Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En melanom pasient-avledet Xenograft modell

Published: May 20, 2019 doi: 10.3791/59508
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wistar Institute

Summary

Pasient-avledet xenograft (PDX) modeller mer robust recapitulate melanom molekylær og biologiske egenskaper og er mer prediktiv behandling respons i forhold til tradisjonelle plast vev kultur-baserte analyser. Her beskriver vi vår standard drifts protokoll for etablering av nye PDX-modeller og karakterisering/eksperimentering av eksisterende PDX-modeller.

Abstract

Akkumulere bevis tyder på at molekylære og biologiske egenskaper varierer i melanom celler dyrket i tradisjonelle to-dimensjonale vev kultur fartøy versus in vivo i menneskelige pasienter. Dette er på grunn av flaskehalsen utvalg av klonal bestander av melanom celler som kan robust vokse in vitro i fravær av fysiologiske forhold. Videre svar på behandling i todimensjonale vev kulturer generelt ikke reflekterer trofast svar på behandling hos melanom pasienter, med de fleste kliniske studier unnlater å vise effekten av terapeutiske kombinasjoner vist å være effektive i Vitro. Selv om xenografting av melanom celler til mus gir den fysiologiske in vivo kontekst fraværende fra to-dimensjonale vev kultur analyser, melanom cellene som brukes for engraftment har allerede gjennomgått flaskehals utvalg for celler som kan vokse under todimensjonale tilstander når cellelinjen ble opprettet. Den irreversible forandringer som oppstår som en konsekvens av flaskehalsen inkluderer endringer i vekst og invasjon egenskaper, samt tap av spesifikke subpopulasjoner. Derfor, modeller som bedre recapitulate den menneskelige tilstand in vivo kan bedre forutsi terapeutiske strategier som effektivt øker den generelle overlevelse av pasienter med metastatisk melanom. Den pasient-avledet xenograft (PDX) teknikken innebærer direkte implantation av tumorceller fra den menneskelige pasienten til en mus mottaker. På denne måten tumorceller er konsekvent dyrket under fysiologiske påkjenninger i vivo og aldri gjennomgår to-dimensjonal flaskehals, som bevarer den molekylære og biologiske egenskaper til stede når svulsten var i den menneskelige pasient. Kjente, PDX modeller avledet fra organ nettsteder av metastaser (dvs. hjernen) vise lignende metastatisk kapasitet, mens PDX modeller avledet fra terapi naive pasienter og pasienter med ervervet resistens mot terapi (dvs. BRAF/MEK inhibitor terapi) display lignende følsomhet for terapi.

Introduction

Prekliniske modeller er avgjørende for alle aspekter av translational kreftforskning, inkludert sykdoms karakterisering, oppdagelse av nyttige sårbarheter unik for kreft versus normale celler, og utvikling av effektiv terapier som utnytter disse sikkerhetsproblemene for å øke den generelle overlevelsen av pasientene. I melanom feltet, titusenvis av cellelinje modeller har blitt sterkt benyttet for narkotika screening, med > 4000 bidratt av vår gruppe alene (WMXXX-serien). Disse cellelinje modeller ble avledet fra melanom pasienter med ulike former for hud melanom (dvs. acral, uveal, og overfladisk spredning) og diverse genotyper (dvs. BRAFV600-mutant og neuroblastom RAS viral diagnostisk homologe [ NRAS Q61R-mutant]), som spenner over spekteret av sykdom som finnes i klinikken1,2.

Utvetydig, den mest vellykkede, målrettede terapi strategi i melanom feltet har dukket opp fra 1) den genomisk karakterisering av pasientens svulster identifisere BRAF mutasjoner i ~ 50% av melanomer3 og fra 2) prekliniske etterforskning utnytte melanom cellelinje modeller4. Den BRAF/MEK inhibitor kombinasjon var Food and Drug Administration (FDA)-godkjent i 2014 for behandling av pasienter som melanomer havnen aktivere BRAFV600E/K mutasjoner og har en > 75% responsrate5. Til tross for denne innledende effekten, oppstår motstanden raskt i nesten alle tilfeller på grunn av mangfoldige indre og ervervet motstands mekanismer og intratumoral heterogenitet. Dessverre, cellelinje modeller ikke recapitulate representative biologiske heterogenitet når vokst i to-dimensjonal kultur i plast fartøy, som masker deres klinisk prediktiv potensial når etterforskere forsøker å eksperimentelt bestemme behandling som kan være effektive hos pasienter med en bestemt form eller genotype av melanom6. Forstå hvordan du best modell pasienten intratumoral heterogenitet vil tillate etterforskerne å bedre utvikle terapeutiske modaliteter som kan drepe terapi-resistente subpopulasjoner at stasjonen svikt til dagens standard-of-Care terapier.

