Summary
Este protocolo descreve procedimentos da optimização em um modelo fluorescência-etiquetado duplo baseado em vírus do xenograft do tumor usando o zebrafish larval como anfitriões. Este modelo heterogêneo do xenograft imita a composição do tecido do microambiente pancreatic do cancro in vivo e sere como uma ferramenta mais precisa para avaliar respostas da droga em modelos personalizados de zPDX (xenograft paciente-derivado de zebrafish).
Abstract
O xenograft paciente-derivado do tumor (PDX) e o xenograft pilha-derivado do tumor (CDX) são técnicas importantes para a avaliação pré-clínica, a orientação da medicamentação e as pesquisas básicas do cancro. Gerações de modelos PDX em camundongos hospedeiros tradicionais são demoradas e só trabalham para uma pequena proporção de amostras. Recentemente, zebrafish PDX (zPDX) surgiu como um sistema de acolhimento único, com as características de pequena escala e de alta eficiência. Aqui, nós descrevemos uma metodologia aperfeiçoada para gerar um modelo fluorescência-etiquetado duplo do xenograft do tumor para a avaliação comparativa da quimioterapia em modelos de zPDX. As pilhas e os fibroblasto do tumor foram enriquecidos do tecido pancreatic recentemente-colhido ou congelado do cancro em condições diferentes da cultura. Ambos os grupos celulares foram rotulados por Lentivirus expressando proteínas fluorescentes verde ou vermelha, bem como um gene BCL2L1. As células transfectadas foram pré-misturadas e coinjetadas no zebrafish larval 2 DPF que foram então criados em meio E3 modificado a 32 ° c. Os modelos do xenograft foram tratados por drogas da quimioterapia e/ou pelo inibidor de BCL2L1, e as viabilidades de pilhas e de fibroblastos do tumor foram investigadas simultaneamente. Em resumo, este protocolo permite que os investigadores gerem rapidamente uma grande quantidade de modelos de zPDX com um microambiente heterogêneo do tumor e forneça uma janela mais longa da observação e uma quantitação mais precisa em avaliar a eficiência de candidatos da droga.
Introduction
A Oncologia de precisão tem como objetivo encontrar as estratégias terapêuticas mais benéficas para o paciente individual1. Atualmente, inúmeros modelos pré-clínicos como a cultura primária in vitro, a cultura organoide in vitro2e os xenoenxertos derivados do paciente (PDX) em camundongos antes ou depois da cultura organoide são propostos para o diagnóstico e para a tela/avaliação do potencial escolhas terapêuticas3. O modelo PDX gerado pela injeção de células cancerosas primárias humanas em camundongos imunocomprometidos é uma das ferramentas mais promissoras para a triagem personalizada de fármacos em oncologia clínica3,4. Diferentemente da linhagem celular cultivada in vitro, os modelos PDX geralmente preservam a integridade e a heterogeneidade do ambiente tumoral in vivo, imitando melhor a diversidade e as características idiossincráticas de diferentes pacientes tumorais e, portanto, podem prever a resultados médicos potenciais dos doentes4. No entanto, a geração de modelos PDX em camundongos requer amostras de pacientes de alta qualidade e meses de tempo para reunir células e modelos suficientes para experimentos em vários grupos, e as composições celulares/genéticas do Xenoenxerto podem derivar das do original biópsiado paciente. A taxa de sucesso para o estabelecimento de camundongos PDX modelo também é baixa, tornando difícil de ser amplamente implementado na prática clínica. Para os pacientes que transportam cânceres rapidamente progredidos como câncer pancreático, eles podem não ser capazes de obter informações valiosas dos experimentos PDX no tempo.
Nos últimos anos, zebrafish foi relatado para ser anfitriões potenciais para não somente CDX (pilha-derivado xenograft do tumor) modela, mas também PDX modela5,6,7,8,9, 10. como um animal modelo vertebrado, o zebrafish abriga semelhanças suficientes com mamíferos em genética e fisiologia, com duas vantagens significativas: transparência e pequeno tamanho11. O zebrafish também é altamente fecundidade, e centenas de larvas inpuras podem ser obtidas dentro de poucos dias a partir de um único par de adultos12. Vários estudos têm empregado zebrafish para gerar modelos transgênicos e xenoenxertos de doenças cancerosas13,14. Comparado aos xenoenxertos de camundongos, os xenoenxertos de zebrafish permitem o rastreamento em uma resolução de célula única. Uma certa quantidade de tecidos humanos é capaz de gerar centenas de modelos de zebrafish PDX (zpdxs), enquanto só pode ser suficiente para gerar um par de ratos PDX modelos15,16. Além disso, as larvas de zebrafish em 2-5 DPF já desenvolvem sistemas circulatórios completos e órgãos metabólicos, como fígado e rim, mas não o sistema imunológico17, enquanto o saco de gema remanescente é um meio natural 3D, ideal para triagem de drogas, drogas testes de resistência e observações de migração tumoral6,18,19,20,21.
