Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret præcis Genredigering ved Rørelektroporation

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59512
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret her er en protokol for effektiv CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret genredigering i pattedyrsceller ved hjælp af rørelektroporation.

Abstract

Genredigerende nukleaser, repræsenteret ved CRISPR-associeret protein 9 (Cas9), er ved at blive mainstream værktøjer i biomedicinsk forskning. Vellykket levering af crispr/Cas9 elementer i målcellerne ved transfektering er en forudsætning for effektiv genredigering. Denne protokol viser, at rørelektroporation (TE) maskine-medieret levering af CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), sammen med enkelt-strandede oligodeoxynucleotid (ssODN) donor skabeloner til forskellige typer af pattedyrceller, fører til robust præcise genredigeringshændelser. For det første blev te anvendt til at levere crispr/Cas9 RNP og ssodns til at fremkalde sygdomsfremkaldende mutationer i interleukin 2-receptor underenhed gamma (IL2RG)-genet og sepiapterin-reduktase (spr)-genet i kanin fibroblast celler. Præcise Mutations rater på 3.57% blev opnået som bestemt af bakteriel TA kloning sekvensering. Den samme strategi blev derefter anvendt i humane ipscs på flere klinisk relevante gener, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), myosin binding protein C, hjerte (Mybpc3), og hæmoglobin underenhed Beta (hbb). Konsekvent, meget præcise Mutations rater blev opnået (11.65%-37,92%) som bestemt ved dyb sekvensering (DeepSeq). Det nuværende arbejde viser, at rørelektroporation af crispr/Cas9 RNP repræsenterer en effektiv transfektering protokol til genredigering i pattedyrceller.

Introduction

CRISPR/Cas9 er den mest almindeligt anvendte programmerbare nuklease til genredigering. Det virker gennem enkelt guide RNA (sgRNA)-medieret anerkendelse af begge målsekvenser og en tilstødende protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens i genomet. Cas9-nukleasen genererer en dobbeltstrenget DNA-pause (DSB), der er placeret tre nukleotider opstrøms for PAM-sekvens1. Dsb'er repareres enten gennem fejlbehæftede ikke-homologe ende slutte (NHEJ) eller Homology-rettet reparation (HDR) veje. For at opnå præcis genredigering gennem HDR pathway, er donor skabeloner ofte leveres i form af plasmid DNA (pDNA) eller enkelt-strandede oligodeoxynucleotid (ssODN).

Crispr/Cas9 og sgrna kan leveres til cellerne i tre formater: ribonucleoprotein (RNP)-komplekset af Cas9 protein og grna2,3; Cas9 mRNA og sgrna4,5; eller plasmid DNA (pdna), der indeholder de nødvendige promotorer, drevet sgrna, og Cas9 kodning region6,7,8. Mange grupper har påvist, at når CRISPR/Cas9 leveres som RNP, overgår genredigeringen ofte de resultater, der opnås i pDNA-eller mRNA-formater, som kan tilskrives den meget mindre RNP-størrelse sammenlignet med nukleinsyre9. Desuden har det tidligere vist sig, at en roman tube elektroporation (TE) maskine er særligt effektiv i genredigering applikationer i flere celletyper9.

Præsenteret i det nuværende arbejde er en trin-for-trin protokol i at udnytte TE til levering af CRISPR/Cas9 RNP til pattedyrceller af forskellige arter på flere klinisk relevante loci. Denne roman te transfektering teknik og høj HDR sats fænomen kan finde brede anvendelser i biomedicinsk forskning.

Protocol

Alle dyre vedligeholdelses-, pleje-og brugs procedurer blev gennemgået og godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) ved University of Michigan.