Paramount til begrenset prediktiv verdi av cellelinje modeller er hvordan de er i utgangspunktet etablert. Irreversible forandringer oppstår i tumor klonal landskapet når en enkelt celle suspensjon av en pasientenes svulst er dyrket på todimensjonale, plast vev kultur fartøy, inkludert endringer i proliferativ og invasiv potensial, eliminering av spesifikke subpopulasjoner, og endring av genetisk informasjon7. Xenotransplantater inn mus av disse melanom cellelinje modeller representerer den mest brukte in vivo plattform for prekliniske studier; imidlertid lider denne strategien også fra de fattige recapitulation av komplekse tumor heterogenitet observert klinisk. For å overvinne denne brist, har det vært en økende interesse i å innlemme mer sofistikerte prekliniske modeller av melanom, inkludert PDX modell. PDX-modellene har blitt benyttet i > 30 år, med banebrytende studier hos pasienter med lungekreft som viser samsvar mellom pasientens respons på cytotoksisk midler og responsen til PDX-modellen som stammer fra samme pasient8. Nylig har det vært en stasjon for å utnytte PDX modeller som verktøyet for valg for prekliniske undersøkelser både i bransjen og i akademiske sentre. PDX-modeller, på grunn av sin overlegne recapitulation av tumor heterogenitet hos mennesker, er mer klinisk relevante å bruke i behandlings optimalisering innsats enn cellelinje xenotransplantater9. I melanom, det er enorme hekk som sløv den terapeutiske forvaltningen av avansert sykdom10. Klinisk relevante PDX modeller har blitt brukt til å modellere klinisk motstand og identifisere terapeutiske strategier med klinisk tilgjengelige agenter for å behandle terapi-resistente svulster11,12. Kort sagt, protokollen som presenteres her for å generere PDX modeller krever subkutan implantation av ferskt vev fra primær eller metastatisk melanomer (samlet inn av biopsi eller kirurgi) til NOD/scid/IL2-reseptor null (NSG) mus. Ulike variasjoner i metodisk tilnærming brukes av ulike grupper; Imidlertid finnes en fundamental kjerne13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende dyre protokoller følger retningslinjene for The Wistar Institute ' s humane etikk komité og dyr omsorg retningslinjer.

1. melanom tumor vev samling

  1. Samle tumor vev (betegnet passasje 0) fra melanom pasienter ved en av følgende kirurgi eller biopsi metoder.
    1. For kirurgisk forbruker av vev, opprettholde minst 1 g vev (resect metastaser og primære lesjoner) i transport lagringsmedier (RPMI 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% Gentamicin) ved 4 ° c eller på is.
    2. For kirurgisk biopsi vev, opprettholde mindre enn 1 g vev (ofte punch biopsier av subkutan [SC] metastaser og lymfeknuter [LN] metastaser) i transport lagringsmedier ved 4 ° c eller på is.
    3. For kjernen biopsi vev, vaske ut en sylinder (kjerne) av vev på ca 10 mm x 1 mm (ofte, leveren biopsier) i et 15 mL rør som inneholder 5 mL transport lagringsmedier ved 4 ° c eller på is.
    4. For fin nål aspirer (FNAs) vev, Hold en svært liten mengde vev (mindre enn 1 mm i størrelse) tatt direkte fra pasienten i en nål og sprøyte ved 4 ° c eller på is.
  2. Lever vevet i transport lagringsmedier ved 4 ° c eller på is på samme dag eller med frakt over natten etter kirurgisk fjerning eller biopsi. Behandle vevet innen 1-2 h av leveransen.

