Summary
Patienter som härrör xenograft (PDX) modeller mer robust recapitulate melanom molekylära och biologiska egenskaper och är mer prediktiva för behandlingssvar jämfört med traditionella plast vävnad kulturbaserade analyser. Här beskriver vi vårt standard drifts protokoll för etablering av nya PDX-modeller och karakterisering/experimenterande av befintliga PDX-modeller.
Abstract
Ackumulerande bevis tyder på att molekylära och biologiska egenskaper skiljer sig i melanomceller som odlas i traditionella tvådimensionella vävnadsodling fartyg kontra in vivo hos mänskliga patienter. Detta beror på flaskhalsen urvalet av klonala populationer av melanomceller som robust kan växa in vitro i avsaknad av fysiologiska tillstånd. Vidare, svar på behandling i tvådimensionella vävnadskulturer övergripande inte troget återspeglar svar på behandling hos melanom patienter, med majoriteten av kliniska prövningar inte visar effekten av terapeutiska kombinationer visat sig vara effektiva i In vitro. Även om xenograftering av melanomceller till möss ger den fysiologiska in vivo-kontexten frånvarande från tvådimensionella vävnads odlings analyser, har de melanomceller som används för inympning redan genomgått flaskhals val för celler som kan växa under två-dimensionella förhållanden när cell linjen upprättades. De oåterkalleliga förändringar som uppstår till följd av flaskhalsen inkluderar förändringar i tillväxt-och invasions egenskaper, liksom förlusten av specifika subpopulationer. Därför kan modeller som bättre recapitulate människans villkor in vivo bättre förutsäga terapeutiska strategier som effektivt öka den totala överlevnaden för patienter med metastaserande melanom. Den patient-härledda xenograft (PDX) teknik innebär direkt implantation av tumörceller från den mänskliga patienten till en mus mottagare. På detta sätt, tumörceller ständigt odlas under fysiologiska spänningar in vivo och aldrig genomgå den tvådimensionella flaskhalsen, som bevarar de molekylära och biologiska egenskaper som finns när tumören var i den mänskliga patienten. Anmärkningsvärda, PDX-modeller härledda från organ platser av metastaser (dvs. hjärnan) uppvisar likartad metastaserande kapacitet, medan PDX-modeller som härrör från behandlingsnaiva patienter och patienter med förvärvad resistens mot behandling (dvs. BRAF/MEK-hämmare) visar liknande känslighet för behandling.
Introduction
Prekliniska modeller är kritiska för alla aspekter av Translationell Cancerforskning, inklusive sjukdomkaraktärisering, upptäckt av angripbara sårbarheter som är unika för cancer kontra normala celler, och utveckling av effektiva terapier som utnyttjar dessa sårbarheter för att öka patienternas totala överlevnad. I melanom fältet, tiotusentals cellinjer modeller har varit tungt utnyttjas för Drug screening, med > 4000 bidragit med vår grupp ensam (WMXXX-serien). Dessa cellinjer modeller härstammar från melanom patienter med olika former av kutana melanom (dvs., acral, ukalv, och ytliga spridning) och olika genotyper (dvs., BRAFV600-Mutant och neuroblastom ras viral onkogen homolog [ Nationella regleringsmyndigheter Q61R-Mutant]), som spänner över det spektrum av sjukdomar som finns i kliniken1,2.
Otvetydigt, den mest framgångsrika, riktade terapi strategi i melanom fältet har uppstått från 1) den genomiska karakteriseringen av patienternas tumörer som identifierar BRAF -mutationer i ~ 50% av melanom3 och från 2) preklinisk undersökning utnyttja melanom cell linje modeller4. Kombinationen BRAF/MEK-hämmare var Food and Drug Administration (FDA)-godkänd i 2014 för behandling av patienter vars melanom Harbor aktiverande BRAFV600E/K- mutationer och ståtar med en > 75% svarsfrekvens5. Trots denna initiala effekt, resistens uppstår snabbt i nästan alla fall på grund av mångskiftande inneboende och förvärvade resistensmekanismer och intratumorala heterogenitet. Tyvärr, cellinjer modeller inte recapitulate representativa biologiska heterogenitet när odlas i tvådimensionell kultur i plast fartyg, som döljer sin kliniskt prediktiva potential när utredare försök att experimentellt avgöra terapier som kan vara effektiva hos patienter med en specifik form eller genotyp av melanom6. Förstå hur man bäst modell patienten intratumorala heterogenitet kommer att göra det möjligt för utredare att bättre utveckla terapeutiska modaliteter som kan döda behandlingsresistenta subpopulationer som driver underlåtenhet att nuvarande standard-of-Care terapier.
Avgörande för den begränsade prediktiva värdet av cellinjer modeller är hur de ursprungligen fastställts. Irreversibla förändringar förekommer i tumörens klonala landskap när en encellig suspension av en patient tumör odlas på tvådimensionella, plast vävnad kultur fartyg, inklusive förändringar i proliferativ och invasiv potential, eliminering av specifika subpopulationer, och förändringen av genetisk information7. Xenografts till möss av dessa melanom cell linje modeller representerar den mest använda in vivo plattform för prekliniska studier; men denna strategi lider också av den fattiga rekapitulation av komplexa tumör heterogenitet observerats kliniskt. För att övervinna denna brist har det funnits ett växande intresse av att införliva mer sofistikerade prekliniska modeller av melanom, inklusive PDX-modellen. PDX-modellerna har använts i > 30 år, med seminala studier på lungcancerpatienter som demonstrerade överensstämmelse mellan patienternas respons på cytotoxiska medel och responsen hos PDX-modellen som härrör från samma patient8. Nyligen har det varit en enhet att använda PDX modeller som verktyg för val för prekliniska utredningar både i branschen och i akademiska centra. PDX modeller, på grund av deras överlägsna rekapitulation av tumör heterogenitet hos mänskliga patienter, är mer kliniskt relevanta att använda i terapi optimering insatser än cellinjer xenograft9. I melanom, det finns enorma hinder som trubbigt den terapeutiska hanteringen av avancerad sjukdom10. Kliniskt relevanta PDX-modeller har använts för att modellera kliniskt motstånd och identifiera terapeutiska strategier med kliniskt tillgängliga medel för behandling av behandlingsresistenta tumörer11,12. Kortfattat, det protokoll som presenteras här för att generera PDX modeller kräver subkutan implantation av färsk vävnad från primära eller metastaserande melanom (samlas in av biopsi eller kirurgi) till nod/scid/IL2 nätters-receptor null (NSG) möss. Olika grupper använder sig av skilda variationer i metodologisk metod. emellertid finns en grund kärna13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande djur protokoll följer riktlinjerna från Wistar Institutes humana etikkommitté och riktlinjer för djuromsorg.
1. melanom tumör vävnad insamling
- Samla tumör vävnad (kallas passage 0) från melanom patienter med en av följande kirurgi eller biopsi metoder.
- För kirurgisk excision vävnad, upprätthålla minst 1 g vävnad (resect metastaser och primära lesioner) i transport lagringsmedia (RPMI 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% gentamicin) vid 4 ° c eller på is.
- För kirurgisk biopsi vävnad, underhålla mindre än 1 g vävnad (ofta Punch biopsier av subkutana [s.c.] metastaser och lymfkörtel [LN] metastaser) i transport lagringsmedia vid 4 ° c eller på is.
- För kärna biopsi vävnad, tvätta ur en cylinder (kärna) av vävnad av cirka 10 mm x 1 mm (ofta, leverbiopsier) i en 15 mL tub som innehåller 5 mL transport lagringsmedia vid 4 ° c eller på is.
- För fin nål aspirera (FNAs) vävnad, hålla en mycket liten mängd vävnad (mindre än 1 mm i storlek) tas direkt från patienten i en nål och spruta vid 4 ° c eller på is.
- Leverera vävnaden i transport lagringsmedier vid 4 ° c eller på is på samma dag eller med övernattning leverans efter kirurgisk excision eller biopsi. Bearbeta vävnaden inom 1-2 h för leverans.
2. tumör vävnad bearbetning för mus implantation
- Kirurgisk excision eller kirurgisk biopsi vävnad bearbetning
- Överför vävnaden till en steril petriskål och separera tumör vävnad från omgivande normal vävnad så mycket som möjligt.
- Ta bort nekrotisk vävnad (vanligtvis identifieras som blek-vitaktig vävnad ligger centralt i tumören) från den återstående tumören så mycket som möjligt.
- Använd en skalpell för att dela upp en initial tumör bit i ungefär lika delar (~ 3 mm x 3 mm) för kirurgisk mus implantation (figur 2).
- Alternativt, om tillräckligt med tumör vävnad finns, snap-frysa vävnaden för nedströms analyser (RNA sekvensering [RNASeq], hela Helexomanalyserna sekvensering [WES], etc.).
- Gör en tumör flytgödsel genom att malning tumörvävnad med hjälp av en cross Blade teknik med två skalpell blad. Finhacka tumören bitar så fint som möjligt för att bilda en slurry, som nu är redo för kirurgiska mus implantation.
- Alternativt, om tumörvävnad är för svårt för mekanisk dissociation, Använd en digestionsdissociation förfarande för att bilda gel-liknande flytgödsel och en encellig suspension för implantation och/eller injektion.
- Finhacka tumören bitar så fint som möjligt för att bilda flytgödsel.
- Sätt flytgödsel i en 50 ml tub med Cold Hank ' s balanserade saltlösning (Hbss)-/- (utan ca+ + och mg+ +); därefter Centrifugera och pelleten vid 220 x g i 4 min vid 4 ° c.
- Omsuspendera flytgödsel i 10 ml värmda färska smälta media (200 u/ml kollagenase IV + 5 mm CaCl2 + 50 U/ml DNase i Hbss-/-) per 1 g tumör vävnad.
- Placera röret i ett 37 ° c vattenbad i 20 min och blanda kraftigt var 5 min med en engångspipett.
- Tvätta med upp till 50 mL HBSS-/-; Centrifugera sedan vid 220 x g i 4 minuter vid 4 ° c.
- Tillsätt 5 ml föruppvärmd teg (0,025% trypsin + 40 μg/ml etylenglykol-bis (β-aminoetyleter)-N, n, n ',, N'-tetraättiksyra [EGTA] + 10 μg/ml polyvinylalkohol [PVA]) per 1 g tumör vävnad, försiktigt Omsuspendera/skaka, och placera röret vid 37 ° c i 2 min utan blandning.
- Tillsätt minst 1 lika stora mängder kallt Färgnings medel (1% bovint serumalbumin [BSA] + 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineetanesulfonic Acid [HEPES] + 1x penicillin-streptomycin i L15 Media) för att släcka trypsin och centrifugera vid 220 x g i 4 minuter C.
- Omsuspendera provet i 10 mL färgmedia per 1 g tumör vävnad och filtrera det genom en cell SIL på 40 μm för att få en encellig suspension för mus injektion (figur 2).
- Slurry kvar på toppen av cellen SIL kan också samlas in för kirurgiska mus implantation.
- C malm biopsi vävnad bearbetning
- Häll kärnan cylinder vävnad i vävnad-transportröret i en 5 cm petriskål.
- Ta bort överflödig vätska, skrapa vävnad till kanten av petriskål, finhacka tumörvävnad, tillsätt ~ 100-150 μL av HBSS-/- ovanpå tumör vävnad, och snabbt dra Hbss/tumör vävnad suspensionen i 1 ml sprutan.
- Fäst en 23 G nål till 1 mL spruta, passera HBSS/tumör vävnad suspensionen genom nålen i en 1,5 mL spinn röret.
- Rita om tumören suspensionen i sprutan med nålen fortfarande på tills den kan passera smidigt genom nålen.
- Slutligen dra tumören suspensionen tillbaka in i sprutan och lossa 23 G nål.
- Fäst en 27 G nål och dra en lika volym (~ 100 – 150 μL) av konstgjord extracellulär matris (se tabell över material) i sprutan.
- Tillsätt en lika mängd konstgjord extracellulär matris långsamt i 1,5 mL spinn röret med tumören/HBSS-/- fjädring, försiktigt undvika bildandet av bubblor.
- Rita en sista gång tillbaka in i sprutan och kärnan biopsi tumör vävnad är nu redo för mus injektion.
- FNA-bearbetning
- Placera sprutan som innehåller FNA-proverna (fångade i nålen) på isen.
- Separera nålen (som innehåller FNA-vävnad) från sprutan och ta bort kolven från sprutan, tillsätt ~ 150 – 200 μL HBSS-/- överst på sprutan.
- Sätt tillbaka kolven i sprutan och nålen (innehållande FNA-vävnaden) och tryck ut HBSS-/- genom nålen i ett spin-rör på 1,5 ml. Detta steg tar bort FNA-tumören från nålen.
- Upprepa steg 2.3.3 med det Hbss-/-/Fna-fjädringen två gånger med samma spruta för att maximera inhämtningen av tumör vävnad från nålen.
- Tillsätt en lika volym (~ 100 – 150 μL) konstgjord extracellulär matris till 1,5 mL spinn röret som innehåller HBSS/FNA-fjädringen.
- Blanda ordentligt genom att sakta dra upp den konstgjorda extracellulära matrisen/Hbss-/-/Fna-fjädringen tillbaka till 23 G-nålen och upprepa två gånger.
- Dra hela den konstgjorda extracellulära matrix/Hbss-/-/Fna volym tillbaka in i sprutan, ersätta 23 g nål med en 27 g nål, och Fna provet är nu redo för mus injektion.
3. tumör implantation och injektion hos möss
- Implantation av kirurgisk excision eller kirurgisk biopsi vävnad
Obs: se till att alla kirurgiska instrument är sterila genom autoklavering eller användning av försteriliserade engångsinstrument.- Raka hår från den nedre delen av NSG 6-8 vecka manliga eller kvinnliga möss lämnar en cirka 1,5 cm x 3 cm område utan hår. Anesthetize möss med isofluran, och bekräfta genom att försiktigt klämma foten som ett test av lyhördhet. Använd vet salva på deras ögon för att förhindra torrhet.
- Placera enskilda möss på en Värmekudde i näsan konen av anestesi maskinen, skrubba rakade området med klorhexidin. Sedan Släck med 70% etanol och låt avdunra.
- Förbered bitar eller dividera tumör uppslamningar i en petriskål i enskilda högar för kirurgisk implantation (dvs, i tre lika högar om att implanteras i 3 möss).
- Med hjälp av skalpell bladet gör ett snitt på ca 5 mm lång på mitten av baksidan av musen, ta ett par tång och lyfta upp huden på sidan av snittet motsatsen till operatören.
- Ta saxen i den andra handen och separera huden från muskellagret genom att försiktigt skära fascian membran med små saxskär, vilket skapar en "ficka" för tumör vävnad.
- Plocka upp en tumör bit eller en enskild kulle av tumör flytgödsel vävnad med skalpell bladet och försiktigt placera vävnaden i den skapade fickan.
- Administrera 100 μL konstgjord extracellulär matris på tumörvävnadhögen i fickan.
- Med två par tång, dra upp snittet på båda ändarna så att såret kanterna kommer nära varandra, och Stäng såret genom att tillämpa en eller två sår klämmor.
- Subkutan injektion 1-5 mg/kg meloxikam som smärtstillande medel i möss efter operation.
- Ta musen ut ur näsan konen och placera den tillbaka i sin ursprungliga bur, Observera musen medan du vaknar. Återgå inte till en bur förrän den är helt återställd.
- Ta bort sår klämmor efter cirka 7 dagar. Om läkningen inte slutförs efter 7 dagar, lämna såret klippet i ytterligare en eller två dagar.
Obs: om du använder en enda cellsuspension från kirurgisk excision eller kirurgisk biopsi vävnad bearbetning, det kommer att blandas med konstgjord extracellulär matris (vid 1:1 ratio) för möss injektion.
- Injektion av FNA eller Core biopsi vävnad
- Placera en NSG-mus på ett rutnät rack stål, håll musen stadigt av svansen, och försiktigt dra tillbaka musen. Det kommer att greppa rutnätet med dess frambenen stadigt. Alternativt, begränsa en mus i den icke-dominerande handen och låt flank området synlig.
- Desinficera huden på flanken med alkohol prep Svabb, långsamt och stadigt injicera innehållet i sprutan under huden på musen.
- Dra ut nålen och Placera musen tillbaka i sin bur.
4. övervaka tumörtillväxt
- Övervaka möss en gång i veckan för att kontrollera påtaglig tumörer.
- När tumörer är på en mätbar storlek (ca 50 mm3), Använd en bromsfält för att registrera tumör dimensioner. Använd följande formel för att beräkna tumör volymer: (bredd x bredd x längd)/2.
- Harvest tumör när tumör volymen når runt 1,5 cm3 (cirka 4 – 10 veckor). Tumören kallas nu mus passage 1 (MP1).
5. Harvest tumör för bank vävnad, reimplantation, och experiment/karakterisering
- Euthanize mus i en CO2 kammare, kontrollera vitala tecken för att bekräfta döden, och sedan dränka musen i en virkon lösning för att sterilisera huden för 30 s i bio-skåpet.
- Använd böjda saxar och kirurgiska tång för att lyfta huden intill tumören och göra en horisontell snitt.
- Använd en trubbig separation teknik för att mobilisera huden på båda sidor av tumören och över tumören, utsätta tumören.
- Använd sax eller en skalpell blad för att separera tumören från fascian.
- Resect tumören och överföra tumören till en steril petriskål, skär tumören i små bitar och ta bort nekrotisk vävnad från tumören.
- Bank tumör vävnad för framtida implantation.
- Ta 2-3 små tumör bitar mindre än ~ 10 mm x 10 mm och finhacka dem i bitar mindre än ~ 1 mm x 1 mm.
- Överför all hackad vävnad till en 2 mL kryogen injektionsflaska, tillsätt 1 mL frys medium (10% DMSO + 90% FBS).
- Blanda väl och placera kryogena injektionsflaskor i en förkyld isopropanolbaserad cell frysnings behållare på torris.
- Förvara behållaren i-80 ° c frys över natten och överför sedan kryogena injektionsflaskor till flytande kväve (LN2) lagring.
- Snap-Freeze vävnad för nedströms analyser (RNASeq, WES, etc.).
- Placera tumör vävnad bitar (~ 3 mm x 3 mm) i en kryogen injektionsflaska och placera den kryogena injektionsflaskan i LN2 omedelbart. Förvara ampuller i-80 ° c frys.
6. PDX terapi prövningar
Obs: det kommer att ta två expansionsfaser att växa tillräckligt tumör vävnad för att generera det nödvändiga antalet PDX bärande möss för terapin rättegång.
- Plocka upp en cryovial innehåller bankas PDX vävnad från LN2, och placera cryovial i en 37 ° c vattenbad tills frys mediet som innehåller tumörvävnad är bara börjar smälta.
- Töm innehållet i cryovial i förvärmda HBSS-/- i en 50 ml tub, och tvätta vävnad.
- Pellets vävnad genom centrifugering i 5 min vid 1 200 rpm.
- Ta bort HBSS-/- från tumörprovet med vakuum aspiration med en Pasteur pipet.
- Skjut PDX vävnad från 50 mL röret till en 5 cm eller 10 cm petriskål och placera på våt is.
- Följ ovanstående implantations protokoll för att implantatet bankas vävnad från en kryogen flaska till 5 NSG möss för den första omgången av PDX tumör expansion.
- När tumörer når ~ 600-800 mm3, skörd 1-2 tumörer för att få en enda cellsuspension med ovanstående protokoll för tumör vävnad bearbetning: mekanisk dissociation, kollagenase nedbrytning dissociation förfarande.
- Pelletceller och omsuspenderas i 6 ml Hbss-/-/konstgjord extracellulär matris (1:1 ratio), subkutan injektion ~ 50 NSG-möss, med 100 μl cell blandning per mus för den andra omgången av PDX tumör expansion.
- Mät tumörstorlek med bromsok varannan vecka.
- Vänta på en tumörstorlek ~ 100 mm3 i 3-5 veckor, randomize lines möss i grupper, och starta behandling.
- När tumörstorlek når den maximala IACUC-godkänd volym, stoppa behandlingen.
- Följ ovanstående Harvest tumör protokoll för att samla Snap frysta tumör bitar, tumör bitar för paraffinblock.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumör vävnad för melanom PDX modeller kan komma från en mängd olika källor och kan också bearbetas per tillväxtdynamik enskilda modeller och önskad användning av PDX vävnad. Prioriteringen vid upprättande av en PDX-modell är att ha tillräckligt med material till banken för framtida användning och DNA för karakterisering (figur 1).
När tillräckligt material är bankas, tumör vävnad kan utökas i en av tre huvudsakliga metoder för att växa tillräckligt tumör för att utföra en formell terapi studie (figur 2a). Var och en av de metoder som beskrivs häri kommer att möjliggöra utbyggnad av tumör från PDXs (figur 2B). Det är vår erfarenhet att skapa en enda cellsuspension av tumörceller med användning av enzymatisk matsmältning (kollagenase IV) kan möjliggöra en snabbare tumörtillväxt, och kan tillåta en initial tumör som ska utvidgas till 10 – 20 möss, medan tumören bit och flytgödsel metoden kan endast utökas till 5 – 10 möss (figur 2C). Som tidigare visats i andra tumörtyper, melanom PDX modeller återspeglar ofta drogen känslighet patienten visas när på behandling. Visat här är en representativ terapi kurva från en melanom patient med BRAFV600E Mutant melanom som initialt svarat på en BRAF-hämmare men i slutändan recidiverade. PDX som härrör från denna patient visade också initial känslighet för BRAF-hämning (Rx1) plus en ytterligare hämmare (Rx2); emellertid, tumörerna slutligen recidiverat (figur 3).
Figur 1 : PDX modell generation arbetsflöde för bank tumör vävnad och utför terapi studier. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Alternativa metoder för implantation. A) tumörer kan bearbetas till antingen bitar, en suspension eller som en encellig suspension. (B) alla tre metoderna kommer att möjliggöra tillväxt av tumörer in vivo. Visas här är möss subkutant implanteras med tumör och avbildas 12 dagar efter implantation. (C) visas tumörtillväxt kurvor för möss injiceras med en av de tre implantations metoder. N = 5 per arm; felstaplar är standardfel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa data för en PDX-behandlingsstudie. Möss implanterades med PDX tumörer och behandlades med antingen en fordonskontroll eller en två-hämmare kombination av en BRAF-hämmare och en MEK-hämmare. N = 6 per arm. Randomisering användes för att placera möss i studiegrupper. Notera, även om ~ 500 mm3 användes i detta exempel som start tumör volym för behandling initiering, den rutinmässiga volymen för att börja PDX studier är 100-200 mm3 som PDX tumörer är aggressiva och deras tillväxt är svårt att hämma när de för stor en storlek (> 300 mm3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har häri beskrivs genererar PDX modeller av melanom med patient vävnad som härrör från primära och metastaserande tumörer, kärnbiopsier, och FNAs. När direkt inympas i NSG-möss, tumörer uppvisar liknande morfologiska, genomiska, och biologiska egenskaper till de som observerats i patienten. I fallet när endast en liten mängd vävnad är tillgänglig för utredare, som ofta sker med FNAs, tillåter PDX tekniken för utbyggnad av tumör vävnad för DNA, RNA, och proteinkarakterisering, samt för behandling prövningar för att möjliggöra prekliniska läkemedel Utveckling.
Kritisk till framgången för PDX-engrafet är kvaliteten på material utredarna börjar med. Försiktighet måste iakttas för att säkerställa att tumör vävnad bevaras på lämpligt sätt så mycket som möjligt i avsnitten 1 och 2. Viktigt är att responsen på behandling av PDX melanom modeller bättre recapitulates känsligheten hos givaren patienten, vilket möjliggör robusta prekliniska undersökningar för att utveckla förbättrade terapeutiska strategier för att bekämpa terapi resistens och förbättra hållbarheten hos responsen. De flesta metastaserande melanom patienter upplever inte botemedel med befintlig standard av vård (SOC) terapier5. Vår PDX melanom samling innehåller mer än 500 distinkta modeller, inklusive de som härrör från patienter som recidiverat på riktad terapi och immunterapi1,2. Denna resurs kommer att vara avgörande för utvecklingen av terapeutiska modaliteter som övervinna resistens mot nuvarande SOC. framtida tillämpningar för PDX-modellen kommer att förlita sig på kostnadseffektiva, högt genomflödesansatser som utnyttjar PDX-modeller i drog skärmar och CRISPR-Cas9 skärmar för att identifiera nya effektiva strategier för olika genotyper (dvs., BRAFV600E, NRASQ61R) och subtyper (dvs., ukalv, acral) av melanom14.
En begränsning av PDX tekniken är nödvändigheten av att tumörmaterial inympas i möss utan ett immunsystem för att säkerställa engraftionsframgång1. Därför PDX studier optimera terapeutiska strategier för att bekämpa terapi resistens inte ta itu med hur nya behandlingsstrategier kan positivt eller negativt påverka immunförsvaret och/eller anti-tumör immunsvar. Lyckligtvis framsteg inom området mus humanisering med ett humant immunförsvar har gjorts och kommer att möjliggöra mer idealiska PDX studier i möss som bättre recapitulate den mänskliga mikromiljö15.
Sammanfattnings, PDX modeller möjliggör prekliniska undersökningar av melanomceller som bättre recapitulate tumören heterogenitet och melanom aggressivitet observerats i kliniken (jämfört med andra tvådimensionella och standard xenograft metoder). PDX-modellerna möjliggör en djupare förståelse för vilka gener som är involverade i behandlingsresistens och ger en mer kliniskt relevant modell från vilken effektivare terapier kan utvecklas för att öka den totala överlevnaden hos patienter med metastaserande melanom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Wistar Institute djur anläggning, mikroskopi anläggning, Histotechnology anläggning, och forskning Supply Center. Denna studie finansierades delvis av bidrag från U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), P01 (CA114046-07), Dr. Miriam och Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, och melanom Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