1. klargøring af celler

  1. Erhverve Human iPSCs (ACS-1030) af den Amerikaner skrive kultursamling (ATCC). Kultur-iPScs på kunstig ekstravellulær matrix med feeder-fri cellekulturmedium (se tabel over materialer) i en cellekultur-inkubator (5% CO2 ved 37 °c) efter leverandørens anvisninger.
    1. 2 timer før transfection, behandle iPSCs med 10 μM Rho-associeret, coiled-spole indeholdende protein kinase (ROCK) inhibitor Y27632 (anvendelse af som reducerer apoptose af dissocierede menneskelige hiPSCs og øger overlevelse og kloning effektivitet af hiPSCs uden påvirker deres pluripotens).
    2. Når transfecting, dissociere iPSCs med celle løsrivelse løsning (Se tabel over materialer) til enkeltceller ved 37 °c i 5 min. Tæl celletallet.
  2. Etablere en kanin fibroblast cellekultur ved hjælp af en primær kultur af kanin øre hud vævsbiopsier, som tidligere beskrevet10.
    1. En 0,5 cm x 0,5 cm øre hud biopsi fås fra spidsen af kanin øret. Barber håret ud af ørevævet.
    2. Skyl 2x med Dulbeccos fosfatbuffer (DPBS) med 5% penicillin-streptomycin. Overfør ørevævet til en ny 6 cm vævskultur skål, og skær derefter vævet i små stykker (~ 1,0 mm x 1,0 mm). Tilsæt et par dråber føtal bovin serum for at forhindre, at vævet tørrer ud.
    3. Spred det strimlet væv til en 10 cm vævskultur skål, tilsæt derefter 10 ml kulturmedium. Kanin fibroblast celler dyrkes i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum. Læg vævskultur skålen i celle kulturens inkubator (5% CO2 ved 37 °c).
    4. Tre til fem dage efter plating, brug trypsin-EDTA til at fordøje celler ved 37 °C i 2 min. Tæl celletallet.

2. design og syntese af gRNAs og donor oligos

  1. For hvert gen, design guide RNA baseret på sekvensen af den målrettede søgsmåls ved hjælp af et online-værktøj (for eksempel < http://crispor.tefor.net/>).
  2. Indsæt i DNA-sekvensen af interesse.
  3. Vælg et genom og et protospacer-tilstødende motiv (PAM). Mulige guide sekvenser i input-DNA-sekvenser vil blive vist på outputsiden. Det anbefales at vælge gRNA med højere forventet effektivitet og lavere off-Target potentialer.
  4. Syntetisere DNA af en kommerciel sælger til overførsel grnas. Udfør in vitro-transkription af gRNA ved hjælp af et gRNA-syntese kit i henhold til producentens anvisninger.
  5. Rens gRNA ved hjælp af en RNA-rense mikrokolonne, der er inkluderet i gRNA-syntese sættet. Mål koncentrationen, og opbevar derefter gRNAs ved-80 °C.
  6. Design en ssODN-donor skabelon for hvert Mutations websted. Den ssODNs kan syntetiseres af kommercielle leverandører såsom IDT. Generelt er hver ssodn 120-160 nukleotider (NT) i længden, der består af 60-80 NT i den venstre homologi arm og 60-80 NT i den rigtige homologi arm. For at forhindre, at det redigerede DNA genfindes, bør der indføres en tavs mutation på PAM i ssODN, når det er muligt. CRISPR cut-stedet skal placeres så tæt på den tilsigtede genomiske ændring som muligt.

3. tube elektroporation af Cas9 RNP og ssODNs

  1. Forbered cellerne som beskrevet i afsnit 1.
  2. Resuspender 2-3 x 105 celler i 20 μl elektroporationbuffer. Pipette forsigtigt op og ned for at fremstille en enkelt cellesuspension.
  3. For Cas9 RNP transfection, premix 2 μg Cas9-NLS protein med 0,67 μg gRNA ved stuetemperatur (RT) for 10-15 min. Derefter blandes forsigtigt det dannede RNP-kompleks sammen med 2 μg ssODN med celler.
  4. Celle blandingen overføres til et 20 μL elektroporationsrør med Universal-fit pipettespidser, som leveres af rørelektroporationssættet. For at opnå bedre elektroporation, så prøv at undgå dannelsen af luftbobler under overførslen.
  5. Anbring elektroporationsrør i åbningen af elektroporatoren, og tryk på "go" for at afslutte. Følg producentens foreslåede parametre for hver celletype. For eksempel, for humane iPSCs og kanin fibroblast celler, er spændings sættet 420 V, og puls tiden er 30 MS. en vellykket elektroporation cyklus er indikeret af puls rapporten på displayet skærmen af elektro porator.
  6. Efter elektroporationen overføres de humane iPS-celler til 1 mL præ-warmed Y-27632-holdigt dyrkningsmedium, der er beskrevet i celle kulturdel. For kanin fibroblast celler overføres de til DMEM med 10% føtalt bovint serum.
  7. Pladen de resuspenderede celler til en brønd af en 12 brønd cellekultur plade.
  8. Skift kulturmediet hver dag. Y-27632 fjernes fra Human iPSC Culture medium 24 h post-elektro poration.

