostralt till halsen och posteriort om tuggmusklerna. Använd pinkoppar och dra försiktigt i cochleae och Lägg dem i en 2 mL injektionsflaska med RNA-stabiliserande lösning.
  7. Försiktigt skrapa hjärnan (som kommer att vara mycket mjuk) med tång. Luktbulben kommer att bli synlig, sitter vid den ventrala delen av insidan av skallen. Försök att hålla lukt glödlampa bifogas.
  8. Om luktbulben inte redan har avlägsnats, skrapa försiktigt bort vävnaden, och cribriform plattan kommer att bli uppenbar. Detta är ett kritiskt ben för att hålla forskaren orienterad. Det kan identifieras som den mest främre regionen av skallen med flera foramen och den punkt där två spår där luktbulben vilar.
  9. Om möjligt, hålla hjärn formen intakt och omedelbart placera på torris för att hålla formen eller i en 5 mL injektionsflaska med RNA-stabiliserande lösning. Om immunohistokemi ska göras på hjärnan, placera i 4% paraformaldehyd, om tillgängligt.
  10. Gör två snitt där den övre och nedre käken gå, och ta bort underkäken.
  11. När mandibeln har avlägsnats, ta bort talarstol (överkäken) från den resterande delen av skallen. Se till att käken inkluderar cribriform plattan.
  12. Placera näsan i RNA-stabiliserande lösning och förvara vid 4 ° c över natten. Eftersom detta är en tät vävnad, det kräver tid att tillåta RNA stabiliserande lösning att genomtränga hela vävnaden.
  13. Placera näs flaskan i LN2 efter nattblöt i RNA-stabiliserande lösning.
  14. Från nedre underkäken, skär tungan med sax och placera i en 2 mL flaska med RNA för senare.
  15. Detta protokoll förverkat det mesta av skallen. Tänder, särskilt de från underkäken, kan återvinnas och kan vara användbara för arter diagnostik. Benvävnad kan förvaras i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).

5. postcranial dissektioner för RNA

  1. Använd en skalpell för att tränga igenom bukhålan, vilket gör ett längsgående snitt upp till revbenen (figur 3). Detta förverkat skelett ramen. Om ben ska bevaras, noggrant dissekera från huden i muskler och förvara i 1x PBS efter mjuk vävnad dissektion är klar.
  2. Remsor huden för att avslöja bröstmuskeln, ta minst två prover av muskler, en för RNA stabiliserande lösning och en att förbli frysta för HMW DNA, placera omedelbart i en flaska att sätta i LN2.
  3. Skär genom bröstbenet och dra bort revbenen för att samla in prover från lungan.
  4. Samla hjärtat, som kan tas hela men bör sektioneras i halvor, så RNA stabiliserande lösningen suger ordentligt.
  5. Ta prover från levern. Ta minst två prover av levern, en att förbli fryst för HMW DNA, placera omedelbart i en tom flaska att sätta i LN2. Levern är mycket enzymatisk, och det är viktigt att göra proverna tillräckligt små för RNA stabiliserande lösningen att helt suga in.
  6. Den hepatiska kanalen, som fungerar för att dränera galla från levern, förbinder levern till bukspottkörteln och tunntarm. Detta fartyg är lätt att identifiera genom att sondera sämre/bakre delen av levern och spåra fartyget i en bakre sätt. Kanalen är ofta en grönaktig färg, samt. Följ den hepatiska kanalen för att hitta bukspottkörteln och gallblåsan och samla in dessa separat. I respektive injektionsflaskor med RNA-stabiliserande lösning.
  7. Samla magen och, bredvid den, vid dess bas och visas som en annan nyans av lila, är fjäder-liknande mjälte. Bukspottkörteln bör också synas här som en vit struktur (figur 3). I respektive injektionsflaskor med RNA-stabiliserande lösning.
  8. Samla små prover av små och stora tarmen. I respektive injektionsflaskor med RNA-stabiliserande lösning. Tarmarna kan också screenas för endoparasiten. Om en parasitolog är i området, en inspektion för parasiter kan utföras. Om detta ska göras vid ett senare tillfälle, kan hela tarmen tas i en 5 mL kryogen injektionsflaska.
  9. Ta en av njurarna och följ deras kanaler till urinblåsan. I respektive injektionsflaskor med RNA-stabiliserande lösning.
  10. Använd den andra njuren som en guide för att hitta testiklarna (om man) eller livmodern och genom den äggstockarna (om kvinnor). Samla in en eller båda gonaderna, om möjligt.
  11. Håll prover av olika delar av huden på vingen i separata flaskor (muskulös kontra icke muskulös del).