2. tumor vev behandling for mus implantation

  1. Kirurgisk fjerning eller kirurgisk biopsi vevs behandling
    1. Overfør vevet til en steril Petri parabol og skille tumorvevet fra omkringliggende normalt vev så mye som mulig.
    2. Fjern nekrotisk vev (vanligvis identifisert som blek-hvitaktig vev ligger sentralt i svulsten) fra de resterende svulsten så mye som mulig.
    3. Bruk en skalpell til å dele opp en første tumor del i omtrent like store biter (~ 3 mm x 3 mm) for kirurgisk mus implantation (figur 2).
    4. Alternativt, hvis nok tumor vev er tilgjengelig, snap-fryse vevet for nedstrøms analyser (RNA sekvensering [RNASeq], hele exome sekvensering [WES], etc.).
    5. Lag en svulst slurry ved hakking av tumor vev ved hjelp av et kors blad teknikk med to skalpell kniver. Hakke svulsten biter så fint som mulig å danne en slurry, som nå er klar for kirurgisk mus implantation.
    6. Alternativt, hvis tumorvevet er for vanskelig for mekaniske dissosiasjon, bruk en fordøyelse dissosiasjon prosedyre for å danne gel-lignende slurry og en enkelt celle suspensjon for implantation og/eller injeksjon.
      1. Hakke svulsten biter så fint som mulig å danne slurry.
      2. Sett slurry i en 50 mL rør med kaldt Hank ' s balansert saltløsning (HBSS)-/- (uten ca+ + og mg+ +); deretter, sentrifuger og pellets ved 220 x g for 4 min ved 4 ° c.
      3. Resuspend den slurry i 10 mL av varmet friskt fordøye Media (200 U/mL kollagenase IV + 5 mM CaCl2 + 50 U/ml DNASE i HBSS-/-) per 1 g av tumor vev.
      4. Plasser røret i et vannbad på 37 ° c i 20 minutter og bland kraftig hver 5 min med en gangs pipette.
      5. Vask med opptil 50 mL HBSS-/-; deretter sentrifuge ved 220 x g for 4 min ved 4 ° c.
      6. Tilsett 5 mL prewarmed TEG (0,025% Trypsin + 40 μg/mL etylen glykol-BIS (β-aminoethyl Eter)-N, N, N ', N'-Tetraacetic acid [EGTA] + 10 μg/mL polyvinylklorid alkohol [PVA]) per 1 g av tumor vev, forsiktig resuspend/rist, og plasser røret ved 37 ° c i 2 min uten å blande.
      7. Legg til minst 1 lik volum av Cold farging Media (1% storfe serum albumin [BSA] + 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid [HEPES] + 1x penicillin-Streptomycin i L15 Media) for å slukke Trypsin og sentrifuger ved 220 x g for 4 min ved 4 ° C.
      8. Resuspend prøven i 10 mL av farging Media per 1 g av tumor vev og filtrere det gjennom en 40 μm celle sil for å få en enkelt celle suspensjon for musen injeksjon (figur 2).
      9. Slurry igjen på toppen av celle sil kan også samles for kirurgisk mus implantation.
  2. C Ore biopsi vevs behandling
    1. Hell kjernen sylinder vev i vev-transportrør inn i en 5 cm Petri parabolen.
    2. Fjern overflødig væske, skrape vev til kanten av Petri parabolen, fint hakke svulsten vev, tilsett ~ 100-150 μL av HBSS-/- på toppen av tumor vev, og raskt trekke HBSS/tumor vev suspensjon i 1 ml sprøyten.
    3. Fest en 23 G nål til 1 mL sprøyte, pass HBSS/tumor vev suspensjon gjennom nålen til en 1,5 mL spin tube.
    4. Trekke tumor suspensjonen inn i sprøyten med nålen fortsatt på til den kan passere jevnt gjennom nålen.
    5. Til slutt trekke tumor suspensjonen tilbake i sprøyten og løsne den 23 G nålen.
    6. Fest en 27 G nål og trekk et lik volum (~ 100 – 150 μL) av kunstig ekstracellulære matrise (se tabell over materialer) inn i sprøyten.
    7. Legg til et likt volum av kunstig ekstracellulære matrise langsomt inn i 1,5 mL spin tube med tumor/HBSS-/- suspensjon, forsiktig Unngå dannelse av bobler.
    8. Tegn en siste gang tilbake i sprøyten og kjernen biopsi tumorvevet er nå klar for musen injeksjon.
  3. FNA-behandling av vev
    1. Plasser sprøyten som inneholder FNA-prøvene (fanget i nålen) på isen.
    2. Skill nålen (som inneholder FNA-vevet) fra sprøyten og fjern stempelet fra sprøyten, tilsett ~ 150 – 200 μL av HBSS-/- til toppen av sprøyten.
    3. Sett stempelet inn i sprøyten og nålen (som inneholder FNA-vevet), og skyv ut HBSS-/- through nålen inn i en 1,5 ml spin tube. Dette trinnet fjerner FNA-svulsten fra nålen.
    4. Gjenta trinn 2.3.3 med HBSS-/-/Fna suspensjon to ganger med samme sprøyte for å maksimere henting av tumor vev fra nålen.
    5. Legg til et lik volum (~ 100 – 150 μL) av kunstig ekstracellulære matrise til 1,5 mL spin tube som inneholder HBSS/FNA-fjæringen.
    6. Tilstrekkelig blanding av langsomt utarbeide den kunstige ekstracellulære Matrix/HBSS-/-/Fna suspensjon tilbake i 23 G nålen og gjenta to ganger.
    7. Tegn hele kunstig ekstracellulære Matrix/HBSS-/-/Fna Volume tilbake i sprøyten, erstatte den 23 g nålen med en 27 g nål, og Fna prøven er nå klar for musen injeksjon.

