Summary
このプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュを宿主として用いたウイルスベースの二重蛍光標識腫瘍異種移植片モデルにおける最適化手順について説明する。この異種異種異種移植片モデルは、生体内の膵臓癌微小環境の組織組成を模倣し、パーソナライズされたzPDX(ゼブラフィッシュ患者由来異種移植片)モデルにおける薬物応答を評価するためのより正確なツールとして機能する。
Abstract
患者由来腫瘍異種移植片(PDX)および細胞由来腫瘍異種移植片(CDX)は、前臨床評価、投薬指導および基礎癌研究のための重要な技術である。従来の宿主マウスにおけるPDXモデルの世代は時間がかかり、サンプルのごく一部に対してのみ働いています。近年、ゼブラフィッシュPDX(zPDX)は、小規模かつ高効率の特性を持つ独自のホストシステムとして登場しています。ここでは、zPDXモデルにおける比較化学療法評価のための二重蛍光標識腫瘍異種移植片モデルを生成するための最適化された方法論について説明する。腫瘍細胞および線維芽細胞は、異なる培養条件で新たに採取または凍結した膵臓癌組織から濃縮された。両方の細胞基は、緑色または赤色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルス、ならびに抗アポトーシス遺伝子BCL2L1によって標識された。トランスフェクトされた細胞を予め混合し、次いで32°Cで修飾されたE3培地で飼育した2dpf幼虫ゼブラフィッシュに共注入した。異種移植片モデルは化学療法薬および/またはBCL2L1阻害剤によって治療され、腫瘍細胞と線維芽細胞の両方の生存率を同時に調べた。要約すると、このプロトコルは、研究者が異種腫瘍微小環境を持つ大量のzPDXモデルを迅速に生成することを可能にし、薬物候補の効率を評価する際に、より長い観察ウィンドウとより正確な定量を提供します。
Introduction
精密腫瘍学は、個々の患者1のための最も有益な治療戦略を見つけることを目指しています。現在、インビトロ一次培養、インビトロオルガノイド培養2、およびオルガノイド培養前後のマウスにおける患者由来異種移植片(PDX)などの多数の前臨床モデルが、診断およびスクリーニング/評価のために提案されている。治療上の選択肢3.ヒト原発癌細胞を免疫侵害マウスに注射することによって生成されるPDXモデルは、臨床腫瘍学3、4におけるパーソナライズされた薬物スクリーニングのための最も有望なツールの1つである。インビトロの培養細胞株とは異なり、PDXモデルは通常、生体内腫瘍環境の完全性と不均一性を維持し、異なる腫瘍患者の多様性および特異的特性をより良く模倣し、したがって、患者4の潜在的な医学的結果.しかし、マウスにおけるPDXモデルの生成は、多集団実験のための十分な細胞およびモデルを集めるために高品質の患者サンプルと数ヶ月の時間を必要とし、異種移植片の細胞/遺伝的組成物は、元のものから漂流する可能性がある患者の生検。マウスPDXモデルの確立に向けた成功率も低く、臨床現場での広く実施することが困難です。膵臓癌のような急速に進行した癌を運ぶ患者のために、彼らは時間内にPDX実験から貴重な情報を得ることができないかもしれません。
ここ数年、ゼブラフィッシュはCDX(細胞由来腫瘍異種移植片)モデルだけでなく、PDXモデル5、6、7、8、9の潜在的な宿主であると報告されている。10.脊椎動物モデル動物として、ゼブラフィッシュは遺伝学と生理学の両方で哺乳類と十分な類似性を抱き、2つの重要な利点を有する:透明性および小さいサイズ11。ゼブラフィッシュはまた、非常にフェクティビティであり、何百もの繁殖幼虫は、成人12の単一のペアから数日以内に得ることができます。いくつかの研究は、癌疾患のトランスジェニックおよび異種移植片モデルの両方を生成するためにゼブラフィッシュを採用しています13,14.マウス異種移植片と比較して、ゼブラフィッシュ異種移植片は、単一細胞分解能での追跡を可能にする。ある程度の量のヒト組織は、数百のゼブラフィッシュPDXモデル(zPDX)を生成することができるが、マウスPDXモデル15、16のカップルを生成するだけで十分でありうる。また、2-5 dpfのゼブラフィッシュ幼虫は、すでに肝臓や腎臓などの完全な循環系と代謝器官を開発していますが、免疫系17ではなく、残りの黄身嚢は天然の3D培地であり、薬物スクリーニングに最適です。抵抗試験および腫瘍移動観察6,18,19,20,21.
zPDXを臨床用スクリーニング/検査プラットフォームとして使用する究極の試みとして、ここでは、より少ない細胞を低コストで使用して短時間で生体内候補薬の評価を可能にする膵臓癌のzPDXモデルに対する最適化された提案について説明します。zPDX6,9,10に関する以前の参考文献と比較して、臨床個別診断のためのシステムをより実現可能で信頼性の高い方法にするために、いくつかの最適化を導入しました: 1) 異なる細胞を事前にソートする原発性腫瘍組織のグループとさらなる実験の前に1週間の原発細胞を安定化;2)ヒト細胞を標識し、レンチウイルスベースの遺伝子改変を介して異種移植片における細胞生存率を高める;3)栄養サプリメント(グルコースとグルタミン)と温度の両方でゼブラフィッシュ培養条件を最適化します。4)比較的な方法で異なる細胞タイプの薬物応答を定量化する。また、いくつかの補足材料を追加して注入液に変更を加えました。全体として、これらの改善は、候補薬の応答を評価するための信頼性の高いツールとして使用することができるゼブラフィッシュ宿主において、より患者様の異種移植片を迅速に生成する可能性を提供する。
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Protocol
すべての動物の手順が承認され、復旦大学の動物倫理委員会のガイドラインに従い、すべての膵臓癌標本は復旦大学上海癌センターから得られました。FUSCC倫理委員会から倫理的承認を得て、各患者から書面によるインフォームド・コンセントが得られた。
1. マイクロインジェクション用機器の準備
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射出プレートを準備する。
- E3溶液に溶解した1%アガロースの50mL溶液(二重蒸留水+0.01mg/Lメチレンブルーで0.6g/L水槽塩)を調出す。アガロースが溶けるまで溶液を沸騰させます。
- アガロース溶液の50 mLを10cmペトリ皿に注ぎ、ゼブラフィッシュ胚固定金型を表面に置きます。アガロース溶液が固まったら金型を取り除きます。
- 射出プレートに20mLのE3溶液を加え、長期保存のために4°Cで維持します。
-
注射針を準備する
- 針の引き出しの2つの針に0.9 mmの内寸の10 cmのガラス毛細血管を引っ張る。
- 鉗子を使用して針の端を切断し、顕微鏡下に開口部を作成します。
2. 移植のための胚の準備
- 午前7~9時に1~2組の成虫ゼブラフィッシュを交配槽に入れ、翌朝8時頃に受精卵を採取する。
- 受精卵を交配タンクから新鮮なE3溶液の40 mLを含むペトリ皿に移し、28.5 °Cでインキュベートする。
- E3溶液中のインキュベーションの8時間後、色素沈着を抑制するためにE3溶液に0.03%1-フェニル-2-チオンレア(PTU)を加えます。48馬力まで28.5 °Cで0.03%PTUでE3溶液中の胚をインキュベートします。このステップは、インブレッドキャスパー変異型ゼブラフィッシュを使用する場合は省略することができます。
3. 新鮮な外科膵臓癌標本または凍結組織からの原発性ヒト細胞の単離と培養
- 腹部手術中に約1cm3の大きさのヒト膵臓癌組織の検体を取得し、すぐに成長培地(10%の胎児ウシ血清(FBS)、10μM Y-27632、100 μg/mLプリモシン、10 μg/mLプトレシン)に組織を移す二塩酸塩、10mMニコチンアミドおよび1%ペニシリンストレプトマイシン)。
- 膵臓癌サンプルをペトリ皿に移し、周囲の壊死組織、脂肪組織および結合組織を取り除く。
- リン酸バッファー(PBS)で5~6回がん組織をすすいで、メスを使って1mm3個に切ります。
- 細断された組織を50mLチューブで5mLのHBSSに移し、コラゲナーゼタイプIV、ヒアルロニダーゼ、DNase Iをそれぞれ200単位/mL、100mg/L、20mg/Lの最終濃度で加えます。よく混ぜるために上下に混合物をピペット。
- 5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cで混合物を15〜20分間インキュベートし、5分ごとに数回上下に混合物を上下にピペットします。
- 消化が完了したら、チューブに7 mLのDMEMを追加し、110 x gで5分間4°Cで遠心分離機を追加します。
- 上清をデカントし、DMEMで腫瘍混合物を再中断する。