6. insamling och beredning av vävnadskulturer

  1. Förbered tillväxtmedium för cellerna genom att göra upp Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 20% foster bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S), och 50 μg/mL gentamycin. Aliquots av tillväxtmedia bör göras färskt varje dag i protokollet.
  2. Efter uppsamling måste Ving biopsin stansar placeras direkt i 1 mL kallt odlingssubstrat i ett väl tillsluten 1,5 mL centrifug tub. Linda röret i parafilm för att täta.
  3. Rören skall sedan transporteras i en låda av polystyren med kylelement för att hålla proverna vid 4 ° c. Transporter bör påskyndas. även friska celler kan göras från stansar som har lagrats på detta sätt i upp till 6 dagar men mindre optimalt23.
  4. När transporteras till vävnad kultur anläggning, kan följande protokoll användas för att generera cellkulturer. Standardsterila tekniker bör användas för resten av protokollet41.

7. dag 1 vävnadsodling: dissociation av vävnad

  1. Överför innehållet i röret (odlingsmedium som innehåller Ving membranbiopsi) till ett 15 mL koniskt centrifugeringsrör.
  2. Ta försiktigt bort odlingsmediet. Tvätta försiktigt biopsin två gånger med 500 μL steril PBS.
  3. Tillsätt 500 μL kollagenase IV (1 mg/mL) till röret. Detta kommer att orsaka nedbrytning av vävnaden i enskilda celler.
  4. Inkubera över natten (max 16 h) vid 37 ° c utan agitation.

8. dag 2 vävnad kultur: plating celler

  1. Gör upp färsk odlingssubstrat och värm den till 37 ° c.
  2. Förbered en 6 brunn vävnad kultur plattan genom att tillsätta 2 mL färskt, förvärmda odlingssubstrat i varje brunn av plattan som skall användas (1 brunn per 3 mm vinge biopsi). Förvara denna platta i en 37 ° c och 5% CO2 inkubator tills det behövs (steg 8,7).
  3. Ta bort 15 mL-röret som innehåller cellerna från inkubatorn och släcka digestionsreaktionen genom att tillsätta 1 mL färskt odlingsmedium (förvärmning till 37 ° c).
  4. Omsuspendera cellerna genom att försiktigt triturera lösningen med en P1000 pipettspets för att uppnå en enda cellsuspension.
  5. Snurra försiktigt ner cellerna i en bordsskiva centrifug i 3 min vid 300 x g.
    Anmärkning: Små bitar av vävnad kan fortfarande vara synlig antingen i suspensionen eller fästas på väggen i 15 mL röret. Men detta påverkar inte cellsuspensionen förberedelse
  6. Kassera supernatanten genom att försiktigt ta bort 80% – 90% av vätskan med en P1000 pipett.
    Anmärkning: om den fortfarande är synlig, kassera inte vävnads delen och försiktigt triturera den i nästa steg (8,7).
  7. Omsuspendera pelleten i 500 μL av det förvärmda tillväxt mediet, försiktigt triturera suspensionen för att säkerställa att pelleten eller stora fragment av pelleten inte längre är synliga och att cellerna är tillräckligt suspenderade. Medierna kan se grumlig på grund av närvaron av celler.
    Anmärkning: I detta skede kan ett livskraftigt cellantal utföras för att bedöma kvaliteten på cellerna suspension och avkastning av celler som härrör från Ving klämman (se steg 10,11 för mer information).
  8. Pipettera försiktigt hela volymen av cellsuspensionen till en enda brunn på en 6 brunn tallrik.
    Anmärkning: Utför ovanstående steg omedelbart och Tillåt inte att celler sedimentera efter steg 8,7. Använd en pipett för att försiktigt fördela cellsuspensionen över ytan av brunnen på ett droppvis sätt. Inte Pipettera hela lösningen i mitten av brunnen, eftersom detta skulle resultera i att cellerna klumpar i mitten av brunnen.
    Notera: om vävnads biten fortfarande är synlig, överför den inte till odlings kärlet väl.
  9. Försiktigt klippa plattan från sida till sida och fram-till-back 2x-3x för att hjälpa celler fördela över brunnen ytan i ett enda lager.
  10. Kontrollera de pläterade cellerna under mikroskopet, eftersom de bör vara enstaka celler som visas balled upp och flytande men mycket tät.
  11. Placera plattan försiktigt i en inkubator förinställt till 37 ° c och 5% CO2.
  12. Efter ~ 24 h, Observera cellerna under mikroskop för att bestämma hälsan hos kulturen. Celler ska nu fästas på plattytan och verka tillplattade (figur 4a). Olika celltyper kan vara synlig i kulturen när man tittar genom mikroskopet.
  13. Det kommer sannolikt att finnas några flytande celler som inte har bifogat. En del av dessa celler är döda. Om det finns en hög andel flytande celler synliga i brunnen, bör medierna uppdateras. I detta fall, försiktigt aspirera ~ 50% av mediet från brunnen och försiktigt tillsätt 1 mL förvärmda tillväxtmedium på sidan av brunnen för att inte störa cellerna.
  14. Underhålla cellerna i en inkubator förinställt till 37 ° c och 5% CO2. Celler bör observeras under Mikroskop regelbundet (men inte mer än en gång om dagen) för att avgöra behovet av media förfriskning eller uppdelning.
    Anmärkning: När celler är nyligen pläterade, de kommer att dela snabbt och så bör kontrolleras varje dag. Efter en tid i kulturen, tillväxten kommer att sakta, och de kan kontrolleras varje 48 – 72 h.

