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Cancer Research

एक मेलेनोमा रोगी व्युत्पन्न Xenograft मॉडल

Published: May 20, 2019 doi: 10.3791/59508
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wistar Institute

Summary

रोगी व्युत्पन्न xenograft (PDX) मॉडल अधिक मजबूती से मेलेनोमा आणविक और जैविक सुविधाओं recapitulate और पारंपरिक प्लास्टिक ऊतक संस्कृति आधारित परख की तुलना में चिकित्सा प्रतिक्रिया के अधिक भविष्य कहनेवाला हैं. यहाँ हम नए PDX मॉडल की स्थापना के लिए हमारे मानक ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल और मौजूदा PDX मॉडल की विशेषता /

Abstract

एकत्र सबूत पता चलता है कि आणविक और जैविक गुण मानव रोगियों में vivo में बनाम पारंपरिक दो आयामी ऊतक संस्कृति वाहिकाओं में बड़े मेलेनोमा कोशिकाओं में अलग हैं. यह मेलेनोमा कोशिकाओं के क्लोनल आबादी की बाधा चयन के कारण है जो शारीरिक स्थितियों के अभाव में इन विट्रो में मजबूती से विकसित हो सकता है। इसके अलावा, दो आयामी ऊतक संस्कृतियों में चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं समग्र ईमानदारी से मेलेनोमा रोगियों में चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं करते, नैदानिक परीक्षणों के बहुमत के साथ चिकित्सीय संयोजन की प्रभावकारिता दिखाने में सक्षम होने के लिए दिखाया गया है विट्रो. हालांकि चूहों में मेलेनोमा कोशिकाओं के xenografting दो आयामी ऊतक संस्कृति परख से अनुपस्थित vivo संदर्भ में शारीरिक प्रदान करता है, engraftment के लिए इस्तेमाल मेलेनोमा कोशिकाओं पहले से ही कोशिकाओं है कि के तहत विकसित हो सकता है के लिए bottleneck चयन आया है द्वि-आयामी स्थितियाँ जब कक्ष पंक्ति स्थापित की गई थी. बाधा ओंठ के परिणामस्वरूप होने वाले अपरिवर्तनीय परिवर्तनों में विकास और आक्रमण गुणों में परिवर्तन, साथ ही विशिष्ट उप-जनसंख्या के नुकसान शामिल हैं। इसलिए, मॉडल है कि बेहतर vivo में मानव हालत recapitulate बेहतर चिकित्सीय रणनीतियों है कि प्रभावी ढंग से metastatic मेलेनोमा के साथ रोगियों के समग्र अस्तित्व में वृद्धि की भविष्यवाणी कर सकते हैं. रोगी व्युत्पन्न xenograft (PDX) तकनीक एक माउस प्राप्तकर्ता के लिए मानव रोगी से ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रत्यारोपण शामिल है. इस तरह, ट्यूमर कोशिकाओं को लगातार विवो में शारीरिक तनाव के तहत बड़े हो रहे हैं और दो आयामी बाधाओं से गुजरना कभी नहीं, जो आणविक और जैविक गुणों को बरकरार रखता है जब ट्यूमर मानव रोगी में था. उल्लेखनीय है, पीडीएक्स मॉडल मेटास्टेस के अंग साइटों से व्युत्पन्न (यानी, मस्तिष्क) इसी तरह मेटास्टैटिक क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जबकि पीडीएक्स मॉडल चिकित्सा भोले रोगियों और चिकित्सा के लिए अधिग्रहीत प्रतिरोध के साथ रोगियों से व्युत्पन्न (यानी, BRAF/MEK अवरोधक चिकित्सा) प्रदर्शन चिकित्सा के लिए इसी तरह की संवेदनशीलता.

Introduction

पूर्व नैदानिक मॉडल translational कैंसर अनुसंधान के सभी पहलुओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, रोग लक्षण सहित, सामान्य कोशिकाओं बनाम कैंसर के लिए अद्वितीय कार्रवाई कमजोरियों की खोज, और प्रभावशाली उपचार है कि शोषण के विकास इन कमजोरियों रोगियों के समग्र अस्तित्व को बढ़ाने के लिए। मेलेनोमा क्षेत्र में, सेल लाइन मॉडल के हजारों के दसियों भारी दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया गया है, के साथ gt;4,000 अकेले हमारे समूह द्वारा योगदान (WMXXX श्रृंखला). इन सेल लाइन मॉडल त्वचीय मेलेनोमा के विभिन्न रूपों के साथ मेलेनोमा रोगियों से प्राप्त किए गए थे (यानी, acral, uveal, और सतही प्रसार) और विविध जीनोटाइप (यानी, BRAFV600-म्यूटेंट और neuroblastoma आरएएस वायरल oncogene homolog ] एनआरएएस Q61R-म्यूटेंट]), जो क्लिनिक में मौजूद रोग के स्पेक्ट्रम का विस्तार1,2.

असमान रूप से, मेलेनोमा क्षेत्र में सबसे सफल, लक्षित चिकित्सा रणनीति 1) रोगियों के ट्यूमर के जीनोमिक लक्षणीकरण से उभरा है जो मेलेनोमा3 के $50% में BRAF उत्परिवर्तनों की पहचान करता है और 2) पूर्व नैदानिक जांच से मेलेनोमा सेल लाइन मॉडल का लाभ4| BRAF/MEK अवरोधक संयोजन खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) था- 2014 में उन रोगियों के उपचार के लिए अनुमोदित किया गया था जिनके मेलेनोमा बीआरएएफ V600E/K उत्परिवर्तनों को सक्रिय करते हैं और एक और 75% प्रतिक्रिया दर5दावा करते हैं। इस प्रारंभिक प्रभावकारिता के बावजूद, प्रतिरोध तेजी से लगभग हर मामले में विविध आंतरिक और प्राप्त प्रतिरोध तंत्र और intratumoral विषमता के कारण उठता है. दुर्भाग्य से, सेल लाइन मॉडल प्रतिनिधि जैविक विषमता recapitulate नहीं है जब प्लास्टिक के जहाजों में दो आयामी संस्कृति में बड़े हो, जो मास्क उनके नैदानिक भविष्य कहनेवाला क्षमता जब जांचकर्ताओं प्रयोगात्मक निर्धारित करने का प्रयास उपचार है कि एक विशिष्ट रूप या मेलेनोमा के जीनोटाइप के साथ रोगियों में प्रभावी हो सकताहै 6. समझ कैसे सबसे अच्छा मॉडल रोगी intratumoral विषमता जांचकर्ताओं बेहतर चिकित्सीय तरीके है कि चिकित्सा प्रतिरोधी subpopulations कि वर्तमान मानक की देखभाल के उपचार के लिए विफलता ड्राइव को मार सकते हैं विकसित करने के लिए अनुमति देगा.

सेल लाइन मॉडल की सीमित भविष्य कहनेवाला मूल्य के लिए पैरामाउंट है कि वे कैसे शुरू में स्थापित कर रहे हैं. अपरिवर्तनीय परिवर्तन ट्यूमर क्लोनल परिदृश्य में होते हैं जब एक रोगियों के ट्यूमर के एकल सेल निलंबन दो आयामी, प्लास्टिक ऊतक संस्कृति वाहिकाओं पर उगाया जाता है, proliferative और इनवेसिव क्षमता में परिवर्तन सहित, विशिष्ट के उन्मूलन subpopulations, और आनुवंशिक जानकारी के परिवर्तन7| इन मेलेनोमा सेल लाइन मॉडल के चूहों में Xenografts पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए विवो मंच में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया प्रतिनिधित्व करते हैं; हालांकि, इस रणनीति को भी जटिल ट्यूमर विषमता के गरीब recapitulation से ग्रस्त नैदानिक मनाया. इस कमी को दूर करने के लिए, वहाँ PDX मॉडल सहित मेलेनोमा के और अधिक परिष्कृत पूर्व नैदानिक मॉडल को शामिल करने में एक बढ़ती रुचि रही है. PDX मॉडल के लिए उपयोग किया गया है और 30 साल, फेफड़ों के कैंसर के रोगियों cytotoxic एजेंटों के लिए रोगियों की प्रतिक्रिया और एक ही रोगी से व्युत्पन्न PDX मॉडल की प्रतिक्रिया के बीच सामंजस्य का प्रदर्शन में मौलिक अध्ययन के साथ8. हाल ही में, वहाँ दोनों उद्योग में और शैक्षिक केन्द्रों में पूर्व नैदानिक जांच के लिए पसंद के उपकरण के रूप में PDX मॉडल का उपयोग करने के लिए एक अभियान किया गया है. PDX मॉडल, क्योंकि मानव रोगियों में ट्यूमर विषमता के अपने बेहतर recapitulation की, अधिक चिकित्सकीय सेल लाइन xenografts9की तुलना में चिकित्सा अनुकूलन प्रयासों में उपयोग करने के लिए प्रासंगिक हैं. मेलेनोमा में, वहाँ भारी बाधाओं है कि उन्नत रोग10के चिकित्सीय प्रबंधन कुंद कर रहे हैं. चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक PDX मॉडल नैदानिक प्रतिरोध मॉडल और चिकित्सकीय उपलब्ध एजेंटों के साथ चिकित्सकीय रणनीतियों की पहचान करने के लिए चिकित्सा प्रतिरोधी ट्यूमर11,12के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया है. संक्षेप में, पीडीएफ मॉडल उत्पन्न करने के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राथमिक या मेटास्टैटिक मेलेनोमा से ताजा ऊतक के subcutaneous प्रत्यारोपण की आवश्यकता है (बायोप्सी या सर्जरी द्वारा एकत्र) NOD/ पद्धति संबंधी प्रकिया में विभिन्न विभिन्न विविधताओं का उपयोग विभिन्न समूहों द्वारा किया जाता है; हालांकि, एक मौलिक कोर13मौजूद है.

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Protocol

निम्नलिखित पशु प्रोटोकॉल Wistar संस्थान के मानवीय नैतिकता समिति और पशु देखभाल दिशा निर्देशों के दिशा निर्देशों का पालन करें.