Com uma tentativa final de usar zPDX como uma plataforma de triagem/teste para uso clínico, aqui, descrevemos uma proposta otimizada para o modelo zPDX de câncer pancreático, que permite a avaliação in vivo do candidato a drogas dentro de um curto espaço de tempo usando menos células a custos mais baixos. Comparado com as referências anteriores sobre zpdx6,9,10, introduzimos várias otimizações para tornar o sistema mais viável e confiável para o diagnóstico clínico personalizado: 1) pré-classificação de células diferentes grupos nos tecidos primários do tumor e estabilizando as células primárias por uma semana antes de novas experiências; 2) rotular as células humanas e melhorar a viabilidade celular em Xenoenxerto via modificação genética baseada em Lentivirus; 3) otimizando a condição de cultura zebrafish em ambos os suplementos de nutrição (glicose e glutamina) e temperatura; 4) quantificando as respostas medicamentosas de diferentes tipos de células de forma comparativa. Também fizemos alterações na solução de injeção adicionando vários materiais complementares. Ao todo, essas melhorias proporcionam a possibilidade de gerar rapidamente um Xenoenxerto mais paciente-like em hospedeiros zebrafish que podem ser usados como uma ferramenta confiável para avaliar a resposta dos medicamentos candidatos.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram aprovados e seguiram as diretrizes do Comitê de ética animal da Universidade de Fudan e todos os espécimes de câncer pancreático foram obtidos do centro de câncer de Xangai da Universidade de Fudan. A aprovação ética foi obtida do Comitê de ética da FUSCC, e o termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido por cada paciente.
1. preparando o equipamento para a microinjeção
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Preparando a placa de injeção.
- Prepare uma solução de 50 mL de agarose a 1% dissolvida na solução E3 (0,6 g/L de sal de aquário em água destilada dupla + 0, 1 mg/L de azul de metileno). Ferva a solução até dissolver o agarose.
- Despeje 50 mL da solução de agarose em um prato de Petri de 10 cm e, em seguida, coloque o molde de fixação do embrião zebrafish na superfície. Retire o molde quando a solução de agarose torna-se solidificada.
- Adicione 20 mL de solução E3 à placa de injecção e mantenha-a a 4 ° c para armazenamento a longo prazo.
-
Preparando as agulhas de injeção.
- Puxe um capilar de vidro de 10 cm com uma dimensão interna de 0,9 milímetros em duas agulhas em um extrator da agulha.
- Use fórceps para cortar a extremidade da agulha para criar uma abertura o microscópio.
2. preparação de embriões para transplante
- Coloque 1 a 2 pares de zebrafish adulto em um tanque de acasalamento em 7-9 pm e recolher os ovos fertilizados em cerca de 8 am da manhã seguinte.
- Transfira os ovos fertilizados do tanque de acoplamento para um prato de Petri contendo 40 mL de solução E3 fresca e incubar a 28,5 ° c.
- Após 8 h de incubação na solução de E3, adicione 0, 3% 1-phenyl-2-thiourea (PTU) na solução E3 para inibir a pigmentação. Incubar os embriões na solução E3 com 0, 3% PTU a 28,5 ° c até 48 HPF. Esta etapa pode ser omitida se usando o zebrafish in-bred do mutante de Casper.
3. isolação e cultura de pilhas humanas preliminares do espécime pancreatic cirúrgico fresco do cancro ou do tecido congelado
- Obter espécimes de tecido de cancro pancreático humano do tamanho em torno de 1 cm3 durante uma cirurgia abdominal, e transferir imediatamente o tecido para o meio de crescimento (DMEM com soro bovino fetal a 10% (FBS), 10 μm Y-27632, 100 μg/ml de primoicina, 10 μg/ml de putrescina dihydrochloride, nicotinamida de 10 mM e 1% de estreptomicina da penicilina).
- Transfira a amostra de cancro pancreático para uma placa de Petri e retire o tecido necrótico circundante, tecido adiposo e tecido conjuntivo.
- Enxague o tecido oncológico por 5-6 vezes com tampão fosfato (PBS) e corte o tecido em 1 mm3 peças usando bipéis.
- Transfira os tecidos desfiado em 5 ml de HBSS em um tubo de 50 ml e adicione o tipo IV do colagenase, o hialuronidase e o DNase mim em concentrações finais de 200 unidades/ml, de 100 mg/l e de 20 mg/l, respectivamente. Pipeta a mistura para cima e para baixo para misturar bem.
- Incubar a mistura a 37 ° c em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% por 15-20 min. pipeta a mistura para cima e para baixo algumas vezes a cada 5 min.
- Adicionar 7 mL de DMEM ao tubo e centrifugar a 110 x g durante 5 min a 4 ° c quando a digestão estiver concluída.
- Decantar o sobrenadante e re-suspender a mistura tumoral em DMEM.
- Placa da mistura em um prato de Petri de 6 cm em 3 mL de meio de crescimento total (DMEM com 10% FBS, 20 μg/mL de insulina, 100 ng/mL bFGF, 10 ng/mL EGF, 10 μM Y-27632, 100 μg/mL primocin, 10 μg/mL de putrescina dihydrochloride, 10 mM nicotinamida , 1% de estreptomicina da penicilina). Separe as células em dois grupos.
- No grupo I, adicionar 100x inibidor de fibroblastos de câncer pancreático no meio após 48 h para remover os fibroblastos sobrecrescidos, deixando as células cancerosas como os principais tipos de células;. No grupo II, os fibroblastos irão superar as células cancerosas dentro de uma semana.
- Cultura ambos os grupos de células para 1-2 semana, dependendo das densidades de células/puridades e mudar a mídia a cada três dias. Os tipos de células esperados em ambos os grupos I & II podem ocupar mais de 98% na proporção em uma experiência bem sucedida.
4. rotulando as células com Lentivirus expressando anti-apoptose gene BCL2L1 (BCL-XL) e diferentes proteínas fluorescentes separadamente
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Produção de Lentivirus
- Placa 3 x 106 células HEK 293T com meio DMEM completo (DMEM fornecido com 10% FBS) em 10 cm pratos e cultura durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de dióxido de carbono 5%. Substitua o meio por 6 mL de meios livres de soro antes da transfecção.
- Prepare A solução A: 8 μg de BCL2L1-contendo vetores lentivirais (Pcdh-EF1α-MKATE2-E2A-BCL2L1-wpre ou Pcdh-EF1α-EGFP-E2A-BCL2L1-wpre), 2,4 μg de pvsvg, 4 μg pmdl (gag/pol), 1,6 ΜG de DMEM anterior e sem soro num volume total de 500 ΜL. gentilmente Pipet a mistura várias vezes, e colocá-lo em temperatura ambiente por 5 min.
- Prepare a solução B: 40 μL de PEI (polyethyleneimine) em 460 μL DMEM soro-livre. Coloque-o à temperatura ambiente por 5 min.
- Adicione lentamente a solução B na solução A e deixe o tubo à temperatura ambiente durante 30 min.
- Adicione a mistura final no prato de cultura de células HEK 293T preparado na etapa 4.1.1 e incubar a 37 ° c em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Após 12 h, adicione um adicional de 5 mL do meio DMEM completo. Após 48 h, colher o meio contendo o Lentivirus.
- Filtre o sobrenadante utilizando um filtro estéril de 0,45 μm, adicione o sobrenadante a uma coluna de concentração, centrifugador a 6.000 x g por 25-30 min a 4 ° c. As alíquotas de Lentivirus de 100 μL por tubo são feitas e armazenadas a-80 ° c.
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Infecção das células primárias
- Semente das células (grupo I & II) para ser infectado em uma placa de 12 poços com 30-40% de densidade e cultura as células durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de dióxido de carbono 5%.
- Substitua o meio por 500 μL de meio livre de soro contendo 8 μg/mL de polibreno durante 4 h. Em seguida, adicione um adicional de 100 μL do lentivirus no meio (eGFP-E2A-BCL2L1 para o grupo I ou mKate2-E2A-BCL2L1 para o grupo II). Após 12 h, substitua o meio por 1 mL de meio completo.
- Verifique os marcadores de fluorescência após 48 h.
- Colher as células infectadas e misturá-los em 1:1 relação com uma concentração final de 106/ml.
- Centrifugue as células a 110 x g durante 5 min e Resuspenda a mistura de células em 50 μL de solução injetável (1640 média com 10% de fbs, 0, 5% de ácido hialurônico sal de sódio, 0, 5% metilcelulose).
5. injetando a suspensão da pilha misturada no zebrafish
- Adicionar 10x solução de tricaína em água E3 para anestesiar larvas de zebrafish e transferir as larvas (da etapa 2,3) para a placa de injeção preenchida por E3 modificada (E3 com 1 g/L de glicose e 5 mmol/L L-glutamina).
- Encha 25 μL de suspensão de células mistas na agulha de micro capilares e insira a agulha no manipulador de microinjecção.
- Ajuste a pressão e o tempo da injeção. Injete 50-80 células (~ 8 NL) no saco gema de 48 HPF zebrafish.
6. cultura do zebrafish Xenografted (modelo de zPDX)
- Transfira as larvas de zebrafish pós-xenografadas para 40 mL de solução de mistura (solução E3 com 1 g/L de glicose e 5 mmol/L L-glutamina) a 32 ° c.
7. administração de medicamentos sobre o zebrafish Xenografado e a avaliação de células tumorais/fibroblastos viabilidades
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Determinando a concentração óptima de gemcitabine/navitoclax.
- Coloc 10 embriões do zebrafish do tipo selvagem em 48 HPF em cada poço de uma placa de 12 poços.
- Adicione diferentes concentrações de gemcitabina ou navitoclax em cada poço e incubar a 32 ° c durante dois dias.
- Após 2 dias, calcule a dosagem de tolerância máxima (MTD) de gemcitabina e navitoclax em que as larvas de zebrafish não mostraram malformação significativa e comportamento anormal, e as concentrações de trabalho são definidas abaixo do MTD.
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Tratamento de modelos de zPDX com gemcitabine/navitoclax.
- Coloc 10 larvas xenografados em cada poço de uma placa de 12 poços.
- Divida as larvas em quatro grupos, trate o grupo controle na E3 contendo 0,1% DMSO, e trate os outros grupos com 5 μg/mL de gemcitabina e/ou 50 μM de navitoclax, e incubar a 32 ° c por dois dias.
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Avaliação das viabilidades celulares e composição celular em modelos zPDX.
- Anestesiar as larvas xenografadas após o tratamento e colocá-las em metilcelulose a 3%.
- Imagem as larvas da vista lateral usando um microscópio da fluorescência ou um microscópio confocal.
- Quantifique a intensidade dos sinais de fluorescência vermelho e verde usando o software ImageJ e GraphPad.
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Representative Results
Um esboço esquematizado do procedimento é representado na Figura 1. No short, as pilhas preliminares do tecido do cancro foram semeadas no meio completo após a digestão com ou sem a adição de inibidores pancreatic do fibroblasto do cancro. As células cancerosas e os fibroblastos foram enriquecidos como duas populações distintas que os fibroblastos dominaram sem inibidores, e o crescimento das células cancerosas prevaleceu após a adição de inibidores (Figura 2). Foram construídos dois vetores de embalagens lentivirais, que expressaram proteínas fluorescentes verdes ou vermelhas e BCL2L1 como mostrado na Figura 3. A rotulagem fluorescente vírus-baseada igualmente representou o status da sobrevivência das pilhas. As pilhas e os fibroblastos de cancro misturados foram injetados no saco de gema do zebrafish em 48 HPF e tratados pelo gemcitabina e/ou pelo navitoclax por dois dias. As viabilidades celulares em diferentes populações e a composição celular do Xenoenxerto foram alteradas como as respostas ao tratamento medicamentoso (Figura 4).
Figura 1: diagrama esquemático da geração e avaliação medicamentosa do modelo de Xenoenxerto de zebrafish derivado do câncer pancreático. Tecidos removidos cirurgicamente de pacientes com câncer pancreático são cortados e digeridos, seguidos pela cultura em duas condições diferentes, um dos quais é adicionado por um inibidor de fibroblastos, e o outro grupo não é. Após 1-2 semanas, as células primárias foram modificadas geneticamente para expressar uma proteína BCL2L1 e diferentes proteínas fluorescentes. Depois disso, as duas populações foram misturadas e coinjetadas em larvas de zebrafish 48 HPF para avaliar os efeitos das drogas quimioterápicas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: cultura e enriquecimento de células cancerosas pancreáticas e fibroblastos. Imagens de células cancerosas e fibroblastos enriquecidos a partir de três diferentes pacientes com câncer pancreático após 10 dias de cultura. Barra de escala, 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: estrutura do vetor lentivirais expressando BCL2L1 e diferentes proteínas fluorescentes. Diagrama esquemático de dois vetores lentivirais expressando constantemente mKate2-E2A-BCL2L1 ou eGFP-E2A-BCL2L1, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: efeitos na Xenoenxerto por gemcitabina. (A) visão lateral do Xenoenxerto no saco vitelino de larvas de zebrafish em 3 h pós-transplante (HPT). (B) imagens representativas dos xenoenxertos em larvas de zebrafish em 60 HPT, tratadas por DMSO ou gemcitabina. (C) renderização 3D representativa dos xenoenxertos em 60 HPT. (D) estatísticas da intensidade de fluorescência do Xenoenxerto antes e após o tratamento com inibidores da gemcitabina e/ou BCL2L1. N = 10 por grupo para cada ensaio. Barra de escala = 100 μm; NS, não significativo; *P < 0, 5; P < 0, 1; média ± DP, com diferenças estatísticas determinadas por ANOVA unidirecional. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ambos os modelos PDX e CDX são plataformas vitais no campo da biologia tumoral22, e o passo crítico de um transplante de sucesso entre espécies é melhorar a sobrevida do Xenoenxerto. Recentemente, alguns estudos mostraram que a expressão transitória de BCL2L1 (BCL-XL) ou BCL2 pode melhorar significativamente a viabilidade de células-tronco embrionárias humanas em hospedeiros de camundongos sem afetar as identidades celulares e destinos23 , 24 de cada , 25. em nosso manuscrito, rotulamos as células com Lentivirus expressando constantemente o gene BCL2L1 (BCL-XL), bem como as proteínas fluorescentes. A introdução de BCL2L1 melhorou muito o tempo de sobrevivência de células humanas xenograft em zebrafish para prolongar a janela de observação para os estudos, enquanto os sinais fluorescentes não só rotular as células, mas também relatar a condição de vida do células, como descobrimos que a fluorescência desaparece rapidamente com a morte celular. Enquanto isso, estamos atualmente modificando o zebrafish como um melhor hospedeiro para xenoenxertos humanos. Por um lado, o RAG2 e o prkdc estão sendo eliminados através da tecnologia crispr/Cas9 para preparar um zebrafish imune-deficiente combinado, que fosse similar aos ratos imune-deficientes combinados, para fazer as larvas mais velhas do zebrafish igualmente compatíveis com células e tecidos humanos26. Por outro lado, o zebrafish também foi modificado para expressar proteínas humanas, como IGF1 e INS, para melhor apoiar a sobrevivência e proliferação de células humanas implantadas usando a tecnologia transgênica mediada por Transposon Tol2. Além disso, o zPDX também carece de um sistema imunológico funcional semelhante ao humano, e as interações entre as células estromais humanas e o sistema imunológico, e no futuro, podemos tentar coinjetar células imunes humanas para reconstruir um ambiente imunológico humanizado a curto prazo em zebrafish.
Nos modelos de camundongos PDX, as condições de Xenoenxerto foram tradicionalmente monitoradas por observação direta em nós de tamanho visível, o que requer muito tempo para se desenvolver. Nos modelos transparentes de zPDX como a comparação, o xenograft pode ser investigado a microscopia no tempo real. Entretanto, era difícil avaliar as alternações do número de pilha em uma população da único-cor sem um controle apropriado, e a idéia introduzir a população de duas células da fluorescência diferente melhora significativamente a quantificação da viabilidade da pilha. Misturando e injetando pilhas diferentes em relações fixas, nós não somente imitamos o microambiente do tumor, mas igualmente podemos quantificar exatamente a resposta da droga comparando os dois grupos da pilha. Embora a proporção original de células cancerosas para fibroblastos nos tecidos primários seja altamente diferente, aqui começamos com a proporção de 1:1, e os efeitos do tratamento medicamentoso na mesma composição celular de uma proporção diferente serão investigados no futuro. Adicionalmente, os efeitos do ° c 32 em vez das incubações de 37 ° c nos comportamentos de pilhas humanas igualmente exigem estudos comparativos detalhados. Por fim, a estratégia do modelo heterogêneo de Xenoenxerto derivado do paciente para câncer pancreático para avaliação comparativa de fármacos também pode ser aplicada a outros tipos de cânceres sólidos. Esta abordagem é particularmente útil para o PDX usando larvas de zebrafish como hospedeiros, que são cristalinas e viáveis para análise na resolução de uma única célula.
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Disclosures
Não foram divulgados potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China 81402582, Fundação de ciência natural de Xangai 12DZ2295100, 14YF1400600 e 18ZR1404500
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
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