9. uppfriskande Media

  1. Kontrollera cellerna under mikroskopet regelbundet för att iaktta deras tillväxt och kvalitet i kulturen. Övervaka färgen på mediet som en indikator på dess kvalitet. Celler bör finnas kvar i samma media i högst 3 dagar eller tills passaging är nödvändigt, beroende på vilket som inträffar först.
    1. Om celler växer snabbt och utmattande media, detta kommer också att vara synlig för ögat, som färgen på mediet kommer att vända från rött till gult.
  2. Närhelst nödvändigt försiktigt aspirera ~ 50% av mediet från brunnen och försiktigt lägga ungefär samma volym förvärmda tillväxtmedium till sidan av brunnen för att inte störa cellerna.
  3. Returnera cellerna till 37 ° c och 5% CO2 inkubator.

10. passaging celler

  1. Passaging celler hänvisar till att ta en befintlig kultur och dela upp den i nya brunnar. Passaging bör ske när cellerna är ~ 80% konfluenta [dvs, när de upptar ~ 80% av ytan av brunnen och endast ~ 20% av plasten är fortfarande synlig som luckor (figur 4b)].
  2. Försiktigt aspirera och kassera ~ 90% av odlingsmediet.
  3. Tvätta cellerna mycket försiktigt genom att tillsätta 1 mL steril PBS till väggen i brunnen för att inte störa cellerna. Försiktigt klippa plattan fram och tillbaka och sida till sida 2x-3x. Försiktigt aspirera och kassera alla PBS från plattan.
  4. Upprepa steg 10,3 för att tvätta cellerna igen.
  5. Tillsätt försiktigt 250 μL trypsin-EDTA (Sigma Aldrich, Cat #T4049) till brunnen och inkubera i 1,5 minuter vid rumstemperatur.
    Anmärkning: Se till att trypsin-EDTA-lösningen täcker hela ytan av brunnen genom att försiktigt gunga plattan.
  6. Släcka reaktionen genom att tillsätta 1 mL färskt förvärmda odlingssubstrat.
  7. Pipettera upp och ner ~ 5x för att tvätta cellerna från ytan av plattan och se till att cellerna är i suspension.
    Anmärkning: Lösningen ska bli grumlig på grund av närvaron av cellerna.
  8. Placera cellsuspensionen i en 15 mL tub och snurra ner cellerna i en bordsskiva centrifug i 3 min vid 300 x g.
  9. Kassera supernatanten genom att försiktigt ta bort 80% – 90% av vätskan med en P1000 pipett.
  10. Omsuspendera pelleten i 1 mL förvärmda odlingssubstrat och försiktigt triturera suspensionen. Se till att pelleten eller stora fragment av pelleten inte längre är synliga, och celler är i en enda cellsuspension.
  11. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cell räknare som beskrivs här, eller manuellt med hjälp av en hemocytometern som beskrivs i detalj i Reference video42. Blanda en 10 μL alikvot av de suspenderade cellerna 1:1 med Trypan Blue för att detektera livskraftiga celler.
  12. Inkubera i 1 min och Pipettera 10 μL av lösningen på räkneglaset. Infoga inventerings bilden i en automatiserad cell räknare för att räkna cellerna med hjälp av lämpliga inställningar. Avkastningen bör vara runt 1 – 2 miljoner celler från en konflytande enkel brunn av en 6 väl tallrik, även om detta kan variera beroende på storleken på celler och arter. Om cellerna inte är i en enda cellsuspension kommer antalet celler inte att vara korrekt.
  13. Dessa cellkulturer kommer i allmänhet att tolerera en 1:2 Split [dvs., en konflytande brunn av celler kan delas upp i två nya brunnar (totalt)]. För att göra detta, försiktigt hackad cellerna igen, sedan ta cellsuspensionen i två halvor (~ 730 μl vardera) och placera dem i var och en av två nya brunnar som innehåller 750 μl av förvärmda tillväxtmedium i droppvis mode.
    Anmärkning: Efter 2 – 3 dagar ska brunnarna vara konfluenta och åter klara för klyvning. Vid denna punkt, det rekommenderas att bevara en brunn av celler med det klara sig frysning protokollet (avsnitt 11). Ytterligare lager av celler kan frysas under ytterligare passager som önskvärt.
    Anmärkning: Efter ~ 6 passager, cellerna tenderar att träda åldras och kommer inte längre att dela. Detta är en indikation på att cellerna inte längre kan delas eller expanderas för att öka cell nummer. Detta är också en indikation på att cellerna inte kommer att vara lönsamt för mycket längre.

11. frysning livskraftiga levande celler

  1. Förbered frysning Media genom att kombinera DMEM med 20% FBS, 10% DMSO, 1% P/S, och 50 μg/mL gentamycin.
  2. Frysning utförs genom att ta celler inblandning pelleterat enligt passaging processen. Pelleten bör förberedas från en 80% – 90% konfluenta brunn på en 6 brunn tallrik (representerar ~ 1 – 2 miljoner celler), enligt steg 8.1 – 8.9.
  3. Omsuspendera pelleten i 1,5 mL frys medium.
  4. Placera ~ 750 μL cellsuspension i var och en av två separata kryovials.
  5. Placera injektionsflaskorna i en kryogen frys behållare, vilket resulterar i att cellerna fryser långsamt för att bibehålla cellernas vitalitet. Placera dem omedelbart i-80 ° c.
  6. Efter 24 – 48 h, överför cryovials av celler till LN2 för långtidslagring. Lagras på detta sätt, celler kan återupplivas och kommer att vara livskraftiga i åratal.