1. मेलेनोमा ट्यूमर ऊतक संग्रह

  1. निम्नलिखित सर्जरी या बायोप्सी तरीकों में से एक द्वारा मेलेनोमा रोगियों से ट्यूमर ऊतक (कहा गया मार्ग 0) ले लीजिए।
    1. सर्जिकल चीरा ऊतक के लिए, परिवहन भंडारण मीडिया में ऊतक (मेटास्टेसिस और प्राथमिक घावों को पुनर्जीवित) की एक न्यूनतम बनाए रखने (RPMI 1640 + 0.1% कवकक्षेत्र + 0.2% gentamicin) 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर।
    2. सर्जिकल बायोप्सी ऊतक के लिए, परिवहन भंडारण मीडिया में 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर 1 g से कम (अक्सर उपत्वचाके नीचे [s.c.] मेटास्टेस और लिम्फ नोड [LN] मेटास्टेसिस की बायोप्सी पंच।
    3. कोर बायोप्सी ऊतक के लिए, लगभग 10 मिमी x 1 मिमी (अक्सर, जिगर बायोप्सी) के ऊतक के एक सिलेंडर (कोर) को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर परिवहन भंडारण मीडिया के 5 एमएल युक्त 15 एमएल ट्यूब में धोएं।
    4. ठीक सुई aspirate (FNAs) ऊतक के लिए, ऊतक की एक बहुत छोटी राशि रखने के लिए (आकार में कम से कम 1 मिमी) एक सुई में रोगी से सीधे लिया और सिरिंज पर 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर.
  2. परिवहन भंडारण मीडिया में 4 डिग्री सेल्सियस पर या एक ही दिन पर या शल्य चीरा या बायोप्सी के बाद रात भर शिपिंग के साथ बर्फ पर ऊतक उद्धार। ऊतक को 1-2 घंटे के भीतर प्रसव के भीतर संसाधित करें।

2. चूहे प्रत्यारोपण के लिए ट्यूमर ऊतक प्रसंस्करण

  1. सर्जिकल चीरा या शल्य बायोप्सी ऊतक प्रसंस्करण
    1. एक बाँझ पेट्री डिश के लिए ऊतक स्थानांतरण और संभव के रूप में ज्यादा के रूप में सामान्य ऊतक आसपास से ट्यूमर ऊतक अलग.
    2. नेक्रोटिक ऊतक निकालें (आमतौर पर संभव के रूप में ज्यादा के रूप में शेष ट्यूमर से, ट्यूमर के भीतर केंद्रीय स्थित पीला-सफेद ऊतक के रूप में पहचान की।
    3. सर्जिकल माउस प्रत्यारोपण के लिए लगभग बराबर टुकड़ों में एक प्रारंभिक ट्यूमर खंड उपविभाजित करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें ($3 मिमी x 3 मिमी) (चित्र 2)।
    4. वैकल्पिक रूप से, यदि पर्याप्त ट्यूमर ऊतक उपलब्ध है, तो डाउनस्ट्रीम परख के लिए ऊतक को स्नैप-फ्रीज करें (RNA अनुक्रमण [RNASe], पूरे एक्सोम अनुक्रमण [WES], आदि)।
    5. दो स्केलपेल ब्लेड के साथ एक क्रॉस ब्लेड तकनीक का उपयोग कर ट्यूमर ऊतक mincing द्वारा एक ट्यूमर घोल बनाओ। एक घोल बनाने के लिए संभव के रूप में पतले ट्यूमर टुकड़े मिन्स, जो अब सर्जिकल माउस प्रत्यारोपण के लिए तैयार है।
    6. वैकल्पिक रूप से, यदि ट्यूमर ऊतक यांत्रिक वियोजन के लिए बहुत मुश्किल है, तो जेल की तरह घोल और प्रत्यारोपण और/या इंजेक्शन के लिए एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए एक पाचन वियोजन प्रक्रिया का उपयोग करें।
      1. घोल बनाने के लिए ट्यूमर के टुकड़ों को बारीक पीस लें।
      2. ठंड हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ एक 50 एमएल ट्यूब में घोलरखो-/ तो, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 220 x g पर अपकेंद्रण और गोली।
      3. गर्म ताजा डाइजेस्ट मीडिया के 10 एमएल में घोल को फिर से खोलें (200 U/mL कोलैजा ईवी + 5 एम एम CaCl2 + 50 U/mL DNase HBSSमें -/-) प्रति 1 ग्राम ट्यूमर ऊतक।
      4. 20 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब प्लेस और एक डिस्पोजेबल पिपेट के साथ जोरदार हर 5 मिनट मिश्रण.
      5. HBSS के 50 एमएल तक के साथ धो लें-/-; तब, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 220 x g पर अपकेंद्रित्र।
      6. प्रीवाम्ड टीईजी के 5 एमएल जोड़ें (0.025% ट्रिप्सिन + 40 डिग्री ग्राम/एमएल एथिलीन ग्लाइकोल-बिस(जेड-एमिनोएथिल ईथर)-N,N',N'-tetraacetic एसिड [EGTA] + 10 g/mL polyvinyl अल्कोहल [PVA] के बिना ट्यूमर के 1 g, धीरे से हिला/
      7. ठंड धुंधला मीडिया के कम से कम 1 बराबर मात्रा जोड़ें (1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [BSA] + 10 mM 4- (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic एसिड [HEPES] + 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन में L15 मीडिया में trypsin और सेंट्रीफ्यूज को 220 g पर 4 मिनट के लिए बुझाने के लिए सी.
      8. 1 ग्राम ट्यूमर ऊतक के प्रति धुंधला मीडिया के 10 एमएल में नमूना पुन: निलंबित करें और माउस इंजेक्शन के लिए एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए इसे 40 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें (चित्र2)।
      9. सेल छलनी के शीर्ष पर शेष स्लरी भी शल्य माउस प्रत्यारोपण के लिए एकत्र किया जा सकता है।
  2. सी अयस्क बायोप्सी ऊतक संसाधन
    1. एक 5 सेमी पेट्री डिश में ऊतक परिवहन ट्यूब में कोर सिलेंडर ऊतक डालो.
    2. पेट्री डिश के किनारे पर अतिरिक्त तरल, परिमार्जन ऊतक निकालें, ट्यूमर के ऊतकों को बारीक कीमा करें, ट्यूमर के ऊतकों को 100-150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें - ट्यूमर ऊतक के शीर्ष पर-/- ट्यूमर ऊतक के शीर्ष पर, और जल्दी से HBSS/ ट्यूमर ऊतक निलंबन को 1 एमएल सिरिंज में खींच लें।
    3. 1 एमएल सिरिंज के लिए एक 23 जी सुई संलग्न करें, एक 1.5 एमएल स्पिन ट्यूब में सुई के माध्यम से HBSS / ट्यूमर ऊतक निलंबन पारित।
    4. यह सुई के माध्यम से सुचारू रूप से पारित कर सकते हैं जब तक पर सुई के साथ सिरिंज में ट्यूमर निलंबन फिर से बनाना.
    5. अंत में ट्यूमर निलंबन सिरिंज में वापस आकर्षित और 23 जी सुई अलग.
    6. एक 27 जी सुई संलग्न करें और सिरिंज में कृत्रिम एक्स्ट्राकोल्यूलर मैट्रिक्स (सामग्री की तालिकादेखें) की एक समान मात्रा ($100-150 $L) आकर्षित करें।
    7. ट्यूमर के साथ 1.5 एमएल स्पिन ट्यूब में धीरे-धीरे कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स की एक समान मात्रा जोड़ें/
    8. एक पिछली बार सिरिंज में वापस ड्रा और कोर बायोप्सी ट्यूमर ऊतक अब माउस इंजेक्शन के लिए तैयार है.
  3. FNA ऊतक प्रसंस्करण
    1. बर्फ पर FNA नमूने (सूई में फंस) युक्त सिरिंज रखें।
    2. सिरिंज से सुई (FNA ऊतक युक्त) को अलग करें और सिरिंज से प्लंजर को हटा दें, एचबीएसएस के $ 150-200 $L जोड़ें-/- सिरिंज के शीर्ष पर।
    3. सिरिंज और सुई (FNA ऊतक युक्त) में प्लंजर को फिर से डालें, और HBSS को बाहर धकेलें- सुई के माध्यम से 1.5 एमएल स्पिन ट्यूब में। यह चरण सुई से FNA ट्यूमर को हटा देता है।
    4. HBSS के साथ चरण 2.3.3 दोहराएँ-///FNA निलंबन दो बार एक ही सिरिंज का उपयोग करने के लिए सुई से ट्यूमर ऊतक की पुनर्प्राप्ति को अधिकतम.
    5. एचबीएसएस/एफएनए निलंबन युक्त 1.5 एमएल स्पिन ट्यूब में कृत्रिम एक्स्ट्रासेल्यूलर मैट्रिक्स की समान मात्रा ($100-150 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें।
    6. धीरे-धीरे कृत्रिम एक्स्ट्रासेल्यूलर मैट्रिक्स/एचबीएसएस को ड्राइंग करके पर्याप्त रूप से मिश्रणकरें -/FNAनिलंबन 23 जी सुई में वापस और दो बार दोहराते हैं।
    7. पूरे कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स ड्रा// / / FNA मात्रा सिरिंज में वापस, एक 27 जी सुई के साथ 23 जी सुई की जगह, और FNA नमूना अब माउस इंजेक्शन के लिए तैयार है.

