Summary
Здесь мы описываем гидропонный план роста исследования для количественной оценки присутствия видов и визуализации пространственного распределения бактерий во время первоначальной колонизации корней растений и после их передачи в различных средах роста.
Abstract
Бактерии образуют сложные микрофлоры корневища, сформированные взаимомикробами, взаимодействующими, более крупными организмами и абиотической средой. В лабораторных условиях, порочносферная колонизация бактериями, стимулирующими рост растений (PGPB), может повысить здоровье или развитие растений-хозяев по сравнению с неколонизованных растений. Однако, в полевых условиях, бактериальные процедуры с PGPB часто не обеспечивают существенных преимуществ для сельскохозяйственных культур. Одно из объяснений заключается в том, что это может быть связано с потерей PGPB во время взаимодействия с эндогенными микробами почвы в течение срока службы растения. Эту возможность было трудно подтвердить, так как большинство исследований сосредоточены на первоначальной колонизации, а не поддержание PGPB в rhizosphere общин. Здесь предполагается, что сборка, сосуществование и поддержание бактериальных сообществ определяются детерминированными особенностями микросреды ризосферы, и что эти взаимодействия могут повлиять на выживание PGPB в родных местах. Для изучения такого поведения, гидропонный план роста анализа оптимизирован с помощью Arabidopsis thaliana количественно и визуализировать пространственное распределение бактерий во время первоначальной колонизации корней растений и после перехода к различным ростам Средах. Воспроизводимость и полезность этой системы затем проверяются с хорошо изученным PGPB Pseudomonas simiae. Чтобы исследовать, как наличие нескольких видов бактерий может повлиять на колонизацию и динамику обслуживания на корне растения, модель сообщества из трех бактериальных штаммов (Артробактерия, Куртобактерии, и Microbacterium , и Microbacterium видов) первоначально изолированы от A. thaliana rhizosphere построен. Показано, что присутствие этих разнообразных бактериальных видов может быть измерено с помощью этого гидропонного исследования растительного языка, который обеспечивает альтернативу секвенирования основе бактериальных исследований сообщества. Будущие исследования с использованием этой системы могут улучшить понимание бактериального поведения в многовидовых микробиомах растений с течением времени и в меняющихся условиях окружающей среды.
Introduction
Уничтожение сельскохозяйственных культур бактериальными и грибковыми заболеваниями приводит к снижению производства продуктов питания и может серьезно нарушить глобальную стабильность1. Основываясь на открытии, что микробы в подавляющих почвах несут ответственность за повышение здоровья растений2, ученые спросили, может ли микробиом растений быть использованы для поддержки роста растений путем изменения присутствия и изобилия частности бактериальных видов3. Бактерии, найденные для помощи в росте растений или развитии, коллективно называются бактериями, способствующими росту растений (PGPB). В последнее время исследования перешли от простого выявления потенциальных PGPB к пониманию того, как взаимодействие между царством в почве, вокруг корней, или в rhizosphere (область, непосредственно окружающая и в ключая корневую поверхность) может влиять на PGPB деятельность4.
Колонизация rhizosphere PGPB может увеличить здоровье или развитие растений хозяина в ответ на различные стрессоры по отношению к неколонизованных растений5. Однако, результаты часто более переменны в родных условиях почвы посравнению с теми, которые наблюдаются в тесно контролируемых тепличных и лабораторных условиях 6. Одна из гипотез для этого различия заключается в том, что рост или поведение PGPB может быть ингибирована родной почвенных бактерий или грибов в полях7,8. Благотворное воздействие rhizosphere бактерий обычно зависит от способности бактерий 1) найти и двигаться к корню, 2) колонизировать корень через биопленки формирования, и 3) взаимодействовать с принимающей растений или патогенов через производство малых молекул метаболитов7,9. Любое из этих колонизации поведения могут быть затронуты наличием и активностью соседних микробов10.
