Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Atomabsorptionsspektroskopi til måling af intracellulære zink puljer i pattedyrsceller

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Dyrkede primære eller etablerede cellelinjer anvendes almindeligvis til at behandle grundlæggende biologiske og mekanistiske spørgsmål som en indledende tilgang, før der anvendes dyremodeller. Denne protokol beskriver, hvordan man forbereder hele celleekstrakter og subcellulære fraktioner til undersøgelser af zink (Zn) og andre sporstoffer med atomabsorptionsspektroskopi.

Abstract

Overgangsmetaller er essentielle mikronæringsstoffer for organismer, men kan være giftige for celler ved høje koncentrationer ved at konkurrere med fysiologiske metaller i proteiner og generere redox stress. Patologiske tilstande, der fører til metaldepletering eller akkumulering, er kausale agenser af forskellige sygdomme hos mennesker. Nogle eksempler omfatter anæmi, acrodermatitis enteropatiica, og Wilson's og Menkes ' sygdomme. Det er derfor vigtigt at kunne måle niveauerne og transporten af overgangsmetaller i biologiske prøver med høj følsomhed og nøjagtighed for at gøre det lettere at forske i, hvordan disse elementer bidrager til normale fysiologiske funktioner og Toksicitet. Zink (Zn), for eksempel, er en cofaktor i mange pattedyr proteiner, deltager i signalering begivenheder, og er en sekundær budbringer i celler. Overskydende, Zn er giftigt og kan hæmme absorption af andre metaller, mens i underskud, det kan føre til en række potentielt dødbringende betingelser.

Grafit ovn atomabsorptionsspektroskopi (GF-AAS) giver en meget følsom og effektiv metode til bestemmelse af Zn og andre Overgangsmetal koncentrationer i forskellige biologiske prøver. Elektro termisk forstøvning via GF-AAS kvantificerer metaller ved at forstøvning små mængder af prøver til efterfølgende selektiv absorption analyse ved hjælp af bølgelængde af excitation af elementet af interesse. Inden for grænserne af linearitet af øl-Lambert lov, absorbans af lys af metallet er direkte proportional med koncentrationen af analysand. Sammenlignet med andre metoder til bestemmelse af Zn-indhold registrerer GF-AAS både fri og kompleks bundet Zn i proteiner og muligvis i små intracellulære molekyler med høj følsomhed i små prøvevolumener. Desuden er GF-AAS også lettere tilgængelig end Induktivt koblet plasma massespektrometri (ICP-MS) eller synkrotron-baseret røntgen fluorescens. Ved denne metode beskrives den systematiske prøveforberedelse af forskellige dyrkede cellelinjer til analyser i en GF-AAS. Variationer i dette sporstof blev sammenlignet i både hele celle lysater og subcellulære fraktioner af prolifererende og differentierede celler som bevis for princippet.

Introduction

Overgang og tungmetaller, såsom Zn, cu, MN, og fe, findes naturligt i miljøet i både næringsstoffer i fødevarer og forurenende stoffer. Alle levende organismer kræver forskellige mængder af disse mikronæringsstoffer; eksponering for høje niveauer er imidlertid skadelig for organismer. Metal erhvervelse er hovedsageligt gennem kosten, men metaller kan også inhaleres eller absorberes gennem huden1,2,3,4,5. Det er vigtigt at bemærke, at tilstedeværelsen af metaller i atmosfæriske partikler er stigende og har været i vid udstrækning forbundet med sundhedsrisici. På grund af menneskeskabte aktiviteter er der påvist forhøjede niveauer af tungmetaller såsom AG, AS, cd, CR, HG, ni, fe og PB i atmosfæriske partikler, regnvand og jord6,7. Disse metaller har potentialet til at konkurrere med essentielle fysiologiske sporstoffer, især Zn og fe, og de fremkalder toksiske virkninger ved at inaktivere grundlæggende enzymer til biologiske processer.

Sporstoffet Zn er Redox neutral og opfører sig som en Lewis syre i biologiske reaktioner, hvilket gør det til en grundlæggende cofaktor nødvendig for proteinfoldning og katalytisk aktivitet i over 10% af pattedyrsproteiner8,9, 10og Bull. Derfor er det afgørende for forskellige fysiologiske funktioner8,11. Men ligesom mange sporstoffer, der er en hårfin balance mellem disse metaller letter normale fysiologiske funktion og forårsager toksicitet. I pattedyr, Zn mangler føre til anæmi, vækstretardering, hypogonadisme, hud abnormiteter, diarré, alopeci, smagsforstyrrelser, kronisk betændelse, og svækket immun og neurologiske funktioner11,12, 13,14,15,16,17,18. Overskydende, Zn er cytotoksisk og svækker absorptionen af andre essentielle metaller som kobber19,20,21.

Derudover, nogle metaller som cu og fe har potentiale til at deltage i skadelige reaktioner. Produktion af reaktive oxygenarter (ros) via Fenton Chemistry kan forstyrre samlingen af jern svovl klynge proteiner og ændre lipid metabolisme22,23,24. For at forhindre denne skade, celler udnytter metal-bindende chaperoner og transportører for at forhindre toksiske virkninger. Utvivlsomt, metal homøostase skal være stramt kontrolleret for at sikre, at specifikke celletyper opretholde passende niveauer af metaller. Af denne grund er der et betydeligt behov for at fremme teknikker til nøjagtig måling af spormetaller i biologiske prøver. I udviklings-og modne organismer findes der et differentieret biologisk behov for sporstoffer på celleniveau, på forskellige udviklingsstadier og under normale og patologiske forhold. Derfor er præcis bestemmelse af væv og systemiske metal niveauer er nødvendig for at forstå organismal metal homøostase.