3. ट्यूमर प्रत्यारोपण और चूहों में इंजेक्शन

  1. शल् यक्रिया ओंकारया या शल् यक्रिया बायोप्सी ऊतक का प्रत्यारोपण
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों autoclaving या पूर्व बाँझ डिस्पोजेबल उपकरणों का उपयोग करके बाँझ हैं।
    1. एनएसजी 6-8 सप्ताह पुरुष या मादा चूहों के निचले हिस्से से बाल दाढ़ी कोई बाल के साथ एक लगभग 1.5 सेमी x 3 सेमी क्षेत्र छोड़ने. आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें, और प्रतिक्रिया के परीक्षण के रूप में पैर को धीरे से निचोड़कर पुष्टि करें। सूखापन को रोकने के लिए उनकी आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
    2. संज्ञाहरण मशीन की नाक शंकु में एक गर्मी पैड पर अलग-अलग चूहों रखें, chlorhexidine के साथ मुंडा क्षेत्र साफ़. तो 70% इथेनॉल के साथ douse और वाष्पित करने के लिए अनुमति देते हैं.
    3. टुकड़ों को तैयार करें या एक पेट्री डिश में ट्यूमर घोल को सर्जिकल प्रत्यारोपण के लिए अलग-अलग टीले में विभाजित करें (यानी, तीन बराबर टीले में यदि 3 चूहों में प्रत्यारोपित किया जाए)।
    4. स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, माउस के पीछे के केंद्र पर लगभग 5 मिमी लंबे समय का चीरा, संदंश की एक जोड़ी लेने के लिए और ऑपरेटर के विपरीत चीरा के पक्ष में त्वचा उठा.
    5. दूसरे हाथ में कैंची ले लो और धीरे छोटे कैंची कटौती के साथ fascial झिल्ली काटने से मांसपेशियों की परत से त्वचा को अलग, जिससे ट्यूमर के ऊतकों के लिए एक "जेब" बनाने.
    6. एक ट्यूमर हिस्सा या स्केलपेल ब्लेड के साथ ट्यूमर घोल ऊतक के एक व्यक्ति टीला उठाओ और धीरे बनाया जेब में ऊतक जगह है।
    7. जेब में ट्यूमर ऊतक टीले पर कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स के 100 $L प्रशासन.
    8. संदंश के दो जोड़े का उपयोग करना, दोनों सिरों पर चीरा ऊपर खींच इतना है कि घाव के किनारों को एक साथ बंद आते हैं, और एक या दो घाव क्लिप लागू करने से घाव बंद.
    9. उपत्वचा इंजेक्ट 1-5 मिलीग्राम/किलोग्राम मेलोक्सीकैम सर्जरी के बाद चूहों में एनाल्जेसिक के रूप में।
    10. माउस को नाक शंकु से बाहर ले जाओ और इसे वापस अपने मूल पिंजरे में रखें, जागने के दौरान माउस का निरीक्षण करें। एक पिंजरे में वापस जब तक पूरी तरह से बरामद मत करो.
    11. लगभग 7 दिनों के बाद घाव क्लिप निकालें. यदि 7 दिनों के बाद उपचार पूरा नहीं होता है, तो घाव क्लिप को एक अतिरिक्त एक या दो दिनों के लिए छोड़ दें।
      नोट: यदि शल्य चीरा या शल्य बायोप्सी ऊतक प्रसंस्करण से एक एकल सेल निलंबन का उपयोग कर, यह कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स के साथ मिश्रण होगा (पर 1:1 अनुपात) चूहों इंजेक्शन के लिए.
  2. FNA या कोर बायोप्सी ऊतक का इंजेक्शन
    1. एक स्टील ग्रिड रैक पर एक NSG माउस प्लेस, पूंछ से मजबूती से माउस पकड़, और धीरे माउस वापस खींच. यह ग्रिड को अपने सामने के पैरों के साथ मजबूती से समझ जाएगा। वैकल्पिक रूप से, गैर-प्रमुख हाथ में एक माउस को नियंत्रित करें और पार्श्व क्षेत्र को दिखाई दें।
    2. शराब prep swabs के साथ पार्श्व की त्वचा को संक्रमित, धीरे धीरे और तेजी से माउस की त्वचा के नीचे सिरिंज की सामग्री सुई.
    3. सुई बाहर खींचो और माउस अपने पिंजरे में वापस जगह है.

4. मॉनिटर ट्यूमर विकास

  1. मॉनिटर चूहों एक बार साप्ताहिक स्पष्ट ट्यूमर के लिए जाँच करने के लिए.
  2. एक बार ट्यूमर एक औसत दर्जे का आकारपर हैं (लगभग 50 मिमी 3), ट्यूमर आयाम रिकॉर्ड करने के लिए एक कैलिपर का उपयोग करें। ट्यूमर वॉल्यूम की गणना करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें: (चौड़ाई x चौड़ाई x लंबाई) /
  3. हार्वेस्ट ट्यूमर एक बार ट्यूमर की मात्रा के आसपास तक पहुँचता है 1.5 सेमी3 (लगभग 4-10 सप्ताह). ट्यूमर अब माउस मार्ग 1 (MP1) कहा जाता है.

5. बैंकिंग ऊतक, पुनर्रोपण, और प्रयोग/

  1. एक सीओ2 कक्ष में माउस Euthanize, मौत की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण संकेत की जाँच करें, और फिर एक Virkon समाधान में माउस डूब के लिए 30 के लिए त्वचा बाँझ जैव-cabinet में.
  2. ट्यूमर के निकट त्वचा को उठाने और एक क्षैतिज कटौती करने के लिए घुमावदार कैंची और सर्जिकल संदंश का उपयोग करें।
  3. ट्यूमर के दोनों पक्षों पर और ट्यूमर पर त्वचा जुटाने के लिए एक कुंद जुदाई तकनीक का प्रयोग करें, ट्यूमर को उजागर।
  4. फासिया से ट्यूमर को अलग करने के लिए कैंची या स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें।
  5. ट्यूमर को फिर से काटें और ट्यूमर को बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, ट्यूमर को छोटे टुकड़ों में काट लें और ट्यूमर से नेक्रोटिक ऊतक को हटा दें।
  6. भविष्य प्रत्यारोपण के लिए बैंक ट्यूमर ऊतक.
    1. $ 10 मिमी x 10 मिमी से छोटे 2-3 छोटे ट्यूमर टुकड़े ले लो और उन्हें $ 1 मिमी x 1 मिमी से छोटे टुकड़ों में कीमा।
    2. एक 2 एमएल क्रायोजेनिक शीशी के लिए सभी कीमा बनाया ऊतक स्थानांतरण, ठंड मीडिया के 1 एमएल जोड़ें (10% DMSO + 90% FBS).
    3. अच्छी तरह से मिक्स और सूखी बर्फ पर एक पूर्व ठंडा आइसोप्रोपेनोल आधारित सेल फ्रीजिंग कंटेनर में क्रायोजेनिक शीशियों जगह है।
    4. कंटेनर को रात में -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें और फिर क्रायोजेनिक शीशियों को तरल नाइट्रोजन (एलएन2) भंडारण में स्थानांतरित करें।
  7. डाउनस्ट्रीम परख के लिए स्नैप फ्रीज ऊतक (RNASeQ, WES, आदि).
    1. एक क्रायोजेनिक शीशी में ट्यूमर ऊतक टुकड़े ($ 3 मिमी x 3 मिमी) प्लेस और LN2 में क्रायोजेनिक शीशी तुरंत डाल दिया। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में शीशियों को स्टोर करें।

6. PDX चिकित्सा परीक्षण

नोट: यह चिकित्सा परीक्षण के लिए PDX असर चूहों की आवश्यक संख्या उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त ट्यूमर ऊतक विकसित करने के लिए दो विस्तार चरणों ले जाएगा.

  1. एलएन2से बैंक्ड पीडीएक्स ऊतक युक्त एक क्रायोविएल उठाओ, और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में क्रायोविएल जगह जब तक ट्यूमर ऊतक युक्त ठंड मीडिया बस पिघल करने के लिए शुरू कर रहा है।
  2. क्रायोविएल की सामग्री को पूर्व-वार्म्ड एचबीएसएस में खाली करें-/- एक 50 एमएल ट्यूब में, और ऊतक धोएं।
  3. 1,200 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा गोली ऊतक।
  4. HBSS निकालें- / - एक पाश्चर पाइप्ट के साथ वैक्यूम आकांक्षा द्वारा ट्यूमर नमूना से।
  5. 50 एमएल ट्यूब से पीडीएक्स ऊतक को 5 सेमी या 10 सेमी पेट्री डिश में स्लाइड करें और गीले बर्फ पर रखें।
  6. PDX ट्यूमर विस्तार के पहले दौर के लिए 5 NSG चूहों में एक क्रायोजेनिक शीशी से बैंक ऊतक प्रत्यारोपण करने के लिए ऊपर प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल का पालन करें।
  7. एक बार ट्यूमर तक पहुँचने $ 600-800 मिमी3, फसल 1-2 ट्यूमर ट्यूमर ऊतक प्रसंस्करण के लिए ऊपर प्रोटोकॉल के साथ एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए: यांत्रिक वियोजन, collagenase पाचन वियोजन प्रक्रिया.
  8. गोली कोशिकाओं और HBSS के 6 एमएल में resuspend- / /कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स (1:1 अनुपात), subcutaneous सुई $ 50 NSG चूहों, PDX ट्यूमर विस्तार के दूसरे दौर के लिए माउस प्रति सेल मिश्रण के 100 $L के साथ.
  9. कैलिपर्स द्विसाप्ताहिक के साथ ट्यूमर के आकार को मापने।
  10. 3-5 सप्ताह में $ 100 मिमी3 के ट्यूमर आकार के लिए प्रतीक्षा करें, समूहों में चूहों randomize, और उपचार शुरू करते हैं।
  11. जब ट्यूमर का आकार अधिकतम IACUC-अनुमोदित मात्रा तक पहुँचता है, उपचार बंद करो।
  12. तस्वीर जमे हुए ट्यूमर टुकड़े, पैराफिन ब्लॉक के लिए ट्यूमर टुकड़े इकट्ठा करने के लिए ऊपर फसल ट्यूमर प्रोटोकॉल का पालन करें।

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Representative Results

मेलेनोमा PDX मॉडल के लिए ट्यूमर ऊतक विभिन्न स्रोतों की एक किस्म से आ सकते हैं और यह भी व्यक्तिगत मॉडल के विकास की गतिशीलता और PDX ऊतक के वांछित उपयोग के अनुसार संसाधित किया जा सकता है. एक PDX मॉडल की स्थापना करते समय प्राथमिकता के लिए भविष्य में उपयोग और चरित्र के लिए डीएनए के लिए बैंक के लिए पर्याप्त सामग्री है (चित्र 1) है.

एक बार पर्याप्त सामग्री banked है, ट्यूमर ऊतक एक औपचारिक चिकित्सा अध्ययन करने के लिए पर्याप्त ट्यूमर विकसित करने के लिए तीन मुख्य तरीकों में से एक में विस्तार किया जा सकता है (चित्र 2ए)। यहाँ वर्णित विधियों में से प्रत्येक PDXs से ट्यूमर के विस्तार के लिए अनुमति देगा (चित्र 2बी) . यह हमारा अनुभव है कि एंजाइमी पाचन (collagenase IV) के उपयोग के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के एक एकल सेल निलंबन बनाने और अधिक तेजी से ट्यूमर के विकास के लिए अनुमति दे सकते हैं, और एक प्रारंभिक ट्यूमर में विस्तार किया जा करने के लिए अनुमति दे सकते हैं 10 - 20 चूहों, जबकि ट्यूमर हिस्सा और घोल विधि का विस्तार केवल 5 - 10 चूहों में किया जा सकता है (चित्र 2ब्) जैसा कि पहले अन्य ट्यूमर प्रकार में प्रदर्शन किया गया है, मेलेनोमा PDX मॉडल अक्सर दवा संवेदनशीलता रोगी जब चिकित्सा पर प्रदर्शित प्रतिबिंबित. यहाँ दिखाया BRAFV600E उत्परिवर्ती मेलेनोमा के साथ एक मेलेनोमा रोगी से एक प्रतिनिधि चिकित्सा वक्र है जो शुरू में एक BRAF अवरोध करनेवाला को जवाब दिया, लेकिन अंततः relapsed. इस रोगी से व्युत्पन्न PDX भी BRAF निषेध (Rx1) प्लस एक अतिरिक्त अवरोध करनेवाला (Rx2) के लिए प्रारंभिक संवेदनशीलता प्रदर्शित; तथापि, ट्यूमर अंततः पुनः पतन (चित्र 3)।

Figure 1
चित्र 1 : बैंकिंग ट्यूमर ऊतक और प्रदर्शन चिकित्सा अध्ययन के लिए PDX मॉडल पीढ़ी कार्यप्रवाह. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : वैकल्पिक प्रत्यारोपण तरीकों. (एक) ट्यूमर या तो खंड, एक घोल निलंबन, या एक एकल सेल निलंबन के रूप में संसाधित किया जा सकता है। (बी) सभी तीन तरीकों विवो में ट्यूमर के विकास के लिए अनुमति देगा। यहाँ दिखाया चूहों subcutaneously ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित कर रहे हैं और प्रत्यारोपण के बाद 12 दिन की छवि. (ग) दिखाया गया है ट्यूमर विकास घटता चूहों तीन प्रत्यारोपण विधियों में से एक के साथ इंजेक्शन के लिए कर रहे हैं. N $ 5 प्रति हाथ; त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : एक PDX चिकित्सा परीक्षण के लिए प्रतिनिधि डेटा. चूहे PDX ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित किया गया और या तो एक वाहन नियंत्रण या एक BRAF अवरोध करनेवाला और एक MEK अवरोध करनेवाला के एक दो अवरोधक संयोजन के साथ इलाज किया. N]6 प्रति हाथ. यादृच्छिकीकरण का उपयोग चूहों को अध्ययन समूहों में रखने के लिए किया जाता था। नोट की, हालांकि $ 500 मिमी3 चिकित्सा दीक्षा के लिए प्रारंभिक ट्यूमर की मात्रा के रूप में इस उदाहरण में इस्तेमाल किया गया था, PDX अध्ययन शुरू करने के लिए नियमित मात्रा है 100-200 मिमी3 PDX ट्यूमर आक्रामक हैं और उनके विकास को बाधित करने के लिए मुश्किल है एक बार वे बहुत बड़ा एक आकार (gt; 300 मिमी3) . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम यहाँ प्राथमिक और metastatic ट्यूमर, कोर बायोप्सी, और FNAs से व्युत्पन्न रोगी ऊतक के साथ मेलेनोमा के PDX मॉडल पैदा करने का वर्णन किया है. जब सीधे एनएसजी चूहों में engrafted, ट्यूमर रोगी में मनाया उन लोगों के लिए इसी तरह morphologic, जीनोमिक, और जीवविज्ञान गुण मौजूद हैं. मामले में जब केवल ऊतक की एक छोटी मात्रा जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध है, के रूप में अक्सर FNAs के साथ होता है, PDX तकनीक डीएनए के लिए ट्यूमर ऊतक के विस्तार के लिए अनुमति देता है, आरएनए, और प्रोटीन लक्षण, साथ ही चिकित्सा परीक्षणों के लिए पूर्व नैदानिक दवा की अनुमति देने के लिए विकास.

PDX engraftment की सफलता के लिए महत्वपूर्ण सामग्री जांचकर्ताओं की गुणवत्ता के साथ शुरू होता है. देखभाल ट्यूमर ऊतक उचित रूप से वर्गों 1 और 2 में संभव के रूप में ज्यादा संरक्षित है सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात, PDX मेलेनोमा मॉडल की चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया बेहतर दाता रोगी की संवेदनशीलता recapitulates, मजबूत पूर्व नैदानिक जांच के लिए बेहतर चिकित्सीय रणनीति विकसित करने के लिए चिकित्सा प्रतिरोध का मुकाबला करने और सुधार करने के लिए अनुमति देता है प्रतिक्रिया की स्थायित्व. अधिकांश मेटास्टैटिक मेलेनोमा रोगियों देखभाल के मौजूदा मानक (एसओसी) उपचार5के साथ इलाज का अनुभव नहीं है। हमारे PDX मेलेनोमा संग्रह में 500 से अधिक अलग मॉडल हैं, जिनमें लक्षित चिकित्सा और इम्यूनोथेरेपी1,2पर फिर से आने वाले रोगियों से प्राप्त मॉडल शामिल हैं. इस संसाधन चिकित्सीय रूपरेखा है कि वर्तमान समाज के लिए प्रतिरोध पर काबू पाने के विकास के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा. PDX मॉडल के लिए भविष्य अनुप्रयोगों लागत प्रभावी, उच्च प्रवाह दृष्टिकोण है कि दवा स्क्रीन में PDX मॉडल का लाभ और पर निर्भर करेगा CRISPR-Cas9 स्क्रीन विभिन्न जीनोटाइप के लिए उपन्यास प्रभावी रणनीतियों की पहचान करने के लिए (यानी, BRAFV600E, NRASQ61R) और subtypes (यानी, uveal, acral) मेलेनोमा14के.

PDX तकनीक की एक सीमा की आवश्यकता है कि ट्यूमर सामग्री एक प्रतिरक्षा प्रणाली के बिना चूहों में engrafted है engraftment सफलता सुनिश्चित करने के लिए1. इसलिए, PDX अध्ययन चिकित्सा प्रतिरोध का मुकाबला करने के लिए चिकित्सकीय रणनीतियों का अनुकूलन पता नहीं कैसे नई चिकित्सा रणनीतियों सकारात्मक या नकारात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावित कर सकते हैं और / सौभाग्य से, एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ माउस मानवीकरण के क्षेत्र में अग्रिम किया गया है और चूहों में अधिक आदर्श PDX अध्ययन के लिए अनुमति देगा कि बेहतर मानव microenvironment recapitulate15.

सारांश में, PDX मॉडल मेलेनोमा कोशिकाओं के पूर्व नैदानिक जांच के लिए अनुमति देते हैं कि बेहतर ट्यूमर विषमता और मेलेनोमा आक्रामकता क्लिनिक में मनाया recapitulate (अन्य दो आयामी और मानक xenograft दृष्टिकोण बनाम). PDX मॉडल एक गहरी समझ है जो जीन चिकित्सा प्रतिरोध में शामिल हैं और एक अधिक नैदानिक प्रासंगिक मॉडल है जिसमें से अधिक प्रभावी उपचार metastatic मेलेनोमा के साथ रोगियों के समग्र अस्तित्व को बढ़ाने के लिए विकसित किया जा सकता प्रदान करने के लिए अनुमति देते हैं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकWistar संस्थान पशु सुविधा, माइक्रोस्कोपी सुविधा, हिस्टोप्रौद्योगिकी सुविधा, और अनुसंधान आपूर्ति केंद्र धन्यवाद. इस अध्ययन के भाग में U54 से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), डॉ मरियम और शेल्डन जी Adelson चिकित्सा अनुसंधान फाउंडेशन, और Melanoma अनुसंधान फाउंडेशन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Hepes SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # H0887-100ML
100x PenStrep  Invitrogen Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) MED Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin  SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # T4549-100ML 10 mL aliquots stored at –20oC
BSA SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # A9418-500G
Chlorhexidine Fisher Scientific Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL) Worthington  Cat #4189 make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # C6295-50ML
DNase SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) Merck Cat # 324626.25
FBS INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES Cat # 16000-044
Fungizone INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES Cat # 15290-018
Gentamicin FISHER SCIENTIFIC Cat # BW17518Z
Isoflurane HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH Cat # 050031
Leibovitz's L15 media  Invitrogen Cat # 21083027
Matrigel Corning Cat # 354230 Artificial extracellular matrix
Meloxicam HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein Cat # 025115 1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice The Wistar Institute, animal facility breeding
PVA (polyvinyl alcohol) SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Fisher Scientific Cat# MT10041CM
Scalpel Feather Cat # 2976-22
Virkon GALLARD-SCHLESINGER IND Cat # 222-01-06
Wound clips MikRon Cat #427631

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 147 मेलेनोमा रोगी व्युत्पन्न xenograft चिकित्सा प्रतिरोध विवो मॉडल में मेटास्टेसिस
एक मेलेनोमा रोगी व्युत्पन्न Xenograft मॉडल
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Xiao, M., Rebecca, V. W., Herlyn, M. … More

Xiao, M., Rebecca, V. W., Herlyn, M. A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model. J. Vis. Exp. (147), e59508, doi:10.3791/59508 (2019).

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