Мы разработали систему количественной оценки и визуализации этих различных этапов бактериальной колонизации ризосферы(рисунок 1). Этот подход облегчит исследования, исследующие, почему долгосрочное техническое обслуживание PGPB иногда не наблюдается после переноса растений в новые среды, например, во время посадки предварительно привитых саженцев. Arabidopsis thaliana, как были выбраны в качестве модели растений из-за его широкого использования в лабораторных исследованиях, а также достаточно данных о его микробных взаимодействий11. Есть три этапа в системе: 1. A. thaliana роста, 2) бактериальной колонизации, и 3) бактериального обслуживания (см. Рисунок 1). Поскольку А. Талиана является наземным растением, было важно, чтобы он не страдал неоправданным водным стрессом в гидропонной системе12. Вдохновленные методами, используемыми Haney et al.13,саженцы выращиваются на пластиковой сетке, чтобы отделить побег от жидкой среды роста. Эта система, как представляется, не ставит под угрозу здоровье и развитие хозяина растения, и это улучшает рост A. thaliana в жидкости11. Как завод стрелять плавает над поверхностью, корни полностью подвержены колонизации бактериями прививки в жидкой бактериальной среды роста. Это позволяет бактерии, представляющие интерес, которые будут рассмотрены для колонизации питательных веществ, которые являются наиболее благоприятными для роста, в то время как изменение условий, чтобы позволить заводу продолжать расти в питательной среде, предназначенной для поддержки его роста. Оба этапа включают устойчивое встряхивание, чтобы предотвратить аноксию корня13. Бактерии могут быть визуализированы или количественно из корней растений после передачи либо из колонизации среды или поддержания среды. Эта гидропоника очень гибкая, что позволяет легко изменять экспериментальные условия и прикладные напряжения в зависимости от интересов исследователей.
Этот описанный метод имеет важное значение в контексте более широкого тела литературы о растительно-микробных взаимодействий, поскольку он обеспечивает надежную систему для изучения этих взаимодействий на корневой поверхности, а также настраиваемый на предпочтения роста различных бактерий. Лаборатории биологии растений часто выполняют эксперименты по колонизации растений и микробов на твердом агаре, что позволяет проводить только планарное движение (если это) бактерий, требуя при этом потенциально разрушительных манипуляций растений во время последующей передачи. В отличие от микробиологических лабораторий часто приоритеты здоровья бактерий в рамках своих экспериментов, в ущерб растениям14,15. Эти различные приоритеты растений и микробиологии ориентированных лабораторий исторически затрудняет сравнение результатов между этими группами, так как каждый из них обычно оптимизирует экспериментальные условия для оптимизации их организм интересов15. Описанная здесь система плавающей сетки растений предотвращает полное погружение растений, что является заметным преимуществом для предыдущих исследований, ориентированных на микробиологию, а также временно оптимизирует рост и выживание бактерий для содействия колонизации. Таким образом, анализ, который мы представляем здесь, может решить проблемы как биологов растений (о чрезмерной гидратации и тактильных манипуляций завода), удовлетворяя при этом критериям микробиологов (с учетом различных условий роста бактерий и нескольких видовых взаимодействий)7. Этот протокол предназначен для адаптивной для использования с различными бактериями, растениями и условиями окружающей среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная настройка описывается для ясности и используется для генерации репрезентативных результатов, включенных в данный отчет, но условия могут быть изменены по желанию. Все шаги должны быть выполнены с использованием СИЗ и после институциональных и федеральных reccomendations для безопасности, в соответствии с статусом BSL бактерий, используемых.
1. Характеристика бактерий
- Определите морфологию бактерий на росте средней агарпластинки. Resuspend клетки на приблизительном OD600 и 0,5 и пластины 1 йЛ объем на агар среды выбора. Добавьте X-gal к пластинам агара к окончательной концентрации 20 мг/мл, чтобы лучше дифференцировать отдельных членов конкретного бактериального сообщества. Расти при 24 градусах или 30 градусах цельсия до тех пор, пока не образуются колонии, а затем фотографируйте и заметки о морфологии колоний.