12. upptining av frysta celler

  1. Förbered en 6 väl-platta som innehåller 2 mL förvärmda odlingssubstrat i varje brunn som kommer att användas (1 brunn per injektionsflaska med celler som Tinas). Behåll plattan i inkubatorn 37 ° c och 5% CO2 tills det behövs.
  2. Ta en flaska med celler från LN2 och placera den i ett varmt vattenbad (37 ° c) till snabbt Tina celler. Detta bör ta 2 – 3 min.
    Anmärkning: Lämna inte injektionsflaskorna upptining längre än 3 – 5 min, eftersom DMSO i frys mediet är giftigt för cellerna en gång tinat.
  3. Så snart lösningen i injektionsflaskan är tinad, Pipettera försiktigt upp och ner för att homogenisera lösningen och placera omedelbart hela lösningen (~ 750 μL) i en brunn på en 6-brunn-platta (förberedd i steg 12,1).
  4. Försiktigt klippa plattan från sida till sida och fram och tillbaka 2-3 gånger för att hjälpa celler fördela över brunnen ytan i ett enda lager.
  5. Placera cellerna i inkubatorn vid 37 ° c och 5% CO2 inkubator för 24 – 48 h.
  6. Övervaka och passera cellerna enligt beskrivningen ovan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dna
För standardanalyser av låg molekylvikt (LMW) utvunnits DNA från tre arter av neotropiska fladdermöss. Vävnadsprover samlades in på fältet från Dominikanska republiken och Costa Rica, enligt de protokoll som beskrivs i detta dokument. Efter dissektion, små bitar (< 0,5 cm vid den tunnaste delen) av blandade vävnader (hjärna, lever, och tarm) placerades i RNA-stabiliserande lösning, blixt fryst, sedan lagras vid-80 ° c. Extraktioner utfördes med standard DNA-extraktion protokoll med RNase behandling43. Bedömning av DNA-integritet med en automatiserad elektrofores verktyg avslöjade följande representativa prov toppar fragment storlekar: Art 1 (två separata extraktioner) bestod av 22 kB och 20 KB; Art 2 bestod av 25 KB; och art 3 bestod av 24 KB (figur 5, tabell 2).

DNA som utvinns för tredje generationens sekvensering krävs för att samlas i höga koncentrationer och minimalt fragmenterat. HMW DNA utvinns ur Flash-fryst hjärnvävnad från en gammal värld frukt bat (Eidolon helvum) som samlats in i Ghana erhölls. HMW DNA extraherades med hjälp av Bionano Extraction Protocol for efterföljande analys på Irys-plattformen. Detta DNA var 607 463 MB i längd och hade en genomsnittlig molekyl N50 på 194,5 MB.

Rna
En gemensam indikator för framgång för RNA-extraktioner är RNA Integrity Number (RIN) värde. Det är ofta inte rekommenderas genom sekvensering anläggningar för att genomföra ett RNA-SEQ bibliotek förberedelse eller ordningsföljd protokoll när extraktioner har ett RIN värde mindre än åtta, som värden under denna tröskel börjar uppvisa höga signaturer av nedbrytning44 ,45. Figur 6 visar Rin-värden för RNA-extraktioner av olika vävnadstyper enligt detta protokoll. Utvinning av vävnad som samlats in med protokollen har resulterat i hög kvalitet RNA, oberoende av fält provtagning ort. När LN2 var inte omedelbart tillgänglig i Amazonas, vävnader placerades i RNA-stabiliserande lösning och hålls vid 4 ° c för 1 vecka tills placeras i LN2. Även i sådana fall var RIN värden jämförbara med dem som omedelbart placerades i RNA-stabiliserande lösning och direkt i LN2. RNA-stabiliserande lösning är ett viktigt stabiliserande medel.

Vävnadskultur
Omedelbart efter plätering, celler kommer att balled upp och flytande. Men inom 24 h, fibroblaster bör platta och fäster på ytan av plattan (figur 4a). Vid denna punkt, cellerna bör vara på ungefär 20%-30% sammanflödet för att säkerställa överlevnad. Ett lägre värde än detta kan resultera i att hela kulturen dör. Inledningsvis måste de ha gott om utrymme mellan varandra för att möjliggöra expansion, eftersom cellerna kommer att dela och expandera i kulturen. De bör delas upp när de når 80%-90% sammanflödet [dvs, de täcker > 80% av plattan ytan (figur 4b)]. På detta sätt kan celler underhållas i kultur för ett antal passager (vanligtvis > 6 passager) innan de genomgår senescence. Om celler bibehålls i kulturen bortom denna tid eller inte delas när de blir konfluenta, de kan ändra morfologi och bli större och längre (figur 4c). Celler med denna morfologi kan fortfarande dela, men detta tyder vanligtvis på att cellerna är eller kommer snart att träda åldras och kommer inte längre att kunna upprätthållas eller utvidgas i kulturen.

