Summary
Dit protocol beschrijft de optimalisatie procedures in een virus-gebaseerde Dual fluorescentie-gelabelde tumor xenotransplantaatmodellen is model met behulp van larvale zebravis als gastheren. Dit heterogene xenotransplantaatmodellen is-model bootst de weefsel samenstelling van de micro-omgeving van pancreaskanker na in vivo en dient als een preciezer hulpmiddel voor het beoordelen van geneesmiddel responsen in gepersonaliseerde zpdx (Zebrafish patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is) modellen.
Abstract
Patiënt-afgeleide tumor xenotransplantaatmodellen is (PDX) en cel-afgeleide tumor xenotransplantaatmodellen is (CDX) zijn belangrijke technieken voor Preklinische beoordeling, medicatie begeleiding en fundamentele kanker onderzoeken. Generaties PDX-modellen in traditionele hostmuizen zijn tijdrovend en werken slechts voor een klein deel van de monsters. Onlangs is zebravis PDX (zpdx) ontstaan als een uniek hostsysteem, met de kenmerken van kleinschalige en hoge efficiëntie. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methodologie voor het genereren van een dubbel fluorescentie-gelabeld tumor xenotransplantaatmodellen is-model voor vergelijkende chemotherapie-evaluatie in zpdx-modellen. Tumor cellen en fibroblasten werden verrijkt met vers geoogst of bevroren pancreaskanker weefsel onder verschillende cultuuromstandigheden. Beide celgroepen werden gelabeld door lentivirus dat groene of rode fluorescentie eiwitten uitdrukt, evenals een gen BCL2L1dat anti-apoptosis heeft. De getransfeerde cellen werden voorgemengd en geïnjecteerd in de 2 DPF larvale zebravis die vervolgens werden gefokt in gemodificeerde E3 medium op 32 ° c. De xenotransplantaatmodellen is modellen werden behandeld door chemotherapie drugs en/of BCL2L1 inhibitor, en de vicapaciteiten van beide tumorcellen en fibroblasten werden gelijktijdig onderzocht. Samenvattend, dit protocol stelt onderzoekers in staat om snel een grote hoeveelheid zPDX modellen met een heterogene tumor micro-omgeving te genereren en biedt een langere observatie-venster en een preciezere kwantificerings bij het beoordelen van de efficiëntie van drugs kandidaten.
Introduction
Precision oncologie streeft naar het vinden van de meest gunstige therapeutische strategieën voor individuele patiënt1. Momenteel worden talrijke preklinische modellen zoals in vitro primaire kweek, in vitro organoïde Culture2en patiënt-afgeleide xenotransplantaten (PDX) bij muizen voor of na de organoïde cultuur voorgesteld voor diagnose en om de potentiële therapeutische keuzes3. PDX-model dat wordt gegenereerd door de injectie van menselijke primaire kankercellen in immuungecompromitteerde muizen, is een van de meest veelbelovende hulpmiddelen voor gepersonaliseerde geneesmiddelen screening in klinische oncologie3,4. In tegenstelling tot de gekweekte cellijn in vitro, de PDX modellen meestal behouden de integriteit en heterogeniteit van de in vivo tumor omgeving, beter nabootsen van de diversiteit en idiosyncratische kenmerken van verschillende tumor patiënten, en daarom, kan voorspellen de potentiële medische uitkomst van patiënten4. De generatie van PDX-modellen in muizen vereist echter een hoge kwaliteit patiënt monsters en maanden tijd om voldoende cellen en modellen te verzamelen voor experimenten met meerdere groepen, en de cellulaire/genetische samenstellingen van de xenotransplantaatmodellen is kunnen afwijken van die van de oorspronkelijke debiopsie van de patiënt. Het succespercentage voor het vaststellen van model muizen PDX is ook laag, waardoor het moeilijk is om in de klinische praktijk breed te worden uitgevoerd. Voor de patiënten die snel gevorderde kankers zoals pancreaskanker dragen, kunnen ze niet tijdig waardevolle informatie van de PDX-experimenten verkrijgen.
In de afgelopen jaren, zebravis is gemeld dat potentiële hosts voor niet alleen CDX (cel-afgeleide tumor xenograft) modellen, maar ook PDX modellen5,6,7,8,9, 10. als een gewervelde model dier, zebravis herbergt voldoende gelijkenissen met zoogdieren in zowel genetica en fysiologie, met twee belangrijke voordelen: transparantie en kleine in maat11. Zebravis is ook zeer vruchtbaarheid, en honderden ingeteelde larven kunnen worden verkregen binnen een paar dagen vanaf één paar volwassenen12. Verschillende studies hebben gebruikt zebravis voor het genereren van zowel transgene en xenotransplantaatmodellen is modellen van kanker ziekten13,14. In vergelijking met muizen xenotransplantaten, zebravis xenotransplantaten toestaan tracking bij een enkele celresolutie. Een bepaalde hoeveelheid menselijk weefsel is in staat om honderden zebravis PDX-modellen (zpdxs) te genereren, terwijl het mogelijk alleen volstaat om een paar muizen PDX-modellen15,16te genereren. Behalve, de zebravis larven op 2-5 DPF al ontwikkelen complete bloedsomloop en metabole organen zoals lever en nieren, maar niet het immuunsysteem17, terwijl de overgebleven dooier SAC is een natuurlijke 3D-medium, ideaal voor drug screening, drug resistentie tests en tumor migratie observaties6,18,19,20,21.
Met een ultieme poging om zPDX te gebruiken als screening/testplatform voor klinisch gebruik, beschrijven we hier een geoptimaliseerd voorstel voor het zPDX-model van pancreaskanker, waarmee de in vivo kandidaatgeneesmiddelen beoordeling binnen korte tijd met minder cellen tegen lagere kosten mogelijk is. Vergeleken met de eerdere referenties over zpdx6,9,10, introduceerden we verschillende optimalisaties om het systeem realiseerbaar en betrouwbaarder te maken voor klinische gepersonaliseerde diagnoses: 1) verschillende cellen vooraf sorteren groepen in de primaire tumorweefsels en stabiliseert primaire cellen voor een week voor verdere experimenten; 2) labelen van de menselijke cellen en verbetering van de levensvatbaarheid van de cel in xenotransplantaatmodellen is via lentivirus gebaseerde genetische modificatie; 3) het optimaliseren van de zebravis cultuur conditie in beide voedingssupplementen (glucose en glutamine) en temperatuur; 4) kwantificeren van de Drug reacties van verschillende celtypen op een vergelijkende manier. We hebben ook wijzigingen aangebracht in de injectie oplossing door verschillende aanvullende materialen toe te voegen. In totaal bieden deze verbeteringen de mogelijkheid om snel een meer patiënt-achtige xenotransplantaatmodellen is in zebravis-hosts te genereren die kan worden gebruikt als een betrouwbaar hulpmiddel om de respons van kandidaatmedicijnen te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier procedures werden goedgekeurd en volgden de richtlijnen van het Animal Ethics Committee bij Fudan University en alle pancreaskanker specimens werden verkregen van Fudan University Shanghai Cancer Center. De ethische goedkeuring werd verkregen van de afdeling ethiek van de FUSCC en elke patiënt kreeg schriftelijke geïnformeerde toestemming.
1. voorbereiding van de apparatuur voor de micro injectie
-
Voorbereiding van de injectie plaat.
- Bereid een 50 mL oplossing van 1% agarose opgelost in E3 oplossing (0,6 g/L Aquarium zout in dubbel gedistilleerd water + 0,01 mg/L methyleenblauw). Kook de oplossing totdat de agarose oplost.
- Giet 50 mL van de agarose oplossing in een 10 cm Petri schaaltje en plaats de zebravis embryo fixatie mal op het oppervlak. Verwijder de mal wanneer de agarose-oplossing wordt gestijgd.
- Voeg 20 mL E3-oplossing toe aan de injectie plaat en onderhoud deze bij 4 °C voor langdurige opslag.
-
Voorbereiding van de injectienaalden.
- Trek een 10 cm Glazen capillair met een inwendige afmeting van 0,9 mm in twee naalden op een naald trekker.
- Gebruik de tang om het uiteinde van de naald te snijden om een opening onder de Microscoop te maken.
2. embryo's voor transplantatie voorbereiden
- Plaats 1 tot 2 paar volwassen zebravis in een parings tank op 7-9 pm en verzamel de bevruchte eieren op ongeveer 8 uur van de volgende ochtend.
- Breng de bevruchte eitjes over van de parings tank naar een Petri schaaltje met 40 mL verse E3 oplossing en inbroed bij 28,5 °C.
- Na 8 h van incubatie in E3 oplossing, Voeg 0,03% 1-fenyl-2-thiourea (PTU) in E3 oplossing voor de remming van de pigmentatie. Inincuberen van de embryo's in E3 oplossing met 0,03% PTU bij 28,5 °C tot 48 HPF. Deze stap kan weggelaten worden bij het gebruik van in-Bred Casper Mutant Zebrafish.
3. isolatie en cultuur van primaire menselijke cellen van verse chirurgische pancreaskanker specimen of bevroren weefsel
- Het verkrijgen van specimens van menselijke alvleesklierkanker weefsel van de grootte rond 1 cm3 tijdens een abdominale chirurgie, en onmiddellijk overbrengen van het weefsel in groeimedia (DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS), 10 μM Y-27632, 100 μg/ml primocin, 10 μg/ml putrestsin DIHYDROCHLORIDE, 10 mM Nicotinamide en 1% penicillaire streptomycine).
- Breng het monster van de alvleesklierkanker over in een Petri schaaltje en verwijder het omringende necrotisch weefsel, vetweefsel en bindweefsel.
- Spoel het kanker weefsel voor 5-6 keer met fosfaatbuffer (PBS) en snijd het weefsel in 1 mm3 stuks met behulp van scalpels.
- Breng de geraspte weefsels over in 5 mL HBSS in een buis van 50 mL en voeg Collagenase type IV, hyaluronidase en DNase I toe bij de eindconcentraties van respectievelijk 200 eenheden/mL, 100 mg/L en 20 mg/L. Pipetteer het mengsel op en neer om goed te mengen.
- Incuberen het mengsel bij 37 °C in een incubator van 5% koolstofdioxide voor 15-20 min. Pipetteer het mengsel een paar keer per 5 min.
- Voeg 7 mL DMEM toe aan de buis en centrifugeer bij 110 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c wanneer de spijsvertering is voltooid.
- Decaner het supernatant en resuspendeer het tumor mengsel in DMEM.
- Plaat het mengsel in een 6 cm Petri schaaltje in 3 ml volle groeimedia (DMEM met 10% FBS, 20 μg/ml insuline, 100 ng/ml bFGF, 10 ng/ml EGF, 10 μM Y-27632, 100 μg/ml primocin, 10 μg/ml putrestsin dihydrochloride, 10 mm Nicotinamide , 1% penicillaire streptomycine). Scheid de cellen in twee groepen.
- In groep I, voeg 100x remmer van pancreaskanker fibroblasten in het medium na 48 h om de overwoekerde fibroblasten te verwijderen, het verlaten van de kankercellen als de belangrijkste celtypen;. In groep II zullen de fibroblasten de kankercellen binnen een week ontgroeien.
- Cultuur beide celgroepen voor 1-2 week afhankelijk van de celdichtheden/zuiverheid en verander de media elke drie dagen. De verwachte celtypen in beide groep I & II kunnen meer dan 98% in beslag nemen in een typisch succesvol experiment.
4. het labelen van de cellen met lentivirus uitdrukken anti-apoptosis gen BCL2L1 (BCL-XL) en verschillende fluorescerende eiwitten afzonderlijk
-
Linvirusproductie
- Plaat 3 x 106 HEK 293t cellen met volledige DMEM medium (DMEM geleverd met 10% FBS) in 10 cm gerechten en cultuur 's nachts bij 37 ° c in een 5% kooldioxide incubator. Vervang het medium door 6 mL serum vrije media voor de transfectie.
- Oplossing voorbereiden A: 8 μg BCL2L1-bevattende linvirale vectoren (Pcdh-EF1α-MKATE2-E2A-BCL2L1-wpre of pCDH-EF1α-EGFP-E2A-BCL2L1-wpre), 2,4 μg pvsvg, 4 μg pmdl (gag/Pol), 1,6 μg van de vorige en serum vrije DMEM in een totaal volume van 500 ΜL. voorzichtig pipet het mengsel meerdere malen, en plaats het bij kamertemperatuur 5 min.
- Bereid oplossing B: 40 μL van PEI (polyethyleenmine) in 460 μL serum vrije DMEM. Plaats het op kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg langzaam oplossing B toe aan oplossing A en laat de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het uiteindelijke mengsel toe aan de cel van de HEK 293T, bereid in stap 4.1.1 en inculeer bij 37 ° c in een incubator van 5% kooldioxide. Voeg na 12 uur nog 5 mL van het volledige DMEM-medium toe. Na 48 h, oogst het medium dat het lentivirus bevat.
- Filtreer de supernatant met een steriel filter van 0,45 μm, voeg het supernatant toe aan een concentratie kolom, centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 25-30 min bij 4 °c. De lentivirus aliquots van 100 μL per buis worden gemaakt en opgeslagen bij-80 °C.
-
Infectie van de primaire cellen
- Zaad de cellen (groep I & II) worden geïnfecteerd in een 12-put plaat met 30-40% dichtheid en kweek de cellen 's nachts bij 37 ° c in een 5% kooldioxide incubator.
- Vervang het medium door 500 μL serumvrij medium met 8 μg/mL poly Brene gedurende 4 uur. Voeg vervolgens een extra 100 μL van het lentivirus toe aan het medium (eGFP-E2A-BCL2L1 voor groep I of mKate2-E2A-BCL2L1 voor groep II). Vervang het medium na 12 uur door 1 mL volledig medium.
- Controleer de fluorescentie markeringen na 48 h.
- Oogst de geïnfecteerde cellen en meng ze op 1:1 ratio met een eindconcentratie van 106/ml.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 110 x g en onderbreek het celmengsel opnieuw in 50 μL injectie oplossing (1640 medium met 10% fbs, 0,05% hyaluronzuur natriumzout, 0,05% methylcellulose).
5. injecteren van gemengde celsuspensie in de zebravis
- Voeg 10x tricaïne oplossing toe aan het E3 water om zebravis larven te anesthetiseren en breng de larven (van stap 2,3) over naar de injectie plaat gevuld met gemodificeerde E3 (E3 met 1 g/L glucose en 5 mmol/L L-glutamine).
- Vul 25 μL gemengde celsuspensie in micro capillairen naald en steek de naald in de micro-injectie manipulator.
- Stel de injectiedruk en-tijd in. Injecteer 50-80 cellen (~ 8 nL) in de dooierzak van 48 HPF zebravis.
6. cultuur van de Xenografted zebravis (zPDX-model)
- Breng de na xenografted zebravis larven over in 40 ml Meng oplossing (E3 oplossing met 1 g/l glucose en 5 mmol/l l-glutamine) bij 32 °c.
7. Drug Administration op de Xenografted zebravis en de beoordeling van tumor cellen/fibroblasten Vivaardigheden
-
Bepaling van de optimale concentratie van Gemcitabine/navitoclax.
- Plaats 10 wild type zebravis embryo's op 48 HPF in elke put van een 12-well plaat.
- Voeg in elk goed verschillende concentraties Gemcitabine of navitoclax toe en incuberen gedurende twee dagen bij 32 °C.
- Bereken na 2 dagen de maximale tolerantie dosering (MTD) van Gemcitabine en navitoclax waarbij de zebravis larven geen significante misvorming en abnormaal gedrag vertonen, en de werk concentraties worden onder de MTD vastgesteld.
-
Behandeling van zPDX-modellen met Gemcitabine/navitoclax.
- Plaats 10 xenografted larven in elke put van een 12 goed bord.
- Verdeel de larven in vier groepen, behandel de controlegroep in E3 met 0,1% DMSO, en behandel de andere groepen met 5 μg/mL Gemcitabine en/of 50 μM navitoclax, en inincuberen bij 32 °C gedurende twee dagen.
-
Beoordeling van de celvivaardigheden en cellulaire samenstelling in zPDX-modellen.
- Anesthetiseer de xenografted larven na de behandeling en plaats ze in 3% methylcellulose.
- Afbeelding van de larven uit de laterale weergave met behulp van een fluorescentiemicroscoop of confocale Microscoop.
- Kwantificeer de intensiteit van rode en groene fluorescentie signalen met behulp van ImageJ en GraphPad-software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische schets van de procedure wordt weergegeven in Figuur 1. Kortom, de primaire kanker weefselcellen werden in het volledige medium na de spijsvertering, met of zonder toevoeging van alvleesklierkanker fibroblast remmers. Kankercellen en fibroblasten werden verrijkt als twee verschillende populaties die fibroblasten gedomineerd zonder remmers, en kanker celgroei heerste na de toevoeging van remmers (Figuur 2). Er werden twee linvirale verpakkings vectoren geconstrueerd, die groene of rode fluorescerende eiwitten en BCL2L1 uitmaakten zoals weergegeven in Figuur 3. De op virussen gebaseerde fluorescerende labeling vertegenwoordigde ook de overlevings status van de cellen. De gemengde kankercellen en fibroblasten werden geïnjecteerd in de zebravis dooier SAC op 48 HPF en werden behandeld door Gemcitabine en/of navitoclax gedurende twee dagen. De celvivaardigheden in verschillende populaties en cellulaire samenstelling van de xenotransplantaatmodellen is werden veranderd als de reacties op de medicamenteuze behandeling (Figuur 4).
Figuur 1: Schematisch diagram van de generatie-en geneesmiddelenbeoordeling van het model zebravis xenotransplantaatmodellen is afgeleid van pancreaskanker. Chirurgisch verwijderde weefsels van patiënten met pancreaskanker worden geschoren en verteerd, gevolgd door cultuur in twee verschillende omstandigheden, waarvan er één wordt toegevoegd door een fibroblast-remmer, en de andere groep niet. Na 1-2 weken waren de primaire cellen genetisch gemodificeerd om een anti-apoptotic Protein BCL2L1 en verschillende fluorescerende eiwitten uit te drukken. Daarna werden de twee populaties gemengd en geïnjecteerd in 48 HPF zebravis larven om de effecten van chemotherapeutische geneesmiddelen te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Cultuur en verrijking van pancreaskanker cellen en fibroblasten. Beelden van kankercellen en fibroblasten verrijkt met drie verschillende pancreaskanker patiënten na 10-dagen cultuur. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: structuur van linvirale vector die BCL2L1 en verschillende fluorescerende eiwitten uitdrukt. Schematisch diagram van twee linvirale vectoren die constant mKate2-E2A-BCL2L1 of eGFP-E2A-BCL2L1 uitdrukken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: effecten op xenotransplantaatmodellen is door Gemcitabine. A) laterale weergave van de xenotransplantaatmodellen is in de dooierzak van zebravis larven op 3 h na transplantatie (hpt). B) representatieve beelden van de xenograften in zebravis larven bij 60 hpt, behandeld door DMSO of Gemcitabine. C) representatieve 3D-rendering van de xenotransplantaten bij 60 hpt. D) statistieken van de intensiteit van de fluorescentie van de xenotransplantaatmodellen is voor en na behandeling met Gemcitabine en/of BCL2L1 remmers. N = 10 per groep voor elke test. Schaalbalk = 100 μm; NS, niet significant; *P < 0,05; P < 0,0001; gemiddelde ± SD, met statistische verschillen bepaald door de One-way ANOVA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zowel de PDX-als de CDX-modellen zijn vitale platformen op het gebied van tumor biologie22, en de kritieke stap van een succesvolle Inter-species transplantatie is het verbeteren van het voortbestaan van de xenograft. Onlangs hebben sommige studies aangetoond dat voorbijgaande expressie van BCL2L1 (BCL-XL) of BCL2 de levensvatbaarheid van menselijke embryonale stamcellen bij muizen hosts aanzienlijk kan verbeteren zonder de celidentiteiten en lot23 te beïnvloeden , 24 , 25. in ons manuscript, we gelabeld de cellen met lentivirus voortdurend uitdrukken anti-apoptosis gen BCL2L1 (BCL-XL), evenals fluorescerende eiwitten. De introductie van BCL2L1 heeft de overlevingstijd van xenotransplantaatmodellen is menselijke cellen in zebravis sterk verbeterd om het observatie venster voor de studies te verlengen, terwijl de fluorescerende signalen niet alleen de cellen labelen, maar ook de levens toestand van de cellen, zoals we ontdekten dat de fluorescentie snel vervaagt met de celdood. Ondertussen wijzigen we momenteel de zebravis als een betere gastheer voor menselijke xenografts. Aan de ene kant worden de rag2 en PRKDC uitgeschakeld via crispr/Cas9-technologie om een gecombineerde Immuundeficiënte zebravis te bereiden, die vergelijkbaar was met gecombineerde Immuundeficiënte muizen, om oudere zebravis-larven ook compatibel te maken met menselijke cellen en weefsels26. Aan de andere kant werd de zebravis ook aangepast om menselijke eiwitten zoals IGF1 en INS uit te drukken om de overleving en proliferatie van geïmplanteerde menselijke cellen beter te ondersteunen door gebruik te maken van de Tol2 transposon-gemedieerde transgene technologie. Bovendien mist zPDX ook een mensachtig functioneel immuunsysteem en de interacties tussen menselijke stromale cellen en het immuunsysteem, en in de toekomst kunnen we proberen menselijke immuuncellen te injecteren om een kortdurende gehumaniseerde immuunomgeving in zebravis te herbouwen.
In de muizen PDX-modellen werden de xenotransplantaat condities van oudsher gecontroleerd door directe observatie op knopen van zichtbare grootte, die een lange tijd nodig hebben om te ontwikkelen. In de transparante zpdx modellen als vergelijking, de xenotransplantaatmodellen is kan worden onderzocht onder microscopie in real time. Het was echter moeilijk om het celnummer te beoordelen in een eenkleurige populatie zonder een goede controle, en het idee om twee celpopulatie van verschillende fluorescentie te introduceren, verbetert de kwantificering van de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk. Door het mengen en injecteren van verschillende cellen op vaste ratio's, we niet alleen nabootsen van de tumor micro omgeving, maar ook in staat zijn om nauwkeurig kwantificeren van de drug Response door het vergelijken van de twee celgroepen. Hoewel de oorspronkelijke verhouding van kankercellen tot fibroblasten in primaire weefsels sterk verschilt, hier begonnen we met 1:1 ratio, en de effecten van medicamenteuze behandeling op dezelfde celsamenstelling van een andere verhouding zullen in de toekomst worden onderzocht. Bovendien vereisen de effecten van 32 °C in plaats van 37 °C incubaties op het gedrag van menselijke cellen ook gedetailleerde vergelijkende studies. Ten slotte kan de strategie van het door de patiënt afgeleide heterogene xenotransplantaatmodellen is-model voor pancreaskanker voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling ook worden toegepast op andere soorten vaste kankers. Deze aanpak is met name handig voor PDX met zebravis larven als gastheren, die glashelder en haalbaar zijn voor analyse bij een resolutie met één cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werden geen potentiële belangenconflicten bekendgemaakt.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door National Natural Science Foundation van China 81402582, Natural Science Foundation van Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 en 18ZR1404500
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