- 完全成長培地の3 mLで6cmペトリ皿に混合物をプレート(DMEM 10%FBS、20 μg/mLインスリン、100 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF、10μM Y-27632、100 μg/mLプリモシン、10μg/mLプト塩リン、10μg/mLプトヒドロ、1%ペニシリンストレプトマイシン)。セルを 2 つのグループに分けます。
- グループIでは、48時間後に膵臓癌線維芽細胞の100倍阻害剤を培地に加え、成長しすぎた線維芽細胞を除去し、癌細胞を主要な細胞型として残す。グループIIでは、線維芽細胞は1週間以内に癌細胞を成長させる。
- 両方の細胞群を細胞密度/純度に応じて1〜2週間培養し、3日ごとに培養物を変化する。両方のグループI&IIで期待される細胞型は、タイピック成功実験で98%以上の割合を占めることができます。
4. 抗アポトーシス遺伝子BCL2L1(BCL-XL)と異なる蛍光タンパク質を別々に発現するレンチウイルスで細胞を標識する
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レンチウイルス生産
- プレート3 x 106 HEK 293T細胞に完全なDMEM培地(DMEMは10%FBSを供給)で10cmの皿で、5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cで一晩培養する。トランスフェクションの前に、無血清培地の6 mLで培地を交換してください。
- 調製溶液A:BCL2L1-含有レンチウイルスベクター(pCDH-EF1α-mKate2-E2A-BCL2L1-WPREまたはpCDH-EF1α-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE)、pVSVGの2.4 μg、 4 μg pMDL(ギャグ/ポール)、pREVの1.6 μgおよび無血清のDMEMの総容積500 μLの穏やかなピペ混合物を数回、室温で5分間置きます。
- 溶液B:460μL無血清フリーDMEM中のPEI(ポリエチレンエイミン)の40 μLを調製する。室温で5分間置きます。
- 溶液Bを溶液Aにゆっくりと加え、チューブを室温のままに30分間放置する。
- ステップ4.1.1で調製したHEK 293T細胞培養皿に最終混合物を加え、5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cでインキュベートします。12時間後、完全なDMEM培地の5mLを追加します。48時間後、レンチウイルスを含有する培地を収穫する。
- 0.45 μmの滅菌フィルターを使用して上清を濾過し、上清を濃度カラムに加え、遠心分離機を6,000×gで4°Cで25〜30分間行う。 チューブあたり100μLのレンチウイルスアリコートが作られ、-80°Cで保存されます。
-
一次細胞の感染
- 細胞(グループI&II)を30〜40%の密度で12ウェルプレートに感染させ、5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cで一晩培養する。
- 4時間のポリブレンの8 μg/mLを含む無血清培地の500 μLで培地を交換してください。次に、レンチウイルスの100 μLを培地に加えます(eGFP-E2A-BCL2L1群Iの場合はeGFP-E2A-BCL2L1、グループIIの場合はmKate2-E2A-BCL2L1)。12時間後、培地を1mLの完全培地に置き換える。
- 48時間後に蛍光マーカーを確認してください。
- 感染した細胞を収穫し、106/mLの最終濃度で1:1の比率でそれらを混合します。
- 細胞を110xgで5分間遠心分離し、50μLの注入液(1640培地、0.05%ヒアルロン酸ナトリウム塩、0.05%メチルセルロース)で細胞混合物を再定置する。
5. ゼブラフィッシュに混合細胞懸濁液を注入する
- E3水に10xトリカイン溶液を加えてゼブラフィッシュ幼虫を麻酔し、幼虫を(ステップ2.3から)改変E3(E3、1g/Lグルコースおよび5mmol/L L-グルタミン)で満たされた注入プレートに移します。
- 混合細胞懸濁液の25 μLをマイクロキャピラリー針に充填し、マイクロインジェクションマニピュレータに針を挿入します。
- 射出圧力と時間を設定します。48馬力ゼブラフィッシュの黄嚢に50-80細胞(約8nL)を注入する。
