Summary
Пациент полученных ксенотрансплантат (PDX) модели более надежно резюмировать меланомы молекулярных и биологических особенностей и более прогностические терапии ответ по сравнению с традиционными пластиковых тканей культуры на основе анализов. Здесь мы описываем наш стандартный операционный протокол для создания новых моделей PDX и характеристики/экспериментирования существующих моделей PDX.
Abstract
Накопленные данные свидетельствуют о том, что молекулярные и биологические свойства отличаются в клетках меланомы, выращенных в традиционных двухмерных сосудах культуры тканей по сравнению с in vivo у пациентов с людьми. Это связано с узким местом выбора клональных популяций клеток меланомы, которые могут сильно расти в пробирке при отсутствии физиологических условий. Кроме того, ответы на терапию в двухмерных культурах тканей в целом не точно отражают реакцию на терапию у пациентов с меланомой, при этом большинство клинических испытаний не показывают эффективность терапевтических комбинаций, которые доказали свою эффективность в Пробирке. Хотя ксенотрансплантация клеток меланомы на мышей обеспечивает физиологический контекст виво отсутствует в двухмерных анализов культуры тканей, меланомы клеток, используемых для прививки уже претерпели узкое место выбор для клеток, которые могли бы расти под двумерные условия, когда была установлена клеточная линия. Необратимые изменения, которые происходят в результате узкого места включают изменения в росте и вторжение свойства, а также потери конкретных субпопуляций. Таким образом, модели, которые лучше резюмировать состояние человека in vivo может лучше предсказать терапевтические стратегии, которые эффективно увеличить общую выживаемость пациентов с метастатической меланомы. Методки ксенотранспланта (PDX) пациента включает в себя прямую имплантацию опухолевых клеток от пациента к получателю мыши. Таким образом, опухолевые клетки постоянно выращиваются под физиологическими нагрузками in vivo и никогда не проходят двухмерное узкое место, которое сохраняет молекулярные и биологические свойства, присутствующие при обнаружении опухоли у пациента. Примечательно, что модели PDX, полученные из органов сайтов метастазов (т.е. мозга) отображают аналогичную метастатическую способность, в то время как модели PDX, полученные из терапии наивных пациентов и пациентов с приобретенной устойчивостью к терапии (т.е. бигибаторной терапии BRAF/MEK) отображаются аналогичная чувствительность к терапии.
Introduction
Доклинические модели имеют решающее значение для всех аспектов трансляционных исследований рака, включая характеристику болезней, открытие действенных уязвимостей, присущих только раку, по сравнению с нормальными клетками, и развитие эффективных методов лечения, которые эксплуатируют эти уязвимости для повышения общей выживаемости пациентов. В области меланомы, десятки тысяч моделей клеточной линии были в значительной степени использованы для скрининга наркотиков, с йgt;4,000 способствовали только нашей группы (WMXXX серии). Эти модели клеточной линии были получены от пациентов с меланомой с различными формами кожной меланомы (т.е. акрала, увеального и поверхностного распространения) и различных генотипов (т.е. BRAFV600-мутант и нейробластома РАН вирусный онкоген однородный НРАС «61R-мутант»), которые охватывают спектр заболеваний, присутствующих в клинике1,2.
Однозначно, наиболее успешная, целевая стратегия терапии в области меланомы возникла из 1) геномной характеристики опухолей пациентов, определяющих мутации BRAF в 50% меланомы3 и от 2) доклинического исследования использование меланомы клеточной линии модели4. Комбинация ингибитора BRAF/MEK была утверждена Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в 2014 году для лечения пациентов, чья меланома гавани активации BRAFV600E / K мутаций и может похвастаться йgt;75% ответ5. Несмотря на эту начальную эффективность, сопротивление быстро возникает почти в каждом случае из-за многогранных внутренних и приобретенных механизмов сопротивления и внутриопухолевой неоднородности. К сожалению, модели клеточных линий не резюмируют репрезентативной биологической неоднородности, когда выращивается в двумерной культуре в пластиковых сосудах, что маскирует их клинически прогностический потенциал, когда исследователи пытаются экспериментально определить терапии, которые могут быть эффективными у пациентов с определенной формой или генотипом меланомы6. Понимание того, как лучше моделировать внутриопухолевую неоднородность пациента позволит следователям лучше разработать терапевтические методы, которые могут убить устойчивых к терапии субпопуляций, которые приводят к неспособности к текущим стандартам лечения.
Первостепенное значение ограниченного прогностического значения моделей клеточной линии — это то, как они изначально устанавливаются. Необратимые изменения происходят в клональном ландшафте опухоли, когда одноклеточная суспензия опухоли пациента выращивается на двухмерных, сосудах культуры пластиковой ткани, включая изменения в пролиферативном и инвазивном потенциале, устранение специфических субпопуляций, и изменение генетической информации7. Xenografts в мышей этих моделей линии клетки меланомы представляют наиболее часто используемые в vivo платформа для preclinical изучений; однако, эта стратегия также страдает от плохой перепросмотра сложной неоднородности опухоли наблюдается клинически. Чтобы преодолеть этот недостаток, наблюдается растущий интерес к включению более сложных доклинических моделей меланомы, включая модель PDX. Модели PDX были использованы для йgt;30 лет, с семенных исследований в больных раком легких, демонстрирующих соответствие между ответом пациентов на цитотоксические агенты и ответ модели PDX, полученных от того же пациента8. В последнее время наблюдается стремление использовать модели PDX в качестве инструмента выбора для доклинических исследований как в промышленности, так и в академических центрах. Модели PDX, из-за их превосходной перепросмотра неоднородности опухоли у пациентов, более клинически уместны для использования вусилиях оптимизации терапии чем xenografts линии клетки 9. В меланоме, Есть огромные препятствия, которые тупой терапевтического управления передовых заболеваний10. Клинически значимые модели PDX были использованы для моделирования клинической резистентности и определения терапевтических стратегий с клинически доступными агентами для лечения устойчивых к терапии опухолей11,12. Кратко, протокол представленный здесь для того чтобы произвести модели PDX требует subcutaneous имплантации свежей ткани от главным образом или метастатических меланом (собранных биопсией или хирургией) в NOD/scid/IL2-рецептор null (NSG) мышей. Различные различия в методологическом подходе используются различными группами; однако, фундаментальное ядро существует13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующие протоколы животных следуют руководящим принципам комитета по гуманной этике Института Вистара и руководящим принципам по уходу за животными.
1. Сбор опухолевых тканей меланомы
- Соберите опухолевую ткань (термин "переход 0") у пациентов с меланомой одним из следующих методов операции или биопсии.
- Для хирургической ткани иссечения, поддерживать не менее 1 г ткани (резекта метастазы и первичные поражения) в транспорте хранения средств (RPMI 1640 0,1% грибковзон 0,2% гентамицин) при 4 градусах Цельсия или на льду.
- Для хирургической биопсии ткани, поддерживать менее 1 г ткани (часто удар биопсии подкожных метастазов и лимфатических узлов (LN) в транспорте хранения средств хранения при 4 градусах Цельсия или на льду.
- Для основной ткани биопсии промыть цилиндр (ядро) ткани примерно 10 мм х 1 мм (часто, биопсия печени) в трубку 15 мл, содержащую 5 мл транспортных носителей хранения при 4 c или на льду.
- Для тонкой иглы аспират (FNAs) ткани, держать очень небольшое количество ткани (менее 1 мм в размере), принятых непосредственно от пациента в иглы и шприца при 4 кв или на льду.
- Доставка ткани в транспорте хранения средств на 4 кв или на льду в тот же день или с ночной доставкой после хирургического иссечения или биопсии. Обработка ткани в течение 1-2 ч от доставки.
2. Обработка опухолевых тканей для имплантации мыши
- Хирургическое иссечение или хирургическая обработка биопсии
- Перенесите ткань в стерильную чашку Петри и отделите опухолевую ткань от окружающих нормальных тканей как можно больше.
- Удалить некротической ткани (как правило, определены как бледно-ватные ткани, расположенные в центре опухоли) из оставшейся опухоли как можно больше.
- Используйте скальпель, чтобы разделить первоначальный кусок опухоли примерно на равные части (3 мм х 3 мм) для хирургической имплантации мыши(рисунок 2).
- Дополнительно, если достаточно опухолевой ткани доступна, оснастки заморозить ткани для вниз по течению анализы (РНК секвенирования "RNASeq", весь exome секвенирования "WES" и т.д.).
- Сделать опухолевую суспензию, сбивая опухолевую ткань с помощью техники перекрестного лезвия с двумя скальпелями. Фарш опухоли куски как можно лучше сформировать суспензию, которая теперь готова для хирургической имплантации мыши.
- Кроме того, если опухолевая ткань слишком сложна для механической диссоциации, используйте процедуру диссоциации пищеварения, чтобы сформировать гель-подобную суспензию и одноклеточную подвеску для имплантации и/или инъекции.
- Фарш опухоли куски как можно штрафом, чтобы сформировать суспензию.
- Положите суспензию в трубку 50 мл с сбалансированным солевой раствором (HBSS) (HBSS)-/- (без Каи и Мг); затем, центрифуга и гранулы на 220 х г в течение 4 мин при 4 градусах Цельсия.
- Приостанавливайте суспензию в 10 мл разогретого свежего дайджеста (200 U/mL коллагеназiv IV 5 мМ CaCl2 50 U/mL DNase в HBSS-/)) на 1 г опухолевой ткани.
- Поместите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут и энергично перемешайте каждые 5 минут с одноразовой пипеткой.
- Вымойте до 50 мл HBSS-/-; затем, центрифуга на 220 х г в течение 4 мин при 4 c.
- Добавьте 5 мл претепловой TEG (0,025% трипсин и 40 мкг/мЛ этилен гликоль-бис (з-аминоэтил эфир)-N,N,N',N',N',N'-тетраацетической кислоты (EGTA) аккуратно отрежь /встряхните, и поместите трубку на 37 градусов по Цельсию в течение 2 минут без смешивания.
- Добавить по крайней мере 1 равный объем холодных окрашивания средств (1% бычьего сыворотки альбумина »BSA» 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетанесульфоновая кислота «HEPES» 1x пениколлин-стрептомицин в L15 media) чтобы утолить трипсин и центрифуги на 20. C.
- Resuspend образец в 10 мл окрашивающих средств на 1 г опухолевой ткани и фильтровать его через 40 мкм ячейки ситечко, чтобы получить одноклеточную подвеску для инъекций мыши (Рисунок 2).
- Суспензия, оставшаяся на верхней части клеточного ситеча, также может быть собрана для хирургической имплантации мыши.
- C обработка рудной биопсии тканей
- Налейте основной ткани цилиндра в ткани-транспортная трубка в 5 см Чашка Петри.
- Удалить лишнюю жидкость, соскребать ткани к краю чашки Петри, мелко фарш опухолевой ткани, добавить 100-150 л HBSS-/- на верхней части ткани опухоли, и быстро обратить HBSS / опухоли ткани подвески в 1 мл шприц.
- Прикрепите 23 G иглу к шприцу 1 мл, передайте hBSS/tumor tissue suspension через иглу в 1,5 мл спиновой трубки.
- Перерисовывайте суспензию опухоли в шприц с иглой, пока она не пройдет гладко через иглу.
- Наконец обратить опухоли подвески обратно в шприц и отсоединить 23 G иглы.
- Прикрепите иглу 27 G и нарисуйте в шприц одинаковый объем (100–150 л) искусственной внеклеточной матрицы (см. таблицуматериалов).
- Добавьте равный объем искусственной внеклеточной матрицы медленно в 1,5 мл спиновой трубки с опухолью/HBSS-/- подвеской, тщательно избегая образования пузырьков.
- Нарисуйте последний раз обратно в шприц и основной ткани опухоли биопсии теперь готов к инъекции мыши.
- Обработка тканей FNA
- Поместите шприц, содержащий образцы FNA (застряв в игле) на льду.
- Отделите иглу (содержащую ткань FNA) от шприца и удалите поршень из шприца, добавьте 150-200 л HBSS-/- к верхней части шприца.
- Повторно вставьте поршень в шприц и иглу (содержащую ткань FNA), и вытолкнуть HBSS-/- через иглу в 1,5 мл спиновой трубки. Этот шаг удаляет опухоль FNA из иглы.
- Повторите шаг 2.3.3 с HBSS-/-/FNA подвески дважды с помощью одного и того же шприца, чтобы максимизировать извлечение опухолевой ткани из иглы.
- Добавьте равный объем (100–150 л) искусственной внеклеточной матрицы к спиновой трубке объемом 1,5 мл, содержащей подвеску HBSS/FNA.
- Адекватно смешивать, медленно составление искусственной внеклеточной матрицы / HBSS-/-/FNA подвески обратно в 23 G иглы и повторять дважды.
- Нарисуйте всю искусственную внеклеточную матрицу/HBSS-/-/FNA объем обратно в шприц, замените 23 G иглу с иглой 27 G, и образец FNA теперь готов для инъекций мыши.
3. Имплантация опухолей и инъекция у мышей
- Имплантация хирургического иссечения или хирургической биопсии
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все хирургические инструменты стерильны путем автоклавирования или использования предварительно стерилизованных одноразовых инструментов.- Бритье волос из нижней части nsG 6-8 недель мышей мужского или женского пола оставляя примерно 1,5 см х 3 см области без волос. Анестезить мышей с помощью изофлюран, и подтвердить, мягко сжимая ногу в качестве теста отзывчивости. Используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость.
- Поместите отдельных мышей на тепловую площадку в носовой конус анестезии машины, скраб бритая область с хлоргексидином. Затем облить 70% этанола и дать испариться.
- Подготовка куски или разделить опухолевую суспензию в чашке Петри на отдельные насыпи для хирургической имплантации (т.е. на три равные насыпи, если быть имплантированным в 3 мышей).
- Используя скальпельное лезвие, сделайте разрез длиной около 5 мм по центру задней части мыши, возьмите одну пару щипц и поднимите кожу на стороне разреза, противоположного оператору.
- Возьмите ножницы в другую руку и отделить кожу от мышечного слоя, мягко резки фасциальной мембраны с небольшими ножницами сокращений, тем самым создавая "карман" для опухолевой ткани.
- Возьмите один кусок опухоли или один отдельный насыпь ткани суспензии скальпеля и аккуратно место ткани в созданный карман.
- Администрирование 100 зл искусственной внеклеточной матрицы на насыпи опухолевой ткани в кармане.
- Используя две пары щипцы, подтяните разрез на обоих концах так, чтобы края раны сблизились, и закройте рану, применяя одну или две зажимы.
- Подкожный вводят 1-5 мг/кг мелоксикама в качестве анальгетика у мышей после операции.
- Возьмите мышь из конуса носа и поместите его обратно в свою первоначальную клетку, наблюдать за мышью во время пробуждения. Не возвращайтесь в клетку, пока полностью не выздоровеет.
- Удалите раны клипы примерно через 7 дней. Если заживление не завершено через 7 дней, оставьте рану клипа в течение дополнительных одного или двух дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании одной клеточной подвески от хирургического иссечения или хирургической обработки биопсии ткани, он будет смешиваться с искусственной внеклеточной матрицы (в соотношении 1:1) для инъекций мышей.
- Инъекция ФНА или основной биопсии ткани
- Поместите мышь NSG на стальную стойку сетки, держите мышь крепко за хвост и осторожно потяните мышь назад. Он будет хватать сетку с его передними ногами твердо. Кроме того, сдержать мышь в недоминирующей стороны и пусть фланг области видны.
- Дезинфицировать кожу фланга спиртными подготовительными тампонами, медленно и неуклонно впрыскивать содержимое шприца под кожу мыши.
- Вытяните иглу и поместите мышь обратно в клетку.
4. Мониторинг роста опухоли
- Мониторинг мышей один раз в неделю, чтобы проверить на ощутимые опухоли.
- После того, как опухоли находятся на измеримых размеров (примерно 50 мм3), используйте caliper для записи размеров опухоли. Используйте следующую формулу для расчета объемов опухоли: (ширина x ширина x длина) / 2.
- Урожай опухоли, как только объем опухоли достигает около 1,5 см3 (примерно 4-10 недель). Опухоль теперь называется мышью проход 1 (MP1).
5. Опухоль урожая для банковской ткани, реимплантации и эксперимента/характеристики
- Эвтаназия мышь в камере CO 2, проверить жизненно важные признаки, чтобы подтвердить смерть, а затем погрузить мышь в раствор Virkon стерилизовать кожу в течение 30 с в био-кабинет.
- Используйте изогнутые ножницы и хирургические щипцы, чтобы поднять кожу рядом с опухолью и сделать горизонтальный разрез.
- Используйте тупой метод разделения, чтобы мобилизовать кожу с обеих сторон опухоли и над опухолью, подвергая опухоли.
- Используйте ножницы или скальпель нопасти, чтобы отделить опухоль от фасции.
- Пересектировать опухоль и перенести опухоль в стерильную чашку Петри, разрезать опухоль на мелкие кусочки и удалить некротические ткани из опухоли.
- Банковская опухолевая ткань для будущей имплантации.
- Возьмите 2-3 небольших опухолевых кусочка меньше, чем 10 мм х 10 мм, и фарш их на кусочки меньше, чем 1 мм х 1 мм.
- Перенесите всю рубленую ткань в криогенный флакон 2 мл, добавьте 1 мл замораживающих носителей (10% DMSO и 90% FBS).
- Хорошо перемешайте и поместите криогенные флаконы в предварительно охлажденный изопропанол на основе клеточного замораживания контейнера на сухом льду.
- Храните контейнер в морозильной камере -80 градусов на ночь, а затем перенесите криогенные флаконы в жидкое азот (LN2) на хранение.
- Привязка-замораживание ткани для ниже по течению анализы (RNASeq, WES и т.д.).
- Поместите кусочки опухолевой ткани (3 мм х 3 мм) в криогенный флакон и немедленно поместите криогенный флакон в LN2. Храните флаконы в морозильной камере -80 градусов.
6. PDX терапии испытаний
ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет две фазы расширения расти достаточно опухолевых тканей для создания необходимого количества PDX подшипников мышей для терапии суда.
- Возьмите криовые содержащие накренился PDX ткани из LN2, и место кривиной в 37 градусов по Цельсию водяной бане до замораживания средств, содержащих опухолевой ткани только начинает таять.
- Опорожните содержимое криового в предварительно разогретый HBSS-/- в трубке 50 мл, и мыть ткани.
- Ткань пеллеты центрифугированием в течение 5 мин при 1200 об/мин.
- Удалить HBSS-/- из образца опухоли путем вакуумного аспирации с трубой Pasteur.
- Сдвиньте ткань PDX из трубки 50 мл в тарелку Петри на 5 см или 10 см и поместите на мокрый лед.
- Следуйте вышеупомянутому протоколу имплантации, чтобы имплантировать накренченную ткань из криогенного флакона в 5 мышей NSG для первого раунда расширения опухоли PDX.
- Как только опухоли достигают 600-800 мм3,урожай 1-2 опухоли, чтобы получить одну клеточную подвеску с вышеуказанным протоколом для обработки опухолевых тканей: механическая диссоциация, процедура диссоциации коллагеназа.
- Клетки пеллет и resuspend в 6 мл HBSS-/-/искусственной внеклеточной матрицы (1:1 соотношение), подкожный инъекционные мыши N50 NSG, с 100 л клеточной смеси на мышь для второго раунда расширения опухоли PDX.
- Измеряйте размер опухоли с помощью калиперов раз в две недели.
- Подождите, пока опухоль размером 100 мм3 в 3-5 недель, рандомизации мышей в группы, и начать лечение.
- Когда размер опухоли достигает максимального объема, одобренного IACUC, прекратите лечение.
- Следуйте выше протокол опухоли урожая, чтобы собрать оснастки замороженных опухолей, опухоли частей для парафин блоков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Опухолевые ткани для меланомы PDX модели могут поступать из различных источников, а также могут быть обработаны в динамике роста отдельных моделей и желаемого использования ткани PDX. Приоритет при создании модели PDX заключается в том, чтобы иметь достаточно материала для банка для будущего использования и ДНК для характеристики(рисунок 1).
После того, как достаточный материал накренился, опухолевой ткани могут быть расширены в одном из трех основных методов, чтобы вырастить достаточно опухоли для выполнения формального исследования терапии(Рисунок 2A). Каждый из описанных в этом методе позволит расширить опухоль из PDXs(рисунок 2B). Наш опыт показывает, что создание одноклеточной суспензии опухолевых клеток с использованием ферментативного пищеварения (коллагеназы IV) может обеспечить более быстрый рост опухоли, и может позволить одной первоначальной опухоли, которая будет расширена на 10 - 20 мышей, в то время как опухоль кусок и суспензии метод может быть расширен только на 5 - 10 мышей(рисунок 2C). Как было ранее показано в других типах опухоли, меланома PDX модели часто отражают чувствительность препарата отображается пациент отображается при терапии. Здесь показана репрезентативная кривая терапии от пациента с меланомой BRAFV600E мутанта, который первоначально ответил на ингибитор BRAF, но в конечном итоге рецидив. PDX, полученный от этого пациента также отображается первоначальная чувствительность к торможению BRAF (Rx1) плюс дополнительный ингибитор (Rx2); однако, опухоли в конечном итоге рецидива(рисунок 3).
Рисунок 1 : PDX модель генерации рабочего процесса для банковских опухолевых тканей и выполнения терапевтических исследований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Альтернативные методы имплантации. (A) Опухоли могут быть обработаны в любой куски, суспензии суспензии, или как одноклеточная подвеска. (B) Все три метода позволят для роста опухолей in vivo. Здесь показаны мыши, подкожно имплантированные с опухолью и изображенные через 12 дней после имплантации. (C) Показаны кривые роста опухоли для мышей, введенных с одним из трех методов имплантации. N - 5 евро на руку; бары ошибок являются стандартной ошибкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Репрезентативные данные для исследования терапии PDX. Мышам имплантировали опухоли PDX и лечили либо с помощью управления транспортным средством, либо с помощью двухингисторного комбинации ингибитора BRAF и ингибитора MEK. No 6 на руку. Рандомизация использовалась для размещения мышей в исследовательские группы. Следует отметить, что, хотя 500 мм3 был использован в этом примере в качестве стартового объема опухоли для начала терапии, обычный объем, чтобы начать исследования PDX 100-200 мм3, как PDX опухоли агрессивны и их рост трудно ингибировать, как только они слишком большой размер (Зтт;300 мм3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали генерацию МОДЕЛЕй pdX меланомы с тканью пациента, полученной из первичных и метастатических опухолей, основных биопсий и FNAs. При непосредственном привитом в NSG мышей, опухоли представляют аналогичные морфологические, геномные и биологические свойства для тех, наблюдается у пациента. В случае, когда только небольшое количество ткани доступно для исследователей, как это часто происходит с FNAs, метод PDX позволяет для расширения опухолевой ткани для ДНК, РНК и белковой характеристики, а также для терапии испытаний, чтобы доклинические препараты Развития.
Критически к успеху engraftment PDX качество материала исследователя начинают с. Необходимо позаботиться о том, чтобы опухолевые ткани надлежащим образом сохранились в разделах 1 и 2. Важно отметить, что ответ на терапию моделей меланомы PDX лучше резюмирует чувствительность пациента-донора, что позволяет надежные доклинические исследования для разработки улучшенных терапевтических стратегий для борьбы с устойчивостью терапии и улучшения долговечность ответа. Большинство пациентов метастатической меланомы не испытывают лечения с существующим стандартом лечения (SOC) терапии5. Наша коллекция меланомы PDX содержит более 500 различных моделей, в том числе полученных от пациентов, которые рецидивировали на целевую терапию и иммунотерапию1,2. Этот ресурс будет иметь решающее значение для развития терапевтических методов, которые преодолевают устойчивость к текущей SOC. Будущие приложения для модели PDX будут опираться на экономически эффективные, высокопроизводительные подходы, которые используют модели PDX в лекарственных экранах и CRISPR-Cas9 экраны для выявления новых эффективных стратегий для различных генотипов (т.е., BRAFV600E, NRASNo 61R) и подтипов (т.е., uveal, acral) меланомы14.
Одним из ограничений метода PDX является необходимость того, чтобы опухолевый материал привиты в мышей без иммунной системы, чтобы обеспечить успех прививок1. Таким образом, исследования PDX по оптимизации терапевтических стратегий для борьбы с устойчивостью терапии не затрагивают, как новые стратегии терапии могут положительно или негативно повлиять на иммунную систему и/или противоопухолевые иммунные реакции. К счастью, достижения в области гуманизации мыши с иммунной системой человека были сделаны и позволит более идеальным исследованиям PDX на мышах, которые лучше резюмировать микроокружение человека15.
Таким образом, модели PDX позволяют проводить доклинические исследования клеток меланомы, которые лучше подыгрывают неоднородности опухоли и агрессивности меланомы, наблюдаемым в клинике (по сравнению с другими двумерными и стандартными подходами ксенотрансплантата). Модели PDX позволяют глубже понять, какие гены участвуют в резистентности терапии, и обеспечивают более клинически-соответствующую модель, из которой могут быть разработаны более эффективные методы лечения для повышения общей выживаемости пациентов с метастатической меланомой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Wistar институт животных фонда, микроскопии фонда, гистотехнологии фонда, и научно-исследовательский центр снабжения. Это исследование было частично профинансировано грантами U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), Доктором Мириам и Шелдоном Г. Адельсоном, Фондом медицинских исследований меланомы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
