Summary
Patient afledte xenograft (PDX) modeller mere robust rekapitulere melanom molekylære og biologiske egenskaber og er mere forudsigende for terapi respons sammenlignet med traditionelle plast vævskultur-baserede assays. Her beskriver vi vores standard Operations protokol for etablering af nye PDX modeller og karakterisering/eksperimenter af eksisterende PDX modeller.
Abstract
Akkumulerende beviser tyder på, at molekylære og biologiske egenskaber er forskellige i melanom celler dyrket i traditionelle todimensionale vævskultur fartøjer versus in vivo hos humane patienter. Dette skyldes flaskehalsen udvælgelse af klonale populationer af melanom celler, der kan robust vokse in vitro i fravær af fysiologiske betingelser. Desuden afspejler responserne på behandling i todimensionelle vævskulturer generelt ikke på en trofast Vis respons på behandling hos melanompatienter, idet størstedelen af de kliniske forsøg ikke viser effekten af terapeutiske kombinationer, der er påvist at være effektive i In vitro. Selvom xenografering af melanom celler i mus giver den fysiologiske in vivo-kontekst fraværende fra to-dimensionelle vævskultur analyser, har de melanom celler, der anvendes til engraftment, allerede undergået flaskehalsen udvælgelse for celler, der kunne vokse under to-dimensionelle betingelser, når celle linjen blev etableret. De irreversible ændringer, der opstår som følge af flaskehalsen, omfatter ændringer i vækst-og invasions egenskaber samt tab af specifikke delpopulationer. Derfor, modeller, der bedre rekapitulere den menneskelige tilstand in vivo kan bedre forudsige terapeutiske strategier, der effektivt øger den samlede overlevelse af patienter med metastatisk melanom. Den patient afledte xenograft (PDX) teknik involverer direkte implantation af tumorceller fra den menneskelige patient til en mus modtager. På denne måde, tumorceller er konsekvent dyrkes under fysiologiske belastninger in vivo og aldrig gennemgå de to-dimensionelle flaskehalsen, som bevarer de molekylære og biologiske egenskaber til stede, når tumoren var i den menneskelige patient. Bemærkelsesværdige, PDX-modeller afledt af organ sider med metastaser (dvs. hjernen) udviser lignende metastatisk kapacitet, mens PDX-modeller afledt af behandlingsnaive patienter og patienter med erhvervet resistens over for behandling (dvs. BRAF/MEK-inhibitor terapi) viser lignende følsomhed over for terapi.
Introduction
Prækliniske modeller er afgørende for alle aspekter af translationel kræftforskning, herunder sygdomskarakterisering, opdagelse af handlingsrettede sårbarheder unikke for kræft versus normale celler, og udviklingen af virkningsfulde terapier, der udnytter disse sårbarheder for at øge patienternes samlede overlevelse. I melanom feltet, titusinder af cellelinje modeller er blevet stærkt udnyttet til Drug screening, med > 4000 bidraget af vores gruppe alene (wmxxx Series). Disse cellelinje modeller blev afledt af melanompatienter med forskellige former for kutan melanom (dvs. Acral, ukalvekød og overfladisk spredning) og forskellige genotyper (dvs. BRAFV600-mutant og neuroblastom RAS viral onkogen ligner [ NTM Q61R-mutant]), som spænder over det spektrum af sygdomme, der findes i klinikken1,2.
Utvetydigt, den mest vellykkede, målrettede terapi strategi i melanom feltet er dukket op fra 1) den genomiske karakterisering af patienternes tumorer identificere BRAF mutationer i ~ 50% af melanomer3 og fra 2) prækliniske undersøgelse udnyttelse af melanom cellelinje modeller4. Kombinationen af BRAF/MEK-hæmmere var Food and Drug Administration (FDA)-godkendt i 2014 til behandling af patienter, hvis melanomer havn aktivering af BRAFV600E/K -mutationer og kan prale af en > 75% responsrate5. På trods af denne indledende virkning opstår resistens hurtigt i næsten alle tilfælde på grund af mangfoldige iboende og erhvervede resistensmekanismer og intratumoral heterogenitet. Desværre, cellelinje modeller ikke rekapitulere repræsentative biologisk heterogenitet, når de dyrkes i todimensionale kultur i plastbeholdere, som maskerer deres klinisk forudsigelige potentiale, når forskerne forsøger at eksperimentelt bestemme behandlingsformer, der kan være effektive hos patienter med en specifik form eller genotype af melanom6. Forståelse af hvordan man bedst model patient intratumoral heterogenitet vil gøre det muligt for undersøgere bedre at udvikle terapeutiske modaliteter, der kan dræbe terapi-resistente subpopulationer, der drev manglende nuværende standard-of-Care terapier.
