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Biochemistry

परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी स्तनधारी कोशिकाओं में Intracellular जस्ता पूल को मापने के लिए

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
* These authors contributed equally

Summary

सुसंस्कृत प्राथमिक या स्थापित कोशिका रेखाएँ सामान्यतः पशु मॉडलों का उपयोग करने से पहले एक प्रारंभिक दृष्टिकोण के रूप में मौलिक जैविक और यंत्रवादी प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोग की जाती हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे पूरे सेल निष्कर्षों और जस्ता (Zn) और परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ अन्य ट्रेस तत्वों के अध्ययन के लिए subcellular भागों तैयार करने के लिए ।

Abstract

संक्रमण धातुएँ जीवों के लिए आवश्यक सूक्ष्मपोषक होती हैं, लेकिन प्रोटीन में शारीरिक धातुओं के साथ प्रतिस्पर्धा और रेडॉक्स तनाव उत्पन्न करके उच्च सांद्रता में कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकती हैं । रोग की स्थिति है कि धातु की कमी या संचय के लिए नेतृत्व अलग मानव रोगों के कारण एजेंट हैं । कुछ उदाहरणों में एनीमिया, एक्रोडर्मेटाइटिस एन्टोपथानिका, और विल्सन और मेंक्स के रोग शामिल हैं । इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि उच्च संवेदनशीलता और सटीकता के साथ जैविक नमूनों में संक्रमण धातुओं के स्तर और परिवहन को मापने में सक्षम होना चाहिए ताकि अनुसंधान को सुविधाजनक बनाया जा सके कि कैसे ये तत्व सामान्य शारीरिक कार्यों में योगदान करते हैं और विषाक्तता. जस्ता (Zn), उदाहरण के लिए, कई स्तनधारी प्रोटीन में एक cofactor है, संकेत घटनाओं में भाग लेता है, और कोशिकाओं में एक द्वितीयक दूत है । अतिरिक्त में, Zn विषाक्त है और अंय धातुओं के अवशोषण को बाधित कर सकते हैं, जबकि घाटे में, यह संभावित घातक परिस्थितियों की एक किस्म के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

ग्रेफाइट फर्नेस परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (GF-आस) विभिंन जैविक नमूनों में Zn और अंय संक्रमण धातु सांद्रता का निर्धारण करने के लिए एक अत्यंत संवेदनशील और प्रभावी तरीका प्रदान करता है । GF के माध्यम से इलेक्ट्रोथर्मल कणिकायन-आस, ब्याज के तत्व के उत्तेजन की तरंगदैर्घ्य का उपयोग करते हुए परवर्ती चयनात्मक अवशोषण विश्लेषण के लिए नमूनों की छोटी मात्रा के परमाणुकरण द्वारा धातुओं की गणना करती है । बीयर-लैम्बर्ट नियम की रैखिकता की सीमा के भीतर, धातु द्वारा प्रकाश का अवशोषण, विश्लेषण के सांद्रण के समानुपाती होता है । Zn सामग्री का निर्धारण करने के अंय तरीकों की तुलना में, GF-आस दोनों स्वतंत्र और complexed Zn प्रोटीन में और संभवतः छोटे नमूनों की मात्रा में उच्च संवेदनशीलता के साथ छोटे intracellular अणुओं में पता लगाता है । इसके अलावा, GF-आस भी प्रेरणिकत: युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) या synchrotron आधारित एक्स-रे प्रतिदीप्ति से अधिक आसानी से सुलभ है. इस विधि में, एक GF-आस में विश्लेषण के लिए विभिंन संवर्धित सेल लाइनों के व्यवस्थित नमूना तैयार करने का वर्णन किया गया है । इस ट्रेस तत्व में भिंनता की तुलना सिद्धांत के प्रमाण के रूप में पूरे सेल lysates और proliferating और विभेदित कोशिकाओं के subcellular भागों में की गई थी ।

Introduction

संक्रमण और भारी धातुओं, जैसे Zn, Cu, Mn, और Fe, प्राकृतिक रूप से भोजन और प्रदूषकों में दोनों पोषक तत्वों में वातावरण में पाए जाते हैं । सभी जीवों को इन सूक्ष्म पोषक तत्वों की भिन्न मात्रा की आवश्यकता होती है । तथापि, जीवों के लिए उच्च स्तर का जोखिम हानिकारक है । धातु अधिग्रहण आहार के माध्यम से मुख्य रूप से है, लेकिन धातुओं भी सांस या त्वचा के माध्यम से अवशोषित किया जा सकता है1,2,3,4,5। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वायुमंडलीय कणों में धातुओं की उपस्थिति बढ़ रही है और स्वास्थ्य जोखिमों से काफी हद तक जुड़ी हुई है । मानवजनित कार्यकलापों के कारण, वायुमंडलीय विविक्त पदार्थ, वर्षा जल और मृदा6,7में भारी धातुओं जैसे कि ग, जैसे, सीडी, सीआर, एचजी, एनआई, एफई और पीबी के बढे़ हुए स्तरों का पता चला है । इन धातुओं के लिए आवश्यक शारीरिक ट्रेस तत्वों, विशेष रूप से Zn और Fe के साथ प्रतिस्पर्धा करने की क्षमता है, और वे जैविक प्रक्रियाओं के लिए मौलिक एंजाइमों निष्क्रिय द्वारा विषाक्त प्रभाव प्रेरित ।

ट्रेस तत्व zn रेडॉक्स तटस्थ है और जैविक प्रतिक्रियाओं, जो यह एक मौलिक cofactor में प्रोटीन तह और उत्प्रेरक गतिविधि के लिए आवश्यक बनाता है में एक लुईस एसिड के रूप में बर्ताव करता है 10% से अधिक स्तनधारी प्रोटीन8,9, 10; नतीजतन, यह विविध शारीरिक कार्यों8,11के लिए आवश्यक है । हालांकि, कई तत्वों का पता लगाने की तरह, वहां सामांय शारीरिक समारोह की सुविधा और विषाक्तता के कारण इन धातुओं के बीच एक नाजुक संतुलन है । स्तनधारियों में, zn कमियों एनीमिया के लिए नेतृत्व, विकास मंदता, hypogonadism, त्वचा असामान्यताएं, दस्त, खालित्य, स्वाद विकारों, जीर्ण सूजन, और बिगड़ा प्रतिरक्षा और न्यूरोलॉजिकल कार्यों11,12, 13,14,15,16,17,18। अतिरिक्त में, zn साइटोटोक्सिक और अन्य आवश्यक धातुओं के impairs अवशोषण जैसे तांबे19,20,21है ।