3. tumor implantation og injeksjon hos mus

  1. Implantation av kirurgisk forbrukeravgift eller kirurgisk vevs vev
    Merk: Sørg for at alle kirurgiske instrumenter er sterile ved autoklavering eller bruk av pre-sterilisert en gangs instrumenter.
    1. Barbere håret fra det lavere rygg av NSG 6-8 uke mannlig eller kvinner mus innlevering en ca 1,5 cm x 3 cm område med nei håret. Bedøve mus ved hjelp av isoflurane, og bekreft ved å forsiktig klemme foten som en test av respons. Bruk veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet.
    2. Plasser individuelle mus på en varmepute i nesen kjegle av anestesi maskinen, skrubbe barberte området med klorheksidin. Deretter slukke med 70% etanol og la fordampe.
    3. Forbered biter eller dele tumor slurry i en Petri parabolen i individuelle hauger for kirurgisk implantation (dvs. i tre like hauger hvis å bli implantert i 3 mus).
    4. Ved hjelp av skalpell blad, lage et snitt på ca 5 mm lang på midten av baksiden av musen, ta ett par tang og løft opp huden på siden av snittet motsatte av operatøren.
    5. Ta saksen inn i den andre hånden og Skill huden fra muskelen laget ved å forsiktig kutte fascial membranen med små saks kutt, og dermed skape en "lomme" for tumor vev.
    6. Plukk opp en svulst blings eller en individuell haug med tumor slurry vev med skalpell bladet og forsiktig plassere vevet inn i den opprettede lommen.
    7. Administrere 100 μL av kunstig ekstracellulære matrise på tumorvevet haugen i lommen.
    8. Ved hjelp av to par tang, trekke opp snittet på begge ender slik at såret kantene kommer tett sammen, og Lukk såret ved å bruke en eller to sår klipp.
    9. Subkutan injeksjon 1-5 mg/kg meloksikam som smertestillende i mus etter operasjonen.
    10. Ta musen ut av nesen kjegle og plassere den tilbake i sin opprinnelige buret, observere musen mens du våkner. Ikke gå tilbake til et bur før det er helt gjenopprettet.
    11. Fjern sår klipp etter ca 7 dager. Hvis healing ikke er fullført etter 7 dager, la såret klippet i en ekstra en eller to dager.
      Merk: Hvis du bruker en enkelt celle suspensjon fra kirurgisk forbrukeravgift eller kirurgisk biopsi vev behandling, vil det blandes med kunstige ekstracellulære matrise (på 1:1 ratio) for mus injeksjon.
  2. Injeksjon av FNA eller kjerne biopsi vev
    1. Plasser en NSG-mus på et stål gitter stativ, Hold musen fast ved halen, og dra musen forsiktig tilbake. Det vil ta tak i rutenettet med sine fremre Ben fast. Alternativt, holde en mus i den ikke-dominerende hånd og la flanken området synlig.
    2. Desinfisere huden på flanken med alkohol prep servietter, langsomt og jevnt injisere innholdet i sprøyten under huden på musen.
    3. Trekk ut nålen og Plasser musen tilbake i buret sitt.