Altafgørende for den begrænsede prædiktive værdi af cellelinje modeller er, hvordan de oprindeligt blev etableret. Irreversible ændringer forekommer i tumor klonale landskab, når en enkelt cellesuspension af en patienternes tumor dyrkes på to-dimensionelle, plast væv kultur fartøjer, herunder ændringer i proliferativ og invasiv potentiale, eliminering af specifikke subpopulationer og ændring af genetisk information7. Xenografts til mus af disse melanom cellelinje modeller repræsenterer den hyppigst anvendte in vivo platform for prækliniske studier; Men, denne strategi lider også af den dårlige rekapitulation af komplekse tumor heterogenitet observeret klinisk. For at overvinde denne mangel, har der været en stigende interesse i at indarbejde mere sofistikerede prækliniske modeller af melanom, herunder PDX model. PDX modeller er blevet udnyttet i > 30 år, med skelsættende undersøgelser af lungekræft patienter viser overensstemmelse mellem patienternes respons på cytotoksiske midler og respons af PDX-modellen afledt af den samme patient8. For nylig har der været et drev til at udnytte PDX-modeller som det foretrukne værktøj til prækliniske undersøgelser både i branchen og i akademiske centre. PDX modeller, på grund af deres overlegne rekapitulation af tumor heterogenitet i humane patienter, er mere klinisk relevante for brug i terapi optimering indsats end cellelinje xenografter9. I melanom, der er enorme forhindringer, der sløv den terapeutiske forvaltning af avanceret sygdom10. Klinisk relevante PDX-modeller er blevet brugt til at modellere klinisk resistens og identificere terapeutiske strategier med klinisk tilgængelige midler til behandling af terapi resistente tumorer11,12. Kort, den protokol, der præsenteres her for at generere PDX modeller kræver subkutan implantation af fersk væv fra primære eller metastatiske melanomer (indsamlet ved biopsi eller kirurgi) i NOD/scid/ilds-receptor null (NSG) mus. Forskellige grupper anvender forskellige variationer i metodologisk tilgang; der findes imidlertid en grundlæggende kerne13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende dyre protokoller følger retningslinjerne i Wistar instituttets humane etiske komité og retningslinjer for dyrepasning.
1. melanom tumor vævs samling
- Indsamle tumor væv (kaldet passage 0) fra melanompatienter ved en af følgende kirurgi eller biopsi metoder.
- For kirurgisk excisionsvæv, opretholde mindst 1 g væv (resect metastaser og primære læsioner) i transport lagermedier (RPMI 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% gentamicin) ved 4 °C eller på is.
- For kirurgisk biopsi væv, opretholde mindre end 1 g væv (ofte punch biopsier af subkutane [s.c.] metastaser og lymfeknude [LN] metastaser) i transport lagringsmedier ved 4 °C eller på is.
- For kerne biopsi væv vaskes en cylinder (kerne) af væv på ca. 10 mm x 1 mm (ofte, leverbiopsier) i et 15 mL rør, der indeholder 5 mL transport lagringsmedier ved 4 °C eller på is.
- For fine nål aspirat (FNAs) væv, holde en meget lille mængde af væv (mindre end 1 mm i størrelse) taget direkte fra patienten i en nål og sprøjte ved 4 °C eller på is.
- Levere vævet i transport lagringsmedier ved 4 °C eller på is på samme dag eller med overnight shipping efter kirurgisk excision eller biopsi. Behandl vævet inden for 1-2 h levering.
2. tumor vævs behandling til mus implantation
- Kirurgisk excision eller kirurgisk biopsi vævs behandling
- Overfør vævet til en steril Petri skål og Adskil tumorvævet fra det omgivende normale væv så meget som muligt.
- Fjern nekrotisk væv (normalt identificeret som bleg-hvidlig væv placeret centralt i tumoren) fra den resterende tumor så meget som muligt.
- Brug en skalpel til at opdele en Initial tumor i omtrent lige store stykker (~ 3 mm x 3 mm) til kirurgisk mus implantation (figur 2).
- Eventuelt, hvis der er nok tumor væv til rådighed, snap-fryse væv til downstream assays (RNA sekventering [rnaseq], hele exome sekventering [Wes], etc.).