Grafit ovn atomabsorptionsspektrometri (GF-AAS) er en meget følsom teknik, der anvendes til små prøvevolumener, hvilket gør den ideel til at måle overgang og tungmetaller til stede i biologiske og miljømæssige prøver25,26 , 27 stk. , 28. på grund af teknikkens høje følsomhed har det desuden vist sig at være hensigtsmæssigt at studere de fine transport egenskaber for Na+/K+-ATPase og gastrisk H+/k+-ATPase ved hjælp af xenopus oocytter som modelsystem29. I GF-AAS absorberer de forzinkede elementer i en prøve en bølgelængde af stråling, der udsendes af en lyskilde, der indeholder det metalliske stof, med den absorberede stråling proportional med koncentrationen af elementet. Elementært elektronisk excitation finder sted ved absorption af ultraviolet eller synlig stråling i en kvantiseret proces, der er unik for hvert kemisk element. I en enkelt elektron proces involverer optagelsen af en fotoner en elektron, der bevæger sig fra et lavere energi niveau til et højere niveau inden for atomet, og GF-AAS afgør, hvor meget fotoner der absorberes af prøven, hvilket er proportionalt med antallet af strålings absorberende elementer forstøvet i grafit røret.

Selektiviteten af denne teknik afhænger af den elektroniske struktur af atomerne, hvor hvert element har en specifik absorption/emission spektrallinje. For Zn er absorbansbølgelængden 213,9 nm og kan skelnes nøjagtigt fra andre metaller. Generelt kan GF-AAS anvendes til at kvantificere Zn med passende detektionsgrænser (LOD) og høj følsomhed og selektivitet25. Ændringerne i absorberet bølgelængde er integreret og præsenteret som toppe af energi absorption på specifikke og isolerede bølgelængder. Koncentrationen af Zn i en given prøve beregnes sædvanligvis ud fra en standardkurve med kendte koncentrationer i henhold til øl-Lambert-loven, hvor absorbansen er direkte proportional med koncentrationen af Zn i prøven. Men, anvendelse af Beer-Lambert ligning til GF-AAS analyser også præsenterer nogle komplikationer. For eksempel kan variationer i forstøvning og/eller ikke-homogene koncentrationer af prøverne påvirke metal målingerne.

Metal forstøvning kræves for GF AAS Trace elementært analyse består af tre grundlæggende trin. Det første skridt er desolvation, hvor det flydende opløsningsmiddel er fordampet; forlader tørre forbindelser efter ovnen når en temperatur på omkring 100 °C. Derefter, stofferne er fordampet ved opvarmning dem fra 800 til 1.400 °C (afhængigt af det element, der skal analyseres) og blive en gas. Endelig, de forbindelser i gasformige tilstand er forstøvet med temperaturer, der spænder fra 1.500 til 2.500 °C. Som nævnt ovenfor, stigende koncentrationer af et metal af interesse vil gøre proportionale stigninger på absorptionen detekteret af GF-AAS, men ovnen reducerer den dynamiske vifte af analyse, som er den arbejds række af koncentrationer, der kan være bestemmes af instrumentet. Således, teknikken kræver lave koncentrationer og en omhyggelig bestemmelse af det dynamiske område af metoden ved at bestemme LOD og grænse for linearitet (LOL) af øl-Lambert lov. LOD er den minimumsmængde, der kræves for et stof, der skal påvises, defineret som tre gange standardafvigelsen for Zn i matrixen. LOL er den maksimale koncentration, der kan påvises ved hjælp af øl-Lambert lov.

I dette arbejde, beskriver vi en standardmetode til at analysere niveauerne af Zn i hele celleekstrakter, cytoplasmatiske og nukleare fraktioner, og i prolifererende og differentiere kultiverede celler (figur 1). Vi tilpassede den hurtige isolation af kerner-protokollen til forskellige cellulære systemer for at forhindre metaltab under prøveforberedelse. De anvendte cellulære modeller var primære myoblaster afledt af mus satellit celler, murine neuroblastom celler (N2A eller Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytter, en human ikke-tumorigen bryst epitelial cellelinje (MCF10A), og epitelial Madin-Darby canine nyre ( MDCK-celler). Disse celler blev etableret fra forskellige slægter og er gode modeller til undersøgelse af Lineage specifikke variationer af metal niveauer in vitro.

Primære myoblaster afledt af mus satellit celler udgør en velegnet in vitro model til at undersøge skeletmuskulatur differentiering. Proliferation af disse celler er hurtig, når de dyrkes under høje serum betingelser. Differentiering i den muskulære Lineage er derefter induceret af lave serum betingelser30. Den murine neuroblastom (N2A) etablerede cellelinje blev afledt fra musen neurale crest. Disse celler præsenterer neuronal og amøboid stamcelle morfologi. Ved differentiering stimulus, de N2A celler præsentere flere egenskaber af neuroner, såsom Neuro filamenter. N2A celler bruges til at undersøge Alzheimers sygdom, neurite outgrowth, og neurotoksicitet31,32,33. 3T3-L1 murine præ-adipocytter etablerede cellelinje er almindeligt anvendt til at undersøge de metaboliske og fysiologiske ændringer forbundet med adipogenesis. Disse celler præsenterer en fibroblast-lignende morfologi, men når stimuleret til differentiering, de præsenterer enzymatisk aktivering forbundet med lipid syntese og triglycerider ophobning. Dette kan observeres som morfologiske ændringer for at producere cytoplasmatiske lipid dråber34,35. MCF10A er en ikke-tumor bryst epitelial cellelinje afledt af en præmenopausal kvinde med bryst fibrocystisk sygdom36. Det har været almindeligt anvendt til biokemiske, molekylære, og cellulære undersøgelser relateret til bryst carcinogenese såsom proliferation, celle migration, og invasion. Den Madin-Darby canine nyre (MDCK) epitelial cellelinje er blevet flittigt anvendt til at undersøge de egenskaber og molekylære hændelser i forbindelse med etableringen af epitelial fænotype. Ved at nå sammenløbet, disse celler bliver polariseret og etablere celle-celle klæbestoffer, karakteristika af pattedyr epitelial væv37.

For at teste AAS evne til at måle niveauerne af Zn i pattedyrceller, vi analyserede hele og subcellulære fraktioner (cytosol og kerne) af disse fem cellelinjer. AAS målinger viste forskellige koncentrationer af Zn i disse celletyper. Koncentrationerne var lavere i prolifererende og differentierende primære myoblaster (4 til 7 nmol/mg protein) og højere i de fire etablerede cellelinjer (fra 20 til 40 nmol/mg protein). En lille ikke-signifikant stigning i Zn niveauer blev påvist i differentiere primære myoblaster og neuroblastom celler sammenlignet med prolifererende celler. Den modsatte effekt blev påvist i differentierede adipocytter. Men, prolifererende 3T3-L1-celler udstillet højere koncentrationer af metallet i forhold til differentierede celler. Vigtigt, i disse tre cellelinjer, subcellulær fraktionering viste, at Zn er differentielt fordelt i cytosol og kerne i henhold til den metaboliske tilstand af disse celler. For eksempel, i prolifererende myoblaster, N2A celler, og 3T3-L1 præ-adipocytter, et flertal af metallet er lokaliseret til kernen. Ved induktion af differentiering ved hjælp af specifikke celle behandlinger, Zn lokaliseret til cytosol i disse tre celletyper. Interessant, begge epitel cellelinjer viste højere niveauer af Zn under proliferation i forhold til når man når sammenløbet, hvor en karakteristisk stram enkeltlags blev dannet. I prolifererende epitelceller, bryst cellelinje MCF10A havde en ligelig Zn fordeling mellem cytosol og kerne, mens i den nyre-afledte cellelinje, det meste af metallet var placeret i kernen. I disse to celletyper, når cellerne nåede sammenløbet, Zn var fortrinsvis placeret til cytosol. Disse resultater viser, at GF-AAS er en meget følsom og præcis teknik til udførelse af elementært analyse i lav-udbytte prøver. GF-AAS kombineret med subcellulær fraktionering og kan tilpasses til at undersøge niveauerne af spor metal elementer i forskellige cellelinjer og væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mammale cellekultur

  1. Generelle betragtninger
    1. Følg de aseptiske teknikker for pattedyr cellekultur, der tidligere gennemgik38.
    2. Vedligehold alle cellelinjer i en befuret 5% CO2 -inkubator ved 37 °c. Celle dyrkningsbetingelserne varierer for hver celletype. Det er vigtigt at opretholde passende dyrkningsbetingelser for hver cellelinje, der anvendes, da variationer af disse procedurer vil føre til afvigende fænotyper og svigt i cellekulturen.
    3. Sørg for at være bekendt med celle linjen, og følg de protokoller, der er angivet for hver celletype, der er valgt til specifikke eksperimenter (se nogle eksempler nedenfor).
  2. Generel procedure for trypsinisation og passage af vedvedende celler
    1. Fjern cellekultur mediet fra kultur pladen ved aspiration.
    2. Cellerne vaskes forsigtigt med PBS uden calcium og magnesium (5 mL pr. 10 cm2 kultur overfladeareal). Tilsæt Vaskeopløsningen til siden af pladen for at undgå at løsne celle monolayer; drejepladen for at maksimere dækningen af opløsningen. For epitelceller er det nødvendigt at inkubere cellerne i 10 til 15 min i inkubatoren ved 37 °C i PBS for at lette dissocieringen af cellerne i følgende trin.
    3. Vaskeopløsningen fjernes ved aspiration.
    4. Der tilsættes tilstrækkeligt dissociations reagens (0,25% trypsin) til pladen (ca. 0,7 mL pr. 10 cm2). Drej forsigtigt pladen for at få fuldstændig dækning af cellenmonolayer.
    5. Man inkuerer kulturen ved stuetemperatur i 2 til 5 minutter. Den faktiske inkubationstid varierer med den anvendte cellelinje, i tilfælde af epitelceller anbefales at inkubere i 10 til 15 min i inkubator ved 37 °C. Overhold cellerne under mikroskopet for celle løsrivelse.
    6. Når de fleste af cellerne er løsnet, skal cellesuspensionen genoprettes i 5 mL af den forvarmede plating eller vækstmediet (se nedenfor for nogle eksempler). Mekanisk dissocierer celle klumper ved at pipette over cellenmonolayer flere gange.
    7. Cellesuspensionen overføres til et 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 1.000 x g i 2 til 5 min. Centrifugeringshastigheden og-klokkeslættet varierer afhængigt af celle typen. Fjern mediet ved skånsom aspiration, og pas på ikke at røre ved celle pillen. Celle pillen resuspenderes i 5 til 10 mL af det passende forvarmede vækstmedium, og der udtages en prøve til optælling ved hjælp af et hemocytometer eller en automatisk celle tæller.
    8. Udnyt den passende volumen af cellen suspension til frø den anbefalede tæthed for hver specifik cellelinje (se nedenfor for nogle eksempler). Supplement med den passende mængde af kultur medier i henhold til størrelsen af kulturen skålen og placere cellerne tilbage i inkubator.
  3. Primære myoblaster afledt af mus satellit celler
    1. Før du starter, forberede kollagen-coated plader til primær myoblast vækst. En opløsning indeholdende 0,02% kollagen og 0,05 M eddikesyre i deioniseret vand skal steriliseres ved filtrering med en 0,22 μm steril Filter anordning. Kultur pladerne inkurueres med kollagenopløsningen natten over ved 37 °C.
    2. På den næste dag, Aspirer kollagenopløsningen, lad pladerne lufttørre i det sterile kabinet og opbevares ved 4 °C indtil brug.
      Bemærk: de minimale volumener af kollagen er: for 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Seed primære myoblaster ved 1 x 104 celler/cm2 i 55 cm2 kollagen-coated kultur plader. Sprednings mediet er Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM)/Skin's F12 næringsstof blanding kultur medier indeholdende 20% føtal bovin serum (FBS), 25 ng/mL rekombinant grundlæggende fibroblastisk vækstfaktor (FGF), og 100 U/mL af penicillin/streptomycin.
      Bemærk: prolifererende og stamceller bør opretholdes under 50% af konfluency. Celle kontakt inducerer engagement af cellerne til myogenic differentiering og svækker vækst kapaciteter af kulturen.
    4. Til differentiering af de primære myoblaster, tillade cellerne at nå 80% til 100% konfluency, som normalt forekommer efter 48 h af plating. Derefter skifte til differentiering medier (DMEM, 2% hest serum, 1% insulin, transferrin, selen et supplement, og 100 U/mL af penicillin/streptomycin). Opdater mediet dagligt indtil høsten.
  4. Murine neuroblastom (N2A)
    1. Plade N2A celler med en densitet på 2 x 104 celler/cm2 i vækstmedier, indeholdende en blanding af reduceret serum medium/DMEM indeholdende højt glucose og L-glutamin (1:1, v:v), supplement med 10% FBS og 100 U/ml penicillin/streptomycin. Vedligehold bestanden kultur under 50% sammenhold.
    2. Inducere differentiering af N2A celler, når konfluency nåede 25% til 40%. Skift til differentierings mediet, der indeholder en blanding af reduceret serum medium/DMEM, 1% FBS og 20 μM retinoinsyre i 7 til 10 dage. Opdater mediet hver anden dag indtil celle høsten.
      Bemærk: som N2A celler differentiere, nogle celler bliver runde, løsnes let, og kan undergå apoptose. Vær forsigtig, når du aspirerer og tilføjer kulturmediet til pladerne.
  5. 3T3 L1 murine præ-adipocytter
    1. Oprethold mus 3T3/L1 celler i DMEM med høj glukose, suppleret med 10% FBS og 100 U/mL penicillin/streptomycin. Den adipogent proces er afhængig af sammenløbet af cellerne; derfor ikke lade bestanden kultur vokse over 50% sammenhæng, da højere sammen løb vil forringe evnen af cellerne til at differentiere.
    2. Plade cellerne ved 2 x 104 celler/cm2. Ved denne tæthed, cellerne vil nå sammenløbet i 3 dage.
    3. Inducerer adipogent differentiering to dage efter cellerne når 100% confluency. Induktions medier består af DMEM, der indeholder 10% FBS, 10 μg/mL insulin, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methyxanthin, 1 μM dexamethason og 10 μM troglitazone.
    4. Udskift induktions mediet efter 48 h inkubation til differentierings mediet (DMEM indeholdende 10% FBS og 5 μg/mL insulin). Opdater mediet hver anden dag, indtil høsten. Repræsentative prøver af fuld differentiering indsamles normalt mellem 7 og 10 dage efter adipogent induktion.
      Bemærk: som adipogenesis skrider frem, cellerne bliver runde og har tendens til at løsne let. Vær forsigtig, når du aspirerer og tilføjer kulturmediet til pladerne.
  6. MCF10A celler
    1. Plade MCF10A celler i DMEM/F12 (1:1, v:v), suppleret med 5% FBS, 100 U/mL penicillin/streptomycin, 0,5 μg/mL hydrocortison, 10 μg/mL insulin og 20 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF). Anbefalet såning tæthed er 1 x 105 celler/cm2. Under disse betingelser, cellerne vil nå 100% confluency inden for 4 dage. Opdater mediet hver 2 til 3 dage, indtil høsten.
      Bemærk: MCF10A celler er svære at løsne. Det anbefales at inkuere cellerne i 10 til 15 min ved 37 °C i PBS fri for calcium med 0,5 mM EDTA før trypsinisation.
  7. Madin-Darby canine nyreceller (MDCK)
    1. Plade MDCK celler i DMEM suppleret med 10% FBS og 100 U/mL penicillin/streptomycin. Anbefalet såning tæthed er 1 x 105 celler/cm2, hvor cellerne vil nå 100% confluency inden for 3 dage. Opdater mediet hver 2.
      Bemærk: MDCK-celler er svære at løsne. Det anbefales at inkuere cellerne i 5 til 10 min ved 37 °C i PBS fri for calcium og magnesium før trypsinisation. For at undgå at celle sammenklumpning ikke ophidser pladerne ved at trykke eller ryste kolben, mens de venter på, at cellerne løsnes.

2. prøveforberedelse af pattedyrscelle kulturer til AAS: hel celle-og subcellulær fraktionering

  1. Kultur cellerne af interesse i 55 cm2 plader. Brugen af mindre dyrknings plader kan give prøver med et indhold af metaller under GF-AAS ' detektionsgrænser.
  2. Ekstrakt af hele celler
    1. Aspirer kulturmediet ved hjælp af en vakuum fælde. Sørg for at fjerne alle spor af medier. Skyl cellerne fra de ønskede tidspunkter eller kulturforhold tre gange med iskold PBS fri for calcium og magnesium.
    2. Straks skrabe cellerne fra pladen ved hjælp af en ny plastik celle skraber i 1 mL PBS fri for calcium og magnesium. Prøven overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, og der centrifugeres i 2 min ved 2.000 x g , og supernatanten aspirerer. Protokollen kan sættes på pause her. Opbevar pellet prøverne ved-20 °C eller Fortsæt til trin 2,4.
  3. Subcellulær fraktionering
    1. Aspirer kulturmediet ved hjælp af en vakuum fælde. Sørg for at fjerne alle spor af medier. Skyl cellerne fra de ønskede tidspunkter eller kulturforhold tre gange med iskold PBS fri for calcium og magnesium. Skrabe cellerne af pladen med 1 mL iskold PBS fri for calcium og magnesium.
    2. Prøverne overføres til et 1,5 mL mikrocentrifugerør og opbevares på is. Der centrifugeres i 10 s ved 10.000 x g. Fortsætte hurtig isolation af kerner, hvis metal analyse af cytoplasmatiske og nukleare fraktioner ønskes. Denne procedure vil minimere det potentielle tab af metaller på grund af celle ekstraktion39, 40.
    3. Supernatanten fjernes ved aspiration og gensuspension af celle pillen i 400 μL iskold PBS fri for calcium og magnesium, indeholdende 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), et ikke-ionisk rengøringsmiddel. Overfør 100 μL til et nyt mikrocentrifugerør, og Betragt det som hele celle prøven. Denne alikvot udgør 25% af stikprøven.
    4. Isoler kerner ved at afpipettere cellesuspensionen 5 til 10 gange på is med en P1000-mikropipette spids. Nuklei isolation af epitelial celler kræver en koncentration på 0,5% NP-40. Opnå celle afkobling ved at passere cellesuspensionen gennem en 26 3/4 g nål 10 til 15 gange, efterfulgt af 10 til 15 passager gennem en 30 1/2 G nål.
      Bemærk: Kontrollér nuklei-integriteten med en let mikroskopi ved hjælp af en 40x-målsætning.
    5. Der centrifugeres den resterende celle lyat suspension (300 μL) i 10 s ved 10.000 x g. Supernatanten vil indeholde den cytosoliske fraktion. Overfør 300 μL til et nyt mikrocentrifugerings glas.
    6. Den pellet, der indeholder den nukleare fraktion, skylles i 500 μL PBS uden calcium og magnesium, indeholdende 0,1% NP-40, hvorefter der centrifugeres i 10 s ved 10.000 x g. Supernatanten fjernes, og den pellet, der indeholder kerterne, resuspenderes i 100 μL af samme opløsning.
      Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. Prøverne kan opbevares ved-20 °C.
  4. Lysere cellerne ved tre sonikering cyklusser (30 s on/30 s off, ved 50 kHz, 200 W) for 5 min. kvantificere det totale proteinindhold i prøven af Bradford41.
  5. Udføre kvalitetskontrol af renheden af fraktioner ved Western blot ved hjælp af antistoffer specifikke for enten nukleare (histoner, kromatin remodelers, nukleare matrix proteiner) eller cytosoliske fraktioner (β-Tubulin, β-aktin) (figur 2).
    Bemærk: Brug ikke sonikatorer med en metalspids. Disse kan forurere prøven med metaller.

3. Zn-indholdsanalyse af hele celle-og subcellulære fraktioner af pattedyrscelle kulturer ved atomabsorptionsspektroskopi

  1. Mineraliserer cellekultur prøverne (hele celler eller nukleare fraktioner) ved syre nedbrydning ved hjælp af en tilsvarende mængde koncentreret HNO3 Trace metal grade (forsigtig) i 1 time ved 80 °c, derefter natten over ved 20 °c.
  2. Stop reaktionen ved at tilsætte 30% af reaktions volumenet på H2O2. Prøvevolumenet bringes op på 500 μL med 18 MΩ renset vand.
    Bemærk: HNO3 håndtering skal ske iført kemikalie sikkerhedsbriller, en ansigtsskærm til stænk beskyttelse, handsker, og en godkendt damp åndedrætsværn, hvis tilstrækkelig ventilation (stinkskab) er ikke tilgængelig. Protokollen kan sættes på pause her. Prøverne kan opbevares ved stuetemperatur (RT).
  3. Forbered standardopløsninger og eksperimentelle prøver til Zn-målinger foretaget af AAS udstyret med en grafit ovn.
    1. Der anvendes 2% (v/v) HNO3 -opløsning i deioniseret vand, som kommer fra samme batch, der bruges til standardkurven som den tomme opløsning til kalibrering hele vejen igennem. Brug analysekvalitet standarder fortyndet i 18 MΩ renset vand.
    2. Forbered en standard på 1.000 PPB af Zn fra en kommercielt tilgængelig 1.000 ppm Zn-stamopløsning med 2% (v/v) HNO3 -opløsning i deioniseret vand. Forbered arbejdsstandard opløsninger fra 100 PPB-standarden ved at fortynde den til 5, 8, 10, 15, 20 og 25 PPB direkte med 2% (v/v) HNO3 -opløsning i deioniseret vand. Forbered Zn standarderne og blank med en 0,1% (1 g/L) mg (NO3)2 matrix modifier.
      Bemærk: den LOD Zn er 0,01 PPB (μg/L). Ved at øge koncentrationen af standarderne, var grænsen for linearitet af Zn fast besluttet på at være 20 PPB (figur 3).
    3. Målestandard og prøver under de samme optimerede betingelser: flowhastighed for indførelse af 250 mL/min, injektions temperatur på 20 °C, og GF temperatur på 1.800 °C.
      Bemærk: GF-temperaturen blev forhøjet til 2450 °C for rense trin før injektion af en ny prøve eller standard.
    4. Optimer lampen (C-HCL) til en strøm på 20 A, bølgelængde på 213,9 nm, og slids på 0,7 nm.
    5. Mål de mineraliserede prøver ved hjælp af Zn-Standardkurven for at bestemme metalindholdet. Da små volumener måles, kan prøverne fordampe, hvis målingerne tager lang tid. Derfor anbefales det at tilføje vand til prøverne. Prøverne fortyndes med 18 MΩ renset vand behandlet med 0,01% HNO3 (analytisk kvalitet), hvis de opnåede data ligger uden for bestemmelsesgrænseværdien.
      Bemærk: prøverne fortyndes typisk til et volumen på 500 μL, som anbringes i den automatiserede Autosampler af AAS, der skal måles, lige efter at standardkurven er fastlagt. Den påkrævede volumen skal bestemmes af brugeren og bør overveje endelige beregninger af koncentrationer. Det anbefales at eftergøre Zn-afgørelserne fra AAS af et komplet eksperiment i ét forsøg. Hvis målingerne stoppes midlertidigt, kan det medføre store eksperimentelle variationer og uoverensstemmelser.
  4. Konverter PPB-målingerne til Molaritet som opnået fra Zn målt via AAS. Overvej massen af Zn (65,39 AMU). Dividerer den mængde PPB, der er opnået af AAS, med 63.390.000. I celler spænder Zn-koncentrationerne fra enheder af pmol til μmol.
    1. Dividerer koncentrationen af Zn (pmol eller μmol) med den oprindelige masse af protein i prøven bestemt af Bradford (trin 2,4). Denne beregning vil gøre mængden af metal (pmol eller μmol Zn) indeholdt pr. mg protein i prøven.
      Bemærk: det er vigtigt at overveje de fortyndingsfaktorer, der anvendes under metal målingerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi testede GF-AAS ' evne til at detektere minut niveauer af Zn i pattedyrsceller (figur 1). Således dyrkede vi primære myoblaster afledt af mus satellit celler, og de etablerede cellelinjer N2A (neuroblastoma afledt), 3T3 L1 (adipocytter), MCF10A (bryst epithelium), og MDCK celler (hund nyre epithelium). Først isolerede vi hele celle, cytosolic, og nukleare fraktioner af alle disse celletyper og evalueret renheden af fraktioner af vestlige blot (figur 2). Repræsentativ immun påvisning af kromatin-Remodeler Brg1 og Tubulin som markører for henholdsvis nukleare og cytosoliske fraktioner, påviste egnetheden af den subcellulære fraktionerings protokol, der er beskrevet i afsnit 2,3, til at udføre det elementære analyse (figur 2). Hele celle-og subcellulære fraktioner blev fremstillet som beskrevet ovenfor for GF-AAS-analyser, og kalibrering af udstyret blev udført for at give en typisk lineær standardkurve (figur 3).

Figur 4 viser repræsentative lys mikroskopi billeder af prolifererende og differentierede eller konflydende monolag af hver celletype, og de tilsvarende Zn niveauer for disse. Vigtigere, alle de cellelinjer analyseret i denne undersøgelse viste Zn koncentrationer i nM-området. Der blev imidlertid påvist en differentieret fordeling af metallet. Differentierede primære myorør udviste højere niveauer af Zn end prolifererende celler (figur 4a). Især, meget af ion var placeret til den nukleare fraktion i både prolifererende og differentierende myoblaster. En lignende subcellulær fordeling af Zn blev påvist i Neuro blastoma afledt cellelinje N2A (figur 4b). Men, målinger viste, at N2A celler havde Zn niveauer en størrelsesorden højere end primære myoblaster. På den anden side, den etablerede 3T3-L1 cellelinje udviste højere niveauer af Zn, når præ-adipocytterne var prolifererende end da de blev induceret til at skelne og danne modne adipocytter, der akkumulerer lipider (figur 4c).

Vi målte også Zn indhold i to forskellige etablerede epitel cellelinjer: MCF10A afledt fra humane brystkirtler (figur 4d) og hunden nyre-afledte mdck (figur 4e) celler. Interessant, i begge tilfælde, højere niveauer af Zn i prolifererende celler end i konflydende monolag blev påvist. Men, epitelceller afledt fra brystkirtlen viste metal niveauer, der var 2 gange højere end i nyre cellerne. MCF10A celler viste lige niveauer af Zn mellem cytosoliske og nukleare fraktioner i prolifererende celler. Når MCF10A celler nå sammenløbet, en 40% fald i hele cellen Zn niveauer blev påvist, og metallet fandtes at være mest koncentreret i cytosoliske fraktion (figur 4d). Omvendt, prolifererende mdck celler udstillet højere niveauer af Zn i den nukleare fraktion, sammenlignet med cytosoliske fraktion, men når mdck celler nået sammenløbet, et fald på Zn i hele celler blev påvist, med størstedelen af denne overgang metal observeret i den cytosoliske fraktion (figur 4e).

Figure 1
Figur 1: repræsentativt flowdiagram for elementært (Zn) analyser af dyrkede celler fra pattedyr. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: validering af renheden af fraktioner opnået via den hurtige isolation af nuklei-protokollen 39 af , 40. repræsentativ Western blot fra differentierende primære myoblaster, der viser renheden af subcellulære fraktioner. Den kromatin Remodeler enzym Brg1 blev brugt til at identificere den nukleare fraktion, og Tubulin blev brugt til at identificere den cytosoliske fraktion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kalibreringskurve for Zn-standarder. Repræsentativ standardkurve for Zn bestemt af GF-AAS. GF-AAS blev kalibreret med standard Zn opløsninger fortyndet ved følgende koncentrationer: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 og 30 PPB. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: zinkindhold i forskellige dyrkede pattedyrceller. Repræsentative lysmikrografer og Zn-indhold i hele celleekstrakter og cytosoliske og nukleare fraktioner. Data repræsenterer middelværdien af tre uafhængige biologiske replikater ± SEM. (a) murine primære myoblaster prolifererende og differentierer i 2 dage. (B) murine neuroblastom N2A cellelinje før og efter induktion for at differentiere ved behandling med retinoinsyre. (C) murine 3T3-L1 præ-adipocytter og 6 dage efter differentiering. (D) præ-konflydende og konflydende enkeltlags af den humane bryst epitelial cellelinje MCF10A. (E) præ-konflydende og konflydende enkeltlags af nyre epitelial cellelinje mdck. Data repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter ± SE. elevens t-test viser signifikans, * p ≤ 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Atomabsorptionsspektroskopi er en meget følsom metode til bestemmelse af Zn i små mængder/masse biologiske prøver. Den beskrevne optimering af Zn måling gør anvendelsen af denne metode enkel og garanterer ideelle analytiske betingelser. Her, ved hjælp af GF-AAS, vi bestemt koncentrationen af Zn i hele celler, og i cytosoliske og nukleare fraktioner, fra forskellige cellelinjer. Resultaterne viser, at denne teknik kan sammenlignes med den, der opnås ved fluorescerende sonder og ICP-MS. For eksempel, flere fluorescerende sonder viste labile mitokondriel Zn niveauer i intervallet 0,1 til 300 PM, niveauer i Golgi var under picomolar rækkevidde, og den endoplasmatiske reticulum varierede fra 800 til 5.000 PM42, som er i overensstemmelse med niveauer påvist i cytosoliske fraktioner. Desuden viste den Zn-Responsive fluorophore fluozin-3 akkumulering af labile Zn i små cytosoliske vesikler i MCF10A og i C2C12 celler43,44, som også er i overensstemmelse med den Zn, der er kvantificeret i cytoplasma. Desuden viste Zn-analyser foretaget af vores gruppe fra ICP-MS, at hele celle niveauerne Zn i differentierende primære myotubes45 svarer til dem, der er opnået i denne rapport af GF-AAS. Desuden har eksempler på Zn-bestemmelser i C6-rotte gliom-celler ved hjælp af AAS og zinquin-E46 også givet tilsvarende intervaller til dem, der er observeret i neuroblastom N2A-celler, der anvendes her.

Til dato, forskellige teknikker er blevet udviklet til at detektere Zn i celler. Men, GF-AAS er stadig en præcis og meget følsom teknik, der ikke kun tillader påvisning af gratis Zn, men det også måler metal kompleks bundet og bundet til proteiner og potentielt til små molekyler. Vores gruppe viste for nylig, at målinger udført med celle gennemtrængelig fluorescerende sonde (som har en høj affinitet for at binde gratis Zn2 +) direkte korreleret med niveauerne af Zn DETEKTERET af GF-AAS i prolifererende og differentiere myoblaster 43. de resultater, der opnås ved disse sonder, må dog ikke være repræsentative for hele celle-eller proteinbundne Zn-koncentrationer. Da Zn Desuden findes som en ikke-redox aktiv dyreart og som divalent kation, er det under fysiologiske forhold fortsat en udfordring at opdage den i cellulære systemer. Nye Zn Imaging teknikker er blevet tilgængelige, såsom den state-of-the-art Synchrotron-baserede røntgen Fluorescens mikroskopi, radioisotoper, og laser ablation Induktivt-koblet plasma massespektrometri (LA-ICP-MS). Desværre, nogle af disse teknikker kræver ressourcer utilgængelige for det videnskabelige samfund29,42,47,48,49,50.

Undersøgelser har vist, at ICP-MS er en mere præcis teknik end AAS, da relative standardafvigelsesværdier har vist sig at være lavere i ICP-MS-bestemmelser for metaller som Zn. Den sandsynlige forklaring på denne effekt er, at ICP-MS i sig selv er i stand til at eliminere kemiske interferenser, da de driftsmæssige argon-temperaturer spænder fra 5.000 til 10.000 °C. Nogle kemiske obligationer kan opretholdes ved 3.000 °C, som er i intervallet for AAS operation. Disse obligationer vil blive fuldstændig forstyrret ved over 6.000 °C. Derfor kan disse høje temperaturer, der opnås i plasma tilstanden af ICP-MS, eliminere kemiske interferenser, hvilket fører til bedre detektionsgrænser51. Desuden kræver ICP-MS større volumen prøver sammenlignet med GF-AAS, da sidstnævnte er i stand til at operere med mængder på under 100 μL, hvilket er betydeligt mindre end andre spektroskopiske metoder såsom AAS, ICP-OES eller ICP-MS. I betragtning af de små mængder, der er involveret i metoden, er GF-AAS den ideelle teknik til bestemmelse af Zn koncentrationen i biologiske prøver, primært hvis analysen involverer subcellulære fraktioner, metal detektioner i renset proteiner, eller små variationer i cellulære metalindhold på grund af mutationer i transportører eller metal bindende proteiner29,52. Desuden er GF-AAS-systemets følsomhed med hensyn til at bestemme spor-og ultra-sporings koncentrationerne (PG/mL til ng/mL) en anden fordel.

Der bør tages vigtige hensyn for at sikre pålideligheden af GF-AAS-dataene. Disse omfatter tilstrækkelig kalibrering, integritet af grafit røret, og udvælgelse af passende matrix ændrings for elektro termisk forstøvning. Matrix modifikatorer er kemiske elementer tilsættes til prøven, som påvirker de termiske processer, der finder sted i forstøver. Disse modifikatorer minimerer tabet af analysand under pyrolyse og bidrager til fjernelse af matrixkomponenter. Generelt kan modifikatorer ændre prøve matrixen for at fordampe matrix komponenterne ved lavere temperaturer og kan fungere som analysand stabilisatorer. Ud over disse overvejelser, er det vigtigt at udføre tilstrækkelig optimering af trinene for forstøver temperatur program.

Der bør tages to hovedhensyn, herunder 1), der fastsætter den optimale pyrolyse temperatur, som refererer til den maksimale temperatur ved det forstøbning, hvor der ikke forekommer analysand, og som muliggør en maksimal absorbans af analysand med minimal Baggrund. Man bør også overveje 2) at etablere den optimale forstøvning temperatur, som refererer til den mindstetemperatur, hvor analysand er helt fordampet og registreres som et reproducerbart signal eller Peak. En af ulemperne ved GF-AAS-analyser er element interferens, hvor en grundig optimering og standardisering er afgørende for præcise målinger. Men til dato, GF-AAS udgør et vigtigt redskab i videnskabelig forskning til at detektere metalioner i forskellige biologiske prøver. Fremtidige anvendelser af Zn (og andre metaller) detektionsmetoder af GF-AAS vil omfatte måling af niveauer af metaller i organer og væv fra dyremodeller eller patient biopsier for bedre at forstå specifikke fysiologiske behov for sporstoffer. Afslutningsvis, GF-AAS er præcis, følsom, omkostningseffektiv, og tilgængelig, og denne analytiske teknik vil fortsætte med at forbedre som teknologiske fremskridt bevæge sig fremad for disse detekteringssystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af fakultetet mangfoldighed Scholars Award fra University of Massachusetts Medical School til T.P.-B. N.N.-T. understøttes af SEP-CONACYT, tilskud 279879. J. G. N støttes af National Science Foundation Grant DBI 0959476. Forfatterne er taknemmelige for Dr. Daryl A. Bosco for at levere N2A celle linjen og til Daniella Cangussu for hendes tekniske support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Tags

Biokemi zink atomare absorbans spektroskopi proliferation differentiering pattedyr cellekultur subcellulær fraktionering
Atomabsorptionsspektroskopi til måling af intracellulære zink puljer i pattedyrsceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,… More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter