Summary
该协议描述了基于病毒的双荧光标记肿瘤异种移植模型中的优化过程,使用幼虫斑马鱼作为宿主。这种异质异种异种移植模型模仿胰腺癌在体内微环境的组织组成,并作为在个性化zPDX(斑马鱼患者衍生异种移植)模型中评估药物反应的更精确的工具。
Abstract
患者衍生的肿瘤异种移植(PDX)和细胞衍生肿瘤异种移植(CDX)是临床前评估、药物指导和基础癌症研究的重要技术。传统宿主小鼠的一代 PDX 模型非常耗时,只适用于一小部分样本。近年来,斑马鱼PDX(zPDX)已成为一种独特的宿主系统,具有体积小、效率高的特点。在这里,我们描述了一种优化的方法,用于在zPDX模型中生成双荧光标记肿瘤异种移植模型,用于比较化疗评估。肿瘤细胞和成纤维细胞在不同的培养条件下从新鲜收获或冷冻的胰腺癌组织中丰富。两个细胞组都标有表达绿色或红色荧光蛋白的慢病毒,以及抗凋亡基因BCL2L1。转染细胞被预混合,并共同注入2dpf幼虫斑马鱼,然后在32°C的改性E3培养中繁殖。用化疗药物和/或BCL2L1抑制剂治疗异种移植模型,同时研究肿瘤细胞和成纤维细胞的毒性。总之,该协议允许研究人员快速生成具有异构肿瘤微环境的大量zPDX模型,并提供更长的观察窗口和更精确的定量评估药物候选者的效率。
Introduction
精准肿瘤学旨在为个别患者找到最有益的治疗策略。目前,提出了许多临床前模型,如体外原发培养、体外有机体培养2和小鼠中患者衍生的异种移植(PDX),在有机体培养前后被建议用于诊断和筛选/评估潜力治疗选择3.PDX模型由人类原发性癌细胞注入免疫功能受损的小鼠,是临床肿瘤学3、4中最有前途的个性化药物筛选工具之一。与体外培养的细胞系不同,PDX模型通常保持体内肿瘤环境的完整性和异质性,更好地模仿不同肿瘤患者的多样性和特异性,因此,可以预测患者的潜在医疗结果4。然而,在小鼠中生成PDX模型需要高质量的患者样本和数月时间来收集足够的细胞和模型进行多组实验,异种移植物的细胞/遗传成分可能与原来的细胞/遗传成分漂移病人的活检小鼠PDX模型的建立成功率也较低,难以在临床实践中得到广泛应用。对于携带胰腺癌等快速进展癌症的患者,他们可能无法及时从PDX实验中获得有价值的信息。
在过去几年中,斑马鱼被报道为不仅CDX(细胞衍生肿瘤异种移植)模型的潜在宿主,而且PDX模型5,6,7,8,9,10.作为脊椎动物的模型动物,斑马鱼在遗传学和生理学上都与哺乳动物有着足够的相似性,具有两个显著的优势:透明度和小尺寸11。斑马鱼的繁殖性也很高,几天之内就可以从一对12岁的成年人身上获得数百只近亲繁殖的幼虫。几项研究已经利用斑马鱼生成癌症疾病的转基因和异种移植模型13,14。与小鼠异种移植相比,斑马鱼异种移植允许在单细胞分辨率下进行跟踪。一定数量的人体组织能够产生数百种斑马鱼PDX模型(zPDX),而可能只能产生一对小鼠PDX模型15,16。此外,斑马鱼幼虫在2-5 dpf已经发展了完整的循环系统和代谢器官,如肝脏和肾脏,但不是免疫系统17,而剩余的蛋黄囊是一个天然的3D介质,理想的药物筛选,药物抗药性试验和肿瘤迁移观察6,18,19,20,21。
随着最终尝试使用zPDX作为临床使用的筛选/测试平台,在这里,我们描述了胰腺癌zPDX模型的优化方案,它允许在短时间内使用更少的细胞以更低的成本进行体内候选药物评估。与之前关于zPDX6、9、10的参考文献相比,我们引入了几种优化,使系统在临床个性化诊断中更加可行和可靠:1)对不同细胞进行预排序在原发性肿瘤组织中组并稳定原发细胞一周,然后再进行进一步的实验;2) 通过基于慢病毒的遗传修饰标记人体细胞,增强异种移植物的细胞活力;3) 优化营养补充剂(葡萄糖和谷氨酰胺)和温度的斑马鱼养殖条件;4) 以比较方式量化不同细胞类型的药物反应。我们还通过添加几种补充材料对注射液进行了更改。总之,这些改进提供了在斑马鱼宿主中快速产生一种更类似患者的异种移植物的可能性,这种异种移植可用于评估候选药物的反应。
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Protocol
所有动物程序均得到复旦大学动物伦理委员会的批准和遵循,所有胰腺癌标本均从复旦大学上海癌症中心获得。道德认证得到了FUSCC道德委员会的批准,并征求了每位患者的书面知情同意。
1. 准备显微注射设备
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准备注塑板。
- 制备溶解在E3溶液中的1%角质的50 mL溶液(双蒸馏水中0.6克/升水族盐= 0.01 mg/L亚甲蓝)。将溶液煮沸,直到甘蔗溶解。
- 将50 mL的琼脂花溶液倒入10厘米培养皿中,然后将斑马鱼胚胎固定模具放在表面上。当甘蔗液凝固时,拆下模具。
- 将20 mL的E3溶液加入注塑板,并将其保持在4°C,用于长期储存。
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准备注射针。
- 将内尺寸为 0.9 mm 的 10 厘米玻璃毛细管拉入针拉器上的两根针中。
- 使用钳子切割针的末端,在显微镜下形成开口。
2. 准备胚胎移植
- 晚上7至9时将1至2对成年斑马鱼放入交配箱,并在次日上午8时左右收集受精卵。
- 将受精卵从交配罐转移到含有40 mL新鲜E3溶液的培养皿中,并在28.5°C孵育。
- 在E3溶液中孵育8小时后,将0.03%的1-苯基-2-硫尿(PTU)加入E3溶液中,以抑制色素沉着。在28.5°C下用0.03%PTU孵育E3溶液中的胚胎,直到48 hpf。如果使用繁殖的卡斯珀突变斑马鱼,可以省略此步骤。
3. 新鲜外科胰腺癌标本或冷冻组织原发性人体细胞的分离与培养
- 在腹部手术期间获取大小约1cm3的人类胰腺癌组织标本,并立即将组织转移到生长培养基(DMEM与10%胎儿牛血清(FBS),10μM Y-27632,100μg/mL初发素,10μg/mL普赖辛二氯化物,10 mM烟酰胺和1%青霉素链霉素)。
- 将胰腺癌样本转移到培养皿中,并去除周围的坏死组织、脂肪组织和结缔组织。
- 用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗癌症组织5-6次,并用手术刀将组织切成1毫米3片。
- 将切碎的组织转移到5mL的HBSS在50 mL管中,并分别添加胶原酶IV型、透明质尿酶和DNase I,最终浓度分别为200单位/mL、100mg/L和20mg/L。上下移液混合物,以混合良好。
- 在5%的二氧化碳培养箱中以37°C孵育混合物15-20分钟。每5分钟将混合物上下几次上下。
- 在4°C下,在110 x g下加入7 mL的DMEM,并在4°C下离心5分钟。
- 在DMEM中去除了上清液并重新悬浮肿瘤混合物。
- 将混合物放入3 mL的全生长培养基(DMEM,含有10%FBS、20 μg/mL胰岛素、100纳克/mL bFGF、10纳克/mL EGF、10 μM Y-27632、100 μg/mL原原素、10微克/mL二氯化物、10个二氯苯、10个二氯胺酮)的6厘米培养皿中。,1%青霉素链霉素)。将单元格分成两组。
- 在组I中,在48小时后将胰腺癌成纤维细胞的100x抑制剂加入培养基中,以去除过度生长的纤维细胞,使癌细胞成为主要细胞类型;在第二组,成纤维细胞将在一周内超过癌细胞。
- 根据细胞密度/纯度,将两个细胞组培养1-2周,并每三天更换一次介质。在Typic成功的实验中,I组和II组的预期细胞类型的比例可占98%以上。
4. 分别用表达抗凋亡基因BCL2L1(BCL-XL)和不同荧光蛋白的Lenti病毒标记细胞
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伦蒂病毒生产
- 板 3 x 106 HEK 293T 细胞,具有完整的 DMEM 培养基(DMEM 提供 10% FBS),在 10 厘米的菜肴中,在 37°C 下在 5% 的二氧化碳培养箱中培养。在转染前,用6mL的无血清介质替换培养基。
- 制备溶液A:8μgBCL2L1 -含慢病毒载体(pCDH-EF1+-mKate2-E2A-BCL2L1-WPRE或pCDH-EF1+-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE),2.4微克pVSVG, 4 μg pMDL(加格/波尔),1.6 μg pREV 和无血清 DMEM,总体积为 500 μL。 混合物几次,并将其置于室温下5分钟。
- 制备溶液B:40μL的PEI(聚乙烯胺),在460μL无血清DMEM中。将其置于室温下 5 分钟。
- 慢慢将溶液B加入溶液A中,将管在室温下保持30分钟。
- 将最终混合物加入步骤4.1.1中制备的HEK 293T细胞培养皿中,在37°C下在5%的二氧化碳培养箱中孵育。12 小时后,添加完整的 DMEM 介质的 5 mL。48小时后,收获含有扁豆病毒的培养基。
- 使用0.45μm无菌过滤器过滤上清液,将上清液加入浓度柱中,在6000 x g下离心25-30分钟,在4°C下。每管100μL的慢病毒等分在-80°C下制成并储存。
-
主细胞感染
- 将细胞(I组和II组)在12孔板中感染,密度为30-40%,并在5%的二氧化碳培养箱中以37°C培养细胞过夜。
- 用含有8微克/mL的聚宝烯的500μL无血清培养基替换该培养基,4小时。然后,在介质中再添加 100 μL 的慢病毒(eGFP-E2A-BCL2L1 用于第一组,或 mKate2-E2A-BCL2L1 为 II 组)。12 小时后,将介质更换为 1 mL 的完整介质。
- 在 48 小时后检查荧光标记。
- 收获受感染的细胞,以1:1的比例与最终浓度为10 6/mL混合。
- 在110 x g下将细胞离心5分钟,并在50μL注射溶液中重新悬浮细胞混合物(1640培养基,10%FBS,0.05%透明质酸钠盐,0.05%甲基纤维素)。
5. 将混合细胞悬浮液注入斑马鱼
- 将10倍三叶草溶液加入E3水中,麻醉斑马鱼幼虫,并将幼虫(从步骤2.3)转移到由改性E3填充的注射板(E3含有1克/L葡萄糖和5毫摩尔/L-谷氨酰胺)。
- 将25μL的混合细胞悬浮液填充到微毛细血管中,并将针头插入微注射操纵器中。
- 设置喷射压力和时间。将50-80个细胞(+8 nL)注射到48 hpf斑马鱼的蛋黄囊中。
6. 异种斑马鱼的培养(zPDX模型)
- 在32°C下将异种后斑马鱼幼虫转移到40 mL的混合溶液中(E3溶液,1克/升葡萄糖和5 mmol/L-谷氨酰胺)。
7. 异种斑马鱼药物管理局与肿瘤细胞/纤维细胞病毒评估
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确定宝石素/纳维托克辛的最佳浓度。
- 将10个野生型斑马鱼胚胎以48 hpf放入12孔板的每个井中。
- 在每个井中加入不同浓度的宝石素或纳维托克,并在32°C孵育两天。
- 2天后,计算斑马鱼幼虫未表现出明显畸形和异常行为的宝石素和纳维他克的最大耐受剂量(MTD),工作浓度设定在MTD以下。
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处理zPDX模型与宝石素/纳维托克。
- 将10个异种幼虫放入12孔板的每个井中。
- 将幼虫分成四组,在E3中治疗含有0.1%DMSO的对照组,用5μg/mL gemcitabine和/或50μM纳维托克治疗其他组,并在32°C孵育两天。
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zPDX模型中细胞活力和细胞组成的评估。
- 麻醉异种移植幼虫治疗后,并把它们放在3%的甲基纤维素。
- 使用荧光显微镜或共聚焦显微镜从横向视图中成像幼虫。
- 使用 ImageJ 和 GraphPad 软件量化红色和绿色荧光信号的强度。
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Representative Results
图 1中表示该过程的架构化大纲。简而言之,原发性癌症组织细胞在消化后种子到完整的培养基中,无论是否添加胰腺癌成纤维细胞抑制剂。癌细胞和成纤维细胞被浓缩为两个不同的群体,成纤维细胞在没有抑制剂的情况下占主导地位,而癌细胞生长在添加抑制剂后占主导地位(图2)。构建了两个慢病毒包装载体,分别表示绿色或红色荧光蛋白和BCL2L1,如图3所示。基于病毒的荧光标记也代表了细胞的生存状态。混合癌细胞和成纤维细胞被注射到斑马鱼蛋黄囊在48 hpf,并治疗Gemcitabine和/或纳维托克。不同人群的细胞活力和异种移植物的细胞组成随着对药物治疗的反应而改变(图4)。
图1:胰腺癌的斑马鱼异种移植模型的生成和药物评估的原理图。从胰腺癌患者的手术切除组织被切和消化,随后在两种不同的条件下培养,其中一种由成纤维细胞抑制剂添加,另一组不。1-2周后,对原细胞进行基因改造,以表达抗凋亡蛋白BCL2L1和不同的荧光蛋白。之后,将两个种群混合并共同注射到48hpf斑马鱼幼虫中,以评估化疗药物的效果。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:胰腺癌细胞和成纤维细胞的培养和富集。癌细胞和成纤维细胞的图像,从三个不同的胰腺癌患者在10天的培养后丰富。刻度条,100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:表达BCL2L1和不同荧光蛋白的慢病毒载体结构。两个慢病毒载体的原理图,分别分别表达 mKate2-E2A-BCL2L1 或 eGFP-E2A-BCL2L1。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:宝石异种移植对异种移植的影响。(A) 移植后3小时(hpt)斑马鱼幼虫蛋黄囊异种移植的横向视图。(B) 斑马鱼幼虫在60 hpt时的代表性图像,由DMSO或Gemcitabine处理。(C) 以 60 hpt 表示异种移植的 3D 渲染。(D) 诊断素治疗前后异种移植物的荧光强度统计和/或BCL2L1抑制剂处理。N = 每组每组 10 个。刻度条 = 100 μm;NS,不重要;•P < 0.05;P < 0.0001;均值 = SD,统计差异由单向方差确定。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
PDX和CDX模型都是肿瘤生物学领域的重要平台,成功的物种间移植的关键步骤是提高异种移植的存活率。 最近,一些研究表明,BCL2L1(BCL-XL)或BCL2的瞬态表达可以显著提高小鼠宿主中人类胚胎干细胞的生存能力,而不会影响细胞特性和命运23,24,25.在我们的手稿中,我们标记了含有慢病毒的细胞,这些细胞不断表达抗凋亡基因BCL2L1(BCL-XL)以及荧光蛋白。BCL2L1的引入大大提高了斑马鱼异种移植人类细胞的存活时间,延长了研究的观察窗口,同时荧光信号不仅标记了细胞,还报道了斑马鱼的存活率。细胞,因为我们发现荧光随着细胞死亡而迅速消退。 同时,我们目前正在修改斑马鱼,作为人类异种移植物更好的宿主。一方面,rag2和prkdc正在通过CRISPR/Cas9技术被击倒,以制备一种与联合免疫缺陷小鼠类似的联合免疫缺陷斑马鱼,使年龄较大的斑马鱼幼虫也兼容与人类细胞和组织26。另一方面,斑马鱼也经过改造,以表达IGF1和INS等人类蛋白质,利用Tol2转宗介导转基因技术更好地支持植入的人类细胞的生存和增殖。此外,zPDX还缺乏人样功能免疫系统,以及人类基质细胞与免疫系统之间的相互作用,今后,我们可以尝试共同注入人类免疫细胞,以重建斑马鱼的短期人性化免疫环境。
在小鼠PDX模型中,异种移植条件传统上通过直接观察可见大小的节点来监测,这需要很长时间才能发展。在透明zPDX模型中,异种移植可以在显微镜下实时研究。然而,如果没有适当的控制,很难评估单色种群中的细胞数量交替,引入两个不同荧光的细胞群的想法可以显著提高细胞活力的定量。通过以固定比率混合和注射不同的细胞,我们不仅模拟肿瘤微环境,而且通过比较两个细胞组来准确量化药物反应。虽然原代组织癌细胞与成纤维细胞的原始比例有很大的不同,但这里从1:1的比例开始,将来将研究药物治疗对相同细胞组合物不同比例的影响。此外,32°C而不是37°C孵育对人体细胞行为的影响也需要详细的比较研究。最后,用于比较药物评估的胰腺癌患者衍生异质异种移植模型的策略也可以应用于其他类型的固体癌症。这种方法对于使用斑马鱼幼虫作为宿主的PDX特别有用,这种宿主非常清晰,并且可用于单细胞分辨率的分析。
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Disclosures
未披露任何潜在的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金81402582、上海自然科学基金12DZ2295100、14YF1400600和18ZR1404500的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
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