- Lav en tumor gylle ved at hakle tumorvævet ved hjælp af en crossblade teknik med to skalpel klinger. Hakke tumor bidder så fint som muligt at danne en gylle, som nu er klar til kirurgisk mus implantation.
- Alternativt, hvis tumorvævet er for hårdt til mekanisk dissociation, brug en fordøjelsesdissociations procedure til dannelse af gel-lignende gylle og en enkelt cellesuspension til implantation og/eller injektion.
- Hakke tumor bidder så fint som muligt at danne gylle.
- Sæt gyllen i et 50 mL rør med kold Hank's afbalancerede saltopløsning (HBSS)-/- (uden ca+ + og mg+ +); derefter centrifugeres og pellet ved 220 x g i 4 min ved 4 °c.
- Resuspension af opslæmningen i 10 ml varmet frisk fordøje medie (200 U/ml kollagenase IV + 5 mm CaCl2 + 50 U/ml DNase i hbss-/-) pr. 1 g tumor væv.
- Anbring røret i et 37 °C vandbad i 20 minutter og bland kraftigt hver 5 min. med en engangs pipette.
- Vask med op til 50 mL HBSS-/-; derefter centrifugeres ved 220 x g i 4 minutter ved 4 °c.
- Tilsæt 5 ml forvarmede TEG (0,025% trypsin + 40 μg/ml ethylenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, n, n ', N'-tetraeddikesyre [EGTA] + 10 μg/ml polyvinylchlorid alkohol [PVA]) pr. 1 g tumor væv, forsigtigt resuspension/ryste, og Placer røret ved 37 °c i 2 min uden blanding.
- Tilsæt mindst 1 tilsvarende mængde kold farvnings medie (1% bovint serumalbumin [BSA] + 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonsyre [HEPES] + 1x penicillin-streptomycin i L15-mediet) for at slukke for trypsin og centrifugeres ved 220 x g i 4 min ved 4 ° C.
- Prøven opslæmmes i 10 mL farvnings medie pr. 1 g tumor væv, og den filtreres gennem en 40 μm-celle-si for at få en enkelt cellesuspension til mus injektion (figur 2).
- Gylle tilbage på toppen af cellen si kan også indsamles til kirurgisk mus implantation.
- C behandling af malm biopsi af væv
- Hæld kernen cylinder væv i vævs-transport rør i en 5 cm Petri skål.
- Fjern overskydende væske, skrabe væv til kanten af Petri skålen, fint hakkes tumorvævet, Tilsæt ~ 100-150 μL HBSS-/- på toppen af tumorvævet, og hurtigt trække hbss/tumor væv suspension i 1 ml sprøjten.
- Fastgør en 23 G nål til 1 mL sprøjten, passere HBSS/tumor væv suspension gennem nålen i en 1,5 mL spin tube.
- Redraw tumor suspensionen i sprøjten med nålen stadig på, indtil det kan passere jævnt gennem nålen.
- Endelig trække tumor suspension tilbage i sprøjten og løsrive den 23 G nål.
- Fastgør en 27 G nål og træk en tilsvarende volumen (~ 100 – 150 μL) af kunstig ekstracellulær matrix (Se tabel over materialer) ind i sprøjten.
- Tilsæt en tilsvarende mængde kunstig ekstracellulær matrix langsomt ind i 1,5 mL spin røret med tumoren/HBSS-/- suspensionen, og undgå at dannelsen af bobler undgås.
- Tegn en sidste gang tilbage i sprøjten og kernen biopsi tumor væv er nu klar til mus injektion.
- FNA-vævs behandling
- Anbring sprøjten, der indeholder FNA-prøverne (fanget i nålen) på is.
- Adskil nålen (indeholdende FNA-vævet) fra sprøjten og fjern stemplet fra sprøjten, tilsæt ~ 150 – 200 μL HBSS-/- til toppen af sprøjten.
- Sæt stemplet ind i sprøjten og nålen (indeholdende FNA-vævet), og skub HBSS-/- gennem nålen ind i et 1,5 ml spin tube. Dette trin fjerner FNA-tumoren fra nålen.
- Gentag trin 2.3.3 med hbss-/-/Fna-suspensionen to gange med den samme sprøjte for at maksimere hentningen af tumorvævet fra nålen.
- Der tilsættes en tilsvarende mængde (~ 100 – 150 μL) kunstig ekstracellulær matrix til 1,5 mL spin røret, som indeholder HBSS/FNA-suspensionen.