इसके अतिरिक्त, कुछ धातुओं जैसे घन और Fe के लिए हानिकारक प्रतिक्रियाओं में भाग लेने की क्षमता है । प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन fenton रसायन विज्ञान के माध्यम से (ROS) लोहा सल्फर क्लस्टर प्रोटीन की विधानसभा के साथ हस्तक्षेप कर सकते है और लिपिड चयापचय में परिवर्तन22,23,24। इस नुकसान को रोकने के लिए, कोशिकाओं धातु बाध्यकारी chaperones और ट्रांसपोर्टरों विषाक्त प्रभाव को रोकने के लिए उपयोग । निस्संदेह, धातु homeostasis कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए सुनिश्चित करें कि विशिष्ट कोशिका प्रकार धातुओं के उचित स्तर बनाए रखने के लिए । इस कारण से, वहां जैविक नमूनों में ट्रेस धातुओं के सटीक मापन के लिए तकनीकों अग्रिम करने के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है । विकसित और परिपक्व जीवों में सेलुलर स्तर पर तत्वों का पता लगाने के लिए एक विभेदक जैविक आवश्यकता है, विभिन्न विकासात्मक चरणों में, और सामान्य और रोग की स्थिति में. इसलिए, ऑर्गेनिमल मेटल होमियोस्टैसिस को समझने के लिए ऊतक और प्रणालीगत धातु स्तर का सटीक निर्धारण आवश्यक है ।

ग्रेफाइट फर्नेस परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोमेट्री (GF-एएएस) एक अति संवेदनशील तकनीक छोटे नमूना मात्रा के लिए प्रयोग किया जाता है, यह संक्रमण और जैविक और पर्यावरण के नमूनों में मौजूद भारी धातुओं को मापने के लिए आदर्श बना25,26 , 27 , 28. इसके अलावा, इस तकनीक की उच्च संवेदनशीलता के कारण, यह अच्छा परिवहन गुण Na+/k+-atpase और गैस्ट्रिक H+/K+-atpase xenopus का उपयोग एक मॉडल प्रणाली29के रूप में oocytes । जीएफ-एएएस में, नमूने के भीतर कणित तत्व, किसी प्रकाश स्रोत द्वारा उत्सर्जित विकिरण की तरंगदैर्घ्य को अवशोषित करते हैं जिसमें ब्याज की धातु होती है, अवशोषित विकिरण तत्व की सांद्रता के समानुपाती होते हैं । मौलिक इलेक्ट्रॉनिक उत्तेजना एक quantized प्रक्रिया में प्रत्येक रासायनिक तत्व के लिए अद्वितीय पराबैंगनी या दृश्य विकिरण के अवशोषण पर जगह लेता है. एक इलेक्ट्रॉन प्रक्रम में प़फ़ोटॉन के अवशोषण में इलेक्ट्रॉन निम्न ऊर्जा स्तर से उच्च स्तर तक गतिमान होकर परमाणु के भीतर होता है तथा जीएफ-एएएस नमूने द्वारा अवशोषित फोटॉनों की मात्रा का निर्धारण करता है, जो विकिरण अवशोषित करने की संख्या के समानुपातिक होता है । ग्रेफाइट ट्यूब में atomized तत्वों ।

इस तकनीक की चयनशीलता परमाणुओं की इलेक्ट्रॉनिक संरचना पर निर्भर करती है, जिसमें प्रत्येक तत्व में एक विशिष्ट अवशोषण/उत्सर्जन स्पेक्ट्रमी रेखा होती है । Zn के मामले में, अवशोषण तरंग दैर्ध्य २१३.९ एनएम है और ठीक अन्य धातुओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । कुल मिलाकर, GF-आस का पता लगाने की पर्याप्त सीमा (LOD) और उच्च संवेदनशीलता और चयनात्मकता25के साथ zn मात्रा को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अवशोषित तरंगदैर्घ्य में परिवर्तन को विशिष्ट एवं पृथक तरंगदैर्ध्य पर ऊर्जा अवशोषण की चोटियों के रूप में एकीकृत एवं प्रस्तुत किया जाता है । एक दिए गए नमूने में Zn की एकाग्रता आमतौर पर ज्ञात सांद्रता की एक मानक वक्र से बियर-Lambert कानून के अनुसार गणना की है, जिसमें अवशोषण सीधे नमूने में Zn की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है । हालांकि, बियर-लैम्बर्ट समीकरण को GF-एएएस विश्लेषणों पर लागू करने से कुछ जटिलताएं भी पेश होती हैं । उदाहरण के लिए, नमूनों के परमाणीकरण और/या गैर-समरूप सांद्रता में भिन्नता धातु मापन को प्रभावित कर सकती है ।

धातु atomization GF आस ट्रेस मौलिक विश्लेषण के लिए आवश्यक तीन बुनियादी कदम होते हैं । पहला कदम है, जहां तरल विलायक evaporated है, उजालीकरण है; भट्ठी के बाद शुष्क यौगिकों छोड़ना लगभग १०० डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुँचता है । फिर, यौगिकों उंहें ८०० से १,४०० डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग द्वारा vaporized है (तत्व के आधार पर विश्लेषण किया जा करने के लिए) और एक गैस बन जाते हैं । अंत में, गैसीय अवस्था में यौगिक १,५०० से २,५०० ° ब् तक के तापमान के साथ कणित होते हैं । के रूप में ऊपर चर्चा की, ब्याज की एक धातु की सांद्रता में वृद्धि GF द्वारा पता लगाया अवशोषण पर आनुपातिक वृद्धि प्रदान करेगा-आस, अभी तक भट्ठी विश्लेषण के गतिशील रेंज है, जो सांद्रता है कि हो सकता है की काम रेंज कम कर देता है यंत्र द्वारा निर्धारित । इस प्रकार, तकनीक कम सांद्रता और lod और बियर-lambert कानून के रैखिकता (योग्य) की सीमा का निर्धारण करके विधि के गतिशील रेंज के एक सावधान दृढ़ संकल्प की आवश्यकता है । LOD एक पदार्थ के लिए आवश्यक ंयूनतम मात्रा का पता लगाया जा करने के लिए, मैट्रिक्स में Zn के मानक विचलन के तीन गुना के रूप में परिभाषित किया गया है । योग्य अधिकतम एकाग्रता है कि बियर-Lambert कानून का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है ।

इस काम में, हम एक मानक विधि का वर्णन करने के लिए पूरे सेल निष्कर्षों में Zn के स्तर का विश्लेषण, साइटोप्लाज्मिक और परमाणु भागों, और proliferating और सभ्य कोशिकाओं में फर्क (चित्रा 1). हम नमूना तैयार करने के दौरान धातु हानि को रोकने के लिए विभिन्न सेलुलर प्रणालियों के लिए नाभिक प्रोटोकॉल के तेजी से अलगाव अनुकूलित. प्रयुक्त सेलुलर मॉडल थे प्राथमिक myoblasts से व्युत्पन्न माउस सैटेलाइट कोशिकाओं, murine neuroblastoma कोशिकाओं (N2A या Neuro2A), murine 3T3 L1 आडीपोसाइट, एक मानव गैर-ट्यूमर स्तन उपकला कोशिका रेखा (MCF10A), और उपकला Madin-डार्की कैनाइन गुर्दे ( MDCK) कोशिकाओं । इन कोशिकाओं को विभिंन प्रजातियों से स्थापित किया गया और विट्रो मेंधातु के स्तर के वंश विशिष्ट विविधताओं की जांच के लिए अच्छे मॉडल हैं ।

माउस सैटेलाइट सेलों से व्युत्पन्न प्राथमिक मायोब्लास्ट कंकाल की मांसपेशी विभेदन की जांच करने के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल इन विट्रो मॉडल का गठन करते हैं । इन कोशिकाओं के प्रसार तेजी से जब उच्च सीरम शर्तों के तहत सभ्य है । मांसपेशी वंश में भिंनता है तो कम सीरम30शर्तों द्वारा प्रेरित है । मूरीन न्यूरोब्लास्टोमा (N2A) कोशिका रेखा की स्थापना माउस तंत्रिका शिखा से प्राप्त किया गया था । ये कोशिकाएं न्यूरोनल तथा अमीबोइड स्टेम कोशिका आकारिकी उपस्थित होती हैं । विभेदन उत्तेजना पर, N2A कोशिकाओं neurofilaments के रूप में इस तरह के ंयूरॉंस के कई गुण मौजूद हैं । N2A कोशिकाओं अल्जाइमर रोग की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, neurite outgrowth, और neurotoxicity31,३२,३३. 3T3-L1 murine पूर्व-adipocytes सेल लाइन की स्थापना की आमतौर पर चयापचय और शारीरिक adipoउत्पत्ति के साथ जुड़े परिवर्तन की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इन कोशिकाओं को एक फाइटोब्लास्ट की तरह morphology वर्तमान, लेकिन एक बार भेदभाव के लिए प्रेरित, वे एंजाइमी लिपिड संश्लेषण और ट्राइग्लिसराइड्स संचय के साथ जुड़े सक्रियण वर्तमान. यह साइटोप्लाज्मिक लिपिड बूंदों३४,३५का उत्पादन करने के लिए रूपात्मक परिवर्तन के रूप में मनाया जा सकता है । MCF10A एक गैर ट्यूमर स्तन उपकला कोशिका स्तन फाइब्रोसिस्टिक रोग३६के साथ एक premenopausal औरत से व्युत्पंन लाइन है । यह व्यापक रूप से जैव रासायनिक, आणविक के लिए इस्तेमाल किया गया है, और सेलुलर अध्ययन, जैसे प्रसार, कोशिका प्रवास, और आक्रमण के रूप में स्तन कैंसरजनन से संबंधित. माइन-डार्द्वारा कैनाइन गुर्दा (एमडीकॉक) उपकला कोशिका लाइन को बड़े पैमाने पर उपकला phenotype की स्थापना के साथ जुड़े संपत्तियों और आणविक घटनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । संगम तक पहुँचने पर, इन कोशिकाओं polarized हो जाते हैं और सेल-सेल आसंजन की स्थापना, स्तनधारियों उपकला ऊतकों की विशेषताओं३७.

आस की क्षमता का परीक्षण करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में Zn के स्तर को मापने के लिए, हम पूरे और subcellular भागों (cytosol और नाभिक) इन पांच कोशिका लाइनों का विश्लेषण किया । आस माप इन सेल प्रकार में Zn के विभिंन सांद्रता दिखाया । प्राथमिक पेक्षप्रसू (प्रोटीन के 4 से 7 नामोल/मिग्रा) और चार स्थापित कोशिका रेखाओं (प्रोटीन के 20 से ४० तक के लिए) में उच्च की सांद्रता कम थी । जब कोशिकाओं का प्रसार करने की तुलना में प्राथमिक मायोब्लास्ट और न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं में अंतर करने में Zn स्तरों में एक छोटे से गैर-महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला । विभेदक ऐडिपोसाइट्स में विपरीत प्रभाव पाया गया । तथापि, 3T3-L1 कोशिकाओं में विभेदकारी कोशिकाओं की तुलना में धातु की उच्च सांद्रता प्रदर्शित होती है । महत्वपूर्ण बात, इन तीन सेल लाइनों में, subcellular प्रभाजन से पता चला कि zn विभेदन है cytosol और नाभिक में इन कोशिकाओं की चयापचय स्थिति के अनुसार वितरित की । उदाहरण के लिए, myoblasts, N2A कोशिकाओं, और 3T3-L1 पूर्व-adipocytes के प्रसार में, धातु के बहुमत नाभिक में स्थानीयकृत है । विशिष्ट कोशिका उपचार का उपयोग कर भेदभाव के प्रेरण पर, Zn इन तीन प्रकार के कोशिका में cytosol के लिए स्थानीयकृत । दिलचस्प बात यह है कि दोनों उपकला कोशिका रेखाओं ने प्रसार के दौरान Zn के उच्च स्तर को संगम तक पहुँचने की तुलना में दर्शाया, जिसमें एक विशेषता तंग मोनोलेयर का गठन किया गया था । उपकला कोशिकाओं के प्रसार में, स्तनधारी कोशिका रेखा में कोशिकासॉल और नाभिक के बीच समान Zn वितरण होता है, जबकि गुर्दे से व्युत्पन्न कोशिका रेखा में, अधिकांश धातु नाभिक में स्थित थी । इन दो प्रकार के कक्ष में, जब कोशिकाएं संगम पर पहुंचती हैं, तो Zn मुख्यतः सायकोसोल में स्थित होती है । इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि GF-आस कम उपज नमूनों में मौलिक विश्लेषण प्रदर्शन के लिए एक अत्यंत संवेदनशील और सटीक तकनीक है । GF-आस subcellular प्रभाजन के साथ युग्मित और विभिंन सेल लाइनों और ऊतकों में ट्रेस धातु तत्वों के स्तर की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. स्तनधारी सेल संस्कृति

  1. सामांय विचार
    1. स्तनधारी सेल संस्कृति के लिए अपूतित तकनीकों का पालन पहले३८की समीक्षा की ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified 5% सह2 इनक्यूबेटर में सभी सेल लाइनों को बनाए रखें । कक्ष culture स्थितियां प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए बदलती हैं । इन प्रक्रियाओं के रूपांतरों के रूप में इस्तेमाल किया प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए उपयुक्त संस्कृति की स्थिति बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, ंयायपालिका फीनोटाइप और कोशिका संस्कृति की विफलता के लिए नेतृत्व करेंगे ।
    3. ब्याज की सेल लाइन के साथ परिचित सुनिश्चित करें, और विशिष्ट प्रयोगों के लिए चयनित प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए प्रदान की प्रोटोकॉल का पालन (नीचे कुछ उदाहरण देखें).
  2. Trypsinization और आसंन कोशिकाओं के पारित करने के लिए सामांय प्रक्रिया
    1. आकांक्षा द्वारा संस्कृति थाली से सेल संस्कृति मीडिया निकालें ।
    2. धीरे से कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना PBS का उपयोग कर कोशिकाओं को धोने (10 सेमी2 संस्कृति सतह क्षेत्र प्रति 5 मिलीलीटर) । सेल monolayer अलग से बचने के लिए थाली के पक्ष में धोने समाधान जोड़ें; हल की कवरेज को अधिकतम करने के लिए थाली भंवर । उपकला कोशिकाओं के लिए, यह आवश्यक है कोशिकाओं को 10 से 15 मिनट के लिए सेक्यूबेट में ३७ डिग्री सेल्सियस PBS में निम्न चरणों में कोशिकाओं की वियोजन की सुविधा के लिए.
    3. आकांक्षा द्वारा धुलाई का घोल निकाल लें ।
    4. थाली (लगभग ०.७ मिलीलीटर प्रति 10 सेमी2) करने के लिए पर्याप्त वियोजन अभिकर्मक (०.२५% trypsin) जोड़ें । धीरे से सेल monolayer की पूरी कवरेज पाने के लिए थाली चक्कर ।
    5. 2 से 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संस्कृति सेबेट । औसत ऊष्मायन समय, सेल लाइन के साथ बदलता है, उपकला कोशिकाओं के मामले में ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 10 से 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए सिफारिश की है । कोशिका टुकड़ी के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें ।
    6. जब कोशिकाओं के सबसे अलग है, पूर्व गर्म चढ़ाना या विकास माध्यम के 5 मिलीलीटर में सेल निलंबन ठीक (कुछ उदाहरणों के लिए नीचे देखें) । यंत्रवत् सेल monolayer पर कई बार pipetting द्वारा कोशिका clumps अलग करना ।
    7. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और उन्हें 2 से 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रान्तरण । सेल प्रकार के आधार पर अपकेंद्रण गति और समय बदलती हैं । कोमल आकांक्षा द्वारा मीडिया निकालें, सेल गोली को छूने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है । सेल गोली के लिए उपयुक्त पूर्व गरम वृद्धि मध्यम के 5 से 10 मिलीलीटर में फिर से निलंबित और एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर गिनती के लिए एक नमूना हटा दें ।
    8. प्रत्येक विशिष्ट कोशिका रेखा (कुछ उदाहरणों के लिए नीचे देखें) के लिए अनुशंसित घनत्व बीज के लिए सेल निलंबन की उचित मात्रा का उपयोग. संस्कृति के आकार के अनुसार संस्कृति मीडिया के पर्याप्त मात्रा के साथ अनुपूरक और कोशिकाओं को वापस इनक्यूबेटर में जगह है ।
  3. माउस सैटेलाइट सेलों से व्युत्पन्न प्राथमिक मायोब्लास्ट
    1. शुरू करने से पहले, प्राथमिक मायोब्लास्ट वृद्धि के लिए कोलेजन-लेपित प्लेटें तैयार करें । एक ०.०२% कोलेजन, और विआयनीकृत पानी में ०.०५ एम एसिटिक एसिड युक्त समाधान एक ०.२२ μm बाँझ फिल्टर डिवाइस के साथ निस्पंदन द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए । कोलेजन समाधान के साथ संस्कृति प्लेटों को सेते ३७ ° c पर रात भर ।
    2. अगले दिन, कोलेजन समाधान महाप्राण, बंधेल कैबिनेट में शुष्क हवा के लिए प्लेटों की अनुमति और स्टोर में 4 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें जब तक ।
      नोट: कोलेजन की ंयूनतम मात्रा हैं: ३५ मिमी = 1 मिलीलीटर के लिए; ६० मिमी = 2 मिलीलीटर; 10 सेमी = 5 मिलीलीटर ।
    3. 1 x 104 सेल/सीएम2 में ५५ cm2 कोलेजन-लेपित कल्चर प्लेट्स में सीड प्राइमरी मायोब्लास्ट । प्रसार मीडिया है Dulbecco संशोधित है ईगल मध्यम (DMEM)/हैम है F12 पोषक तत्व मिश्रण संस्कृति मीडिया 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 25 एनजी १००/
      नोट: Proliferating और स्टॉक कोशिकाओं को संप्रवाह के ५०% के तहत बनाए रखा जाना चाहिए । सेल संपर्क के लिए उत्पादक विभेदन कोशिकाओं की प्रतिबद्धता लाती है और संस्कृति की वृद्धि क्षमताओं impairs ।
    4. प्राथमिक myoblasts के अंतर के लिए, कोशिकाओं ८०% तक पहुंचने के लिए १००% संगम है, जो आम तौर पर चढ़ाना के ४८ एच के बाद होता है की अनुमति देते हैं । फिर, भिंनता मीडिया (DMEM, 2% हार्स सीरम, 1% इंसुलिन, transferrin, सेलेनियम एक पूरक के लिए परिवर्तन, और १०० U/ ताज़ा मीडिया फसल जब तक दैनिक ।
  4. मुरीन न्यूरोब्लास्टोमा (N2A)
    1. 2 x 104 कोशिकाओं के घनत्व में प्लेट N2A कोशिकाओं/2 विकास मीडिया में, कम-सीरम मध्यम के मिश्रण से युक्त/उच्च ग्लूकोज और एल glutamine युक्त dmem (1:1, वी: v), 10% के साथ पूरक Fbs और १०० U/ ५०% संगम के तहत स्टॉक संस्कृति को बनाए रखना ।
    2. N2A कोशिकाओं के विभेदन प्रेरित एक बार संगम 25% तक पहुंच ४०% । विभेदन के लिए परिवर्तन मीडिया कम-सीरम मध्यम/DMEM, 1% FBS, और 20 μM रेटिनोइक एसिड का मिश्रण युक्त 7 से 10 दिनों के लिए । ताज़ा मीडिया हर दूसरे दिन सेल हार्वेस्ट तक ।
      नोट: के रूप में N2A कोशिकाओं अंतर, कुछ कोशिकाओं दौर हो, आसानी से अलग है, और apoptosis गुजरना हो सकता है । जब आकांक्षा और प्लेटों के लिए संस्कृति मीडिया जोड़ने सावधान रहें ।
  5. 3T3 L1 मुरीन पूर्व adipocytes
    1. उच्च ग्लूकोज के साथ DMEM में माउस 3T3/L1 कोशिकाओं को बनाए रखने, 10% FBS और १०० U/ आदिवजनित प्रक्रम कोशिकाओं के संगम में निर्भर करता है; इसलिए, नहीं चलो शेयर संस्कृति ५०% से अधिक संगम बढ़ने, के रूप में उच्च संप्रवाह कोशिकाओं की क्षमता अंतर को ख़राब करना होगा ।
    2. प्लेट 2 x 104 कोशिकाओं पर कोशिकाओं/ इस घनत्व में, कोशिकाओं को 3 दिनों में संगम तक पहुंच जाएगा ।
    3. कोशिकाओं के १००% प्रवाह तक पहुँचने के दो दिन बाद आदिजनन विभेदन को प्रेरित करते हैं । प्रेरण मीडिया DMEM जिसमें 10% FBS, 10 μg/एमएल इंसुलिन, ०.५ मिमी 3-isobutyl-1-methyxanthine, 1 μM dexamethasone, और 10 μM troglitazone शामिल हैं ।
    4. ४८ h ऊष्मायन के बाद प्रेरण मीडिया की जगह विभेदन मीडिया (DMEM 10% FBS युक्त, और 5 μg/एमएल इंसुलिन) । ताज़ा मीडिया हर दूसरे दिन फसल तक । पूर्ण विभेदन के प्रतिनिधि नमूने सामान्यत: एडिपोजेनिक प्रेरण के बाद 7 से 10 दिनों के बीच एकत्र किए जाते हैं ।
      नोट: adipogenesis के रूप में प्रगति, कोशिकाओं दौर बन जाते हैं और आसानी से अलग करने के लिए करते हैं. जब आकांक्षा और प्लेटों के लिए संस्कृति मीडिया जोड़ने सावधान रहें ।
  6. MCF10A कोशिकाओं
    1. प्लेट MCF10A कक्ष DMEM/F12 (1:1, v:v), 5% FBS, १०० U/mL पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, ०.५ μg/mL हाइड्रोकॉर्टिएक, 10 μg/mL इंसुलिन, और 20 एनजी/एमएल एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF) के साथ पूरक । अनुशंसित सीडिंग घनत्व 1 x 105 कोशिकाओं/ इन शर्तों के तहत, सेल 4 दिनों के भीतर १००% संगम तक पहुंच जाएगा । ताज़ा मीडिया हर 2 से 3 दिनों तक फसल ।
      नोट: MCF10A कोशिकाओं को अलग करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. यह 10 से 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को ३७ ° c में ०.५ मिमी EDTA के साथ कैल्शियम से मुक्त PBS में trypsinization से पहले की सिफारिश की है ।
  7. Madin-डार्द्वारा कैनाइन गुर्दे की कोशिकाओं (MDCK)
    1. DMEM में प्लेट MDCK कोशिकाओं के साथ पूरक 10% FBS और १०० U/ अनुशंसित बीजारोपण घनत्व 1 x 105 कोशिकाओं/सेमी2है, जहां सेल 3 दिनों के भीतर १००% संगम तक पहुंच जाएगा । ताज़ा मीडिया हर 2 दिन फसल तक ।
      नोट: MDCK कोशिकाओं को अलग करने के लिए मुश्किल हैं । यह सिफारिश की है 5 से 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ३७ ° c में कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त PBS में trypsinization से पहले । सेल clumping रोकने के लिए मार या फ्लास्क मिलाते हुए जब कोशिकाओं को अलग करने के लिए इंतज़ार कर रही द्वारा प्लेटें उत्तेजित मत करो ।

2. आस के लिए स्तनधारी सेल संस्कृति नमूना तैयारी: पूरे सेल और subcellular प्रभाजन

  1. संस्कृति ५५ सेमी2 प्लेटों में ब्याज की कोशिकाओं । छोटे कल्चर प्लेट्स के उपयोग से जीएफ-एएएस की पहचान सीमा के अंतर्गत धातुओं के स्तर के नमूने प्राप्त हो सकते हैं ।
  2. संपूर्ण कक्ष निकालें
    1. एक वैक्यूम जाल का उपयोग कर संस्कृति मीडिया aspirate. मीडिया के सभी निशान हटाने के लिए सुनिश्चित करें । कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त बर्फ-ठंड PBS के साथ वांछित समय अंक या संस्कृति की स्थिति से तीन बार कोशिकाओं कुल्ला ।
    2. तुरंत एक नए प्लास्टिक की सेल खुम्पर का उपयोग कर प्लेट से कोशिकाओं परिमार्जन कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त PBS के 1 मिलीलीटर में । एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए नमूना स्थानांतरण और 2 मिनट के लिए केंद्रान्तरण २,००० एक्स जी में और supernatant महाप्राण । यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है । -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली के नमूनों की दुकान या २.४ कदम के लिए आगे बढ़ें ।
  3. उपकोशिकीय प्रभाजन
    1. एक वैक्यूम जाल का उपयोग कर संस्कृति मीडिया aspirate. मीडिया के सभी निशान हटाने के लिए सुनिश्चित करें । कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त बर्फ-ठंड PBS के साथ वांछित समय अंक या संस्कृति की स्थिति से तीन बार कोशिकाओं कुल्ला । 1 मिलीलीटर आइस-कोल्ड पीबीएस कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त के साथ थाली से कोशिकाओं को कुरेदना ।
    2. नमूनों को १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें । १०,००० एक्स जीमें 10 एस के लिए अपकेंद्रित्र यदि कोशिकाद्रव्यी और नाभिकीय अंशों का धातु विश्लेषण वांछित हो तो नाभिक का तीव्र अलगाव जारी रखें । यह प्रक्रिया सेल निष्कर्षण के कारण धातुओं के संभावित नुकसान को कम करेगा39, 40
    3. आकांक्षा द्वारा supernatant निकालें और सेल गोली ४०० μL में बर्फ की ठंडी PBS कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त, ०.१% Nonidet P-४० (एनपी-४०), एक गैर-ईओण डिटर्जेंट युक्त resuspend । एक नया माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरण १०० μL और यह पूरे सेल नमूना के रूप में विचार करें । इस aliquot नमूना का 25% का प्रतिनिधित्व करता है ।
    4. एक P1000 micropipette टिप के साथ बर्फ पर सेल निलंबन 5 से 10 बार pipetting द्वारा नाभिक को अलग. उपकला कोशिकाओं के नाभिक आइसोलेशन ०.५% एनपी-४० की एकाग्रता की आवश्यकता है. एक 26 3/4 जी सुई 10 से 15 बार के माध्यम से सेल निलंबन पारित करके सेल वियोजन प्राप्त करने, एक 30 1/2 जी सुई के माध्यम से 10 से 15 मार्ग के बाद ।
      नोट: एक 40x उद्देश्य का उपयोग कर प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा नाभिक अखंडता की जाँच करें.
    5. अपकेंद्रित्र शेष सेल lysate निलंबन (३०० μL) 10 एस के लिए १०,००० एक्स जीमें । सुपरनैलेंट में साइक् सोलिक अंश होगा । एक नए माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए ३०० μL स्थानांतरण ।
    6. ५०० μL में परमाणु अंश युक्त गोली कुल्ला कैल्शियम और मैग्नीशियम से मुक्त PBS, ०.१% एनपी-४० है, तो 10 के लिए केंद्राभित्र १०,००० x gपर एस । Supernatant निकालें और एक ही समाधान के १०० μL में नाभिक युक्त गोली resuspend ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । नमूने-20 ° c पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. Lyse तीन sonication के चक्र से कोशिकाओं (30 एस पर/५० kHz, २०० डब्ल्यू पर) 5 मिनट के लिए । ब्रैडफोर्ड४१द्वारा नमूने में कुल प्रोटीन सामग्री quantify
  5. या तो परमाणु (histones, क्रोमेटिन remodelers, परमाणु मैट्रिक्स प्रोटीन) या cytosolic भिन्न (β-ट्यूब्युलिन, β-actin) (चित्र 2) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा अंशों की शुद्धता की गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन ।
    नोट: एक धातु टिप के साथ sonicators का उपयोग न करें । ये धातुओं के साथ नमूना संदूषित कर सकते हैं ।

3. zn पूरी कोशिका और subcellular की सामग्री विश्लेषण स्तनधारियों कोशिका संस्कृतियों के परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा अंश

  1. सेल संस्कृति के नमूनों (पूरी कोशिका या परमाणु भागों) खनिज पाचन द्वारा केंद्रित HNO3 का पता लगाने धातु ग्रेड (सावधानी) की एक समान मात्रा का उपयोग कर ८० डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए, तो रात भर 20 डिग्री सेल्सियस ।
  2. प्रतिक्रिया को एच2ओ 2 के अभिक्रिया आयतन के 30% जोड़कर रोकें 18 MΩ शुद्ध पानी के साथ ५०० μL करने के लिए नमूना मात्रा लाओ ।
    नोट: HNO3 हैंडलिंग रासायनिक सुरक्षा चश्मा पहने किया जाना चाहिए, छप संरक्षण, दस्ताने के लिए एक चेहरा ढाल, और एक अनुमोदित भाप श्वासयंत्र अगर पर्याप्त वेंटिलेशन (धूआं हुड) उपलब्ध नहीं है । यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है । नमूनों को कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. एक ग्रेफाइट भट्ठी के साथ सुसज्जित आस द्वारा Zn मापन के लिए मानक समाधान और प्रयोगात्मक नमूने तैयार ।
    1. 2% (v/v) का उपयोग करें विआयनीकृत पानी में hno3 समाधान, एक ही बैच से आ रही अंशांकन के लिए खाली समाधान के रूप में मानक वक्र के लिए प्रयोग किया जाता भर । का प्रयोग करें विश्लेषणात्मक ग्रेड 18 MΩ शुद्ध पानी में पतला मानकों ।
    2. Zn के १,००० पीपीबी का एक मानक 2% के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध १,००० पीपीएम zn स्टॉक समाधान से तैयार (v/ १०० पीपीबी मानक से 5, 8, 10, 15, 20 और 25 पीपीबी को सीधे 2% (v/v) एचनो3 डिआयनीकृत पानी में समाधान के साथ मानक समाधान तैयार करना । Zn मानकों और एक ०.१% (1 जी/एल) मिलीग्राम (NO3)2 मैट्रिक्स संशोधक के साथ खाली तैयार करते हैं ।
      नोट: zn के lod ०.०१ पीपीबी (μg/L) है । मानकों की एकाग्रता में वृद्धि करके, zn के रैखिकता की सीमा 20 पीपीबी होना निर्धारित किया गया था (चित्रा 3) ।
    3. मानक और नमूनों को एक ही अनुकूलित शर्तों के तहत मापें: २५० मिलीलीटर/मिनट की शुरूआत की प्रवाह दर, इंजेक्शन का तापमान 20 डिग्री सेल्सियस और GF का तापमान १,८०० डिग्री सेल्सियस ।
      नोट: एक नया नमूना या मानक के इंजेक्शन से पहले, शुद्ध चरणों के लिए GF तापमान २४५० डिग्री सेल्सियस तक बढ़ा दिया गया था ।
    4. लैंप (C-HCL) को 20 A, २१३.९ एनएम की तरंगदैर्घ्य और ०.७ nm के झिरी के लिए ऑप्टिमाइज़ करें ।
    5. धातु सामग्री निर्धारित करने के लिए Zn मानक वक्र का उपयोग कर mineralized नमूनों को मापने । छोटे वॉल्यूम मापा जाता है के रूप में, यदि माप समय की लंबी अवधि ले नमूने लुप्त हो जाना कर सकते हैं । इसलिए, यह नमूनों में पानी जोड़ने के लिए सिफारिश की है । 18 MΩ शुद्ध पानी ०.०१% HNO3 (विश्लेषणात्मक ग्रेड) के साथ इलाज के साथ नमूनों पतला अगर प्राप्त डेटा lod से परे है ।
      नोट: आमतौर पर, नमूने मानक वक्र की स्थापना के बाद सही मापा जा करने के लिए आस के स्वचालित ऑटोपारखी में रखा ५०० μL की एक मात्रा को पतला कर रहे हैं । आवश्यक मात्रा उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए और सांद्रता की अंतिम गणना पर विचार करना चाहिए । एक प्रयास में एक पूर्ण प्रयोग की आस से Zn determinations परिष्करण की सिफारिश की है । मापन को परखना बड़ी प्रायोगिक विविधताओं और असंगतताओं का कारण हो सकता है ।
  4. के रूप में zn आस के माध्यम से मापा से प्राप्त के रूप में मोलरता पीपीबी माप परिवर्तित । Zn (६५.३९ एएमयू) के द्रव्यमान पर विचार करें । आस पास द्वारा प्राप्त पीपीबी की राशि को विभाजित ६३,३९०,००० । कोशिकाओं में, Zn सांद्रता, पीमोल की इकाइयों से लेकर μmol तक होती है ।
    1. (कदम २.४) ब्रैडफोर्ड द्वारा निर्धारित नमूने में प्रोटीन के प्रारंभिक द्रव्यमान द्वारा Zn (pmol या μmol) की एकाग्रता विभाजित । यह गणना, नमूने के प्रोटीन की प्रति मिलीग्राम (pmol या μmol Zn) धातु की मात्रा को रेंडर करेगी ।
      नोट: यह धातु determinations के दौरान उपयोग किया कमजोर पड़ने कारकों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

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Representative Results

हम GF की क्षमता का परीक्षण-आस स्तनधारी कोशिकाओं में Zn के मिनट के स्तर का पता लगाने के लिए (चित्रा 1) । इस प्रकार, हम सुसंस्कृत प्राथमिक myoblasts माउस उपग्रह कोशिकाओं से व्युत्पन्न, और स्थापित सेल लाइनों N2A (neuroblastoma व्युत्पन्न), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (स्तन उपकला), और MDCK कोशिकाओं (कुत्ते गुर्दे उपकला). सबसे पहले, हम पूरे सेल, cytosolic, और इन सभी प्रकार के कोशिका के परमाणु भागों अलग और पश्चिमी ब्लॉट द्वारा भागों की शुद्धता का मूल्यांकन (चित्रा 2) । के प्रतिनिधि immunodetection क्रोमैटिन remodeler Brg1 और ट्यूब्युलिन के मार्कर के रूप में परमाणु और cytosolic भिन्न क्रमशः, subcellular प्रभाजन प्रोटोकॉल की उपयुक्तता का प्रदर्शन किया खंड २.३ में वर्णित करने के लिए मौलिक प्रदर्शन विश्लेषण (चित्र 2) । पूरे सेल और subcellular भिंनों के रूप में तैयार थे GF-आस विश्लेषण के लिए ऊपर वर्णित है, और उपकरणों के अंशांकन के लिए एक ठेठ रैखिक मानक वक्र उपज प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 3) ।

चित्रा 4 हर कोशिका प्रकार के proliferating और विभेदक monolayers के प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों से पता चलता है, और इन के लिए इसी zn स्तर. महत्वपूर्ण बात, सभी सेल लाइनों इस अध्ययन में विश्लेषण एनएम रेंज में Zn सांद्रता दिखाया । तथापि, धातु का विभेदक वितरण पाया गया । विभेदित प्राथमिक मायोनली ने कोशिकाओं के प्रसार से अधिक Zn के स्तर को दर्शाया (चित्र 4a) । विशेष रूप से, बहुत से आयन परमाणु-अंश में स्थित थे, दोनों में प्ररोहण और मायोब्लास्ट में अंतर । इस तरह के एक subcellular वितरण Zn neuroblastoma व्युत्पन्न सेल लाइन N2A (चित्रा 4B) में पाया गया था. हालांकि, मापन से पता चला है कि N2A कोशिकाओं Zn स्तर के एक आदेश के परिमाण से अधिक प्राथमिक myoblasts । दूसरी ओर, स्थापित 3t3-L1 सेल लाइन zn के उच्च स्तर पर प्रदर्शित जब पूर्व adipocytes जब वे अंतर और परिपक्व adipocytes कि जमा लिपिड (चित्रा 4c) के रूप में प्रेरित किया गया से proliferating थे ।

हम भी दो अलग स्थापित उपकला सेल लाइनों में Zn सामग्री मापा: MCF10A मानव स्तन ग्रंथि से व्युत्पंन (चित्रा 4d) और कुत्ते गुर्दे-mdck व्युत्पंन (चित्रा 4e) कोशिकाओं । दिलचस्प बात यह है कि दोनों ही मामलों में, संगम monolayers की तुलना में कोशिकाओं proliferating में Zn के उच्च स्तर का पता चला रहे थे । हालांकि, स्तन ग्रंथि से व्युत्पंन उपकला कोशिकाओं धातु का स्तर है कि गुर्दे की कोशिकाओं की तुलना में 2 गुना अधिक थे दिखाया । MCF10A कोशिकाओं को कोशिकाओं के proliferating में cytosolic और परमाणु भिंनों के बीच Zn के बराबर का स्तर दिखाया । एक बार MCF10A कोशिकाओं के संगम, पूरे सेल Zn स्तरों में एक ४०% की कमी का पता चला था, और धातु cytosolic अंश में सबसे अधिक ध्यान केंद्रित पाया गया (चित्रा 4d) । इसके विपरीत, proliferating MDCK कोशिकाओं परमाणु अंश में Zn के उच्च स्तर का प्रदर्शन, cytosolic अंश की तुलना में, लेकिन जब MDCK कोशिकाओं को संगम, पूरे कोशिकाओं में Zn की कमी का पता चला था, इस संक्रमण धातु के बहुमत के साथ पाया गया cytosolic अंश में मनाया (चित्र 4E) ।

Figure 1
चित्रा 1: मौलिक (Zn) स्तनधारी संवर्धित कोशिकाओं का विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि फ्लो चार्ट । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: नाभिक प्रोटोकॉल के तेजी से अलगाव के माध्यम से प्राप्त अंशों की शुद्धता का सत्यापन ३९ , ४०. प्रतिनिधि पश्चिमी ब्लॉट प्राथमिक myoblasts में अंतर से subcellular भागों की शुद्धता दिखा । क्रोमेटिन रिरिफर एंजाइम Brg1 का प्रयोग नाभिकीय अंश की पहचान करने के लिए किया जाता था, और ट्यूब्युलिन का प्रयोग साइक्सोलिक अंश की पहचान करने के लिए किया जाता था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: Zn मानकों के अंशांकन वक्र । Zn के लिए प्रतिनिधि मानक वक्र GF द्वारा निर्धारित-आस । GF-आस मानक Zn निंनलिखित सांद्रता पर पतला समाधान के साथ calibrated था: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, और 30 ppb । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विभिंन स्तनधारी सुसंस्कृत कोशिकाओं में जस्ता स्तर । प्रतिनिधि प्रकाश micrographs और पूरे सेल निष्कर्षों और cytosolic और परमाणु भागों में Zn सामग्री । डेटा तीन स्वतंत्र जैविक के माध्य का प्रतिनिधित्व ± SEM प्रतिकृति । () दो दिनों के लिए म्यूरीन प्राइमरी मायोब्लास्ट का प्रसार और विभेदा कर रही है । () मुरीन न्यूरोब्लास्टोमा N2A कोशिका रेखा प्रेरण से पहले और बाद में रेटिनोइक एसिड उपचार द्वारा अंतर करने के लिए । () म्यूरीन 3T3-एल1 प्री-एडिपोसाइट्स और 6 दिन के बाद का विभेदन । () मानव स्तन उपकला कोशिका रेखा MCF10A के पूर्व-संगम और संगम के रूप में । () गुर्दा उपकला सेल लाइन के पूर्व-संगम और संगम के रूप में मोनोलेयर । आंकड़ों के तीन स्वतंत्र प्रयोगों ± एसई के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं । छात्र टी-टेस्ट महत्व, * p ≤ ०.०५ से पता चलता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

परमाण्विक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी एक अति संवेदनशील विधि है जो छोटे आयतन/जन जैविक नमूनों में Zn प्रमात्रीकरण के लिए है । Zn मापन का वर्णन अनुकूलन इस विधि के आवेदन सरल बनाता है और आदर्श विश्लेषणात्मक शर्तों की गारंटी देता है । यहां, GF का उपयोग कर-आस, हम पूरी कोशिकाओं में Zn की एकाग्रता निर्धारित है, और cytosolic और परमाणु भागों में, विभिंन सेल लाइनों से । परिणाम दर्शाते हैं कि यह तकनीक फ्लोरोसेंट प्रोब्स और आईसीपी-एमएस द्वारा प्राप्त किए गए लोगों के तुलनीय है । उदाहरण के लिए, कई फ्लोरोसेंट जांच ०.१ की सीमा में ३०० बजे, golgi स्तर picomolar रेंज के नीचे थे, और अंतर्द्रव्यी जालिका ८०० से लेकर ५,००० pm४२है, जो स्तर के साथ संगत कर रहे है में अस्थिर माइटोकॉन्ड्रियल zn स्तर दिखाया cytosolic भागों में पता चला । इसके अलावा, zn-उत्तरदायी फ्लोरोफोर fluozin-3 MCF10A में छोटे cytosolic पुटिकाओं में अस्थिर zn के संचय दिखाया और C2C12 कोशिकाओं में४३,४४, जो भी zn के साथ संगत कर रहे हैं कोशिका द्रव्य में मात्रा निर्धारित. इसके अलावा, हमारे समूह द्वारा प्रदर्शन किया ICP-MS द्वारा Zn विश्लेषण से पता चला है कि प्राथमिक myotubes४५ में अंतर में पूरे सेल स्तर zn उन के समान है GF द्वारा इस रिपोर्ट में प्राप्त-आस । इसके अलावा, आस और zn ई४६ का उपयोग करके सी 6 चूहा तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं में zn determinations के उदाहरण भी neuroblastoma N2A कोशिकाओं यहां इस्तेमाल में मनाया उन लोगों के लिए इसी तरह पर्वतमाला प्रदान की गई है ।

तिथि करने के लिए, विभिन्न तकनीकों कोशिकाओं में Zn का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है. हालांकि, GF-आस एक सटीक और अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है कि न केवल मुक्त Zn का पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी धातु complexed उपाय और प्रोटीन के लिए बाध्य और छोटे अणुओं के लिए संभावित । हमारे समूह ने हाल ही में पता चला है कि माप सेल पारनीय फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्रदर्शन किया (जो एक उच्च समानता बांध मुक्त zn2 +) सीधे zn के स्तर के साथ सहसंबद्ध है GF द्वारा पता लगाया-आस proliferating और फर्क में myoblasts ४३. हालांकि, इन जांच द्वारा प्राप्त परिणाम पूरे सेल या प्रोटीन-बाउंड Zn सांद्रता के प्रतिनिधि नहीं हो सकते हैं । इसके अलावा, के बाद से zn एक गैर-redox सक्रिय प्रजातियों के रूप में मौजूद है और द्वि-संयोजक धनायन के रूप में, शारीरिक स्थितियों के तहत, सेलुलर प्रणालियों में इसकी पहचान एक चुनौती बनी रही । उपंयास zn इमेजिंग तकनीक उपलब्ध हो गए हैं, जैसे राज्य के अत्याधुनिक synchrotron आधारित एक्स-रे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, radioisotopes, और लेजर अपक्षरण inductively युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ला-icp-एमएस) । दुर्भाग्य से, इन तकनीकों के कुछ वैज्ञानिक समुदाय के लिए दुर्गम संसाधनों की आवश्यकता है29,४२,४७,४८,४९,५०

अध्ययनों से पता चला है कि आईसीपी-एमएस एएएस से अधिक सटीक तकनीक है, क्योंकि सापेक्ष मानक विचलन मानों को Zn जैसी धातुओं के लिए आईसीपी-एमएस determinations में कम दिखाया गया है । इस प्रभाव के लिए संभावित स्पष्टीकरण यह है कि icp-MS आंतरिक रूप से रासायनिक interferences को नष्ट करने में सक्षम है, के रूप में ऑपरेटिंग आर्गन तापमान ५,००० से १०,००० डिग्री सेल्सियस के लिए रेंज । कुछ रासायनिक बांड ३,००० डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है, जो आस आपरेशन के लिए सीमा में है । ये बांड ६,००० डिग्री सेल्सियस के ऊपर पूरी तरह से बाधित होंगे । इसलिए, इन उच्च तापमान ICP-MS द्वारा प्लाज्मा स्थिति में पहुंच रासायनिक interferences को समाप्त कर सकते हैं, बेहतर खोज सीमा५१करने के लिए अग्रणी । इसके अलावा, ICP-MS GF-एएएस की तुलना में बड़ी मात्रा नमूनों की आवश्यकता है, के रूप में उत्तरार्द्ध १०० μL के तहत संस्करणों के साथ संचालन करने में सक्षम है, जो अन्य स्पेक्ट्रोस्कोपिक तरीकों जैसे आस, आईसीपी-OES, या आईसीपी-एमएस की तुलना में काफी कम है । इस विधि में शामिल छोटे संस्करणों को देखते हुए, GF-एएएस जैविक नमूनों में zn एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए आदर्श तकनीक है, मुख्य रूप से अगर विश्लेषण subcellular भागों शामिल है, शुद्ध प्रोटीन में धातु संसूचन, या सेलुलर में छोटे रूपों ट्रांसपोर्टर या धातु बंधन प्रोटीन में परिवर्तन के कारण धातु सामग्री29,५२। इसके अलावा, GF-आस प्रणाली की संवेदनशीलता का पता लगाने और अल्ट्रा ट्रेस सांद्रता (pg/mL से एनजी/एमएल) एक और फायदा है ।

GF-आस डेटा की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण विचार किए जाने चाहिए । इनमें पर्याप्त अंशांकन, ग्रेफाइट ट्यूब की अखंडता, और इलेक्ट्रोथर्मल atomization के लिए उपयुक्त मैट्रिक्स संशोधक का चयन शामिल हैं । मैट्रिक्स संशोधक रासायनिक तत्वों नमूना है, जो थर्मल में जगह ले जा रहा है प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए जोड़ा है । ये संशोधक पायरोलिसिस के दौरान analyte के नुकसान को कम करने और मैट्रिक्स घटकों को हटाने के लिए योगदान करते हैं । कुल मिलाकर, संशोधक नमूना मैट्रिक्स को कम तापमान पर मैट्रिक्स घटकों लुप्त हो जाना बदल सकते है और analyte स्टेबलाइजर्स के रूप में काम कर सकते हैं । इन बातों के अलावा, यह कणित्र तापमान कार्यक्रम के लिए कदम का पर्याप्त अनुकूलन प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

दो मुख्य विचार, 1 सहित लिया जाना चाहिए) इष्टतम pyrolysis तापमान की स्थापना, जो atomization कदम पर अधिकतम तापमान को संदर्भित करता है, जिस पर कोई analyte नुकसान होता है, और जो ंयूनतम के साथ analyte के एक अधिकतम अवशोषण की अनुमति देता है पृष्ठभूमि. एक भी 2 पर विचार करना चाहिए) इष्टतम atomization तापमान है, जो ंयूनतम तापमान जिस पर analyte पूरी तरह से सुखाया और एक reproducible संकेत या पीक के रूप में दर्ज करने के लिए संदर्भित करता है की स्थापना । GF के नुकसान में से एक-आस विश्लेषण तत्व हस्तक्षेप है, जिसके लिए एक पूरी तरह से अनुकूलन और मानकीकरण सटीक मापन के लिए आवश्यक हैं । तथापि, तिथि करने के लिए, GF-आस वैज्ञानिक अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है के लिए विभिंन जैविक नमूनों में धातु आयनों का पता लगाने । Zn (और अंय धातुओं के भविष्य के अनुप्रयोगों) GF द्वारा पता लगाने के तरीके-एएएस जानवरों के मॉडल या रोगी बायोप्सी से प्राप्त अंगों और ऊतकों में धातुओं के स्तर को मापने के लिए तत्वों का पता लगाने के लिए विशिष्ट शारीरिक जरूरतों को बेहतर ढंग से समझ शामिल होंगे । अंत में, GF-आस सही, संवेदनशील, लागत प्रभावी है, और सुलभ है, और इस विश्लेषणात्मक तकनीक में सुधार के रूप में तकनीकी अग्रिमों इन का पता लगाने प्रणाली के लिए आगे बढ़ने के लिए जारी रहेगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम संकाय विविधता स्कॉलर्स पुरस्कार से मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल के T.P.-B विश्वविद्यालय से समर्थित था । N.N.-T. सितंबर-CONACYT द्वारा समर्थित है, २७९८७९ अनुदान । जे. जी. एन राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान DBI ०९५९४७६ द्वारा समर्थित है । लेखक डॉ डेरिल ए Bosco के लिए आभारी है N2A सेल लाइन प्रदान करने के लिए और Daniella Cangussu के लिए उसे तकनीकी सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

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References

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Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

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