4. analyse af Genredigeringsevents

  1. Høst celler 72 h efter elektroporation. Fordøje celler fra kultur pladen ved hjælp af trypsin-EDTA til kanin fibroblast celler eller opløsning af celle løsrivelse til humane iPSCs. Efter centrifuge, resuspension celler med 350 mL lysis buffer (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA; pH 8,0, 10% SDS, tilsæt 20 μL 20 mg/mL proteinase K lager pr 1 mL lysis buffer), derefter inkube ved 55 °C natten.
  2. Udtræk genomisk DNA med phenol-chloroform ved hjælp af standardprocedurer.
  3. Amplify 100-200 BP DNA fragmenter indeholdende målrettet region ved hjælp af high-fidelity DNA Polymerase, derefter rense DNA fragmenter fra geler ved hjælp af et gel ekstraktions Kit eller direkte fra PCR produkter ved hjælp af en PCR SV mini kit.
  4. At bestemme genredigering effektivitet ved bakteriel koloni sekvensering, ubiquitinligase de oprensede PCR produkter i en pCR4-TOPO vektor ved hjælp af et TOPO TA kloning kit. Tilfældigt afhente bakterielle kloner, derefter sekvens skær ved hjælp af en universel sekvensering primer leveres af TOPO TA kloning kit.
  5. At bestemme genredigering effektivitet ved dyb sekventering, sende de rensede PCR produkter (~ 100-200 BP) fra trin 4,3 for crispr uancv sekvensering i en DNA sekventering kerne.

Representative Results

TE af Cas9 RNP og ssODNs til kanin fibroblast celler

Den samlede proces med TE-medieret levering af Cas9 RNP til pattedyrceller er illustreret i figur 1. Først blev C231Y-og Q235X-mutationer produceret i IL2RG-genet, og R150G-mutationen blev fremstillet i SPR-genet i kanin fibroblast celler. Tab af funktion mutationer i IL2RG og SPR gener er kendt for at forårsage primær immundefekt11 og motoriske og kognitive underskud12, hhv.

De specifikke sgRNA-designs er illustreret i figur 2a. De primere, der anvendes til at forstærke målregionerne, er anført i tabel 3. Sekvenser af ssODNs er vist i tabel 1. Genredigeringsatserne blev bestemt ved bakteriel TA-kloning (figur 2b). På IL2RG C231 locus, ud af de 28 kloner, der blev sekvenseret, en (3,57%) den præcise C231Y-mutation, fire (14,28%) gennemført indsættelse eller sletning (Indel) mutationer, og de resterende 23 (82%) var vildtype. På IL2RG Q235 locus, ud af de 27 kloner, der blev sekvenseret, to (7,41%) den nøjagtige Q235X-mutation, tre gennemførte Indel-mutationer (11,11%) og de resterende var vildtype. På SPG R150 locus, af de 20 kloner sekvenseret, fem (25%) den præcise R150G-mutation, 10 (50%) gennemførte mutationer, og de resterende var vildtype.

TE af Cas9 RNP og ssODNs til humane iPSCs

TE blev derefter brugt til at levere Cas9 RNP og ssODNs til humane iPSCs og målrette klinisk relevant loci i EGFR, Mybpc3 og HBB-gener. Punktmutationer i EGFR T790 proksimal-regionen giver resistens over for EGFR-tyrosinkinasehæmmere hos patienter med ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), der aktiverer mutationer af EGFR13. En frame Shift-mutation i exon 16 i Mybpc3 er impliceret i hypertrofisk kardiomyopati14. E6V-punkts mutationen i HBB-genet fører til seglcellesygdom15.

De specifikke sgRNA-designs er illustreret i figur 3a. De primere, der anvendes til at forstærke målregionerne, er anført i tabel 3. Sekvenser af ssODNs er vist i tabel 1. Genredigeringsatserne blev bestemt af DeepSeq (figur 3b). På EGFR locus, 15,68% af alleler transporteres præcis punktmutationer (6.315 læser), 22,75% båret Indel mutationer (9.162 læser), og de resterende 61,57% var vildtype (24.797 læser). På Mybpc3 locus, 37,92% båret den præcise 4-BP TGAA sletning (11.654 læser), 2,24% båret Indel mutationer (410 læser) og de resterende 59,84% var Wild-type (18.692 læser). På HBB locus, 11,65% båret den nøjagtige E6V mutation (6.565 læsninger), 23,35% båret Indel mutationer (13.163 læser) og de resterende 65% var vildtype (36.644 læser).

Figure 1
Figur 1: flow diagram af rørelektroporation af Cas9 RNP.

Figure 2
Figur 2 : Genredigering af kanin fibroblast celler. (A) illustration af målsekvenser. Kasserne angiver målrettede loci. Understregede bogstaver svarer til gRNA-sekvenser. Røde, farvede bogstaver indikerer PAM-sekvenser. B) at klon resultaterne af genredigeringsarrangementer. Kasser angiver præcist muteret loci. Den viste Indel-sekvens er kun repræsentativ for én allel-type. Andre Indel-sekvenser vises ikke. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Genredigering af humane iPSCs. (A) illustration af målsekvenser. Kasserne angiver målrettede loci. Understregede bogstaver svarer til gRNA-sekvens. Røde, farvede bogstaver indikerer PAM-sekvenser. (B) deepseq-resultater af genredigeringshændelser. Kasser angiver præcist muteret loci. Røde, farvede bogstaver indikerer tavse mutationer, der blev introduceret i donor skabelonerne. Den viste Indel-sekvens er kun repræsentativ for én allel-type. Andre Indel-sekvenser vises ikke. Klik her for at se en større version af dette tal.

Locus Oligo-sekvens
 
(målrettet mutation)
Kanin IL2RG (C231Y) AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT
GAATGGAGK-KÅRNESKAFAKKAĞCFAKATURI
Kanin IL2RG (Q235X) AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT
GAATGGAGK-KÅRNESKAFAKKAĞCFAKATURI
Kanin SPR gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg
cgctgtac
(R150G)
Human EGFR ACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCTACAGTCCAACTGATTACCC
TCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGRAKACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTAC
(Punktmutationer umiddelbare til T790)
Human Mybpc3 GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA
GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT
(4-BP sletning)
Human HBB TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC
Har du ikke mere at fordybe dig i, når du er på toppen af en
E6V

Tabel 1: sekvenser af ssODNs.

Trin Problem Mulige årsager Løsninger
2,1 af Lav Indel-rate Dårlig guide RNA design, guide RNA bestande > 6 måneder, lav guide RNA koncentration Redesign guide RNA, producere/bestille ny guide RNA.
2,3 af Lav PGE-effektivitet dårligt donor-DNA-design, lav effektiv guide-RNA, forkert mængde donor-DNA eller dårlig DNA-kvalitet Forøg homologi arm længde, introducere PAM mutation, introducere tavse mutationer til donor DNA, bruge en mere effektiv guide RNA, Optimer forholdet mellem Cas9 protein over guide RNA.
3,4 af Mislykket transfektering Luftbobler dannet under overførsel af celler-buffer blanding til elektroporation rør, forkert spænding/varighed indstilling Prøv at undgå dannelsen af luftbobler, justere spænding/varighed indstilling.
3,6 af lav cellelevedygtighed efter elektroporation Lav overlevelse af enkelt Human IPSC Tilsæt ROCK-hæmmer efter elektroporation, Øg antallet af celler.
4,1 af Mislykket PCR Højt indhold af GC eller gentagen sekvens Optimer PCR-tilstanden, Tilføj DMSO til PCR-system.

Tabel 2: fejlfindingsvejledninger til hyppige problemer.

Navn på primer Sekvens Bemærk
RB-IL2RG-F CATGACAGTGACAGGGTCCC Til forstærkning af kanin IL2RG DNA-fragment
RB-IL2RG-R TGCCAGAGACACAAGCGAAC
RB-SPR-F Fra Aalborg, Arhus, land Til forstærkning af kanin SPR DNA-fragment
Ralle Af CTCAGCACCCTGACACTGGG
H-EGFR-F TGATGGCCAGCGTGGACAAC Til forstærkning af humant EGFR-DNA-fragment
H-EGFR-R Fra Aalborg, Arhus, lander
H-Mybpc3-F Af ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC Til forstærkning af humant Mybpc3 DNA-fragment
H-Mybpc3-R TCAGGGGAGCCAACCCTCAT
H-HBB-F TAACCTTGATACCAACCTGC Til forstærkning af humant HBB-DNA-fragment
H-HBB-R Af CATTTGCTTCTGACACAACT

Tabel 3: grundere anvendt i trin 4,3.

Discussion

Røret elektroporation metode var effektiv til at levere CRISPR/Cas9 RNP og ssODNs til kanin og humane celler, hvilket fører til robust præcis genredigering (PGE). Den primære forskel mellem TE og andre konventionelle elektro porationsanordninger er brugen af et rør, hvor to elektroder er på toppen og bunden af røret og prøven er lastet i fuld derefter forseglet ved elektroporation (figur 1). I modsætning hertil er elektroderne i en konventionel kuvette på siderne, og prøven er ikke helt forseglet under elektroporering. Dette nye design reducerer luftboble generation og komprimerer luftboble størrelse, som derfor forbedrer jævn fordeling af elektrisk spænding, og som et resultat fører til reduceret celledød og høj transfektering effektivitet9. I det nuværende arbejde er høje PGE rater (15%-37%) blev opnået med EGFR-, Mybpc3-og HBB-gener i humane iPSCs. Disse resultater er i overensstemmelse med en tidligere rapport, hvor der blev opnået høje PGE-rater i humane stamceller9.

Sygdomsfremkaldende mutationer blev rettet mod IL2RG og SPR-gener i kanin celler. For nylig, IL2RG-knockout kaniner er blevet produceret som modeller for humant X-linked svær kombineret immundefekt (scid-x1)16,17. Det nuværende arbejde viser, at patient IL2RG-mutationer (f. eks. C231Y og Q235X) kan genereres effektivt i kanin celler, hvilket demonstrerer gennemførligheden af at skabe SCID-x1 kanin modeller, der transporterer patient mutationer. Det blev også påvist, at SPR R150G mutationer kan oprettes effektivt i kanin celler. Denne mutation forårsager motoriske og kognitive underskud hos børn12. Disse IL2RG og SPR mutation kanin modeller, når de er genereret, kan tjene som værdifulde prækliniske modeller for translationelle undersøgelser. De kan også anvendes til at etablere genredigeringbaseret terapeutisk behandling af disse mono ogene sygdomme.

En bekymring for CRISPR/Cas9-medierede genredigering applikationer er off-Target redigering begivenheder. Indel-satserne blev analyseret på forudsagte top off-Target-lokaliteter for sgRNAs, der blev anvendt i dette studie (tabel S1), ved hjælp af metoder, der tidligere er beskrevet9. I alt blev syv potentielle top off-Target-loci analyseret for SG-RB-IL2RG-01, fem for SG-RB-SPR, syv for SG-hEGFR, fem for SG-hMybpc3 og syv for SG-hHBB) ved hjælp af de primere, der er anført i tabel S2. Ingen ikke-Target-indels blev afsløret af T7E1 analyser (figur S1), hvilket indikerer minimal risiko for ikke-Target-risici for crispr/Cas9-medieret genredigering ved hjælp af disse sgrnas. Det indikerer også, at røret elektroporation metode selv ikke forårsager eller øge off-Target redigeringer. Ikke desto mindre bør indsatsen være dedikeret til at reducere eller eliminere uønskede redigeringer uden for målgruppen. Sekvensering af hele genomet kan være nødvendig for at udelukke sådanne hændelser for celler, der er beregnet til anvendelse i kliniske anvendelser.

På det tekniske plan, er følgende betragtes som vigtige faktorer for at opnå effektiv præcis genom redigering af CRISPR/Cas9 RNP rør elektroporation. For det første anbefales det at vælge en effektiv sgRNA med forventet lav off-Target potentiale. Det er vigtigt at validere den Indel effektivitet af den valgte sgRNA før du bruger det til PEG applikationer. Det er ikke sjældent, at en software forudsagt god sgRNA mislykkes på valideringstrinnet.

For det andet, for at opnå høj PGE, anbefales det at fremkalde en PAM-mutation til ssODN donor, når det er muligt. Begrundelsen er, at ved at gøre det, CRISPR/Cas9 re-skæring efter donor skabelon integration er forhindret. I visse tilfælde introducerer PGE selv PAM-mutationer. I andre tilfælde er det muligt at introducere tavse mutationer i PAM-sekvensen. I tilfælde af at en PAM-mutation ikke er mulig, tilrådes det at prøve at inkludere flere tavse mutationer i donoren, der svarer til sgRNA sekvensen.

For det tredje, særlig relevant for TE, er det vigtigt at undgå dannelsen af luftbobler, når overførsel af celler og RNP blanding til elektroporation røret. Mens udformningen af en TE rør allerede minimerer luftboble dannelse, omhyggelig håndtering vil yderligere reducere og kan endda fuldføre undgå luftboble dannelse. En fejl skydning guide til hyppige problemer, der kan opstå i anvendelsen af røret elektroporation for CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein medieret præcis genredigering er angivet i tabel 2.

Afslutningsvis er det påvist her, at rørelektroporation er et effektivt middel til levering af CRISPR/Cas9 RNP og ssODNs til pattedyrceller for at opnå høje PGE satser. Denne nye te transfektering teknik og dens robuste præcise genredigering sats kan lette udviklingen af genredigering applikationer.

Disclosures

J. C. arbejder hos Celetrix LLC, producent af røret elektroporator. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. Z., Y. E. C. og J. X. erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R21OD023194-JX). Dette arbejde udnyttede Core Services understøttet af Center for Advanced modeller for translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) på University of Michigan Medical Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase STEMCELL Technologies 792 Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. 
Cas9 Nuclease 3NLS IDT 1074182 Cas9 protein, first used in Step 3.3. 
DMEM Thermo Fisher 11965092 For cell culture, first used in Step 1.2.3. 
DPBS Thermo Fisher 1708075 For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. 
EDTA Lonza 51201 For making lysis buffer, first used in Step 4.1. 
Electroporation buffer Celetrix 13–0104 The electroporation buffer, first used in Step 3.2. 
Electroporation tubes Celetrix 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 The electroporation tube, first used in Step 3.4. 
Electroporator Celetrix CTX-1500A LE The tube electroporation machine, first used in Step 3.5
Fetal bovine serum Sigma Aldrich 12003C For cell culture, first used in Step 1.2.2. 
Forma CO2 Incubators Thermo Fisher Model 370 For cell culture, first used in Step 1.1. 
Gel Extraction Kit Qiagen 28115 For gel purification, first used in Step 4.3. 
Human  induced pluripotent stem cells American Type Culture Collection ACS-1030 Human iPSCs, first used in Step 1.1. 
Matrigel                            Corning 354277 Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. 
mTeSR 1 medium  STEMCELL Technologies 85850 Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. 
PCR SV mini GeneAll 103-102 For PCR product purification, first used in Step 4.3. 
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140163 For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. 
Phenol-chloroform Thermo Fisher 15593031 For DNA extraction, first used in Step 4.2. 
Precision gRNA Synthesis Kit Invitrogen A29377 For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. 
Proteinase K Solution Thermo Fisher AM2548 For DNA extraction, first used in Step 4.1. 
Q5 high-fidelity DNA polymerase NEB M0491 For PCR amplification, first used in Step 4.3. 
Sodium dodecyl sulfate Sigma Aldrich L3771 For making lysis buffer, first used in Step 4.1. 
TA Cloning Kit  Thermo Fisher K457502 For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. 
Tissue Culture Dish (10 cm) FALCON 353003 For cell culture, first used in Step 1.2.3. 
Tissue Culture Dish (12 well) FALCON 353043 For cell culture, first used in Step 3.7. 
Tissue Culture Dish (6 cm) FALCON 353004 For cell culture, first used in Step 1.2.2. 
Tris HCl Thermo Fisher BP1757-500 For making lysis buffer, first used in Step 4.1. 
Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200056 For cell digestion, first used in Step 1.2. 4.
Universal Fit Pipette Tips  Celetrix 14-0101 For electroporation, first used in Step 3.4. 
Y27632 LC Labs Y-5301 The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
  3. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  4. Miller, J. B., et al. Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).
  5. Finn, J. D., et al. A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
  6. Liang, C., et al. Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma. Biomaterials. 147, 68-85 (2017).
  7. Luo, Y. L., et al. Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles. ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).
  8. Wang, H. X., et al. Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).
  9. Xu, X., et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).
  10. Du, F., et al. Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).
  11. Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
  12. Friedman, J., et al. GeneReviews(R). Adam, M. P., et al. , (1993).
  13. Hidaka, N., et al. Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).
  14. Ma, H., et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).
  15. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  16. Song, J., et al. Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency. Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).
  17. Song, J., et al. Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting. Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).

Tags

Genetik genredigering CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein rørelektroporation oligodeoxynucleotid pattedyrceller
CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret præcis Genredigering ved Rørelektroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, L., Jang, L., Chen, J., Song,More

Ma, L., Jang, L., Chen, J., Song, J., Yang, D., Zhang, J., Chen, Y. E., Xu, J. CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59512, doi:10.3791/59512 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter