CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein بوساطة تحرير الجينات الدقيقة عن طريق أنبوب الكهربائي
Summary
يقدم هنا بروتوكول للكفاءة كريسبر / Cas9 ribonucleoprotein بوساطة تحرير الجينات في خلايا الثدييات باستخدام electroporation أنبوب.
Abstract
النوى تحرير الجينات، ممثلة بالبروتين المرتبط كريسبر 9 (Cas9)، أصبحت الأدوات الرئيسية في البحوث الطبية الحيوية. إن النجاح في تسليم عناصر CRISPR/Cas9 إلى الخلايا المستهدفة عن طريق التطفل هو شرط أساسي لتحرير الجينات بكفاءة. يوضح هذا البروتوكول أن أنبوب electroporation (TE) الآلات بوساطة تسليم كريسبر / Cas9 ريبونوكليوبروتين (RNP)، جنبا إلى جنب مع وحيد stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) قوالب المانحين لأنواع مختلفة من خلايا الثدييات، يؤدي إلى قوية دقيقة الجينات تحرير الأحداث. أولاً، تم تطبيق TE لتسليم CRISPR/Cas9 RNP وssODNs للحث على الطفرات المسببة للأمراض في جين الخلايا الفرعية لمستقبلات interleukin 2 (IL2RG) وجين اختزال البنيبيفيتين (SPR) في خلايا الخلايا الليفية للأرانب. تم تحقيق معدلات طفرة دقيقة من 3.57%-20% على النحو الذي يحدده تسلسل استنساخ TA البكتيري. ثم استخدمت نفس الاستراتيجية في iPSCs الإنسان على العديد من الجينات ذات الصلة سريريا بما في ذلك مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، البروتين الميوسين ملزمة C، القلب (Mybpc3)، وبيتا الهيموجلوبين الفرعية (HBB). وعلى نحو متسق، تحققت معدلات طفرات دقيقة للغاية (11.65 في المائة – 37.92 في المائة) كما يحددها التسلسل العميق (DeepSeq). ويبين العمل الحالي أن الكهرباب الأنبوبي لـ CRISPR/Cas9 RNP يمثل بروتوكولافعالا للتَنَزَل في تحرير الجينات في خلايا الثدييات.
Introduction
CRISPR/Cas9 هو النوى الأكثر استخداما للبرمجة لتحرير الجينات. وهو يعمل من خلال دليل واحد RNA (sgRNA) بوساطة الاعتراف من كل من التسلسلات الهدف وتتابع الزخرفة البروتوسبيسر المجاورة (PAM) في الجينوم. وينتج عن النواة Cas9 كسر الحمض النووي مزدوجة stranded (DSB) تقع ثلاثة النيوكليوتيدات المنبع من تسلسل PAM1. يتم إصلاح DSBs إما من خلال ربط نهاية غير متجانسة عرضة للخطأ (NHEJ) أو مسارات الإصلاح الموجه homology (HDR). لتحقيق تحرير الجينات بدقة من خلال مسار HDR، غالبا ما يتم توفير قوالب المانحين في شكل الحمض النووي البلازميد (pDNA) أو oligodeoxynucleotide واحد stranded (ssODN).
CRISPR/Cas9 وsgRNA يمكن تسليمها إلى الخلايا في ثلاثة أشكال: مجمع ريبونوكليوبروتين (RNP) من بروتين Cas9 وgRNA2,3; Cas9 mRNA وsgRNA4,5; أو الحمض النووي البلازميد (pDNA) الذي يحتوي على المروجين اللازمة،مدفوعة sgRNA، ومنطقة الترميز Cas9 6،7،8. وقد أظهرت العديد من المجموعات أنه عندما يتم تسليم كريسبر/كاس9 كما RNP, كفاءة تحرير الجينات غالبا ً تفوق تلك التي تحققت في صيغ pDNA أو MRNA, يعزى إلى حجم أصغر بكثير من RNP مقارنة مع الأحماض النووية9. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت سابقا أن أنبوب جديد الكهربائي (TE) آلة فعالة بشكل خاص في تطبيقات تحرير الجينات في عدة أنواع الخلايا9.
ويرد في العمل الحالي بروتوكول خطوة بخطوة في استخدام TE لتسليم CRISPR/Cas9 RNP إلى خلايا الثدييات من مختلف الأنواع في العديد من المواقع ذات الصلة سريريا. هذه الرواية TE تقنية ترانسفيكشن وارتفاع معدل ظاهرة HDR قد تجد تطبيقات واسعة في البحوث الطبية الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكانت طريقة electroporation الأنبوب فعالة في تقديم CRISPR/Cas9 RNP وssODNs إلى الأرانب والخلايا البشرية، مما أدى إلى تحرير الجينات دقيقة قوية (PGE). والفرق الأساسي بين TE والأجهزة الكهربائية التقليدية الأخرى هو استخدام أنبوب، الذي اثنين من الأقطاب الكهربائية هي على أعلى وأسفل الأنبوب ويتم تحميل العينة في كامل ثم مختومة على electroporation (الشكل 1). وعلى النقيض من ذلك، في كوفيت التقليدية، والأقطاب الكهربائية على الجانبين والعينة ليست مختومة تماما خلال electroporation. هذا التصميم الجديد يقلل من توليد فقاعة الهواء ويضغط حجم فقاعة الهواء، مما يحسن بالتالي توزيع حتى من الجهد الكهربائي،ونتيجة لذلك يؤدي إلى انخفاض خلية الموت وارتفاع كفاءة ترانسفيكشن 9. في العمل الحالي، معدلات عالية من الناتج الأدنى (15 في المائة إلى 37 في المائة) وتحققت استهداف EGFR، Mybpc3 وHBB الجينات في iPSCs الإنسان. وتتسق هذه النتائج مع تقرير سابق تحقق فيه ارتفاع معدلات الإصابة بالإصابة بالسرطان في الخلايا الجذعية البشرية9.
واستهدفت الطفرات المسببة للأمراض في الجينات IL2RG وSPR في خلايا الأرانب. في الآونة الأخيرة، تم إنتاج الأرانب IL2RG-knockout كنماذج لنقص المناعة البشري المرتبط بX (SCID-X1)16،17. ويبين العمل الحالي أن طفرات المريض IL2RG (على سبيل المثال، C231Y و Q235X) يمكن أن تولد بكفاءة في خلايا الأرانب، مما يدل على جدوى إنشاء نماذج الأرانب SCID-X1 تحمل طفرات المريض. وقد ثبت أيضا أن طفرات SPR R150G يمكن إنشاؤها بكفاءة في خلايا الأرانب. هذه الطفرة تسبب العجز في الحركية والمعرفية لدى الأطفال12. هذه IL2RG ونماذج الأرانب طفرة SPR, بمجرد توليدها, قد تكون بمثابة نماذج قيمة قبل السريرية للدراسات الترجمة. ويمكن أيضا أن تستخدم لإنشاء العلاجات القائمة على تحرير الجينات لهذه الأمراض أحادية المنشأ.
أحد الاهتمامات لتطبيقات تحرير الجينات التي يتم بوساطة CRISPR/Cas9 هو أحداث التحرير خارج الهدف. تم تحليل معدلات Indel في المواقع المتوقعة خارج الهدف لsgRNAs المستخدمة في هذه الدراسة (الجدولS1)،وذلك باستخدام الأساليب الموصوفة سابقا9. في المجموع، تم تحليل سبعة المواقع المحتملة خارج الهدف لSG-RB-IL2RG-01، وخمسة لSG-RB-SPR، وسبعة لSG-hEGFR، وخمسة لSG-hMybPC3، وسبعة لSG-HHBB)، وذلك باستخدام التمهيديات المدرجة في الجدول S2. لم يتم الكشف عن أي indels خارج الهدف من قبل الاختبارات T7E1 (الشكلS1)،مما يشير إلى الحد الأدنى من المخاطر خارج الهدف لتحرير الجينات CRISPR/Cas9 بوساطة باستخدام هذه sgRNAs. كما يشير إلى أن طريقة electroporation الأنبوبية نفسها لا تسبب أو تزيد من الإنفـاضات خارج الهدف. ومع ذلك، ينبغي تكريس الجهود للحد من الإنصات غير المرغوب فيها أو القضاء عليها. وقد يكون تسلسل الجينوم الكامل ضروريالاستبعاد مثل هذه الأحداث بالنسبة للخلايا التي يقصد استخدامها في التطبيقات السريرية.
على المستوى التقني، تعتبر العوامل الرئيسية التالية لتحقيق كفاءة تحرير الجينوم الدقيق بواسطة كريسبر/Cas9 RNP أنبوب الكهربائي. أولاً، ينصح باختيار sgRNA فعالة مع توقعات منخفضة خارج الهدف المحتملة. من المهم التحقق من فعالية indel من sgRNA المحددة قبل استخدامه لتطبيقات PEG. ليس من النادر أن برنامج تنبأ SgRNA جيدة فشل في خطوة التحقق من الصحة.
ثانيا، لتحقيق ارتفاع PGE، فمن المستحسن للحث على طفرة PAM إلى المتبرع ssODN كلما كان ذلك ممكنا. والأساس المنطقي لذلك هو أن إعادة القطع بعد إدماج نموذج المانحين قد تم منعها من ذلك. في بعض الحالات، PGE نفسها يدخل طفرات PAM. في حالات أخرى، من الممكن إدخال طفرات صامتة إلى تسلسل PAM. في حالة عدم إمكانية حدوث طفرة في PAM، ينصح بمحاولة تضمين العديد من الطفرات الصامتة في المتبرع الذي يتوافق مع تسلسل sgRNA.
ثالثا، لا سيما ذات الصلة لTE، من المهم تجنب تشكيل فقاعات الهواء عند نقل الخلايا وخليط RNP إلى أنبوب electroporation. في حين أن تصميم أنبوب TE يقلل بالفعل تشكيل فقاعة الهواء، والتعامل مع دقيق سوف يقلل أكثر وربما حتى إكمال تجنب تشكيل فقاعة الهواء. وهناك دليل اطلاق النار مشكلة للمشاكل المتكررة التي قد تكون واجهتفي تطبيق أنبوب الكهربائي لكريسبر/ Cas9 ribonucleoprotein بوساطة تحرير الجينات الدقيقة في الجدول 2.
في الختام، ثبت هنا أن أنبوب الكهربائي وسيلة فعالة لتسليم كريسبر/ كاس9 RNP وssodns إلى خلايا الثدييات لتحقيق معدلات عالية PGE. قد تسهل تقنية TE الجديدة هذه ومعدل تحرير الجينات الدقيق القوي تطوير تطبيقات تحرير الجينات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (R21OD023194 إلى JX). استخدم هذا العمل الخدمات الأساسية التي يدعمها مركز النماذج المتقدمة للعلوم الترجمة والعلاجات (CAMTraST) في المركز الطبي لجامعة ميشيغان.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
| Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
| DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
| Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
| Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
| Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
| Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
| mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
| PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
| Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
| Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
| Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
| Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
| Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
| Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
| Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
| Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Miller, J. B., et al. Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).
- Finn, J. D., et al. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Liang, C., et al. Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma. Biomaterials. 147, 68-85 (2017).
- Luo, Y. L., et al. Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles. ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).
- Wang, H. X., et al. Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).
- Xu, X., et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).
- Du, F., et al. Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).
- Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M., Adam, M. P., et al. . GeneReviews(R). , (1993).
- Friedman, J., et al., Adam, M. P., et al. . GeneReviews(R). , (1993).
- Hidaka, N., et al. Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).
- Ma, H., et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Song, J., et al. Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency. Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).
- Song, J., et al. Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting. Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).