- Blandes tilstrækkeligt ved langsomt at tegne den kunstige ekstracellulære matrix/hbss-/-/Fna-affjedring tilbage i 23 G nålen og gentage to gange.
- Træk hele den kunstige ekstracellulære matrix/hbss-/-/Fna-volumen tilbage i sprøjten, Udskift den 23 g nål med en 27 g nål, og Fna-prøven er nu klar til mus injektion.
3. tumor implantation og injektion i mus
- Implantation af kirurgisk excision eller kirurgisk biopsi væv
Bemærk: Sørg for, at alle kirurgiske instrumenter er sterile ved autoklave iser eller brug af Præsteriliserede engangs instrumenter.- Barbering hår fra den nedre ryg af NSG 6-8 uge mandlige eller kvindelige mus forlader en ca 1,5 cm x 3 cm område uden hår. Bedøve mus ved hjælp af isofluran, og Bekræft ved forsigtigt at klemme foden som en test af reaktionsevne. Brug dyrlæge salve på deres øjne for at forhindre tørhed.
- Placer individuelle mus på en varmepude i næse keglen af anæstesi maskinen, skrub det barberede område med chlorhexidin. Derefter slukke med 70% ethanol og lad det fordampe.
- Forbered klumper eller Opdel tumor gylle i en Petri skål i individuelle Mounds til kirurgisk implantation (dvs. i tre lige høje, hvis de skal implanteres i 3 mus).
- Brug skalpel bladet, lav et snit på ca. 5 mm lang på midten af bagsiden af musen, tag et par tang og løft huden på siden af snittet modsat af operatøren.
- Tag saksen i den anden hånd og adskille huden fra muskellag ved forsigtigt at skære fascial membranen med små saks nedskæringer, og dermed skabe en "lomme" for tumorvævet.
- Pick up en tumor luns eller en individuel bunke af tumor gylle væv med skalpel bladet og forsigtigt placere væv i den oprettede lomme.
- Giv 100 μL kunstig ekstracellulær matrix på tumor vævs højden i lommen.
- Brug to par tang, træk indsnit i begge ender, så sårkanterne kommer tæt sammen, og luk såret ved at anvende et eller to sår klip.
- Subkutan injektion af 1-5 mg/kg meloxicam som analgetikum i mus efter operationen.
- Tag musen ud af næse keglen og Placer den tilbage i sin oprindelige bur, observere musen, mens du vågner op. Vend ikke tilbage til et bur, før du er helt rask.
- Fjern sårklippene efter ca. 7 dage. Hvis healing ikke er færdig efter 7 dage, skal du lade sårclipsen være i en yderligere en eller to dage.
Bemærk: Hvis du bruger en enkelt cellesuspension fra kirurgisk excision eller kirurgisk biopsi vævs behandling, vil det blandes med kunstig ekstracellulær matrix (ved 1:1 ratio) for mus injektion.
- Injektion af FNA eller kerne biopsi væv
- Placer en NSG-mus på et stålgitter stativ, hold musen fast ved halen, og træk forsigtigt musen tilbage. Det vil forstå gitteret med sine forreste ben fast. Alternativt kan du begrænse en mus i den ikke-dominerende hånd og lade flanke området være synligt.
- Desinficer huden på flanke med alkohol prep podninger, langsomt og støt injicere indholdet af sprøjten under huden af musen.
- Træk nålen ud og Placer musen tilbage i buret.
4. Overvåg tumorvækst
- Overvåg mus én gang ugentligt for at kontrollere for håndgribelig tumorer.
- Når tumorer er i en målelig størrelse (ca. 50 mm3), skal du bruge en kaliber til at registrere tumor dimensioner. Brug følgende formel til at beregne tumor volumener: (bredde x bredde x længde)/2.
- Høst tumor når tumorvolumen når omkring 1,5 cm3 (ca. 4 – 10 uger). Tumoren kaldes nu muse passage 1 (MP1).
5. høst tumor for bankvæv, reimplantation, og eksperiment/karakterisering
- Euthanize mus i en CO2 kammer, kontrollere vitale tegn for at bekræfte døden, og derefter nedsænkes musen i en virkon opløsning til at sterilisere huden for 30 s i Bio-kabinet.
- Brug buede saks og kirurgiske pincet til at løfte huden støder op til tumoren og gøre en vandret snit.
- Brug en stump adskillelse teknik til at mobilisere huden på begge sider af tumoren og over tumoren, udsætter tumoren.
- Brug en saks eller en skalpel klinge til at adskille tumoren fra fascia.
- Resect tumoren og Overfør tumoren til en steril Petri skål, skær tumoren i små stykker og fjern nekrotisk væv fra tumoren.
- Bank tumor væv til fremtidig implantation.
- Tag 2-3 små tumor stykker mindre end ~ 10 mm x 10 mm og hakkekød dem i stykker mindre end ~ 1 mm x 1 mm.
- Alt hakket væv overføres til et 2 mL kryogen hætteglas, og der tilsættes 1 mL fryse medie (10% DMSO + 90% FBS).
- Bland godt og Placer kryogene hætteglas i en forkølet isopropanol-baseret celle frysende beholder på tøris.
- Opbevar beholderen i-80 °C fryser natten over, og overfør derefter kryogene hætteglas til flydende nitrogen (LN2) opbevaring.
- Snap-fryse vævet til downstream assays (RNASeq, WES, etc.).
- Placer tumor Vævsstykker (~ 3 mm x 3 mm) i et kryogen hætteglas og sæt det kryogene hætteglas i LN2 med det samme. Opbevar hætteglassene i-80 °C fryser.
6. forsøg med PDX-terapi
Bemærk: det vil tage to ekspansionsfaser at vokse nok tumor væv til at generere det nødvendige antal PDX bærende mus til terapi forsøget.
- Saml en cryovial indeholdende krænges PDX væv fra LN2, og Placer cryovial i et 37 °c vandbad, indtil fryse mediet, der indeholder tumorvævet, er lige begyndt at smelte.
- Tøm indholdet af cryovial i forvarmede HBSS-/- i et 50 ml rør, og vask vævet.
- Pellet væv ved centrifugering i 5 min ved 1.200 rpm.
- Fjern HBSS-/- fra tumor prøven ved vakuum aspiration med et Pasteur-pipet.
- Fra 50 mL røret skubbes PDX-vævet ind i en 5 cm eller 10 cm Petri skål og placeres på våd is.
- Følg ovenstående implantations protokol for at implantere krænges væv fra et kryogen hætteglas til 5 NSG mus til den første runde af PDX tumor ekspansion.
- Når tumorer nå ~ 600-800 mm3, høst 1-2 tumorer at få en enkelt cellesuspension med ovenstående protokol for tumor vævs behandling: mekanisk dissociation, kollagenase fordøjelse procedure.
- Pellet celler og resuspension i 6 ml hbss-/-/kunstig ekstracellulær matrix (1:1 ratio), subkutan injektion ~ 50 NSG mus, med 100 μl celle blanding per mus til anden runde af PDX tumor ekspansion.
- Mål tumorstørrelse med kalibre hver uge.
- Vent på en tumorstørrelse på ~ 100 mm3 i 3-5 uger, randomisere mus i grupper, og start behandling.
- Når tumorstørrelse når den maksimale IACUC-godkendt volumen, stoppe behandlingen.
- Følg ovenstående høst tumor protokol til at indsamle snap frosne tumor stykker, tumor stykker for paraffinblokke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumor væv for melanom PDX modeller kan komme fra en række forskellige kilder og kan også behandles pr vækstdynamikken i de enkelte modeller og den ønskede brug af PDX væv. Prioriteten ved etableringen af en PDX-model er at have tilstrækkeligt materiale til at kunne bruges til fremtidig brug og DNA til karakterisering (figur 1).
Når tilstrækkeligt materiale er banket, tumor væv kan udvides i en af tre vigtigste metoder til at vokse nok tumor til at udføre en formel terapi undersøgelse (figur 2a). Hver af de metoder, der er beskrevet heri, vil gøre det muligt at udvide tumor fra PDXs (figur 2B). Det er vores erfaring, at skabe en enkelt cellesuspension af tumorceller med brug af enzymatisk fordøjelse (collagenase IV) kan give mulighed for hurtigere tumorvækst, og kan tillade en Initial tumor, der skal udvides til 10 – 20 mus, mens tumor luns og gylle metode kan kun udvides til 5 – 10 mus (figur 2C). Som tidligere påvist i andre tumortyper, melanom PDX modeller ofte afspejler stof følsomhed patienten vises, når på terapi. Vist her er en repræsentativ terapi kurve fra en melanom patient med BRAFV600E mutant melanom, som oprindeligt RESPONDEREDE på en BRAF-hæmmer, men i sidste ende recidiverede. Den PDX, som er afledt af denne patient, viste også Initial følsomhed over for BRAF-hæmning (Rx1) plus en yderligere inhibitor (Rx2); Men, tumorer i sidste ende recidiverende (figur 3).