6. ゼノ移植ゼブラフィッシュの培養(zPDXモデル)
- ポストキセノグラフトされたゼブラフィッシュ幼虫を40 mLのミックス溶液(1g/Lグルコースおよび5mmol/L L-グルタミンを含むE3溶液)を32°Cで移します。
7. 異種移植ゼブラフィッシュに対する薬物投与と腫瘍細胞/線維芽細胞の生存率の評価
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ゲムシタビン/ナビトクラックスの最適濃度を決定する。
- 12ウェルプレートの各井戸に48馬力で10個の野生型ゼブラフィッシュ胚を置きます。
- 各ウェルに異なる濃度のゲムシタビンまたはナビトクラックスを加え、32°Cで2日間インキュベートします。
- 2日後、ゼブラフィッシュ幼虫が有意な奇形や異常挙動を示さないゲムシタビンおよびナビトクラックスの最大許容量(MTD)を計算し、作業濃度はMTDの下に設定される。
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ゲムシタビン/ナビトクラックスによるzPDXモデルの治療
- 10個の異種移植幼虫を12ウェルプレートの各ウェルに入れます。
- 幼虫を4つの群に分け、0.1%DMSOを含むE3で対照群を処理し、他の群を5μg/mLのゲムシタビンおよび/または50 μMナビトクラックスで処理し、2日間32°Cでインキュベートする。
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zPDXモデルにおける細胞生存率および細胞組成の評価
- 異種移植幼虫の後処理を麻酔し、3%メチルセルロースに入れ。
- 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて横視から幼虫を画像化する。
- ImageJ および GraphPad ソフトウェアを使用して、赤色および緑色の蛍光信号の強度を定量化します。
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Representative Results
プロシージャの概略化されたアウトラインを図 1に示します。要するに、原発癌組織細胞は、膵臓癌線維芽細胞阻害剤の添加の有無にかかわらず消化後に完全培地に播種した。癌細胞と線維芽細胞は、線維芽細胞が阻害剤なしで支配した2つの異なる集団として濃縮され、阻害剤の添加後に癌細胞の増殖が優勢であった(図2)。2つのレンチウイルス包装ベクターを構築し、図3に示すように緑色または赤色蛍光タンパク質およびBCL2L1を発現した。ウイルスベースの蛍光標識はまた、細胞の生存状態を表した。混合癌細胞および線維芽細胞を48馬力でゼブラフィッシュ黄嚢に注入し、ゲムシタビンおよび/またはナビトクラックスによって2日間治療した。異なる集団における細胞生存率および異種移植片の細胞組成は、薬物治療に対する応答として変化した(図4)。
図1:膵臓癌に由来するゼブラフィッシュ異種移植片モデルの生成および薬物評価の概略図。膵臓癌患者から外科的に除去された組織は、せんまされ、消化され、続いて2つの異なる条件で培養され、そのうちの1つは線維芽細胞阻害剤によって添加され、もう一方の群はそうでない。1〜2週間後、一次細胞を遺伝子改変して抗アポトートタンパク質BCL2L1および異なる蛍光タンパク質を発現させた。その後、2つの集団を混合し、化学療法薬の効果を評価するために48馬力のゼブラフィッシュ幼虫に共注入した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:膵臓癌細胞および線維芽細胞の培養と濃縮癌細胞および線維芽細胞の画像は、10日間培養後に3つの異なる膵臓癌患者から濃縮された。スケールバー、100 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:BCL2L1と異なる蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスベクターの構造。mKate2-E2A-BCL2L1またはeGFP-E2A-BCL2L1を常に発現する2つのレンチウイルスベクターの概略図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ゲムシタビンによる異種移植片に及ぼす影響(A) 3時間移植後のゼブラフィッシュ幼虫の黄嚢における異種移植片の横図(hpt)。(B)ゼブラフィッシュ幼虫における異種移植片の代表的な画像を60馬力で、DMSOまたはゲムシタビンによって処理した。(C) 60馬力で異種移植片の代表的な3Dレンダリング。(D) ゲムシタビンおよび/またはBCL2L1阻害剤処理の前後の異種移植片の蛍光強度の統計。N = 各アッセイのグループあたり10。スケールバー = 100 μm;NS は重要ではありません。*P < 0.05;P < 0.0001;平均±SDで、一方通行の分散分析によって決定される統計的差異を有する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
PDXおよびCDXモデルはいずれも腫瘍生物学22の分野における重要なプラットフォームであり、種間移植の成功の重要なステップは異種移植片の生存率を改善することである。 最近、いくつかの研究は、BCL2L1(BCL-XL)またはBCL2の一過性発現が細胞の同一性および運命に影響を与えることなくマウス宿主におけるヒト胚性幹細胞の生存率を有意に改善する可能性があることを示している23,24歳,25.原稿では、抗アポトーシス遺伝子BCL2L1(BCL-XL)を常に発現するレンチウイルスを用いた細胞と蛍光タンパク質を標識した。BCL2L1の導入により、ゼブラフィッシュにおける異種移植片ヒト細胞の生存時間が大幅に延長され、研究の観察期間が延長され、蛍光シグナルは細胞に標識するだけでなく、その生体状態を報告する。細胞は、細胞死とともに蛍光が急速に消えていくことがわかった。 一方、我々は現在、ヒト異種移植片のためのより良いホストとしてゼブラフィッシュを修正しています。一方で、rag2とprkdcはCRISPR/Cas9技術を介してノックアウトされ、免疫欠乏マウスと類似した免疫欠乏ゼブラフィッシュを組み合わせて準備し、古いゼブラフィッシュ幼虫も互換性があります。ヒト細胞および組織26と.一方、ゼブラフィッシュは、Tol2トランスポゾン媒介トランスジェニック技術を用いて、移植されたヒト細胞の生存と増殖をより良くサポートするために、IGF1やINSなどのヒトタンパク質を発現するように改変された。また、zPDXにはヒト様機能性免疫システムも欠けており、ヒト間質細胞と免疫系との相互作用も欠けており、将来的にはヒト免疫細胞を併用してゼブラフィッシュの短期的なヒト化免疫環境を再構築しようとする可能性があります。
マウスPDXモデルでは、異種移植片条件は、従来、発達に長い時間を要する可視サイズの節を直接観察することによって監視されていた。比較として透明なzPDXモデルでは、異種移植片をリアルタイムで顕微鏡下で調べることができる。しかし、適切な制御なしに単色集団における細胞数の交互を評価することは困難であり、異なる蛍光の2つの細胞集団を導入するという考え方は、細胞生存率の定量を有意に改善する。異なる細胞を固定比で混合して注入することにより、腫瘍微小環境を模倣するだけでなく、2つの細胞基を比較することで薬物応答を正確に定量することができる。原発組織における線維芽細胞に対するがん細胞の本来の比率は大きく異なりますが、ここでは1:1の比率から始め、異なる比率の同じ細胞組成に対する薬物治療の効果を今後検討します。また、ヒト細胞の挙動に対する37°Cインキュベーションの代わりに32°Cの効果も詳細な比較研究を必要とする。最後に、比較薬評価のための膵臓癌に対する患者由来の異種異種異種移植片モデルの戦略は、他のタイプの固形癌にも適用することができる。このアプローチは、ゼブラフィッシュ幼虫を宿主として使用するPDXに特に有用であり、これは透明で単一細胞分解能での分析に実現可能である。
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Disclosures
潜在的な利益相反は明らかにされなかった。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団81402582、上海自然科学財団12DZ2295100、14YF1400600および18ZR1404500によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
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