4. Monitor tumor vekst

  1. Overvåk mus én gang per uke for å se etter håndgripelig svulster.
  2. Når svulster er på en målbar størrelse (ca 50 mm3), bruk en tykkelse til posten tumor dimensjoner. Bruk følgende formel til å beregne tumor volumer: (bredde x bredde x lengde)/2.
  3. Harvest svulst når svulsten volumet når rundt 1,5 cm3 (ca 4-10 uker). Svulsten kalles nå mus passasje 1 (MP1).

5. Harvest svulst for banktjenester vev, reimplantation, og eksperimentere/karakterisering

  1. Euthanize mus i en CO2 kammer, sjekk vitale tegn for å bekrefte døden, og deretter Senk musen i en Virkon løsning for å sterilisere huden for 30 s i bio-kabinett.
  2. Bruk buet saks og kirurgisk tang for å løfte huden ved siden av svulsten og lage en horisontal kutt.
  3. Bruk en stump separasjon teknikk for å mobilisere huden på begge sider av svulsten og over svulsten, utsette svulsten.
  4. Bruk saks eller et skalpell blad for å skille svulsten fra dashbordet.
  5. Resect svulsten og overføre svulsten til en steril Petri parabol, skjær svulsten i små biter og fjerne nekrotisk vev fra svulsten.
  6. Bank tumor vev for fremtidig implantation.
    1. Ta 2-3 små tumor biter mindre enn ~ 10 mm x 10 mm og hakke dem i biter mindre enn ~ 1 mm x 1 mm.
    2. Overfør alt hakket vev til en 2 mL kryogene hetteglass, tilsett 1 mL frysing medier (10% DMSO + 90% FBS).
    3. Bland godt og Legg kryogene hetteglass inn i en pre-avkjølt isopropanol-basert celle fryseboks på tørr is.
    4. Oppbevar beholder i-80 ° c fryser over natten og deretter overføre kryogene hetteglass til flytende nitrogen (LN2) lagring.
  7. Snap-fryse vev for nedstrøms analyser (RNASeq, WES, etc.).
    1. Plasser tumor vev brikker (~ 3 mm x 3 mm) i et kryogene hetteglass og sett kryogene hetteglasset i LN2 umiddelbart. Oppbevar hetteglass i-80 ° c fryser.

6. forsøk på PDX terapi

Merk: det vil ta to Utvidelses faser for å vokse nok tumor vev til å generere det nødvendige antall PDX lager mus for terapi rettssaken.

  1. Plukk opp en cryovial som inneholder et PDX-vev fra LN2, og plasser cryovial i et vannbad på 37 ° c til fryse mediet som inneholder tumorvevet, bare begynner å smelte.
  2. Tøm innholdet i cryovial i forvarmet HBSS-/- i et 50 ml rør, og vask vevet.
  3. Pellet vev av sentrifugering i 5 min ved 1 200 rpm.
  4. Fjern HBSS-/- fra tumor prøven ved vakuum aspirasjon med en Pasteur-Pipet.
  5. Skyv PDX-vevet fra 50 mL røret inn i en 5 cm eller 10 cm Petri rett og plasser på våt is.
  6. Følg den ovennevnte implantat protokollen til implantat kryogene vev fra et hetteglass i 5 NSG-mus for den første runden med utvidelse av PDX-tumor.
  7. Når svulster nå ~ 600-800 mm3, Harvest 1-2 svulster for å få en enkelt celle suspensjon med ovennevnte protokoll for tumor vev behandling: mekaniske dissosiasjon, kollagenase fordøyelsen dissosiasjon prosedyre.
  8. Pellets celler og resuspend i 6 ml HBSS-/-/Artificial ekstracellulære matrise (1:1 ratio), subkutan injisere ~ 50 NSG mus, med 100 μL av celle blanding per mus for den andre runden av PDX tumor ekspansjon.
  9. Mål tumor størrelse med markører annenhver uke.
  10. Vent på en svulst størrelse på ~ 100 mm3 i 3-5 uker, tilfeldig mus i grupper, og starte behandling.
  11. Når tumor størrelse når maksimal IACUC-godkjent volum, stopp behandling.
  12. Følg ovenfor høste tumor protokollen for å samle snap frosne tumor stykker, tumor stykker for para fin blokker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tumor vev for melanom PDX-modeller kan komme fra en rekke ulike kilder, og kan også behandles i henhold til vekst dynamikken i enkelte modeller og ønsket bruk av PDX-vevet. Prioriteten for å etablere en PDX-modell er å ha tilstrekkelig materiale til banken for fremtidig bruk og DNA for karakterisering (figur 1).

Når tilstrekkelig materiale er banken, kan tumor vev utvides i en av tre viktigste metodene for å vokse nok svulst til å utføre en formell terapi studie (figur 2a). Hver av metodene som er beskrevet her vil tillate utvidelse av tumor fra PDXs (figur 2B). Det er vår erfaring at å skape en enkelt celle suspensjon av tumorceller med bruk av enzymatisk fordøyelse (kollagenase IV) kan gi rom for raskere tumor vekst, og kan tillate en innledende svulst skal utvides til 10-20 mus, mens svulsten blings og slurry metoden kan bare utvides til 5 – 10 mus (figur 2C). Som tidligere har blitt demonstrert i andre tumor typer, reflekterer melanom PDX-modeller ofte legemiddel følsomheten pasienten viser når de er på behandling. Vist her er en representativ terapi kurve fra en melanom pasient med BRAFV600E mutant melanom som i utgangspunktet svarte på en BRAF inhibitor, men til slutt tilbakefall. PDX avledet fra denne pasienten viste også innledende følsomhet for BRAF hemming (Rx1) pluss en ekstra inhibitor (Rx2); men svulster slutt tilbakefall (Figur 3).

Figure 1
Figur 1 : PDX modell generasjon arbeidsflyt for bank tumor vev og utføre terapi studier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Alternative metoder for implantation. (A) svulster kan behandles i begge biter, en slurry suspensjon, eller som en enkelt celle suspensjon. (B) alle tre metodene vil tillate vekst av svulster i vivo. Vist her er mus subkutant implantert med tumor og fotografert 12 dager etter implantation. (C) vist er tumor vekst kurver for musene injisert med en av de tre implantation metoder. N = 5 per arm; feilfelt er standard feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representative data for en prøveversjon av PDX-behandling. Mus ble implantert med PDX svulster og behandlet med enten en kjøretøy kontroll eller en to-inhibitor kombinasjon av en BRAF-hemmer og en MEK-hemmer. N = 6 per arm. Tilfeldiggjøring ble brukt til å plassere mus i studiegrupper. Av notatet, selv om ~ 500 mm3 ble brukt i dette eksempelet som starter tumor volum for behandling innvielse, rutinen volumet for å starte PDX studier er 100-200 mm3 som PDX svulster er aggressive og deres vekst er vanskelig å hemme når de for store en størrelse (> 300 mm3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har her beskrevet generere PDX modeller av melanom med pasient vev avledet fra primær og metastatisk svulster, kjerne biopsier, og FNAs. Når direkte engrafted til NSG-mus, svulster presentere lignende morfologiske, genomisk, og biologiske egenskaper til de observert i pasienten. I tilfelle når bare en liten mengde vev er tilgjengelig for etterforskere, som ofte skjer med FNAs, gjør PDX teknikken for utvidelse av tumor vev for DNA, RNA, og protein karakterisering, samt for terapi forsøk for å tillate prekliniske narkotika Utvikling.

Kritisk for suksessen til PDX engraftment er kvaliteten på materialet etterforskere begynner med. Forsiktighet må utvises for å sikre tumorvevet er hensiktsmessig bevart så mye som mulig i avsnitt 1 og 2. Viktigere, responsen til behandling av PDX melanom modeller bedre viser følsomheten til donor pasienten, slik at for robuste prekliniske undersøkelser for å utvikle forbedrede terapeutiske strategier for å bekjempe terapi motstand og forbedre holdbarhet av respons. De fleste metastatisk melanom pasienter opplever ikke botemidler med eksisterende standard av omsorg (SOC) terapi5. Vår PDX melanom-kolleksjon inneholder mer enn 500 distinkte modeller, inkludert de som er avledet fra pasienter som har tatt tilbakefall på målrettet behandling og immunterapi1,2. Denne ressursen vil være avgjørende for utviklingen av terapeutiske modaliteter som overvinner motstand mot dagens SOC. fremtidige programmer for PDX-modellen vil være avhengige av kostnadseffektive, høye gjennomstrømmings tilnærminger som utnytter PDX-modeller i stoff skjermer og CRISPR-Cas9 skjermer for å identifisere romanen effektive strategier for ulike genotyper (dvs. BRAFV600E, NRASQ61R) og under typer (dvs. uveal, acral) av melanom14.

En begrensning av PDX-teknikken er nødvendigheten av at tumor materiale engrafted til mus uten et immunsystem for å sikre engraftment suksess1. Derfor, PDX studier optimalisere terapeutiske strategier for å bekjempe terapi motstand ikke ta opp hvordan nye terapi strategier kan positivt eller negativt påvirke immunsystemet og/eller anti-tumor immunresponser. Heldigvis har fremskritt innen muse menneskeliggjøring med et menneskelig immunsystem blitt gjort, og vil muliggjøre mer ideelle PDX-studier hos mus som bedre recapitulate den menneskelige mikromiljøet15.

I sammendraget, PDX modeller tillate prekliniske undersøkelser av melanom celler som bedre recapitulate svulsten heterogenitet og melanom aggressivitet observert i klinikken (versus andre todimensjonale og standard xenograft tilnærminger). PDX-modellene gir en dypere forståelse av hvilke gener som er involvert i behandlings motstanden, og gir en mer klinisk relevant modell der mer effektive terapier kan utvikles for å øke den generelle overlevelsen av pasienter med metastatisk melanom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Wistar Institute Animal Facility, mikroskopi anlegg, histologi Facility, og Research Supply Center. Denne studien ble finansiert delvis av tilskudd fra U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), p01 (CA114046-07), Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, og melanom Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Hepes SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # H0887-100ML
100x PenStrep  Invitrogen Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) MED Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin  SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # T4549-100ML 10 mL aliquots stored at –20oC
BSA SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # A9418-500G
Chlorhexidine Fisher Scientific Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL) Worthington  Cat #4189 make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # C6295-50ML
DNase SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) Merck Cat # 324626.25
FBS INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES Cat # 16000-044
Fungizone INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES Cat # 15290-018
Gentamicin FISHER SCIENTIFIC Cat # BW17518Z
Isoflurane HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH Cat # 050031
Leibovitz's L15 media  Invitrogen Cat # 21083027
Matrigel Corning Cat # 354230 Artificial extracellular matrix
Meloxicam HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein Cat # 025115 1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice The Wistar Institute, animal facility breeding
PVA (polyvinyl alcohol) SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Fisher Scientific Cat# MT10041CM
Scalpel Feather Cat # 2976-22
Virkon GALLARD-SCHLESINGER IND Cat # 222-01-06
Wound clips MikRon Cat #427631

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
  2. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  3. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  4. Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
  5. Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
  6. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
  7. Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
  8. Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
  9. Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
  10. Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
  11. Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
  12. Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
  13. Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
  14. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
  15. De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).

Tags

Kreftforskning melanom pasient-avledet xenograft terapi motstand in vivo-modeller metastasering
En melanom pasient-avledet Xenograft modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, M., Rebecca, V. W., Herlyn, M. … More

Xiao, M., Rebecca, V. W., Herlyn, M. A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model. J. Vis. Exp. (147), e59508, doi:10.3791/59508 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter