Summary
يصف هذا البروتوكول إجراءات التحسين في نموذج xenograft الورم المزدوج القائم على الفيروسات باستخدام سمك الحمار الوحشي اليرقات كمضيفين. هذا النموذج xenograft غير متجانسة يحاكي تكوين الأنسجة من سرطان البنكرياس microenvironment في الجسم الحي، ويعمل كأداة أكثر دقة لتقييم استجابات المخدرات في zPDX شخصية (حمار وحشي المريض المستمدة xenograft) النماذج.
Abstract
يُتعتبر الشُوّة السرطان المستمدة من المريض (PDX) وxenograft (CDX) المستمدة من الخلايا من التقنيات الهامة للتقييم قبل السريري، والتوجيه الدوائي، والبحوث الأساسية للسرطان. أجيال من نماذج PDX في الفئران المضيفة التقليدية تستغرق وقتاطويلا وتعمل فقط لنسبة صغيرة من العينات. في الآونة الأخيرة، ظهرت حمار وحشي PDX (zPDX) كنظام مضيف فريد من نوعه، مع خصائص صغيرة النطاق وكفاءة عالية. هنا، نقوم بوصف منهجية محسنة لتوليد نموذج xenograft الورم المزدوج المسمى الفلورة لتقييم العلاج الكيميائي المقارن في نماذج zPDX. تم إثراء الخلايا السرطانية والخلايا الليفية من أنسجة سرطان البنكرياس التي تم حصادها حديثًا أو المجمدة في ظروف ثقافية مختلفة. وقد وصفت كل من مجموعات الخلايا من قبل lentivirus التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء، فضلا عن الجينات المضادة للأبوبوتوس BCL2L1. وكانت الخلايا المتحولة مختلطة مسبقاً وحقنت بالمشاركة في أسماك الحمار الوحشي لليرقات dpf 2 التي ولدت بعد ذلك في متوسط E3 المعدل عند 32 درجة مئوية. تم علاج نماذج xenograft عن طريق أدوية العلاج الكيميائي و / أو مثبطات BCL2L1، وتم التحقيق في حيوي كل من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية في وقت واحد. وباختصار، يسمح هذا البروتوكول للباحثين لتوليد بسرعة كمية كبيرة من نماذج zPDX مع بيئة صغيرة الورم غير متجانسة ويوفر نافذة مراقبة أطول وكمية أكثر دقة في تقييم كفاءة المرشحين المخدرات.
Introduction
الأورام الدقيقة تهدف إلى إيجاد الاستراتيجياتالعلاجية الأكثر فائدة للمريض الفردي 1. حاليا، العديد من النماذج ما قبل السريرية مثلفي المختبر الثقافة الأولية، في المختبر الثقافة العضوية 2، وxenografts المستمدة من المريض (PDX) في الفئران قبل أو بعد الثقافة العضوية المقترحة لتشخيص وفحص / تقييم إمكانات الخيارات العلاجية3. نموذج PDX التي تم إنشاؤها عن طريق حقن خلايا السرطان الأولية البشرية في الفئران المناعية للخطر، هي واحدة من الأدوات الواعدة لفحص المخدرات شخصية في الأورام السريرية3،4. على عكس خط الخلايا المستزرعة في المختبر، عادة ما تحافظ نماذج PDX على سلامة وتباين بيئة الورم في الجسم الحي، وتحاكي بشكل أفضل التنوع والخصائص المميزة لمرضى الأورام المختلفة، وبالتالي، قد تتنبأ النتائج الطبية المحتملة للمرضى4. ومع ذلك، فإن توليد نماذج PDX في الفئران يتطلب عينات عالية الجودة من المرضى وأشهر من الوقت لجمع ما يكفي من الخلايا والنماذج للتجارب متعددة المجموعات، والتراكيب الخلوية / الوراثية من xenograft قد الانجراف من تلك الأصلية المريض'الخزعة. معدل النجاح لإنشاء الفئران PDX نموذج منخفض أيضا، مما يجعل من الصعب أن تنفذ على نطاق واسع في الممارسة السريرية. بالنسبة للمرضى الذين يحملون سرطانات سريعة التقدم مثل سرطان البنكرياس، قد لا تكون قادرة على الحصول على معلومات قيمة من تجارب PDX في الوقت المناسب.
في السنوات القليلة الماضية، وقد أفيد حمار وحشي أن تكون المضيفين المحتملين ليس فقط CDX (خلية المستمدة من الورم xenograft) نماذج، ولكن أيضا نماذج PDX5،6،7،8،9، 10.كالحيوان نموذج الفقاريات، حمار وحشي يأوي أوجه التشابه كافية مع الثدييات في كل من علم الوراثة وعلم وظائف الأعضاء، مع اثنين من المزايا الهامة: الشفافية وصغيرة في الحجم11. حمار وحشي هو أيضا البراز للغاية، ويمكن الحصول على مئات من اليرقات الأصيلة في غضون أيام قليلة من زوج واحد من البالغين12. وقد استخدمت العديد من الدراسات حمار وحشي لتوليد كل من نماذج المعدلة وراثيا وxenograft من أمراض السرطان13،14. بالمقارنة مع الفئران xenografts، حمار وحشي xenografts تسمح تتبع في قرار خلية واحدة. وهناك كمية معينة من الأنسجة البشرية قادرة على توليد مئات من نماذج PDX حمار وحشي (zPDXs)، في حين قد تكون كافية فقط لتوليد زوجين من الفئران نماذج PDX15،16. إلى جانب ذلك، يرقات حمار وحشي في 2-5 dpf بالفعل تطوير أنظمة الدورة الدموية كاملة والأعضاء الأيضية مثل الكبد والكلى، ولكن ليس الجهاز المناعي17، في حين أن كيس صفار المتبقية هي وسيلة 3D الطبيعية، مثالية لفحص المخدرات، والمخدرات اختبارات المقاومة وملاحظاتهجرة الأورام 6،18،19،20،21.
مع محاولة في نهاية المطاف لاستخدام zPDX كمنصة فحص / اختبار للاستخدام السريري، وهنا، ونحن نصف اقتراح الأمثل لنموذج zPDX من سرطان البنكرياس، والذي يسمح في تقييم المخدرات مرشح في الجسم الحي في غضون فترة قصيرة باستخدام خلايا أقل بتكاليف أقل. بالمقارنة مع المراجع السابقةحول zPDX 6،9،10،قدمنا العديد من التحسينات لجعل النظام أكثر جدوى وموثوق بها للتشخيص السريري شخصية: 1) ما قبل الفرز خلية مختلفة المجموعات في أنسجة الورم الأولية وتثبيت الخلايا الأولية لمدة أسبوع واحد قبل إجراء مزيد من التجارب. 2) وضع العلامات على الخلايا البشرية وتعزيز صلاحية الخلية في xenograft عن طريق التعديل الوراثي القائم على فيروس لينتي؛ 3) تحسين حالة ثقافة سمك الحمار الوحشي في كل من المكملات الغذائية (الجلوكوز والجلوتامين) ودرجة الحرارة؛ 4) قياس استجابات المخدرات من أنواع الخلايا المختلفة بطريقة مقارنة. كما قمنا بإجراء تغييرات على حل الحقن عن طريق إضافة العديد من المواد التكميلية. وإجمالا، توفر هذه التحسينات إمكانية توليد بسرعة أكثر من المرضى مثل xenograft في المضيفين حمار وحشي التي يمكن استخدامها كأداة موثوق بها لتقييم استجابة الأدوية المرشحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية واتباع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة فودان وتم الحصول على جميع عينات سرطان البنكرياس من مركز السرطان بجامعة فودان شنغهاي. وتم الحصول على موافقة أخلاقية من لجنة الأخلاقيات التابعة للجامعة، وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض.
1. إعداد المعدات للحقن الدقيق
-
إعداد لوحة الحقن.
- إعداد حل 50 مل من 1٪ أغاروز المذاب في محلول E3 (0.6 غرام / لتر ملح حوض السمك في الماء المقطر مزدوجة + 0.01 ملغ / لتر الميثيلين الأزرق). يُغلى الحل حتى يذوب الأجاروز.
- صب 50 مل من محلول أغاروز في طبق بيتري 10 سم ثم ضع قالب تثبيت الجنين حمار وحشي على السطح. إزالة القالب عندما يصبح الحل أغاروز توطدت.
- إضافة 20 مل من الحل E3 إلى لوحة الحقن والحفاظ عليه في 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
-
إعداد إبر الحقن.
- سحب 10 سم الشعرية الزجاجية مع البعد الداخلي من 0.9 ملم في اثنين من الإبر على سحب إبرة.
- استخدام ملقط لقطع نهاية الإبرة لإنشاء فتحة تحت المجهر.