Figure 1
Figur 1: en gemensam uppsättning för imnät för att fånga fladdermöss i skogen. Att hålla en hand täckt medan disentangling med motsatt hand är ett sätt att säkert ta bort bat samtidigt minimera stress. Detta foto togs av Jon Flanders. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: en harpa-fälla används ofta för att fånga utanför grottor, stora Roosts, eller flygighet. Fladdermöss kommer att ackumuleras i den nedre påsen av fällan med minimal insnärjning och lätt avlägsnande av prövaren. Detta foto togs av Stephen Rossiter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: arbetsflöde för dissektioner och VÄVNADS provtagning för RNA-vävnadsberedning. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: bat-cellkulturer som härrör från vingslag av phyllostomus missfärgar. (a) 24-48 h efter plätering, celler kommer att bli tillplattad och fäster på plattan ytan. B) cellerna täcker 80%-90% av plattytan och bibehåller den ursprungliga morfologin. Detta representerar den optimala fasen för uppdelning. (C) efter > 6 passager, celler kommer att ändra sin morfologi att bli större och längre, och cellerna kommer att träda senescence. I alla bilder, ljusa, balled upp celler representerar döda celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: representativa resultat av DNA-extraktioner från konservering av standard-DNA-analyser från tre fladdermusarter extraherades DNA två gånger från Art 1. Ett enda stort band indikerar minimal fragmentering och liknande stora fragment av DNA från varje respektive extraktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: RNA-integritetsnummer (RIN) för RNA-extraktioner från 13 olika vävnadstyper från neotropiska fladdermusarter urvalet på fyra olika orter. Dessa extraktioner utarbetades efter det beskrivna protokollet och användes sedan för att förbereda HiSeq/NextSeq-transkriptome-bibliotek. MOE är den viktigaste luktsinnet epitel. VNO är vomeronasalorgeln. Vävnader tagna från arter i Anderna, Costa Rica och Dominikanska republiken placerades direkt i LN2 efter blötläggning i RNA-stabiliserande lösning vid 4 ° c över natten. Vävnader tagna från arter i Amazonas placerades i LN2 cirka 1 vecka efter placering i RNA-stabiliserande lösning och hålls vid 4 ° c kontinuerligt. N representerar antalet individer representerade för varje vävnads extraktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Program Blixt fryst (L2) RNAlater AllProtect FFPE Media
Hög MW DNA Y X Y X X
Låg MW DNA Y Y Y X X
Rna Y Y Y X X
Protein Y X Y Y X
Cell kultur X X X X Y

Tabell 1: översikt över konserveringsmetoder och-tillämpningar. MW = molekylvikt, FFPE = formalin-fast paraffin-inbäddad vävnad. Bockmarkeringar anger önskad konserveringsmetod för respektive avsedd tillämpning. X-markeringar indikerar konserveringsmedel som inte ska användas.

Art-ID Exempel-ID Koncentration (ng/μL) Exempel på fragment maximal storlek (BP)
Arter 1 1,1 31,8 21 885
1,2 22,8 19 633
Arter 2 2 30,4 25 198
Arter 3 3 32 24 386

Tabell 2: representativa resultat för DNA-extraktioner baserade på konserveringsmetoder i detta protokoll. Värdena överensstämmer med gel elektrofores brunnar från figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det protokoll som diskuteras i detta manuskript beskriver de bästa provtagningsmetoderna för olika molekylära analyser av fladdermöss med hög kapacitet. Alla lyckade omics-studier kräver vävnad av hög kvalitet, men provtagning av fladdermusvävnad, liksom andra icke-modellorganismer, förekommer ofta i fältförhållanden som inte kan ställas in på samma standarder som för kontrollerade laboratoriemiljöer. Provtagning sker ofta på avlägsna platser, med minimala resurser, inklusive begränsad tillgång till elektricitet och frysar. Det är svårt, och ofta omöjligt, att säkerställa helt sterila provtagnings förhållanden. Därför beskrivs de protokoll som identifierats som de mest framgångsrika i en mängd olika provtagnings orter och fältförhållanden. För att ha standardiserade provtagningsmetoder för Bat1K-initiativet och relaterade insatser och projekt föreslås det att fladdermusbiologer följer dessa protokoll när de planerar fält expeditioner i den utsträckning som är tillåten.