- Определите корреляцию между оптической плотностью каждого бактериального штамма и количеством CFU (колоний формирования единиц) на мл16. Resuspend бактерий в 1 мл воды в 24-хорошая пластина к приблизительной OD600 и 5, выполнять двукратные серийные разбавления, контролировать OD600 всех разбавлений, и пластины каждый, чтобы определить жизнеспособный CFU / мл в каждом образце на несколько оптических плотностей.
- Определите максимальную тонкую тонкую сотовую устойчивость к каждому бактериально-бактериальном штамму. Для этого, аликвотные клетки в 24-ну хорошую пластину, содержащую жидкую среду, резервирование некоторых клеток в качестве незвукового контрольного образца. Используя ультразвуковой с 24-наконечником рога вложения, применять три раунда 12 с s sonication на 40 усилителя с 2 импульсов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 24-хорошо ультразвукового рекомендуется для облегчения вниз по течению мультиплексирования образцов обработки растений, но если один не доступен, использовать ультразвуковой оснащен микротип и выполнять каждый образец sonication самостоятельно. Всегда носите наушники с рейтингом не менее 25 NRR защиты. - Выполните 10-кратное серийное разбавление звуковых и незвуковых образцов и напрягайте на агар-пластинах. Определите, есть ли сокращение жизнеспособных клеток после sonication. Если это так, используйте свежий образец и повторить звуковой шаг, используя сокращенное общее время звукования или амплитуды, пока лечение не оказывает влияния на окончательный CFU/mL17.
2. Приготовление саженцев арабидопсиса талианы на пластиковой сетке
- Создавайте диски из пластиковой сетки с помощью стандартного перфоратора отверстия.
- Соберите диски в стеклянном контейнере с рыхлой крышкой из алюминиевой фольги, и стерилизовать с помощью автоклава набор 20 мин сухой цикл13.
- Используя стерилизованные пламя пинцеты, распределите около 40 стерилизованных сетных дисков в одном слое по всей поверхности агарной пластины растительного роста и среднего уровня. Используйте 0.5x Мурашиге и Skoog (MS) соли, содержащие 500 мг/л буфера МЧС (N-(N-morpholino)этанесульфоновая кислота» и 1,5% Бакто агар, как среда роста растений, с 50 мкг/мл беномила, добавленного к предельному грибковому загрязнению саженцев.
- Подготовка топорических семян A. thaliana, как ранее описано17.
- Поместите приблизительно 100-300 семян каждый в отдельные центрифуги труб в стойке и поместите в запечатываемый стеклянный или тяжелый пластиковый контейнер ("банк") в дым овой капот.
- Используя осторожность, поместите стакан 100 мл отбеливателя в банку, добавить 3 мл концентрированного HCl к отбеливателю, и немедленно запечатать банку и позволяют паров стерилизовать семена, по крайней мере 4 ч.
- Аккуратно удалите трубки стерилизованных семян из-под банки и уплотньте.
- Поместите два семена в центре каждой сетки. Печать пластин с хирургической лентой и инкубировать в течение 2-6 дней при 4 градусах по Цельсию в темноте, чтобы вперегалозировать семена.
- Чтобы прорасти и вырастить саженцы, поместите пластины агар стороны вниз в камере роста растений в течение 8-10 дней в короткие настройки дня: 9 ч света при 21 КК и 15 ч темных при 18 C(Рисунок 1, шаг 2).
3. Колонизация растений в жидкой бактериальной среде роста
- Добавьте 1 мл среды роста бактерий к каждой скважине стерильной 24-лукционистской пластины, за исключением только медиа-контрольных скважин. Используйте Леннокс Лурия Бульон (10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl) в качестве среды роста бактерий.
- Перенесите проросшие саженцы, встроенные в сетку из агарных пластин в жидкость(рисунок 1, шаг 3а).
- Аккуратно очистить сетку, содержащую две проросшие саженцы вверх и от агарпластинки с помощью пламени стерилизованных щипцы. Выберите сетку с одинаковой и неповрежденной рассадой.
- Если удаление из агара не является гладким, отбросить эту сетку и посадить. Передача одного поплавка к каждому колодцу бактериальной жидкости роста, корневой стороной вниз.
- Прививать бактерии в колодцы, содержащие плавающие саженцы.
- Resuspend бактерий, выращенных на ночь на агар пластины од600 эквивалентно 108 CFU/mL в бактериальной рост средней жидкости. Добавьте 10 зЛ бактериальной суспензии к каждой скважине для окончательной концентрации 106 бактерий CFU на скважину.
- При подготовке смеси бактерий, приложить каждый к OD600 эквивалент 108 CFU/mL, смешать в равных пропорциях, и добавить 10 злификатор апл окончательной смеси на хорошо жидкости.
- Печать пластины для стерильного роста. Не касаясь липкой стороны, тщательно нажмите газпроницаемой пленкой через пластину. Убедитесь, что каждая скважина была индивидуально запечатана, применяя давление вокруг каждого из колец, сделанных скважинами. Замените пластиковую крышку пластины snuggly над пластиной и газпроницаемой пленкой(Рисунок 1, шаг 3b).
- Инкубировать пластины на 18 ч в камере роста растения, при тех же условиях, как саженцы были первоначально прорастают, за исключением орбитальной пластины шейкер установлен до 220 об/мин.
4. Поддержание бактериальной колонизации
- Чтобы промыть все поплавки (растения на сетке), добавьте 1 мл стерильной воды в колодцы новой 24-хорошей пластины. Удалите газопроницаемую пленку. Используя стерильные щипцы, перенесите поплавки в колодцы с водой(рисунок 1, шаг 4а). Промыть, отдыхая в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) без возбуждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения эффективности бактериальной колонизации корней, а не их способность поддерживать колонизацию с течением времени, растения могут быть принесены в жертву на этом этапе, принимая их непосредственно к шагу 5.1. - Заполните скважины новой 24-хорошей пластины 1 мл среды роста растений. Передача одной сетки для каждого колодца. Накройте газопроницаемой уплотнением и инкубировать на 72 ч на вышейке орбитальной пластины при 220 об/мин в камере роста растения(рисунок 1, шаг 4б).
- Повторите промывку в шаге 4.1 с поплавками после инкубационного периода 72 ч.
5. Сбор бактерий для жизнеспособных клеточных отсчетов
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество бактерий на корень рассады может быть определено в любой момент инкубации. Колонизация может контролироваться между 0 ч и 18 ч, в то время как техническое обслуживание может контролироваться с 18 ч. Растения, предназначенные для визуализации, могут перейти непосредственно к разделу 6.
- Удалите саженцы из сетки(рисунок 1, шаг 5). Аккуратно поместите пламя стерилизованные щипцы ниже листьев (но на стороне листа сетки), и слегка щепотку стебля. Wiggle рассады вверх и вдали от сетки, чтобы выбить корень, не нарушая его. Если корень ломается, аккуратно соскребите дно сетки, чтобы собрать полную длину.
- Удалить бактерии из корней растений. Перенесите бактерии в скважины 24-колодской пластины, содержащей 1 мл дДГ20. Снотировать образцы, описанные в шаге 1.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используя микроскоп, ищите все оставшиеся бактерии на поверхности корня на звуковой образец. Если бактерии остаются, увеличить общее время sonication или интенсивность, пока не бактерии остаются связанными, до самого высокого уровня звуковой, что не влияет на жизнеспособные клетки рассчитывает как определяется в разделе 1. - Количественная оценка бактерий на корнях.