2. إعداد الأجنة لزرعها
- ضع 1 إلى 2 أزواج من سمك الحمار الوحشي البالغ في خزان التزاوج في الساعة 7-9 مساءً وجمع البيض المخصبة في حوالي الساعة 8 صباحًا من صباح اليوم التالي.
- نقل البيض المخصبة من خزان التزاوج إلى طبق بيتري يحتوي على 40 مل من محلول E3 الطازج وحضانة في 28.5 درجة مئوية.
- بعد 8 ساعة من الحضانة في محلول E3، أضف 0.03٪ 1-phenyl-2-thiourea (PTU) إلى محلول E3 لمنع التصبغ. احتضان الأجنة في حل E3 مع 0.03٪ وحدة حرارية بريطانية عند 28.5 درجة مئوية حتى 48 حصان. يمكن حذف هذه الخطوة إذا كان استخدام في ولدت كاسبر متحولة حمار وحشي.
3. عزل وثقافة الخلايا البشرية الأولية من عينة سرطان البنكرياس الجراحية الطازجة أو الأنسجة المجمدة
- الحصول على عينات من أنسجة سرطان البنكرياس البشرية من حجم حوالي 1 سم3 خلال عملية جراحية في البطن، ونقل الأنسجة على الفور إلى وسائل الإعلام النمو (DMEM مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 10 μM Y-27632، 100 ميكروغرام / مل primocin، 10 ميكروغرام / مل putrescine ثنائي هيدروكلوريد، 10 مليون متر نيكوتيناميد و 1٪ البنسلين ستربيميتسين).
- نقل عينة سرطان البنكرياس في طبق بيتري وإزالة الأنسجة النخرية المحيطة بها، والأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة.
- شطف أنسجة السرطان لمدة 5-6 مرات مع عازلة الفوسفات (PBS) وقطع الأنسجة إلى 1 مم3 قطع باستخدام المشرط.
- نقل الأنسجة المبشورة إلى 5 مل من HBSS في أنبوب 50 مل وإضافة الكولاجين نوع IV، hyaluronidase وDNase الأول بتركيزات نهائية من 200 وحدة / مل، 100 ملغ / لتر و 20 ملغ / لتر، على التوالي. ماصة الخليط صعودا وهبوطا لخلط جيدا.
- احتضان الخليط في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة 15-20 دقيقة.
- إضافة 7 مل من DMEM إلى الأنبوب والطرد المركزي في 110 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية عند اكتمال الهضم.
- Decant supernatant وإعادة تعليق خليط الورم في DMEM.
- طبق الخليط في طبق بيتري 6 سم في 3 مل من وسائل الإعلام النمو الكامل (DMEM مع 10٪ FBS، 20 ميكروغرام / مل الأنسولين، 100 نانوغرام / مل bFGF، 10 نانوغرام / مل EGF، 10 م Y-27632، 100 ميكروغرام / مل primocin، 10 ميكروغرام / مل بيوتريسين ديهيدروكلوريد، 10 مل نيكوتيناميد ، 1٪ البنسلين العقدية). افصل الخلايا إلى مجموعتين.
- في المجموعة 1، إضافة مثبط 100X من الخلايا الليفية سرطان البنكرياس في المتوسط بعد 48 ساعة لإزالة الخلايا الليفية متضخمة، وترك الخلايا السرطانية كأنواع الخلايا الرئيسية؛. في المجموعة الثانية، سوف تتفوق الخلايا الليفية على الخلايا السرطانية في غضون أسبوع.
- ثقافة كل من مجموعات الخلايا لمدة 1-2 أسبوع اعتمادا على كثافة الخلية / النقاء وتغيير وسائل الإعلام كل ثلاثة أيام. أنواع الخلايا المتوقعة في كل من المجموعة الأولى والثانية يمكن أن تشغل أكثر من 98٪ في نسبة في تجربة ناجحة typic.
4. وضع العلامات على الخلايا مع لينتيفيروس التعبير عن مكافحة المبرمج الجينات BCL2L1 (BCL-XL) والبروتينات الفلورية المختلفة بشكل منفصل
-
إنتاج فيروس لينتي
- لوحة 3 × 106 خلايا HEK 293T مع كامل DMEM المتوسطة (DMEM الموردة مع FBS 10٪) في 10 سم أطباق والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. استبدل الوسيط بـ 6 مل من الوسائط الخالية من المصل قبل الانحراف.
- إعداد الحل A: 8 ميكروغرام من BCL2L1-التي تحتوي على ناقلات اللاتيفيروسي (pCDH-EF1α-mKate2-E2A-BCL2L1-WPRE أو pCDH-EF1α-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE)، 2.4 ميكروغرام من pVSVG، 4 ميكروغرام من pMDL (الكمامة/بول)، 1.6 ميكروغرام من pREV وDMEM خالية من المصل في حجم إجمالي قدره 500 درجة مئوية. الخليط عدة مرات، ووضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إعداد الحل B: 40 درجة مئوية من جزيرة الأمير إدوارد (البولي إثيلينأمين) في 460 درجة مئوية خالية من المصل DMEM. وضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- ببطء إضافة الحل B في الحل A وترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أضف الخليط النهائي إلى طبق ثقافة الخلايا HEK 293T المعد في الخطوة 4.1.1 وحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة لثاني أكسيد الكربون بنسبة 5%. بعد 12 ساعة، إضافة 5 مل إضافية من وسيط DMEM كاملة. بعد 48 ساعة، حصاد المتوسطة التي تحتوي على فيروس لينتي.
- تصفية supernatant باستخدام مرشح معقمة 0.45 م، إضافة supernatant في عمود تركيز، الطرد المركزي في 6000 × ز لمدة 25-30 دقيقة في 4 درجة مئوية. يتم إجراء aliquots lentivirus من 100 درجة مئوية لكل أنبوب وتخزينها في -80 درجة مئوية.
-
عدوى الخلايا الأولية
- بذور الخلايا (المجموعة الأولى والثانية) لتكون مصابة في لوحة 12 جيدا مع 30-40٪ كثافة وثقافة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.
- استبدل المتوسط بـ 500 ميكرولتر من المصل المتوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على 8 ميكروغرام/مل من البوليبرين لمدة 4 ساعة. ثم قم بإضافة 100 ميكرولتر إضافية من فيروس اللينتي إلى الوسط (eGFP-E2A-BCL2L1 للمجموعة الأولى أو mKate2-E2A-BCL2L1 للمجموعة الثانية). بعد 12 ساعة، استبدال المتوسطة مع 1 مل من المتوسطة كاملة.
- تحقق من علامات الفلورة بعد 48 ساعة.
- حصاد الخلايا المصابة ومزجها بنسبة 1:1 مع تركيز نهائي من 106/مل.
- طرد الخلايا في 110 × ز لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق خليط الخلية في 50 درجة مئوية من محلول الحقن (1640 المتوسطة مع 10٪ FBS، 0.05٪ ملح الصوديوم حمض الهيالورونيكس، 0.05٪ ميثيل سيلولوز).
5. حقن تعليق الخلية المختلطة في حمار وحشي
- إضافة 10X حل tricaine في المياه E3 لالتخدير يرقات حمار وحشي ونقل اليرقات (من الخطوة 2.3) إلى لوحة حقن مليئة المعدلة E3 (E3 مع 1 غرام / لتر الجلوكوز و 5 مليمول / L-الجلوتامين).
- ملء 25 ميكرولتر من تعليق الخلية المختلطة في إبرة الشعيرات الدموية الدقيقة وإدراج الإبرة في المتلاعب حقن الدقيقة.
- تعيين ضغط الحقن والوقت. حقن 50-80 خلية (~ 8 نمل) في كيس صفار من 48 حمار وحشي hpf.
6. ثقافة سمك الحمار الوحشي Xenografted (نموذج zPDX)
- نقل يرقات سمك الحمار الوحشي بعد xenografted في 40 مل من حل مزيج (E3 الحل مع 1 غرام / لتر الجلوكوز و 5 مليمول / لتر L-الجلوتامين) في 32 درجة مئوية.
7. إدارة الأدوية على حمار وحشي Xenografted وتقييم الخلايا السرطانية / الأورام الليفية
-
تحديد التركيز الأمثل للجيمسيتابين / نافيتوكلاكس.
- ضع 10 أجنة حمار وحشي من النوع البري عند 48 حصانًا في كل بئر من طبق من 12 بئرًا.
- إضافة تركيزات مختلفة من gemcitabine أو navitoclax في كل بئر وحضانة في 32 درجة مئوية لمدة يومين.
- بعد 2 أيام، حساب جرعة التسامح القصوى (MTD) من gemcitabine وnavitoclax التي يرقات حمار وحشي لا تظهر تشوه كبير والسلوك غير طبيعي، ويتم تعيين تركيزات العمل تحت MTD.
-
علاج نماذج zPDX مع gemcitabine / navitoclax.
- ضع 10 يرقات مُرَفّفة في كل بئر من 12 طبق بئر.
- تقسيم اليرقات إلى أربع مجموعات، وعلاج مجموعة التحكم في E3 تحتوي على 0.1٪ DMSO، وعلاج المجموعات الأخرى مع 5 ميكروغرام / مل gemcitabine و / أو 50 ميكرومتر navitoclax، وحضانة في 32 درجة مئوية لمدة يومين.
-
تقييم حيوية الخلية والتكوين الخلوي في نماذج zPDX.
- التخدير اليرقات xenografted بعد العلاج ووضعها في 3٪ ميثيل سيلولوز.
- صورة اليرقات من وجهة النظر الجانبية باستخدام مجهر الفلورة أو المجهر البؤري.
- قياس كثافة إشارات الفلورة الحمراء والخضراء باستخدام ImageJ وبرنامج GraphPad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تمثيل مخطط تفصيلي للإجراء في الشكل 1. باختصار، تم زرع خلايا الأنسجة السرطانية الأولية في الوسط الكامل بعد الهضم مع أو بدون إضافة مثبطات الخلايا الليفية لسرطان البنكرياس. تم إثراء الخلايا السرطانية والخلايا الليفية كاثنين من السكان المتميزين أن الخلايا الليفية هيمنت دون مثبطات، وساد نمو الخلايا السرطانية بعد إضافة مثبطات (الشكل2). تم بناء متجهين للتغليف في مجال التغليف، مما عبّر عن بروتينات فلورية خضراء أو حمراء وBCL2L1 كما هو مبين في الشكل3. كما تمثل وضع العلامات الفلورية المستندة إلى الفيروس حالة بقاء الخلايا. تم حقن الخلايا السرطانية المختلطة والخلايا الليفية في كيس صفار السمك الوحشي في 48 حصان وعولجت من قبل gemcitabine و / أو navitoclax لمدة يومين. تم تغيير حيوية الخلية في مختلف السكان والتكوين الخلوي للxenograft كماالاستجابات لعلاج المخدرات (الشكل 4).
الشكل 1: رسم تخطيطي للجيل وتقييم المخدرات لنموذج xenograft حمار وحشي المستمدة من سرطان البنكرياس. يتم قص الأنسجة التي تتم إزالتها جراحيًا من المرضى المصابين بسرطان البنكرياس وهضمها، تليها الثقافة في شرطين مختلفين، يتم إضافة أحدهما بواسطة مثبط للفلي، والمجموعة الأخرى ليست كذلك. بعد 1-2 أسابيع، تم تعديل الخلايا الأولية وراثيا للتعبير عن البروتين المضاد للأبوبة BCL2L1 والبروتينات الفلورية المختلفة. بعد ذلك، تم خلط السكان اثنين وحقن مشترك في 48 يرقات حمار وحشي hpf لتقييم آثار الأدوية العلاجية الكيميائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ثقافة وإثراء خلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية. صور الخلايا السرطانية والخلايا الليفية المخصب من ثلاثة مرضى سرطان البنكرياس مختلفة بعد ثقافة 10 أيام. شريط مقياس، 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: هيكل ناقلات اللينفيروسي التعبير عن BCL2L1 والبروتينات الفلورية المختلفة. رسم تخطيطي لاثنين من ناقلات لينتيفيروسي تعبر باستمرار mKate2-E2A-BCL2L1 أو eGFP-E2A-BCL2L1، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الآثار على xenograft من قبل gemcitabine. (أ) عرض جانبي للجرافوجراففي كيس صفار يرقات سمك الحمار الوحشي في 3 ح بعد زرع (hpt). (ب) الصور التمثيلية للxenografts في يرقات سمك الحمار الوحشي في 60 حصانا، المعالجة من قبل DMSO أو gemcitabine. (C) ممثل 3D تقديم xenografts في 60 حصان. (د) إحصاءات شدة الفلورة من xenograft قبل وبعد gemcitabine و / أو BCL2L1 علاج مثبطات. N = 10 لكل مجموعة لكل asay. شريط مقياس = 100 ميكرومتر؛ NS، ليست كبيرة؛ *P < 0.05; P < 0.0001; يعني ± SD، مع الاختلافات الإحصائية التي تحددها ANOVA في اتجاه واحد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كل من نماذج PDX وCDX هي منصات حيوية في مجال بيولوجيا الورم22، والخطوة الحاسمة من زرع ناجحة بين الأنواع هو تحسين بقاء xenograft. في الآونة الأخيرة، أظهرت بعض الدراسات أن التعبير العابر من BCL2L1 (BCL-XL) أو BCL2 قد تحسن بشكل كبير من جدوى الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الفئران المضيفين دون التأثير على هويات الخلايا ومصائر23 , 24 , 25.في مخطوطتنا، ونحن المسمى الخلايا مع لينتيفيروس التعبير باستمرار المضادة للأبوبتوسي الجينات BCL2L1 (BCL-XL)،فضلا عن البروتينات الفلورية. إدخال BCL2L1 عززت إلى حد كبير وقت البقاء على قيد الحياة من الخلايا البشرية xenograft في حمار وحشي لإطالة نافذة المراقبة للدراسات، في حين أن إشارات الفلورسنت ليس فقط تسمية الخلايا، ولكن أيضا الإبلاغ عن حالة المعيشة لل الخلايا، كما وجدنا أن الفلورة تتلاشى بسرعة مع موت الخلية. وفي الوقت نفسه، نحن حاليا تعديل حمار وحشي كمضيف أفضل لxenografts الإنسان. من ناحية، يتم ضرب rag2 وprkdc من خلال تكنولوجيا CRISPR /Cas9 لإعداد سمكحمار وحشي مشترك ناقص المناعة، والذي كان مشابها للفئران التي تعاني من نقص المناعة مجتمعة، لجعل يرقات سمك الحمار الوحشي القديمة متوافقة أيضا مع الخلايا البشرية والأنسجة26. ومن ناحية أخرى، تم تعديل سمك الحمار الوحشي أيضا للتعبير عن البروتينات البشرية مثل منتدى إدارة الإنترنت 1 وINS لدعم أفضل لبقاء وانتشار الخلايا البشرية المزروعة باستخدام التكنولوجيا المعدلة وراثيا التي يتم تحويلها إلى تول 2. وعلاوة على ذلك، zPDX يفتقر أيضا إلى نظام المناعة وظيفية مثل الإنسان، والتفاعلات بين الخلايا سترومال البشرية والجهاز المناعي، وفي المستقبل، ونحن قد نحاول حقن الخلايا المناعية البشرية لإعادة بناء بيئة مناعية إنسانية قصيرة الأجل في حمار وحشي.
في نماذج PDX الفئران، تم رصد ظروف xenograft تقليديا عن طريق المراقبة المباشرة على العقد من حجم مرئي، والتي تتطلب وقتا طويلا لتطوير. في نماذج zPDX شفافة بالمقارنة، يمكن التحقيق xenograft تحت الفحص المجهري في الوقت الحقيقي. ومع ذلك، كان من الصعب تقييم تبديل اتّعاب رقم الخلية في مجموعة من لون واحد دون رقابة مناسبة، وفكرة إدخال اثنين من سكان الخلايا من الفلورة المختلفة يحسن بشكل كبير من تكميم صلاحية الخلية. عن طريق خلط وحقن خلايا مختلفة في نسب ثابتة، ونحن لا مجرد تقليد البيئة الدقيقة الورم، ولكن أيضا قادرة على قياس بدقة استجابة المخدرات عن طريق مقارنة مجموعتي الخلايا. على الرغم من أن النسبة الأصلية للخلايا السرطانية إلى الخلايا الليفية في الأنسجة الأولية مختلفة للغاية، وهنا بدأنا بنسبة 1:1، وسيتم التحقيق في آثار العلاج من المخدرات على نفس تكوين الخلية من نسبة مختلفة في المستقبل. إلى جانب ذلك، فإن آثار 32 درجة مئوية بدلا من 37 درجة مئوية الحضانة على سلوكيات الخلايا البشرية تتطلب أيضا دراسات مقارنة مفصلة. وأخيرا، يمكن أيضا تطبيق استراتيجية نموذج xenograft غير متجانسة المستمدة من المريض لسرطان البنكرياس لتقييم المخدرات المقارنة لأنواع أخرى من السرطانات الصلبة. وهذا النهج مفيد بشكل خاص لـ PDX باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين، وهي واضحة وضوح الشمس وممكنة للتحليل عند دقة الخلية الواحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يكشف عن أي تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 81402582، مؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي 12DZ2295100، 14YF1400600 و 18ZR1404500
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