Protokoll förslag
Medan thorakala kompression var en gemensam strategi för dödshjälp i det förflutna, föreslås det att aldrig använda thorakal komprimering för att samla fladdermöss för-omics analyser. Det är inte längre en godtagbar form av dödshjälp i Förenta staterna46, och denna metod kan leda till enzymatisk nedbrytning av en rad vävnader oavsett arter av intresse47. Om ett djur blir euthanized, det föreslås att vävnad för både genomiska och transkriptomiska analyser samlas in. Båda kräver skörd färsk vävnad som helst skulle blinka fryst i LN2, men som också kan lagras i olika medier för att underlätta DNA, RNA, eller protein utvinning. Det föreslås arbeta parallellt med två personer på kranial och olika dissektioner för att minska nedbrytningen av RNA i vävnader. En person bör dissekera kraniet medan den andra fungerar på post-kraniet.

Stora begränsningar av att utföra dissekera protokoll inkluderar den personal som deltar i dissektion och utrymme som finns för vävnad bevarande (t. ex. i LN2 tank). Beredning av flaskor i förväg och tillräckligt antal människor att hjälpa till med märkning rör och dokumentera flaskor och vävnader samlas kommer att bidra till smidig provbearbetning. Det bör noteras att lämplig dokumentation av proverna är nödvändig för att erhålla de nödvändiga (export-, import) processerna. Den olika dissektion protokollet, till exempel, kräver mer än 20 flaskor per djur.

Om tid och rum är begränsade bör följande prioriteras: 1) prioritering av ett exemplar för arter, eller åtminstone ett exemplar per släkte; prioritering för ett manligt exemplar för att möjliggöra sekvensering av både X-och Y-kromosom och minimering av sannolikheten för provtagning av en reproduktiv hona; 2) för HMW DNA: hjärna, muskler, och lever bör blinka fryst utan någon reagens; 3) för RNA: hjärna, matsmältnings vävnader, mjälte, och sinnesorganen är av hög prioritet. Varje vävnadsprov ska förvaras i RNA-stabiliserande lösning. Muskelvävnad bör också tas som en kontroll för uttrycks analyser av specialiserad vävnad; 4) vid minsta, vävnader bör hållas kallt; 5) tillgängligheten av LN2 kan också vara av intresse. LN2 tankar måste fyllas på minst varannan vecka, men oftare i varmare klimat eller om tanken är ofta öppnas. LN2 är ofta kommersiellt tillgänglig i alla länder, eftersom det ofta används inom jordbruket och hälso-och sjukvården för att transportera prover. Vanligtvis tillhandahålls dessa tjänster av företag som också säljer andra gaser, såsom koldioxid eller syre. Glassbutiker erbjuder ibland ett annat alternativ för torris eller LN2 (eller åtminstone ge en rekommendation för köp), och det föreslås att be lokal personal om hjälp med detta; 6) i figur 6 beskrivs lyckade vävnads extraktioner för vissa insamlings expeditioner där förhållandena var begränsade.

Med fler människor och mer utrymme kan mer vävnad samlas på olika sätt. Följande är ytterligare protokoll som offentliggörs på annat håll att utredarna bör överväga om rätt erfarenhet och material finns tillgängliga: 1) bat metabolome, eller alla de utsöndrade lågmolekylärt metaboliter av celler och vävnader, kan ge inblick i exceptionella bat livslängd eller viloläge och metabolisk flygning krav. Blod bör samlas in från ett lättillgängligt blodkärl, såsom ankeln vener, i en injektionsflaska med heparin48, och fekal prover bör frysas i LN249; 2) immunomik, eller svaret från djuret till patogener, kan analyseras genom att ta lårben och överarmsben och placera dem i vävnad kultur lösning på kulturen makrofager nedströms50; 3) avföring kan vara användbart för två typer av nedströms nukleinsyra baserade analyser, såsom att bestämma diet51 och sondera tarmen mikrobiomet52,53,54. I båda fallen, reagenser såsom vävnad stabiliserande lösning minska nedbrytningen av sällsynta varianter som finns i avföring; 4) lipidomik, eller fosfolipid repertoarer av en vävnadstyp, har avslöjat i förståelsen av vita näsa syndrom svamp patogen55,56. Beredning av vävnad föreslås frysas omedelbart efter dissektion.

Tissue Arkiv för Bat1K
Bat1K syftar till att upprätthålla en vävnadsbank av varje enskild fladdermus som används för att generera Genomes. För närvarande bibehålls dessa vävnadsbanker och de relevanta fenotypiska och ekologiska data som samlats in per individ i de Bat1K bidragande medlemmarnas laboratorier/museisamlingar. Allteftersom projektet fortskrider kommer Bat1K att centralisera och underhålla vävnads samlingar och relevanta databaser genom nätverksanslutna databaser som global Genome nätverk < http://www.ggbn.org/ggbn_portal/>.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo och Fanny Fernández Melo för att göra vävnad samling i Peru möjlighet. Vi tackar också alla medlemmar i Grupo Jaragua och Yolanda León för att göra vävnads insamling i Dominikanska republiken möjligt, liksom till Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, och alla på La Selva biologiska forsknings station i Costa Rica, för att göra provtagning möjlig. Vi tackar Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe för tillgång och provinsamling av Wing stansar från Phyllostomus missfärgar fladdermöss för cellkultur generation. Phyllostomus missfärgar fladdermöss påbörjade från en Avelkoloni i avdelning bio Logi II av Ludwig-Maximilians-universitetar i Munich. Godkännande för att behålla och föda upp fladdermöss utfärdades av München District Veterinary Office. LMD, SJR, KTJD och LRY finansierades av NSF-DEB 1442142. LMD finansierades av NSF-DEB 1838273. LRY finansierades av NSF-PRFB 1812035. SCV och PD finansierades av en Max Planck Research Group Award, och ett Human Frontiers Science program (HFSP) forskningsbidrag (RGP0058/2016). SJR, JHTP och KTJD finansierades av Europeiska forskningsrådet (ERC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) som tilldelades SJR, ECT finansierades genom Europeiska forskningsrådets bidrag (ERC-2012-StG311000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Safelock tubes Fischer Scientific 10509691 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes Sarstedt 62,554,002 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials Thomas Scientific 1154P75 cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3 mm biopsy punch Medline MIL3332 wing biopsy punch for cell culture
6 well plate Greiner 83,392 Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent Qiagen 76405 for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber Bio-Rad 145-0011 Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
Collagenase IV Stemcell Technologies 7909 For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-5X5ML Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 12491-015 culture media
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190169 Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS) Fischer Scientific 10270106 Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt Sigma Aldrich G1264-250MG Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0050 Freezing container which provides 1 °C/min cooling rate
PARAFILM Sigma P7793 Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x Invitrogen 15140130 Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 Thermo Fisher 10010023 salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10x using de-ionized water
RNAlater Thermo Fisher AM7021 RNA stabilizing solution
RNAse away Genetech 83931-250mL breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel Fisher Scientific 7631-86-9 dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102 Automated cell counter
Trypan blue Bio-Rad 145-0013 Cell stain used to assess cell viability
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4049 For dissociation of cells during splitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
  2. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
  3. Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
  4. Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
  5. Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
  6. Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
  7. Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
  8. Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen? Science. 323 (5911), 227 (2009).
  9. Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
  10. Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
  11. Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
  12. Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
  13. Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  14. Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
  15. Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
  16. Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
  17. Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
  18. Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
  19. Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
  20. Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
  21. Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
  22. Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
  23. Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
  24. Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
  26. Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
  27. Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
  28. Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  29. Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
  30. Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
  31. Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
  32. Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
  33. Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
  34. Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
  35. Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
  36. Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
  37. Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , Museum of Texas Tech University. (2003).
  38. Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
  39. Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
  40. Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
  41. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
  42. Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
  43. Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
  44. Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
  45. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
  46. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Schaumburg, IL. (2013).
  47. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
  48. Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  49. Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
  50. Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
  51. Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
  52. Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
  53. Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
  54. Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity? PeerJ. 6, e4174 (2018).
  55. Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
  56. Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).

Tags

Biologi fladdermöss genomik transkriptomik vävnads provtagning vävnads bevarande dissektion cellkultur
Vävnads insamling av fladdermöss för-omics-analyser och primär cell kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. … More

Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. T. J., Potter, J. H. T., Rossiter, S. J., Teeling, E. C., Vernes, S. C., Dávalos, L. M. Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (152), e59505, doi:10.3791/59505 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter