Summary
Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren in einem virusbasierten Dual-Fluoreszenz-markierten Tumor-Xenograft-Modell unter Verwendung von Larvenzebrafischen als Wirte. Dieses heterogene Xenograft-Modell imitiert die Gewebezusammensetzung der Mikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs in vivo und dient als präziseres Werkzeug zur Beurteilung von Arzneimittelreaktionen in personalisierten zPDX-Modellen (Zebrafish Patient-derived xenograft).
Abstract
Patienten-abgeleitetes Tumorxenograft (PDX) und zellabgeleitetes Tumorxenograft (CDX) sind wichtige Techniken für die präklinische Bewertung, Medikationsberatung und grundlegende Krebsforschung. Generationen von PDX-Modellen in traditionellen Wirtsmäusen sind zeitaufwändig und arbeiten nur für einen kleinen Teil der Proben. In letzter Zeit hat sich zebrafish PDX (zPDX) zu einem einzigartigen Wirtssystem entwickelt, mit den Eigenschaften von klein und hoch effizient. Hier beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Erzeugung eines dualen fluoreszenzmarkierten Tumor-Xenograft-Modells zur vergleichenden Chemotherapie-Bewertung in zPDX-Modellen. Tumorzellen und Fibroblasten wurden aus frisch geerntetem oder gefrorenem Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe unter verschiedenen Kulturbedingungen angereichert. Beide Zellgruppen wurden durch Lentivirus mit grünen oder roten fluoreszierenden Proteinen sowie einem Anti-Apoptose-Gen BCL2L1gekennzeichnet. Die transfizierten Zellen wurden vorgemischt und in die 2 dpf Larvenzebrafische mitinjiziert, die dann in modifiziertem E3-Medium bei 32 °C gezüchtet wurden. Die Xenograft-Modelle wurden mit Chemotherapie-Medikamenten und/oder BCL2L1-Hemmern behandelt, und die Viabilitäten von Tumorzellen und Fibroblasten wurden gleichzeitig untersucht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll es Forschern ermöglicht, schnell eine große Menge an zPDX-Modellen mit einer heterogenen Tumormikroumgebung zu generieren und bietet ein längeres Beobachtungsfenster und eine genauere Quantifizierung bei der Bewertung der Effizienz von Wirkstoffkandidaten.
Introduction
Die Präzisionsonkologie zielt darauf ab, die vorteilhaftesten therapeutischen Strategien für den einzelnen Patienten zu finden1. Derzeit werden zahlreiche präklinische Modelle wie In-vitro-Primärkultur, In-vitro-Organoidkultur2und patientenabgeleitete Xenografts (PDX) bei Mäusen vor oder nach der Organoidkultur zur Diagnose und zur Prüfung/Bewertung des Potenzials vorgeschlagen. therapeutische Entscheidungen3. PDX-Modell durch die Injektion von menschlichen primären Krebszellen in immungeschwächte Mäuse generiert, ist eines der vielversprechendsten Werkzeuge für personalisierte Arzneimittel-Screening in der klinischen Onkologie3,4. Im Gegensatz zur kultivierten Zelllinie in vitro bewahren PDX-Modelle in der Regel die Integrität und Heterogenität der In-vivo-Tumorumgebung, imitieren besser die Vielfalt und die eigenwilligen Eigenschaften verschiedener Tumorpatienten und können daher die potenzielle medizinische Ergebnisse von Patienten4. Die Generierung von PDX-Modellen bei Mäusen erfordert jedoch qualitativ hochwertige Patientenproben und Monate Zeit, um genügend Zellen und Modelle für Multi-Gruppen-Experimente zu sammeln, und die zellulären/genetischen Zusammensetzungen des Xenografts können von denen des Originals abweichen. Biopsie des Patienten. Die Erfolgsrate bei der Etablierung des PDX-Modells von Mäusen ist ebenfalls gering, was eine breite Umsetzung in der klinischen Praxis erschwert. Für Patienten, die schnell fortschreitende Krebsarten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs tragen, sind sie möglicherweise nicht in der Lage, rechtzeitig wertvolle Informationen aus den PDX-Experimenten zu erhalten.
In den letzten Jahren wurden Zebrafische als potenzielle Wirte nicht nur für CDX-Modelle (Zell-abgeleitetes Tumor-Xenograft), sondern auch für PDX-Modelle5,6,7,8,9, 10. Als Wirbeltier-Modelltier hat Zebrafisch genügend Ähnlichkeiten mit Säugetieren sowohl in der Genetik als auch in der Physiologie, mit zwei wesentlichen Vorteilen: Transparenz und klein in Größe11. Zebrafische sind auch sehr fecundity, und Hunderte von inzuchtigen Larven können innerhalb weniger Tage von einem einzigen Paar Erwachsene12erhalten werden. Mehrere Studien haben Zebrafische verwendet, um sowohl transgene als auch Xenograft-Modelle von Krebserkrankungen zu erzeugen13,14. Im Vergleich zu Mäusexenografts ermöglichen Zebrafisch-Xenografts die Verfolgung mit Einzelzellauflösung. Eine bestimmte Menge an menschlichen Geweben ist in der Lage, Hunderte von Zebrafisch PDX-Modelle (zPDXs) zu erzeugen, während kann nur ausreichen, um ein paar Mäuse PDX-Modelle15,16zu generieren. Außerdem entwickeln die Zebrafischlarven bei 2-5 dpf bereits komplette Kreislaufsysteme und Stoffwechselorgane wie Leber und Niere, aber nicht das Immunsystem17, während der verbleibende Dottersack ein natürliches 3D-Medium ist, ideal für Dasmedikamentenscreening, Resistenztests und Tumormigrationsbeobachtungen6,18,19,20,21.
Mit dem ultimativen Versuch, zPDX als Screening/Testplattform für den klinischen Einsatz zu nutzen, beschreiben wir hier einen optimierten Vorschlag für das zPDX-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs, das es ermöglicht, die In-vivo-Kandidaten-Arzneimittel innerhalb kurzer Zeit mit weniger Zellen zu geringeren Kosten zu untersuchen. Im Vergleich zu den bisherigen Referenzen über zPDX6,9,10haben wir mehrere Optimierungen eingeführt, um das System für die klinische personalisierte Diagnose machbarer und zuverlässiger zu machen: 1) Vorsortierung verschiedener Zellen Gruppen in den primären Tumorgeweben und stabilisierenden Primärzellen für eine Woche vor weiteren Experimenten; 2) Kennzeichnung der menschlichen Zellen und Verbesserung der Zelllebensfähigkeit in Xenograft durch Lentivirus-basierte genetische Modifikation; 3) Optimierung der Zebrafischkultur Zustand in Nutriment Ergänzungen (Glukose und Glutamin) und Temperatur; 4) Quantifizierung der Wirkstoffreaktionen verschiedener Zelltypen in vergleichender Weise. Wir haben auch Änderungen an der Injektionslösung vorgenommen, indem wir mehrere zusätzliche Materialien hinzugefügt haben. Insgesamt bieten diese Verbesserungen die Möglichkeit, schnell ein patientenähnlicheres Xenograft in Zebrafisch-Wirten zu erzeugen, das als zuverlässiges Werkzeug zur Beurteilung der Reaktion von Kandidatenmedikamenten verwendet werden kann.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren wurden genehmigt und folgten den Richtlinien der Animal Ethics Committee an der Fudan University und alle Proben von Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden vom Fudan University Shanghai Cancer Center bezogen. Die Ethikkommission der FUSCC erhielt die ethische Zustimmung, und jeder Patient erhielt die schriftliche Zustimmung in Kenntnis der Sachlage.
1. Vorbereitung der Ausrüstung für die Mikroinjektion
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Vorbereitung der Injektionsplatte.
- Bereiten Sie eine 50 ml Lösung von 1% Agarose gelöst in E3-Lösung (0,6 g/L Aquariensalz in doppelt destilliertem Wasser + 0,01 mg/L Methylenblau). Die Lösung aufkochen, bis sich die Agarose auflöst.
- 50 ml der Agarose-Lösung in eine 10 cm Petrischale geben und dann die Zebrafisch-Embryofixierungsform auf die Oberfläche legen. Entfernen Sie die Form, wenn die Agarose-Lösung verfestigt wird.
- 20 ml E3-Lösung auf die Injektionsplatte geben und bei 4 °C für die Langzeitlagerung aufbewahren.
-
Vorbereitung der Injektionsnadeln.
- Ziehen Sie eine 10 cm glasige Kapillare mit einer Innenabmessung von 0,9 mm in zwei Nadeln auf einem Nadelzieher.
- Verwenden Sie Zangen, um das Ende der Nadel zu schneiden, um eine Öffnung unter dem Mikroskop zu schaffen.
2. Vorbereitung von Embryonen auf die Transplantation
- Legen Sie 1 bis 2 Paare erwachsener Zebrafische um 19-21 Uhr in einen Paarungsbecken und sammeln Sie die befruchteten Eier gegen 8 Uhr des nächsten Morgens.
- Die befruchteten Eier aus dem Stecktank in eine Petrischale mit 40 ml frischer E3-Lösung geben und bei 28,5 °C brüten.
- Nach 8 h Inkubation in E3-Lösung 0,03% 1-Phenyl-2-Thiourea (PTU) in Die E3-Lösung geben, um die Pigmentierung zu hemmen. Inkubieren Sie die Embryonen in E3-Lösung mit 0,03% PTU bei 28,5 °C bis 48 hpf. Dieser Schritt kann weggelassen werden, wenn Sie in-bred Casper mutierten Zebrafisch verwenden.
3. Isolierung und Kultur der primären menschlichen Zellen aus frischem chirurgischen Bauchspeicheldrüsenkrebs Specimen oder gefrorenes Gewebe
- Erhalten Sie proben von menschlichem Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe der Größe ca. 1 cm3 während einer Bauchoperation und übertragen Sie das Gewebe sofort in Wachstumsmedien (DMEM mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 10 m Y-27632, 100 g/mL Primocin, 10 g/ml Putrescin Dihydrochlorid, 10 mM Nicotinamid und 1% Penicillin-Streptomycin).
- Übertragen Sie die Bauchspeicheldrüsenkrebsprobe in eine Petrischale und entfernen Sie das umgebende nekrotische Gewebe, Fettgewebe und Bindegewebe.
- Spülen Sie das Krebsgewebe 5-6 Mal mit Phosphatpuffer (PBS) und schneiden Sie das Gewebe mit Skalpellen in 1 mm3 Stücke.
- Übertragen Sie das geschredderte Gewebe in 5 ml HBSS in einem 50 ml-Rohr und fügen Sie Kollagenase Typ IV, Hyaluronidase und DNase I bei Endkonzentrationen von 200 Einheiten/ml, 100 mg/L bzw. 20 mg/L hinzu. Pipette die Mischung nach oben und unten gut mischen.
- Inkubieren Sie das Gemisch bei 37 °C in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für 15-20 min. Pipette das Gemisch ein paar Mal alle 5 min auf und ab.
- 7 ml DMEM in das Rohr geben und zentrifugieren bei 110 x g für 5 min bei 4 °C, wenn die Verdauung abgeschlossen ist.
- Dekantieren Sie den Überstand und setzen Sie die Tumormischung in DMEM erneut aus.
- Die Mischung in eine 6 cm Petrischale in 3 ml Vollwachstumsmedien (DMEM mit 10% FBS, 20 g/ml Insulin, 100 ng/mL bFGF, 10 ng/mL EGF, 10 mM Y-27632, 100 g/mL Primocin, 10 g/ml Insulin, 10 g/mL Putrescinedihydrochlorid, 10 mM Nicotinamid , 1% Penicillin Streptomycin). Trennen Sie die Zellen in zwei Gruppen.
- In Gruppe I, fügen Sie 100x Inhibitor der Bauchspeicheldrüsenkrebs Fibroblasten in das Medium nach 48 h, um die überwucherten Fibroblasten zu entfernen, so dass die Krebszellen als die wichtigsten Zelltypen;. In Gruppe II werden die Fibroblasten die Krebszellen innerhalb einer Woche auswachsen lassen.
- Kultur beide Zellgruppen für 1-2 Wochen je nach Zelldichten/Reinheit und ändern Sie die Medien alle drei Tage. Die erwarteten Zelltypen in beiden Gruppen I & II können in einem typischen erfolgreichen Experiment über 98% einnehmen.
4. Kennzeichnung der Zellen mit Lentivirus Exzessitherung Anti-Apoptose-Gene BCL2L1 (BCL-XL) und verschiedenen fluoreszierenden Proteinen getrennt
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Lentivirus-Produktion
- Platte 3 x 106 HEK 293T Zellen mit komplettem DMEM-Medium (DMEM mit 10% FBS) in 10 cm Geschirr und Kultur über Nacht bei 37 °C in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator. Ersetzen Sie das Medium vor der Transfektion durch 6 ml serumfreies Medium.
- Vorbereiten sie Lösung A: 8 g BCL2L1-enthaltende lentivirale Vektoren (pCDH-EF1-mKate2-E2A-BCL2L1-WPRE oder pCDH-EF1-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE), 2,4 g pVSVG, 4 g pMDL (Gag/Pol), 1,6 g pREV und serumfreies DMEM in einem Gesamtvolumen von 500 l. Sanfte Pipetten die Mischung mehrmals, und legen Sie es bei Raumtemperatur für 5 min.
- Bereiten Sie Lösung B: 40 l PEI (Polyethylenimimin) in 460 l serumfreiem DMEM vor. Legen Sie es bei Raumtemperatur für 5 min.
- Fügen Sie Lösung B langsam in Lösung A auf und lassen Sie das Rohr 30 min bei Raumtemperatur.
- Die endgültige Mischung in die in Schritt 4.1.1 zubereitete HEK 293T Zellkulturschale geben und bei 37 °C in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator brüten. Nach 12 h eine zusätzliche 5 ml des kompletten DMEM Mediums hinzufügen. Nach 48 h das Medium mit dem Lentivirus ernten.
- Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45 m sterilen Filter, fügen Sie den Überstand in eine Konzentrationssäule, Zentrifuge bei 6.000 x g für 25-30 min bei 4 °C. Die Lentivirus-Aliquots von 100 l pro Tube werden bei -80 °C hergestellt und gelagert.
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Infektion der Primärzellen
- Samen Sie die Zellen (Gruppe I & II), die in einer 12-Well-Platte mit 30-40% Dichte infiziert werden, und kultivieren die Zellen über Nacht bei 37 °C in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.
- Ersetzen Sie das Medium durch 500 l serumfreies Medium, das 8 g/ml Polybren für 4 h enthält. Fügen Sie dann dem Medium weitere 100 l des Lentivirus hinzu (eGFP-E2A-BCL2L1 für Gruppe I oder mKate2-E2A-BCL2L1 für Gruppe II). Nach 12 h das Medium durch 1 ml komplettes Medium ersetzen.
- Überprüfen Sie die Fluoreszenzmarker nach 48 h.
- Die infizierten Zellen ernten und im Verhältnis 1:1 mit einer Endkonzentration von 106/ml mischen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 110 x g für 5 min und setzen Sie das Zellgemisch in 50 l Injektionslösung (1640 medium mit 10% FBS, 0,05% Hyaluronsäure-Natriumsalz, 0,05% Methylcellulose) wieder auf.
5. Injektion von Mixed Cell Suspension in den Zebrafisch
- 10x Tricain-Lösung in E3-Wasser geben, um Zebrafischlarven zu anästhesisieren und die Larven (ab Schritt 2.3) auf die Mitspritzplatte zu übertragen, die mit modifiziertem E3 gefüllt ist (E3 mit 1 g/L Glukose und 5 mmol/L-Glutamin).
- Füllen Sie 25 l gemischte Zellsuspension in Mikrokapillaren Nadel und setzen Sie die Nadel in den Mikro-Injektionsmanipulator.
- Setzen Sie Deninjektionsdruck und -zeit ein. Injizieren Sie 50-80 Zellen (ca. 8 nL) in den Eigelbsack von 48 hpf Zebrafischen.
6. Kultur des Xenografted Zebrafish (zPDX Modell)
- Die nachgezungsfreien Zebrafischlarven in 40 ml Mischlösung (E3-Lösung mit 1 g/L Glukose und 5 mmol/L-Glutamin) bei 32 °C übertragen.
7. Arzneimitteladministration auf dem Xenografted Zebrafisch und die Bewertung von Tumorzellen/Fibroblasten Viabilities
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Bestimmung der optimalen Konzentration von Gemcitabin/Navitoclax.
- Legen Sie 10 Wildtyp-Zebrafisch-Embryonen bei 48 hpf in jeden Brunnen einer 12-Well-Platte.
- Fügen Sie verschiedene Konzentrationen von Gemcitabin oder Navitoclax in jedem Brunnen hinzu und brüten bei 32 °C für zwei Tage.
- Nach 2 Tagen berechnen Sie die maximale Toleranzdosis (MTD) von Gemcitabin und Navitoclax, bei der die Zebrafischlarven keine signifikante Fehlbildung und abnormes Verhalten aufweisen und die Arbeitskonzentrationen unterhalb der MTD eingestellt sind.
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Behandlung von zPDX-Modellen mit Gemcitabin/Navitoclax.
- 10 xenografierte Larven in jeden Brunnen einer 12 Brunnenplatte geben.
- Teilen Sie die Larven in vier Gruppen auf, behandeln Sie die Kontrollgruppe in E3 mit 0,1 % DMSO, und behandeln Sie die anderen Gruppen mit 5 g/ml Gemcitabin und/oder 50 M Navitoclax und brüten zwei Tage lang bei 32 °C.
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Bewertung der Zellviabilitäten und zellulären Zusammensetzung in zPDX-Modellen.
- Anästhetisieren Sie die xenografted Larven nach der Behandlung und legen Sie sie in 3% Methylcellulose.
- Stellen Sie die Larven aus der Seitenansicht mit einem Fluoreszenzmikroskop oder konfokalen Mikroskop ab.
- Quantifizieren Sie die Intensität von roten und grünen Fluoreszenzsignalen mit ImageJ und GraphPad Software.
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Representative Results
Eine schematisierte Gliederung der Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, die primären Krebsgewebezellen wurden nach der Verdauung mit oder ohne Zugabe von Pankreaskrebs-Fibroblasten in das gesamte Medium eingesät. Krebszellen und Fibroblasten wurden als zwei verschiedene Populationen angereichert, die Fibroblasten ohne Inhibitoren dominierten, und das Wachstum von Krebszellen setzte sich nach der Zugabe von Inhibitoren durch (Abbildung 2). Es wurden zwei lentivirale Verpackungsvektoren konstruiert, die grüne oder rote fluoreszierende Proteine und BCL2L1 exprimierten, wie in Abbildung 3dargestellt. Die virusbasierte Fluoreszenzkennzeichnung stellte auch den Überlebensstatus der Zellen dar. Die gemischten Krebszellen und Fibroblasten wurden bei 48 hpf in den Zebrafisch-Dottersack injiziert und zwei Tage lang mit Gemcitabin und/oder Navitoclax behandelt. Die Zellviabilitäten in verschiedenen Populationen und die zelluläre Zusammensetzung des Xenografts wurden als Reaktionen auf die medikamentöse Behandlung geändert (Abbildung 4).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Erzeugung und Arzneimittelbewertung des Zebrafisch-Xenograft-Modells, das von Bauchspeicheldrüsenkrebs abgeleitet wurde. Chirurgisch entfernte Gewebe von Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs werden geschert und verdaut, gefolgt von Kultur unter zwei verschiedenen Bedingungen, von denen eine von einem Fibroblastenhemmer hinzugefügt wird, und die andere Gruppe nicht. Nach 1-2 Wochen wurden die Primärzellen genetisch verändert, um ein anti-apoptotisches Protein BCL2L1 und verschiedene fluoreszierende Proteine auszudrücken. Danach wurden die beiden Populationen gemischt und in 48-hpf-Zebrafischlarven mitinjiziert, um die Wirkung von Chemotherapeutika zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kultur und Anreicherung von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und Fibroblasten. Bilder von Krebszellen und Fibroblasten, angereichert von drei verschiedenen Bauchspeicheldrüsenkrebspatienten nach 10 Tagen Kultur. Schuppenstange, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Struktur des lentiviralen Vektors, der BCL2L1 und verschiedene fluoreszierende Proteine exzessiert. Schematische Darstellung von zwei lentiviralen Vektoren, die ständig mKate2-E2A-BCL2L1 bzw. eGFP-E2A-BCL2L1 exemitenieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Auswirkungen auf Xenograft von Gemcitabin. (A) Seitenansicht des Xenografts im Dottersack von Zebrafischlarven bei 3 h nach der Transplantation (hpt). (B) Repräsentative Bilder der Xenografts in Zebrafischlarven mit 60 PS, behandelt von DMSO oder Gemcitabin. (C) Repräsentative 3D-Rendering der Xenografts bei 60 PSt. (D) Statistiken über die Fluoreszenzintensität des Xenografts vor und nach der Behandlung von Gemcitabin und/oder BCL2L1-Hemmern. N = 10 pro Gruppe für jeden Test. Skala bar = 100 m; NS, nicht signifikant; *P < 0,05; P < 0,0001; Mittelwert - SD, mit statistischen Unterschieden, die durch einwegige ANOVA bestimmt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Sowohl PDX- als auch CDX-Modelle sind wichtige Plattformen im Bereich der Tumorbiologie22, und der entscheidende Schritt einer erfolgreichen Tierübergreifenden Transplantation ist die Verbesserung des Überlebens des Xenografts. Kürzlich haben einige Studien gezeigt, dass die transiente Expression von BCL2L1 (BCL-XL) oder BCL2 die Lebensfähigkeit menschlicher embryonaler Stammzellen in Mäusewirten signifikant verbessern kann, ohne die Zellidentitäten und Schicksale zu beeinflussen23 , 24 , 25. In unserem Manuskript haben wir die Zellen mit Lentivirus, das ständig das Anti-Apoptose-Gen BCL2L1 (BCL-XL)ausdrückt, sowie fluoreszierende Proteine gekennzeichnet. Die Einführung von BCL2L1 hat die Überlebenszeit von Xenograft-Humanzellen in Zebrafischen erheblich verbessert, um das Beobachtungsfenster für die Studien zu verlängern, während die fluoreszierenden Signale nicht nur die Zellen kennzeichnen, sondern auch den Lebenszustand der Zellen, wie wir festgestellt haben, dass die Fluoreszenz schnell mit dem Zelltod verblasst. In der Zwischenzeit modifizieren wir den Zebrafisch als besseren Wirt für menschliche Xenografts. Einerseits werden rag2 und prkdc mit der CRISPR/Cas9-Technologie ausgeknockt, um einen kombinierten immungeschwächten Zebrafisch vorzubereiten, der kombinierten immungeschwächten Mäusen ähnelte, um auch ältere Zebrafischlarven kompatibel zu machen. mit menschlichen Zellen und Geweben26. Andererseits wurde der Zebrafisch auch modifiziert, um menschliche Proteine wie IGF1 und INS auszudrücken, um das Überleben und die Proliferation implantierter menschlicher Zellen durch die Verwendung der tol2 transponvermittelten transgenen Technologie besser zu unterstützen. Darüber hinaus fehlt zPDX auch ein menschenähnliches funktionelles Immunsystem und die Wechselwirkungen zwischen menschlichen Stromalzellen und dem Immunsystem, und in Zukunft können wir versuchen, menschliche Immunzellen mitinjizieren zu können, um eine kurzfristige humanisierte Immunumgebung in Zebrafischen wieder aufzubauen.
In den PDX-Modellen der Mäuse wurden die Xenograft-Bedingungen traditionell durch direkte Beobachtung an Knoten sichtbarer Größe überwacht, deren Entwicklung eine lange Zeit erfordert. In den transparenten zPDX-Modellen als Vergleich kann das Xenograft unter Mikroskopie in Echtzeit untersucht werden. Es war jedoch schwierig, die Zellzahlwechsel in einer einfarbigen Population ohne eine ordnungsgemäße Kontrolle zu bewerten, und die Idee, zwei Zellpopulationen unterschiedlicher Fluoreszenz einzuführen, verbessert die Quantifizierung der Zelllebensfähigkeit signifikant. Durch das Mischen und Injizieren verschiedener Zellen in festen Verhältnissen imitieren wir nicht nur die Tumormikroumgebung, sondern sind auch in der Lage, die Wirkstoffreaktion durch den Vergleich der beiden Zellgruppen genau zu quantifizieren. Obwohl das ursprüngliche Verhältnis von Krebszellen zu Fibroblasten in Primärgeweben sehr unterschiedlich ist, haben wir hier mit einem Verhältnis von 1:1 begonnen, und die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die gleiche Zellzusammensetzung eines anderen Verhältnisses werden in Zukunft untersucht. Außerdem erfordern die Auswirkungen von 32 °C statt 37 °C-Inkubationen auf das Verhalten menschlicher Zellen auch detaillierte Vergleichsstudien. Schließlich kann die Strategie des vom Patienten abgeleiteten heterogenen Xenograft-Modells für Bauchspeicheldrüsenkrebs zur vergleichenden Arzneimittelbewertung auch auf andere Arten von festen Krebsarten angewendet werden. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für PDX mit Zebrafischlarven als Wirte, die kristallklar und für die Analyse mit Einzelzellauflösung möglich sind.
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Disclosures
Es wurden keine potenziellen Interessenkonflikte offengelegt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von National Natural Science Foundation of China 81402582, Natural Science Foundation of Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 und 18ZR1404500
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
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