Summary
هنا نقوم بوصف اختبار نمو النباتات المائية لتحديد وجود الأنواع وتصور التوزيع المكاني للبكتيريا أثناء الاستعمار الأولي لجذور النباتات وبعد نقلها إلى بيئات نمو مختلفة.
Abstract
تشكل البكتيريا ميكروبيومات جذمور معقدة على شكل ميكروبات متفاعلة، وكائنات أكبر، والبيئة اللاأحيائية. في ظل الظروف المختبرية، يمكن أن يزيد استعمار الجذوسفير من قبل البكتيريا التي تعزز نمو النبات (PGPB) من صحة أو تطوير النباتات المضيفة بالنسبة للنباتات غير المستعمرة. ومع ذلك، في البيئات الميدانية، غالباً ما لا توفر العلاجات البكتيرية مع PGPB فوائد كبيرة للمحاصيل. أحد التفسيرات هو أن هذا قد يكون بسبب فقدان PGPB أثناء التفاعلات مع الميكروبات التربة الذاتية على مدى عمر النبات. وكان من الصعب تأكيد هذه الإمكانية، لأن معظم الدراسات تركز على الاستعمار الأولي بدلا ً من الإبقاء على PGPB داخل مجتمعات الجذمور. ومن المفترض هنا أن التجمع والتعايش والحفاظ على المجتمعات البكتيرية تتشكل من خلال السمات الحتمية للبيئة الدقيقة الجذمورفيس، وأن هذه التفاعلات قد تؤثر على بقاء PGPB في البيئات الأصلية. لدراسة هذه السلوكيات، يتم تحسين اختبار نمو النبات المائي باستخدام أرابيدوبسي ثاليانا لتحديد وتصور التوزيع المكاني للبكتيريا خلال الاستعمار الأولي لجذور النبات وبعد الانتقال إلى نمو مختلف البيئات. ثم يتم التحقق من إمكانية استنساخ هذا النظام وفائدته مع PGPB Pseudomonas simiaeالمدروسة جيدا . للتحقيق في كيفية وجود أنواع بكتيرية متعددة قد تؤثر على الاستعمار وديناميات الصيانة على جذر النبات، مجتمع نموذجي من ثلاث سلالات بكتيرية (Arthrobacter، Curtobacterium،وMicrobacterium الأنواع) معزولة أصلا من تم بناء الجذمورفيس الثاليا. ويتضح أن وجود هذه الأنواع البكتيرية المتنوعة يمكن قياسه باستخدام هذا الفحص المائي للنباتات والتيار اللاين، الذي يوفر بديلا ً للدراسات المجتمعية البكتيرية القائمة على التسلسل. قد تحسن الدراسات المستقبلية التي تستخدم هذا النظام فهم السلوك البكتيري في الميكروبيوم النباتية متعددة الأنواع مع مرور الوقت وفي الظروف البيئية المتغيرة.
Introduction
تدمير المحاصيل من الأمراض البكتيرية والفطرية يؤدي إلى انخفاض إنتاج الأغذية ويمكن أن تعطل بشدة الاستقرار العالمي1. استنادا ً إلى اكتشاف أن الميكروبات في التربة المثبطة هي المسؤولة عن زيادة صحة النبات2،سأل العلماء ما إذا كان يمكن الاستفادة من ميكروبيوم النبات لدعم نمو النبات عن طريق تعديل وجود ووفرة خاصة [ترجم للعربية ] البكتيريا التي تم العثور عليها للمساعدة في نمو النبات أو التنمية تسمى مجتمعة البكتيريا التي تعزز نمو النبات (PGPB). وفي الآونة الأخيرة، تحولت الدراسات من مجرد تحديد PGPB المحتملة إلى فهم كيف أن التفاعلات بين الممالك في التربة، حول الجذور، أو في الغلاف الجذي (المنطقة المحيطة مباشرة بما في ذلك سطح الجذر) قد تؤثر على PGPB النشاط4.
يمكن للاستعمار Rhizosphere من قبل PGPB زيادة الصحة أو تطوير النباتات المضيفة استجابة لعوامل الإجهاد المتنوعة بالنسبة للنباتات غير المستعمرة5. ومع ذلك، غالباً ما تكون النتائج أكثر تغيراً في ظروف التربة الأصلية مقارنة بتلك التي لوحظت في الدفيئة والمختبرات التي يتم التحكم فيها عن كثب6. فرضية واحدة لهذا الاختلاف هو أن نمو أو سلوك PGPB قد تكون تمنعها بكتيريا التربة الأصلية أو الفطريات في الحقول7،8. الآثار المفيدة من قبل بكتيريا جذمور تعتمد عموما على قدرة البكتيريا إلى 1) تحديد موقع والتحرك نحو الجذر، 2) استعمار الجذر من خلال تشكيل biofilm، و 3) التفاعل مع النبات المضيف أو مسببات الأمراض عن طريق إنتاج جزيء صغير الأيض7،9. أي من هذه السلوكيات الاستعمارية قد تتأثر بوجود ونشاط الميكروبات المجاورة10.
قمنا بتصميم نظام لتحديد وتصور هذه المراحل الاستعمارية البكتيرية المتميزة من الجذمورسفير (الشكل1). ومن شأن هذا النهج أن ييسر الدراسات التي تحقق في سبب عدم ملاحظة صيانة الـ PGPB الطويلة الأجل في بعض الأحيان بعد نقل النباتات إلى بيئات جديدة، مثل زراعة الشتلات قبل التلقيح. تم اختيار أرابيدوبسي ثاليانا كنموذج نباتي نظراً لاستخدامه الواسع في الدراسات المختبرية وكذلك البيانات الوافرة المتاحة عن تفاعلاته الميكروبية11. هناك ثلاث مراحل في النظام: 1) A. تاليانا النمو، 2) الاستعمار البكتيري، و 3) الصيانة البكتيرية (انظر الشكل1). لأن A. thaliana هو نبات أرضي، كان من المهم التأكد من أنه لا يعاني من الإجهاد المائي لا مبرر له في النظام المائي12. مستوحاة من الأساليب المستخدمة من قبل هاني وآخرون13، وتزرع الشتلات على شبكة بلاستيكية لفصل تبادل لاطلاق النار من وسط النمو السائل. هذا النظام لا يبدو أن المساس بصحة وتطوير المضيف النبات، وأنه يحسن A. تاليانا النمو في السائل11. كما يطفو تبادل لاطلاق النار النبات فوق السطح، تتعرض الجذور تماما للاستعمار من قبل البكتيريا تلقيح في وسط النمو البكتيري السائل. وهذا يسمح للبكتيريا ذات الأهمية لفحصها للاستعمار في المواد الغذائية التي هي الأكثر ملاءمة للنمو، في حين تحول الظروف للسماح للنبات لمواصلة النمو في وسط المغذيات المصممة لدعم نموها. وتشمل كلتا المرحلتين الهز المستمر لمنع أنوكسيا من الجذر13. يمكن تصور البكتيريا أو قياسها كميامن جذور النبات بعد نقلها إما من وسط الاستعمار أو من وسط الصيانة. هذا النظام المائي مرنة جدا، مما يسمح الظروف التجريبية والضغوط المطبقة ليتم تغييرها بسهولة اعتمادا على مصالح الباحثين.
هذه الطريقة الموصوفة مهمة في سياق مجموعة أكبر من المؤلفات حول التفاعلات النباتية والميكروب لأنه يوفر نظام قوي لدراسة هذه التفاعلات على سطح الجذر في حين يجري أيضا للتخصيص لتفضيلات النمو من بكتيريا مختلفة. مختبرات البيولوجيا النباتية في كثير من الأحيان إجراء تجارب الاستعمار النباتات الميكروب على أجار الصلبة، مما يسمح لحركة المسطحة فقط (إذا كان ذلك) من البكتيريا في حين تتطلب أيضا التلاعب المدمرة المحتملة للنباتات خلال النقل اللاحقة. وعلى النقيض من ذلك، فإن مختبرات علم الأحياء الدقيقة أعطت الأولوية في كثير من الأحيان لصحة البكتيريا ضمن تجاربها، على حساب النباتات14،15. هذه الأولويات المختلفة للمختبرات التي تركز على النبات والميكروبيولوجيا جعلت تاريخيا من الصعب مقارنة النتائج بين هذه المجموعات، لأن كل عادة ما يحسن الظروف التجريبية لتحسين الكائن الحي من الفائدة15. نظام النمو النباتي العائم الشبكي الموصوف هنا يمنع الغمر النباتي الكامل، وهو ميزة ملحوظة للدراسات السابقة الموجهة نحو علم الأحياء الدقيقة، مع تحسين نمو البكتيريا وبقائها بشكل مؤقت لتسهيل الاستعمار. وهكذا، فإن التقييم الذي نعرضها هنا قد يعالج المخاوف من كل من علماء الأحياء النباتية (حول الإفراط في الترطيب والتلاعب عن طريق اللمس من النبات) مع تلبية معايير علماء الأحياء الدقيقة (السماح لظروف النمو البكتيرية المختلفة ومتعددة التفاعلات الأنواع)7. تم تصميم هذا البروتوكول ليكون قابلاً للتكيف مع مختلف البكتيريا والنباتات والظروف البيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم وصف الإعداد التجريبي للوضوح ويستخدم لإنشاء النتائج التمثيلية المضمنة في هذا التقرير ولكن يمكن تعديل الشروط كما هو مطلوب. وينبغي تنفيذ جميع الخطوات باستخدام معدات الوقاية الشخصية واتباع التريس المؤسسية والاتحادية للسلامة، وفقا لحالة BSL من البكتيريا المستخدمة.
1. توصيف البكتيريا
- تحديد مورفولوجيا البكتيريا على لوحة أجار متوسطة النمو. إعادة تعليق الخلايا في ODتقريبي 600 = 0.5 ولوحة حجم 1 μL على أجار المتوسطة للاختيار. إضافة X-غال إلى لوحات أجار إلى التركيز النهائي من 20 ملغ / مل للتمييز بشكل أفضل أفراد الفردية من المجتمع البكتيري محددة. تنمو في 24 درجة مئوية أو 30 درجة مئوية حتى تشكل المستعمرات، ثم التقاط الصور والملاحظات على مورفولوجيا المستعمرة.
- تحديد العلاقة بين الكثافة البصرية لكل سلالة بكتيرية وعدد CFU (وحدات تشكيل مستعمرة) لكل مل16. إعادة تعليق البكتيريا في 1 مل من الماء في لوحة 24 جيدا إلى OD تقريبي600 = 5، وأداء تخفيفات تسلسلية مزدوجة، ورصد OD600 من جميع التخفيفات، ولوحة كل لتحديد CFU قابلة للحياة / مل في كل عينة في كثافات بصرية متعددة.
- تحديد الحد الأقصى للتسامح سونيكيشن لكل سلالة البكتيرية. للقيام بذلك، خلايا aliquot في لوحة 24 جيدا تحتوي على وسط السائل، وحجز بعض الخلايا كعينة تحكم غير سونيكونت. باستخدام ultrasonicator مع مرفق القرن 24 غيض، وتطبيق ثلاث جولات من 12 ق من سونيكيشن في 40 أمبير مع 2 ق البقول.
ملاحظة: ينصح باستخدام ultrasonicator 24-well لتسهيل تعدد الإرسال المصب من عينات مصنع تجهيز، ولكن إذا كان أحد غير متوفر، واستخدام ultrasonicator مزودة microtip وأداء كل sonication عينة بشكل مستقل. دائما ارتداء earmuffs تصنيفها إلى ما لا يقل عن 25 NRR الحماية. - قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف للعينات الصوتية وغير الصوتية وبقعة على لوحات أجار. تحديد ما إذا كان هناك انخفاض في الخلايا القابلة للحياة بعد sonication. إذا كان الأمر كذلك، واستخدام عينة جديدة وتكرار خطوة sonication باستخدام انخفاض إجمالي وقت sonication أو السعة حتى العلاج ليس له تأثير على CFU النهائي / مل17.
2. إعداد شتلات التلايا العربية على شبكة بلاستيكية
- إنشاء أقراص من شبكة بلاستيكية باستخدام اللكم ثقب القياسية.
- جمع الأقراص في وعاء زجاجي مع غطاء فضفاض من رقائق الألومنيوم، وتعقيم باستخدام الأوتوكلاف تعيين إلى دورة جافة 20 دقيقة13.
- باستخدام ملاقط معقمة اللهب، توزيع ما يقرب من 40 أقراص شبكة معقمة في طبقة واحدة عبر سطح نبات النمو المتوسطة لوحة أجار. استخدام 0.5x موراشيج وسكوغ (MS) الأملاح، التي تحتوي على 500 ملغ / لتر من MES العازلة [2-(N-morpholino)حمض الإيثانسولفونيك] و 1.5٪ باكتو أجار، كوسيلة لنمو النبات، مع 50 ميكروغرام / مل بينوميليل وأضاف إلى الحد التلوث الفطري من الشتلات.
- إعداد بذور الفأس من A. thaliana كما سبق وصفها17.
- ضع ما يقرب من 100-300 بذور في كل منها في أنابيب الطرد المركزي الفردية في رف ووضعها في زجاج قابل لإعادة الإغلاق أو حاوية بلاستيكية ثقيلة ("جرة") في غطاء الدخان.
- توخي الحذر، وضع كوب من 100 مل من التبييض في جرة، إضافة 3 مل من حمض الهيدروكلوريك المركزة إلى التبييض، وختم على الفور جرة والسماح للأبخرة لتعقيم البذور لمدة 4 ساعة على الأقل.
- إزالة بعناية أنابيب البذور المعقمة من تحت جرة وختم.
- وضع اثنين من البذور في وسط كل شبكة. ختم لوحات مع الشريط الجراحي وحضانة لمدة 2-6 أيام في 4 درجة مئوية في الظلام لvernalize البذور.
- لإنبات الشتلات وزراعتها، ضع جانب أجار اللوحة في غرفة نمو النبات لمدة 8-10 أيام تحت إعدادات اليوم القصير: 9 ساعة من الضوء عند 21 درجة مئوية و15 ساعة من الظلام عند 18 درجة مئوية (الشكل1، الخطوة 2).
3. استعمار النباتات في متوسط النمو البكتيري السائل
- أضف 1 مل من النمو البكتيري إلى كل بئر من طبق معقم 24 بئر، باستثناء آبار التحكم الخاصة بوسائط الإعلام فقط. استخدام لينوكس لوريا مرق (10 غرام من التربتون، 5 غرام من مستخلص الخميرة، 5 غرام من NaCl) كوسيلة النمو البكتيري.
- نقل الشتلات الإنبات جزءا لا يتجزأ من شبكة من لوحات أجار إلى السائل (الشكل1، الخطوة 3أ).
- قشر بلطف شبكة تحتوي على اثنين من الشتلات الإنبات صعودا وقبالة لوحة أجار باستخدام ملقط اللهب المعقمة. اختيار شبكة مع الشتلات الحجم على قدم المساواة وغير التالفة.
- إذا كان الإزالة من أجار ليست على نحو سلس، وتجاهل تلك الشبكة والنبات. نقل تعويم واحد إلى كل بئر من السائل نمو البكتيرية، والجذر الجانب إلى أسفل.
- تلقيح البكتيريا في الآبار التي تحتوي على الشتلات العائمة.
- إعادة تعليق البكتيريا المزروعة بين عشية وضحاها على لوحات أجار إلى OD600 ما يعادل 108 كفو / مل في السائل المتوسط النمو البكتيري. إضافة 10 ميكرولتر من التعليق البكتيري إلى كل بئر للتركيز النهائي من 106 CFU البكتيريا في بئر.
- إذا إعداد مزيج من البكتيريا، وإعادة تعليق كل إلى OD600 ما يعادل 108 CFU / مل، ومزيج بنسب متساوية، وإضافة 10 ميكرولتر من المزيج النهائي لكل بئر من السائل.
- ختم لوحة للنمو المعقم. دون لمس الجانب لزجة، اضغط بعناية على الفيلم الغاز نفاذية عبر لوحة. تأكد من أن كل بئر قد تم ختمها بشكل فردي من خلال الضغط حول كل من الحلقات التي أدلى بها الآبار. استبدال غطاء من البلاستيك لوحة snuggly على لوحة والفيلم الغاز نفاذية (الشكل1، الخطوة 3b).
- احتضان لوحات لمدة 18 ساعة في غرفة نمو النبات، في ظل نفس الظروف كما تم إنبات الشتلات في الأصل، إلا على لوحة المدارية شاكر تعيين إلى 220 دورة في الدقيقة.
4- الحفاظ على الاستعمار البكتيري
- لشطف جميع العوامات (النباتات على شبكة)، إضافة 1 مل من الماء المعقم إلى الآبار من لوحة جديدة 24 جيدا. إزالة فيلم الغاز نفاذية. باستخدام ملقط معقمة، نقل العوامات إلى الآبار مع الماء (الشكل1، الخطوة 4أ). شطف عن طريق يستريح لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) دون إثارة.
ملاحظة: لتحديد كفاءة الاستعمار البكتيري للجذور بدلا ً من قدرتها على الحفاظ على الاستعمار مع مرور الوقت، يمكن التضحية بالنباتات في هذه الخطوة عن طريق نقلها مباشرة إلى الخطوة 5.1. - ملء الآبار من لوحة جديدة 24 جيدا مع 1 مل من متوسط نمو النبات. نقل شبكة واحدة إلى كل بئر. تغطية مع ختم الغاز نفاذية وحضانة لمدة 72 ساعة على شاكر لوحة المدارية في 220 دورة في الدقيقة في غرفة نمو النبات (الشكل1، الخطوة 4ب).
- كرر الفرّة كما تم تنفيذها في الخطوة 4.1 مع العوامات بعد فترة الحضانة 72 ساعة.
5. جمع البكتيريا لأعداد الخلايا القابلة للحياة
ملاحظة: يمكن تحديد عدد البكتيريا لكل جذر الشتلات في أي نقطة زمنية الحضانة. يمكن رصد الاستعمار بين 0 ساعة و 18 ساعة، في حين يمكن رصد الصيانة من 18 ساعة فصاعدا. ويمكن للنباتات الموجهة للتصوير أن تنتقل مباشرة إلى القسم 6.
- إزالة الشتلات من شبكة (الشكل1، الخطوة 5). وضع بلطف الملقط معقمة اللهب تحت الأوراق (ولكن على الجانب ورقة من شبكة)، وقرصة طفيفة الجذعية. هز الشتلات صعودا وبعيدا عن شبكة لطرد الجذر دون كسره. إذا كسر الجذر، كشط بلطف أسفل شبكة لجمع طول كامل.
- إزالة البكتيريا من جذور النبات. نقل البكتيريا إلى الآبار من لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل من ddH20. Sonicate العينات كما هو موضح في الخطوة 1.3.
ملاحظة: باستخدام المجهر، ابحث عن أي بكتيريا المتبقية على سطح الجذر على عينة سونيكاتد. إذا بقيت البكتيريا، قم بزيادة الوقت أو الكثافة الصوتية الإجمالية حتى لا تبقى البكتيريا مقيدة، حتى أعلى مستوى من سونيكيشن التي لا تؤثر على عدد الخلايا القابلة للحياة على النحو المحدد في القسم 1. - قياس البكتيريا على الجذور.
- تنفيذ تخفيف المسلسل 10 أضعاف العينات sonicated تصل إلى 10-6 تخفيف في المتوسطة النمو البكتيري. إضافة 50 درجة مئوية من كل تخفيف للوحات أجار الفردية وتنتشر مع الخرز الزجاجي المعقم (أو المفرش البكتيري). احتضان لوحات في درجة الحرارة المثلى للبكتيريا حتى المستعمرات الفردية يمكن عدها.
- مرة واحدة يمكن تمييزها، عد عدد كل مورفولوجيا مستعمرة (على النحو المحدد في القسم 1)، وحساب CFU من كل الأنواع البكتيرية لكل شتلة. تجاهل أي عينات تظهر التلوث، لأن التلوث أثناء الاستعمار أو الصيانة قد يؤثر على الوجود البكتيري.
6. جمع جذور النباتات سليمة للميكروسكوب
- باستخدام ملقط، قم بإزالة الشتلات من الشبكة كما هو الحال في القسم 5.
- نقل كل مصنع إلى الشرائح المجهر.
- ضع طرف الجذر على الشريحة واسحب بعيدا ً عن الطرف لتعيين الدفق مع الشريحة، مما يضمن وجود جذر مستقيم للحصول على أفضل تصوير. إضافة قطرة من الماء أو نمو النبات المعقمة المتوسطة إلى العينات لترطيب واجهات بين الأغطية والشرائح.
- ضع غطاء زجاجي فوق تاج الجذر مباشرة (أعلى منطقة محاصرة في الشكل1) وتحت أوراق التصوير لتجنب الميل من غطاء الغلاف (للسماح للتصوير تاج الجذر)، واضغط لأسفل بلطف17.
- إذا كنت تستخدم البكتيريا الفلورية، صورة باستخدام مرشحات الإثارة / الانبعاثات المناسبة للتمييز بين البكتيريا عن بعضها البعض وجذر النبات18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ومن المعروف أن PGPB P. simiae WCS417r تتميز جيدا لاستعمار جذور A. thaliana في الثقافة المائية. ويمكن بسهولة تصور هذه البكتيريا الفلورية الطبيعية باستخدام المجهر على جذورالشتلات بعد الاستعمار (الشكل 2). على الرغم من أنه من الممكن تصوير الطول الكامل لهذه الجذور الشتلات الثاليا (4-6 ملم) ، فإن القيام بذلك لكثير من النباتات سوف يستغرق كمية باهظة من الوقت. لأن معظم التباين عبر النقاط الزمنية وأنواع البكتيريا يمكن التقاطها عن طريق تصوير التاج، الأوسط، وطرف الجذر14 (المشار إليها من قبل مربعات حمراء في الشكل1)، تم إعطاء الأولوية لهذه المناطق للتصوير بدلا من تصوير الجذر الكامل اطوال. في الصور المشرقة من P. simiae-استعمار A. جذور thaliana (الشكل 2)، فمن الممكن لتصور الخطوط العريضة للجذور والشعر الجذر . ومع ذلك، في 18 ح من الاستعمار، فإنه ليس من الممكن التمييز بوضوح بين الجذور المستعمرة مقابل غير المستعمرة باستخدام صور حقل مشرق. في حين يعرض P. simiae autofluorescence، استخدمنا سلالة مصممة أيضا للتعبير عن بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP)19 مع الإثارة / الموجات الموجية الانبعاثات من 490-510/520-550 نانومتر18. وكان التكبير من 100X كافية لتحديد واضح المجاميع الفردية والصغيرة من خلايا P. simiae على جذور A. thaliana. كما هو مبين في الشكل 2، يمكن للمختبرات مع الوصول إلى المجاهر عالية الدقة أو المجاهر أقل تكلفة على سطح الطاولة تصور وجود وتوزيع البكتيريا على طول الجذر.
في حين أن الصور المجهرية مفيدة من حيث التوزيع المكاني، إلا أنها ليست مناسبة تماماً للقياس الكمي للخلايا البكتيرية. وهكذا جمعنا البكتيريا من سطح الجذور باستخدام ultrasonication كما هو موضح سابقا والتحقق من صحتها9،20. ثلاث جولات من 12 ق من ultrasonication21 في سعة 40 كانت كافية لتعطيل السطح الخارجي للشتلات الجذر (الشكلالتكميلي1) وإزالة جميع البكتيريا في حين لا تؤثر على الجدوى البكتيرية. تم استخدام Sonication بدلا من أساليب ضرب حبة9 لتعزيز أفضل تشتت المجاميع البكتيرية / biofilms. قياس CFU / الجذر بعد 18 ساعة من الاستعمار و72 ساعة إضافية من الصيانة أظهرت أن P. simiae على حد سواء يستعمر ويتم الحفاظ على جذور A. thaliana في لدينا المائية، ونظام الشتلات العائمة (الشكل3). وأظهر عدد CFU / الشتلات في أي من الوقت قابلية جيدة للاستنساخعبر عمليات التكاثر البيولوجية التي أجريت في أيام مختلفة (الشكل 3). والتباين الذي لوحظ شائع بين الاختبارات الاستعمارية الجذرية22، ومن المرجح أن يكون راجعاً إلى اختلافات طفيفة في التوقيت، أو الظروف البيئية، أو حجم جذر النبات، حتى بين الشتلات التي تنبت في نفس الوقت واختيرت لتكون مماثلة في الحجم. نلاحظ زيادة في عدد CFU / الشتلات بعد 72 ساعة في وسط الصيانة بالمقارنة مع الأرقام التي لوحظت في نقطة زمنية ما بعد الاستعمار 18 ح (الشكل3). وهذا يشير إلى النمو النشط للبكتيريا المستعمرة على جذر النبات وقعت خلال مرحلة الصيانة.
وبالإضافة إلى فائدة هذا التحاليل المائية لتحديد حجم الاستعمار البكتيري الفردي وصيانته، فإنه ينطبق أيضا على رصد ارتباط أنواع متعددة بجذور نباتية. ولإثبات ذلك، تم اختيار ثلاثة أنواع من البكتيريا المعزولة من A. thaliana المزروعة في التربة الطبيعية في ظل ظروف المختبر20. وكانت العزلات سلالات من النيكوتينوفوران اتردروبك، ميكروباكتريوم أوليفورانس، وكورتوباكتريوم oceanosedimentum23. وقد تم اختيار هذا المجتمع المبسط بسبب قدرة هذه الأنواع على التعايش في وسائل النمو البكتيري السائل في ثقافة الهز (بيانات غير منشورة). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تمييز هذه الأنواع الثلاثة بوضوح على وسائل الإعلام التي تحتوي على X-غال بسبب الاختلافات في مورفولوجيا المستعمرة واللون (الشكل4A). لا يؤثر X-gal على النمو النسبي لأي من هذه الأنواع البكتيرية (بيانات غير منشورة). هذه الاختلافات في مورفولوجيا وظهور مستعمرة على X-غال سمح لنا لحساب CFU / الشتلات من كل نوع دون اختيار المضادات الحيوية، حتى في الزراعة المشتركة متعددة الأنواع.
أ. نيكوتينوفوران، M. oleivorans، وC. oceanosedimentum تم استعمارها والحفاظ عليها على الجذر، سواء بمفردها أو في الثقافة المشتركة البكتيرية (الشكل4B). وأظهرت كل نوع اتجاهات متشابهة عبر مختلف الحالات البيولوجية والتقنية، حتى داخل المجتمعات المختلطة. وهذا يدل على أنه يمكن استخدام بروتوكول الفحص لقياس كل من CFU النسبي أو الكلي/جذر كل نوع. ومن المثير للاهتمام، عندما نمت وحدها، لم تظهر أي نوع من الأنواع الفردية زيادة ملحوظة في وفرة خلال مرحلة الصيانة، ولكن إجمالي CFU / جذر المجتمع مجتمعة زادت في الثقافات المشتركة، مما يدل على أن هذه البكتيريا لا تحظر استعمار سلالات أخرى.
لجميع التجارب، والنباتات المزروعة في وسائل الإعلام السائلة دون إضافة البكتيريا كما تم تضمين الضوابط السلبية دائما. لم تكن أي بكتيريا مرئية علىجذور التحكم هذه أثناء الفحص المجهري (الشكل 2)، كما لم يتم الكشف عن أي بكتيريا عن طريق الطلاء لCFU (البيانات غير المنشورة). وهذا يشير إلى أن تعقيم البذور واستخدام التقنيات المعقمة خلال هذا التحقيق كانت كافية للحفاظ على النباتات axenic ما لم يتم استعمارها عمدا.
الشكل 1: تحديد الاستعمار البكتيري والصيانة على جذور أ. ثاليانا. A. تم نقل شتلات الثاليانا المزروعة على شبكة بلاستيكية معقمة إلى متوسط النمو الأمثل للبكتيريا [هنا، 0.1 × LB (لوريا مرق) لينوكس]. ثم استعمرت البكتيريا الجذر أكثر من 18 ساعة في حين أن النبات طرحت في السائل الهز. بعد شطف، تم نقل تعويم المستعمرة إلى متوسط النمو الأمثل للنباتات (0.5x MS + MES) لمدة 72 ساعة لاختبار للحفاظ على البكتيريا على الجذور. ثم تم شطف الطفو، وتمت إزالة النبات مع أي الميكروبات المرفقة لتحليلها (القياس الكمي للCFU / الشتلات أو التصوير عن طريق الفحص المجهري). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصور P. simiae الاستعمار من الجذور مع المجهرية الفلورسنت. P. simiae (كاذبة اللون الأخضر) استعمار جذور A. thaliana وأبقى على الجذر بعد نقل إلى متوسط نمو النبات. يظهر تاج الجذر (يسار) ومنتصف الطول (الوسط) والطرف (إلى اليمين) عند التكبير 40 x من المناطق المشار إليها في الشكل 1. يُظهر الصفان العلويان الصور المضيئة والضوئية للجذور التي استعمرها P. simiae (التي تم تصويرها بواسطة الفحص المجهري الفلورسنت). كما تم تصوير نفس الجذور بواسطة مجهر مجهر (مركز صفين). السيطرة السلبية لا البكتيريا في الصفين السفليين أظهرت أي استعمار. قضبان مقياس تمثل 50 درجة.
الشكل 3: القياس الكمي لـ P. simiae على جذور A. thaliana. العدد الإجمالي للخلايا القابلة للحياة P. simiae المستردة في شتلة A. thaliana بعد 18 ساعة من الاستعمار أو 72 ساعة من الصيانة. وتظهر ثلاث عمليات تكرار بيولوجية فردية، يحتوي كل منها على ثلاثة نسخ تنسخ تقني لشتلتين لكل عوامة. الأرقام المعروضة هي الوسيلة من النسخ المتماثل التقنية، في حين تمثل الأشرطة أخطاء قياسية للوسائل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحديد الكمي للاستعمار والحفاظ على مجتمع بكتيري مختلط على جذور أ. ثاليانا. (أ) يمكن تمييز مستعمرات أ. نيكوتينوفوران، وإم أوليفوران، وC. oceanosedimentum على متوسط أجار يحتوي على X-gal بواسطة مورفولوجيا المستعمرة ولونها. (ب) تم تلقيح جذور شتلات عمرها 10 أيام بحوالي 3x105 CFU/mL من كل من السلالات الثلاث. وتظهر الشهيات الكلى التي تم استردادها من كل نوع من الأنواع بعد 18 ساعة من الاستعمار أو 72 ساعة من الصيانة عند استعمارها إما بمفردها أو في مجتمع بكتيري مكون من ثلاثة أعضاء. ويظهر نسختان بيولوجيتان، يتألف كل منهما من نسختين تقنيتين من شتلتين لكل عوامة. الأرقام المعروضة هي الوسيلة من النسخ المتماثل التقنية اثنين، في حين أن الأشرطة تمثل أخطاء قياسية من الوسائل . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: Ultrasonication يعطل سطح الجذر. لطرد البكتيريا من سطح الجذر، تم سونيكاتد النباتات كلها، وأطلقت البكتيريا في السائل، الذي تم تخفيفه بشكل تسلسلي ومطلي للقياس الكمي من CFU / الشتلات. (A) شتلة سليمة هو (B) تعطلت هيكليا بعد ultrasonication. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النباتات في جميع البيئات تتفاعل مع الآلاف إلى الملايين من البكتيريا المختلفة والفطريات5،7. ويمكن لهذه التفاعلات أن تؤثر سلبا وإيجابا على صحة النبات، مع ما قد يترتب على ذلك من آثار على غلة المحاصيل وإنتاج الأغذية. ويشير العمل الأخير أيضاً إلى أن الاستعمار المتغير للمحاصيل من جانب الـ PGPBs قد يفسر حجم النباتات وغلة المحاصيل التي لا يمكن التنبؤ بها في التجارب الميدانية22. فهم الآليات الكامنة وراء هذه التفاعلات قد يسمح لنا للتعامل مباشرة مع المجتمعات الميكروبية المرتبطة بالنبات للمساعدة في التنمية الصحية للنباتات، حتى تحت الضغط24.
لأن الاستعمار البكتيري للجذور وصيانتها في الجذمور أمر بالغ الأهمية للتفاعلات النباتية والميكروبات9، أردنا بناء نظام لتصور reproducibly وقياس هذه السلوكيات البكتيرية. هذا الماء، العائمة نظام نمو الشتلات يسمح للتصوير المجهري والقياس الكمي للسكان البكتيرية على جذور A. thaliana.
ويدمج تحليل التفاعل بين النبات والميكروبات الموصوف العناصر المفيدة للبروتوكولات التجريبية القائمة. واستندت طريقة الشبكة العائمة إلى طريقة هاني وآخرون13،التي قيست الاستعمار الأولي لـ P. simiae WCS417r على شتلات A. thaliana الساكنة العائمة. وعند تقييم هذا النظام، تم التحقق من الاستعمار القوي لجذور أ. ثاليانا من قبل P. simiae، على الرغم من استخدام وسيلة نمو مختلفة عن هاني وآخرون وشملت الهز المداري أثناء الاستعمار. إدراج الهز المداري خلال كل من الاستعمار والصيانة يسهل التفاعلات البكتيرية التي قد لا تحدث في الثقافة الثابتة، فضلا عن الحد من الظروف المؤكسدة التي يمكن أن تمنع كل من النمو البكتيري وصحة جذر النبات13. كما قمنا بدمج جوانب البروتوكولات التي تركز على علم الأحياءالدقيقة والمصممة لدعم استعمار جذور النباتات من قبل الأنواع البكتيرية المختلفة 8،15،25. وشمل ذلك خطوة نقل حاسمة للخروج من المتوسط الأمثل للاستعمار البكتيري وإلى وسط الأمثل لنمو النبات. هذا النقل إلى وسيلة جديدة سوف تسمح أيضا الآليات الكامنة وراء الصيانة البكتيرية على الجذور أن تبدأ في معالجة, نهج التي قد توفر رؤى في صيانة غير منتظمة من PGPB في التجارب الميدانية6.
وقد تم تحسين هذا التقييم للمعالجة السريعة لعينات متعددة للسماح باختبار المتغيرات البيئية والمجتمعات البكتيرية المختلطة ضمن عملية تكرار بيولوجية متعددة الآبار. في حين أن ultrasonication قد ثبت سابقا أن تكون كافية لاضطراب وجمع من البكتيريا جذمور، لوحة 24 جيدا ومتعددة الشق مرفق القرن يسرع معالجة العينة. ويمكن استكمال هذا النهج لحساب صلاحية الخلايا لتحديد الحضور البكتيري، أو توسيعنطاقه ليشمل، كيو بي سي بي آر أو MiSeq 16S rRNA التنميط الجين المجتمع لتحديد الوفرة النسبية للمجتمعات أكثر تنوعا من البكتيريا المستعمرة 20.وبالإضافة إلى ذلك، أثناء التصوير، يتم تسليط الضوء على فائدة التركيز على ثلاث مناطق فقط من كل جذر النبات لتسريع التصور من الوجود البكتيري والتوطين على الجذور. وقد تبين أن استعمار هذه المناطق الجذرية المختلفة يختلف بين الأنواع البكتيرية14. يمكن إجراء التصوير إما باستخدام بكتيريا الفلورسنت التلقائي بشكل طبيعي أو البكتيريا القابلة للجهاز الوراثي المصممة للتعبير عن بروتين الفلورسنت.
تسمح المنهجية الموضحة هنا بإجراء تقييم سريع وقابل للتكرار للاستعمار الجذري من قبل بكتيريا PGPB، ولكن هناك قيود على الاستنتاجات التي يمكن استخلاصها من هذه التجارب. على سبيل المثال، من المعروف أن قدرة البكتيريا على العلاج الكيميائي نحو الجذر مهمة بالنسبة للعديد من الأنواع البكتيرية 'استعمار جذور النباتات، ولكن هذه العملية قد لا تكون مطلوبة داخل هذا النظام التلقيح تهتز. ومع ذلك، بالنسبة للدراسات المهتمة على وجه التحديد في chemotaxis، يمكن تنفيذ خطوة الاستعمار في ثقافة السائل الساكنة أو على سطح وسيلة أجار لينة، حيث يمكن أن تكون مطلية البكتيريا بعيدا عن النبات، مما يتطلب منهم التحرك بنشاط نحو الجذر. وبالإضافة إلى ذلك، استُخدمت وسيلة نمو غنية نسبياً أثناء الاستعمار لتعزيز النمو البكتيري وارتباط النبات؛ غير أن هذه التركيزات العالية نسبياً من المغذيات قد تحظر فحص الاستخدام البكتيري للكربون المشتق من النباتات أو التنافس عليه أثناء الاستعمار. مرة أخرى، اعتمادا على متطلبات النمو من البكتيريا التي تجري دراستها، يمكن أن تختلف وسيلة الاستعمار لتناسب أفضل أسئلة البحوث الخاصة من الباحثين محددة.
تم تصميم هذا النظام ليكون قابلاً بسهولة لمختلف ظروف النمو البكتيري والنباتي وإضافة عوامل إجهاد بيئية مختلفة ونقاط زمنية مختلفة. ومع ذلك، فإن الأساليب الموصوفة هنا هي الأنسب لقياس التفاعلات البكتيرية مع جذور شتلات A. thaliana. وقد تم تحسين جمع لهذا النبات، والنباتات أكبر أو أكثر حساسية قد تكون مستعصية في نظام العائمة متعددة جيدا لوحة. وأخيرا، في حين أن البكتيريا ذات الفائدة المستخدمة هنا استعمار جذر النبات في الثقافة السائلة، للبكتيريا الأخرى قد يكون من الضروري لتلقيح جذور النبات عن طريق التلقيح تراجع أو الطلاء على أجار الصلبة المتوسطة بدلا من19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال صناديق البحوث التي قدمتها وزارة الطاقة للبحوث البيولوجية والبيئية (DOE-BER 0000217519 إلى E.A.S.)، والمؤسسة الوطنية للعلوم (INSPIRE IOS-1343020 to E.A.S). كما تلقى البرنامج الدعم من برنامج زمالات بحوث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم. نشكر الدكتور جيفري دانغل على توفير سلالات بكتيرية وبصيرة لا تقدر بثمن. نشكر الدكتور أندرو كلاين وماثيو ج. باورز على الاقتراحات التجريبية. وأخيراً، تود SLH أن تشكر الاتصالات على وسائل التواصل الاجتماعي لتذكيرنا بأن نشر العلم هو امتياز ومسؤولية، لا سيما من خلال وسائل خلاقة وسهلة المنال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