- Выполните серийные 10-кратные разбавления звуковых образцов до 10-6 разбавления в среде роста бактерий. Добавьте 50 кл. каждого разбавления в отдельные агарные пластины и распространяем с помощью стерильных стеклянных бусин (или бактериального распределителя). Инкубировать пластины при оптимальной температуре для бактерий, пока отдельные колонии подсчитываются.
- После того, как различимы, посчитать количество каждой колонии морфологии (как определено в разделе 1), и вычислить CFU каждого бактериального вида на рассаду. Откажитесь от любых образцов, показывающих загрязнение, так как загрязнение во время колонизации или технического обслуживания может повлиять на присутствие бактерий.
6. Сбор нетронутых корней растений для микроскопии
- Используя щипцы, снимите саженцы из сетки, как в разделе 5.
- Перенесите каждое растение на слайды микроскопа.
- Поместите кончик корня на слайдик и утащите от кончика, чтобы установить сбивать флеш с слайдом, обеспечивая выпрямленный корень для лучшей визуализации. Добавьте каплю воды или стерильные среды роста растений в образцы для гидратных интерфейсов между крышками и слайдами.
- Поместите стеклянный покрывало чуть выше корневой коронки (верхняя область в коробке на рисунке 1) и ниже побега листья, чтобы избежать наклона coverslip (для обеспечения корневой коронки изображения), и нажмите вниз мягко17.
- При использовании флуоресцентных бактерий, изображение с использованием соответствующих фильтров возбуждения / выбросов, чтобы дифференцировать бактерии друг от друга и корень растения18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хорошо охарактеризованный PGPB P. simiae WCS417r, как известно, колонизирует корни A. thaliana в гидропонной культуре. Это естественно флуоресцентные бактерии могут быть легко визуализированы с помощью микроскопии на корнях саженцев после колонизации (Рисунок 2). Хотя можно изображение полной длины этих A. thaliana саженцы (4-6 мм длины) корни, делая это для многих растений займет непомерное количество времени. Потому что большинство вариаций между тайм-пойнтами и видами бактерий могут быть захвачены путем визуализации короны, среднего и кончика корня14 (указанные красными ящиками на рисунке 1), эти регионы были приоритетными для визуализации, а не изображения полного корня Длины. На ярких полевых изображениях P. simiae-колонизированныхкорней A. thaliana (рисунок2) можно визуализировать контуры корней и корнеплодов; однако, в 18 ч колонизации, это не возможно четко дифференцировать колонизированные и неколонизированных корней с использованием ярких полевых изображений. В то время как P. simiae отображает автофлюоресценцию, мы использовали штамм, также разработанный, чтобы выразить желтый флуоресцентный белок (YFP)19 с возбуждением/длиной волн выбросов 490-510/520-550 нм18. Увеличение 100x было достаточно, чтобы четко определить индивидуальные и малые агрегаты клеток P. simiae на корнях A. thaliana. Как показано на рисунке 2, лаборатории с доступом либо высокого разрешения конфокальных микроскопов или менее дорогие скамейки микроскопов может как визуализировать наличие и распределение бактерий вдоль корня.
Хотя информативные с точки зрения пространственного распределения, микроскопии изображения не очень хорошо подходят для количественной оценки бактериальных клеток. Таким образом, мы собрали бактерии с поверхности корней с помощью ультразвуковой, как ранее описано и проверено9,20. Три раунда 12 с ультразвуковой21 при амплитуде 40 было достаточно, чтобы нарушить внешнюю поверхность корневых саженцев (Дополнительныйрисунок 1) и удалить все бактерии, не влияя на бактериальную жизнеспособность. Sonication был использован, а не бис-избиения методы9, чтобы лучше способствовать рассеивание бактериальных агрегатов / биопленок. Количественная CFU/root после 18 ч колонизации и дополнительного 72 ч обслуживания показала, что P. simiae и колонизируется и поддерживается на корнях A. thaliana в нашей гидропонной, плавающей системе рассады (Рисунок 3). Количество CFU/ рассады в любой из временных точек показали хорошую воспроизводимость через биологические репликации выполняются в разные дни(рисунок 3). Наблюдаемые изменения распространены среди корневых анализов колонизации22 и, вероятно, из-за незначительных изменений времени, условий окружающей среды или размера корней растений, даже среди саженцев прорастают в то же время и выбраны, чтобы быть похожими по размеру. Мы наблюдаем увеличение числа CFU / рассады после 72 ч в обслуживании среднего по сравнению с числами, наблюдаемыми на пост-колонизации 18 ч точечной точки(рисунок 3). Это указывает на активный рост колонизированных бактерий на корне растения, произошедший на стадии технического обслуживания.
В дополнение к полезности этого гидропонного контроля для количественной оценки индивидуальной бактериальной колонизации и технического обслуживания, это также применимо к мониторингу связи нескольких видов на корни растений. Для демонстрации этого были отобраны три вида бактерий, изолированных от A. thaliana, выращенных в естественной почве в лабораторных условиях. Изоляты были штаммы Arthrobacter nicotinovorans, Microbacterium oleivorans, и Curtobacterium oceanosedimentum23. Это упрощенное сообщество было выбрано из-за способности этих видов сосуществовать в жидкостных бактериальных носителях роста в тряске культуры (неопубликованные данные). Кроме того, эти три вида могут быть четко дифференцированы на носителях, содержащих X-гал из-за различий в колонии морфологии и цвета(рисунок 4A). X-gal не влияет на относительный рост любого из этих видов бактерий (неопубликованные данные). Эти различия в морфологии и появление колонии на X-гал позволило нам рассчитывать CFU / рассада каждого вида без отбора антибиотиков, даже в многовидовой кокультуры.
A. nicotinovorans, M. oleivorans, и C. oceanosedimentum были колонизированы и поддерживаются на корне, будь то только или в бактериальной кокультуры (Рисунок 4B). Каждый вид показал тенденции, которые были схожи по различным биологическим и техническим репликациям, даже в смешанных сообществах. Это свидетельствует о том, что протокол ассеа может быть использован для измерения как относительного, так и общего CFU/корня каждого вида. Интересно, что, когда выращивается в одиночку, ни один отдельный вид не показал заметное увеличение численности на стадии технического обслуживания, но общий CFU / корень комбинированного сообщества увеличилось в cocultures, указывая, что эти бактерии не запрещают колонизации других штаммов.
Для всех экспериментов, растения, выращенные в жидких носителях без добавления бактерий, как отрицательный контроль всегда были включены. Никакие бактерии не были видимы на этих корнях управления во время микроскопии(Рисунок2), ни были обнаружены любые бактерии через покрытие для CFU (неопубликованные данные). Это указывает на то, что стерилизации семян и использования стерильных методов во время этого анализа было достаточно, чтобы сохранить растения топором, если намеренно колонизированы.
Рисунок 1: Асссаи для бактериальной колонизации и поддержания на корнях A. thaliana. A. thaliana саженцы, выращенные на стерилизовой пластиковой сетке, были переведены в среду роста, оптимизированную для бактерий (здесь, 0,1 х LB (Luria Broth) Lennox). Бактерии затем колонизировали корень более 18 ч в то время как растение плавали в дрожащей жидкости. После промывока, колонизированный поплавок был перенесен в среду роста оптимизировандля для растений (0,5x MS и MES) для проверки на содержание бактерий на корнях. Поплавок затем промыть, и растение с любыми прикрепленными микробами было удалено для анализа (количественная оценка CFU/рассады или изображения с помощью микроскопии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Визуализация P. simiae колонизации корней с флуоресцентной микроскопией. P. simiae (ложного цвета зеленый) колонизировали корни A. thaliana и поддерживались на корне после перехода к среде роста растений. Корневая коронка (слева), средняя длина (в центре) и наконечник (справа) при 40-кратным увеличением показаны из областей, указанных на рисунке 1. Два верхних ряда показывают ярко-полевые и флуоресцентные изображения корней, колонизированных P. simiae (на фото эпифлуоресцентной микроскопией). Те же корни были также изображены конфопальный микроскоп (центр два ряда). Отрицательный контроль без бактерий в двух нижних рядах не показал колонизации. Шкала баров представляют 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Количественная оценка P. simiae на корнях A. thaliana. Общее количество жизнеспособных клеток P. simiae, извлеченных на рассаду A. thaliana после 18 ч колонизации или 72 ч технического обслуживания. Показаны три отдельных биологических реплика, каждая из которых содержит три технических репликации по две саженцы на поплавок. Цифры, показанные, являются средствами из технических репликатов, в то время как бары представляют собой стандартные ошибки средств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Количественная оценка колонизации и поддержание смешанного бактериального сообщества на корнях A. thaliana. (A) Колонии A. nicotinovorans, M. oleivorans, и C. oceanosedimentum могут быть дифференцированы на X-гал-содержащей агар среды колонии морфологии и цвета. (B) Корни 10-дневной саженцы были привиты приблизительно с 3x105 CFU/mL каждого из 3 штаммов. Показаны общие CFU / рассада восстановлены каждого вида после 18 ч колонизации или 72 ч обслуживания, когда колонизировали либо в одиночку или в трех членов бактериального сообщества. Показаны две биологические репликации, каждая из которых состоит из двух технических реплик по два саженца на поплавок. Цифры, показанные, являются средствами из двух технических повторов, в то время как бары представляют собой стандартные ошибки средств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Ультразвукация нарушает корневую поверхность. Чтобы выбить бактерии с поверхности корня, целые растения были sonicated, и бактерии были выпущены в жидкость, которая была последовательно разбавленной и покрынные для количественной оценки CFU / рассады. (A) Нетронутая рассада (B) структурно нарушается после ультразвуковой работы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Растения во всех средах взаимодействуют с тысячамии миллионами различных бактерий и грибов 5,7. Такое взаимодействие может оказать негативное и положительное воздействие на здоровье растений, что может оказать потенциальное воздействие на урожайность и производство продуктов питания. Последние работы также показывают, что переменная колонизация культур PGPBs может объяснять непредсказуемые размеры растений и урожайность в полевых испытаниях22. Понимание механизмов, лежащих в основе этих взаимодействий может позволить нам непосредственно манипулировать растений связанных микробных сообществ, чтобы помочь в здоровом развитии растений, даже в условиях стресса24.
Поскольку бактериальная колонизация корней и их содержание в rhizosphere имеет решающее значение для растительно-микробных взаимодействий9, мы хотели построить систему для воспроизводимой визуализации и количественной оценки этих бактериальных поведения. Эта гидропоника, плавающая система роста рассады позволяет микроскопические изображения и количественнобактерии бактериальных популяций на корнях A. thaliana.
Описанный анализ взаимодействия растительно-микробных интегрирует полезные элементы существующих экспериментальных протоколов. Метод плавающей сетки был основан на том, что из Haney et al.13, который измерил начальную колонизацию P. simiae WCS417r на статических, плавающих саженцах A. thaliana. При оценке этой системы была подтверждена сильная колонизация корней A. thaliana P. simiae, хотя была использована другая среда роста haney et al. и включала орбитальную тряску во время колонизации. Включение орбитальной тряски во время колонизации и технического обслуживания облегчает бактериальные взаимодействия, которые не могут произойти в статической культуре, а также уменьшить аноксические условия, которые могут препятствовать как рост бактерий и здоровья корней растений13. Мы также интегрировали аспекты микробиологии ориентированных протоколов, направленных на поддержку корневой колонизации растений различными бактериальными видами8,15,25. Это включало в себя важный шаг передачи из среды оптимизированы для бактериальной колонизации и в среду оптимизированы для роста растений. Этот переход на свежие среды также позволит механизмы, лежащие в основе бактериального обслуживания на корнях, чтобы начать рассматриваться, подход, который может обеспечить понимание неустойчивого поддержания PGPB в полевых испытаниях6.
Этот ассеи был оптимизирован для быстрой обработки нескольких образцов, чтобы обеспечить экологические переменные и смешанные бактериальные сообщества, которые будут асссированы в рамках одной многоскважины биологической репликации. В то время как ультразвуковая ранее была показана достаточна для нарушения и сбора rhizosphere бактерий, 24-хорошая пластина и многозубого рог вложения ускоряет обработку образцов. Этот подход расчета жизнеспособности клеток для количественной оценки бактериального присутствия может быть дополнен или расширен, чтобы включить, qPCR или MiSeq 16S rRNA генного профилирования сообщества для определения относительного изобилия более разнообразных сообществ колонизации бактерий 20. Кроме того, во время визуализации, полезно сосредоточиться только на трех регионах каждого корня растения, чтобы ускорить визуализацию бактериального присутствия и локализации на корнях подчеркивается. Колонизация этих различных корневых регионов, как было показано, отличается между бактериальными видами14. Изображение может быть выполнено либо с естественными автофлуоресцентными бактериями или генетически tractable бактерий инженерии, чтобы выразить флуоресцентный белок.
Описанная здесь методология позволяет быстро и воспроизводимую оценку корневой колонизации бактериями PGPB, но есть ограничения на выводы, которые можно сделать из этих экспериментов. Например, способность бактерий к химиотерапии к корню, как известно, имеет важное значение для колонизации многих бактериальных видов корней растений, но этот процесс не может потребоваться в этой системе тряски прививки. Тем не менее, для исследований, специально заинтересованных в химоксикологии, этап колонизации может быть выполнен в статической жидкой культуры или на поверхности мягкой среды агара, где бактерии могут быть покрыты удаленными от растения, требуя от них активно двигаться в направлении Корневой. Кроме того, относительно богатая среда роста во время колонизации была использована для содействия росту бактерий и привязанности растений; однако эти сравнительно высокие концентрации питательных веществ могут запрещать изучение бактериального использования или конкуренции за растительный углерод во время колонизации. Опять же, в зависимости от требований роста бактерий изучается, колонизации среды могут быть разнообразны, чтобы наилучшим образом удовлетворить конкретные вопросы исследования конкретных исследователей.
Эта система была разработана, чтобы быть легко поддается различных бактериальных и растительных условий роста и добавление различных экологических стрессов и временных точек. Тем не менее, описанные здесь методы лучше всего подходят для измерения бактериальных взаимодействий с корнями саженцев A. thaliana. Коллекция была оптимизирована для этого растения, и большие или более чувствительные растения могут быть неразрешимыми в плавающей многослойной системе. Наконец, в то время как бактерии интереса, используемые здесь колонизировать корень растений в жидкой культуре, для других бактерий может быть необходимо привить корни растений путем погружения-прививки или покрытие на твердой среде агар вместо19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана научно-исследовательскими фондами, предоставленными Департаментом энергетических биологических и экологических исследований (DOE-BER 0000217519 E.A.S.), Национальным научным фондом (INSPIRE IOS-1343020 e.A.S.). SLH также была поддержана Национальным научным фондом Стипендиат стипендий. Мы благодарим доктора Джеффри Дангл за предоставление бактериальных штаммов и бесценное понимание. Мы благодарим д-ра Эндрю Кляйна и Мэтью Джей Пауэрса за экспериментальные предложения. Наконец, SLH хотел бы поблагодарить связи в социальных сетях за напоминание нам о том, что распространение науки является привилегией и ответственностью, особенно с помощью творческих и доступных средств.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80?C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