Figur 1 : PDX model generation workflow for bank tumor væv og udfører terapi undersøgelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Alternative implantations metoder. (A) tumorer kan forarbejdes til enten klumper, en gylle suspension, eller som en enkelt cellesuspension. (B) alle tre metoder vil give mulighed for vækst af tumorer in vivo. Vist her er mus subkutant implanteret med tumor og afbildet 12 dage efter implantation. (C) vist er tumorvækst kurver for mus injiceres med en af de tre implantations metoder. N = 5 pr. arm; fejllinjer er standardfejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentative data for et forsøg med PDX-terapi. Mus blev implanteret med PDX tumorer og behandlet med enten en køretøjskontrol eller en to-hæmmer kombination af en BRAF-hæmmer og en MEK-hæmmer. N = 6 pr. arm. Randomisering blev brugt til at placere mus i studiegrupper. Bemærk, selv om ~ 500 mm3 blev anvendt i dette eksempel som start tumorvolumen for behandling indledning, den rutinemæssige volumen til at begynde PDX undersøgelser er 100 – 200 mm3 som PDX tumorer er aggressive og deres vækst er vanskeligt at hæmme, når de for stor en størrelse (> 300 mm3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har heri beskrevet genererer PDX modeller af melanom med patient væv afledt af primære og metastatiske tumorer, kerne biopsier, og FNAs. Når direkte indpodet i NSG mus, tumorer præsentere lignende morfologiske, genomiske, og biologiske egenskaber til dem, der observeres i patienten. I tilfælde, hvor kun en lille mængde væv er til rådighed for undersøgere, som ofte opstår med FNAs, den PDX teknik giver mulighed for udvidelse af tumorvæv for DNA, RNA, og protein karakterisering, samt for terapi forsøg til at tillade prækliniske lægemidler Udvikling.
Afgørende for succesen af PDX engraftment er kvaliteten af materiale efterforskere begynder med. Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at tumorvævet er passende bevaret så meget som muligt i punkt 1 og 2. Det er vigtigt, at responsen på behandling af PDX-melanom modellerne giver bedre mulighed for at rekapitulerer donor patientens følsomhed, hvilket muliggør robuste prækliniske undersøgelser for at udvikle forbedrede terapeutiske strategier til at bekæmpe resistens over for terapi og forbedre holdbarheden af respons. De fleste metastaserende melanompatienter oplever ikke helbredelsesmetoder med eksisterende behandlingsstandard (SOC)5. Vores PDX melanom kollektion indeholder mere end 500 forskellige modeller, herunder dem, der stammer fra patienter, som recidiverede på målrettet terapi og immunterapi1,2. Denne ressource vil være afgørende for udviklingen af terapeutiske metoder, der overvinde resistens over for nuværende SOC. fremtidige anvendelser af PDX-modellen vil afhænge af omkostningseffektive tilgange med høj dataoverførselshastighed, der udnytter PDX-modeller i CRISPR-Cas9 skærme til at identificere nye effektive strategier for forskellige genotyper (dvs. BRAFV600E, NTMQ61R) og undertyper (dvs., ukalvekød, Acral) af melanom14.
En begrænsning af PDX teknik er nødvendigheden af, at tumor materiale indpodes i mus uden et immunsystem for at sikre engraftment succes1. Derfor, PDX undersøgelser optimering terapeutiske strategier til bekæmpelse af terapi resistens ikke behandle hvordan nye terapi strategier kan positivt eller negativt påvirke immunsystemet og/eller anti-tumor immunrespons. Heldigvis er der gjort fremskridt inden for mus humanisering med et menneskeligt immunsystem og vil give mulighed for mere ideelle PDX undersøgelser i mus, der bedre rekapitulere det menneskelige mikromiljø15.
I Resumé, PDX modeller giver mulighed for prækliniske undersøgelser af melanom celler, der bedre rekapitulere tumor heterogenitet og melanom aggressivitet observeret i klinikken (versus andre to-dimensionelle og standard xenograft tilgange). PDX-modellerne giver mulighed for en dybere forståelse af, hvilke gener der er involveret i terapi resistens, og giver en mere klinisk relevant model, hvorfra der kan udvikles mere effektive terapier for at øge den samlede overlevelse hos patienter med metastatisk melanom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Wistar Institute Animal facilitet, mikroskopi facilitet, Histotechnology Facility, og forskning Supply Center. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af tilskud fra U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation og Melanoma Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
