Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

קווי תאים ראשוניים או מבוססים משמשים בדרך כלל לטיפול בשאלות ביולוגיות ומכניסטיות בסיסיות כגישה ראשונית לפני השימוש במודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין תמציות תאים שלמות ושברים תת-סלולאריים למחקרים של אבץ (Zn) ורכיבי מעקב אחרים עם ספקטרוסקופיה לספיגת האטום.

Abstract

מתכות מעבר הם יסודות חיוניים לאורגניזמים אך יכולים להיות רעילים לתאים בריכוזים גבוהים על ידי התמודדות עם מתכות פיסיולוגיים בחלבונים ויצירת סטרס מחדש. מצבים פתולוגיים המובילים לדלדול מתכות או להצטברות הם סוכנים סיבתיים של מחלות אנושיות שונות. מספר דוגמאות כוללות אנמיה, אקרודרמטיטיס enteropathica, ווילסון ומחלות מנקס. לכן חשוב להיות מסוגל למדוד את רמות והובלה של מתכות מעבר בדגימות ביולוגיות עם רגישות גבוהה ודיוק על מנת להקל על המחקר לחקור כיצד גורמים אלה תורמים פונקציות פיזיולוגיות נורמלית רעילות. אבץ (Zn), למשל, הוא קופקטור במספר רב של חלבונים היונקים, משתתפת באירועים איתות, והוא שליח משני בתאים. בנוסף, Zn הוא רעיל והוא יכול לעכב את ספיגת מתכות אחרות, בעוד בגרעון, זה יכול להוביל למגוון של מצבים קטלניים פוטנציאלי.

התנור גרפיט ספקטרוסקופיית הקליטה האטומית (GF-AAS) מספק שיטה מאוד רגישה ויעילה לקביעת Zn ומעבר ריכוזי מתכת אחרים בדגימות ביולוגיות מגוונות. אלקטרוטרזציה האטומיות דרך GF-AAS ככמת מתכות על ידי הפחתת כמויות קטנות של דגימות עבור ניתוח בליעה סלקטיבית העוקבות באמצעות אורך הגל של עירור של אלמנט העניין. בגבולות היניאריות של חוק בירה-למברט, ספיגת האור על ידי המתכת מידתית באופן ישיר לריכוז האנליטה. לעומת שיטות אחרות של קביעת תוכן Zn, GF-AAS מזהה הן חינם, משלימה Zn בחלבונים ואולי במולקולות תאיים קטנות עם רגישות גבוהה בנפחים מדגם קטן. יתר על כן, GF-AAS הוא גם יותר נגיש בקלות מאשר השראה מצמידים פלזמה מסה מאסיבי (הקאמרי-MS) או סינכרוטרון-רנטגן מבוסס רנטגן. בשיטה זו, ההכנה לדוגמה שיטתית של קווי תאים מתורבתים שונים לניתוחים ב-GF-AAS מתוארת. וריאציות באלמנט מעקב זה הושוו בשני ליטים תא שלם ושברים subcellular של תאים מתרבים והבדיל כהוכחה לעיקרון.

Introduction

מעבר ומתכות כבדות, כגון Zn, Cu, Mn ו-Fe, נמצאים באופן טבעי בסביבה במזון ובחומרים מזהמים. כל האורגניזמים החיים דורשים כמויות שונות של יסודות אלה מיקרו; עם זאת, החשיפה לרמות גבוהות היא מדלטרזה לאורגניזמים. רכישת מתכת היא בעיקר דרך הדיאטה, אבל מתכות יכול גם להיות שאפה או נספג דרך העור1,2,3,4,5. חשוב לציין כי הנוכחות של מתכות חלקיקים אטמוספריים הוא הולך והיה קשור בעיקר לסיכונים בריאותיים. בשל פעילויות אנתרופוגניים, רמות גבוהות של מתכות כבדות כגון Ag, כמו, Cd, Cr, Hg, Ni, Fe, ו-Pb זוהו בחומר חלקיקי אטמוספרי, מי גשמים, ואדמה6,7. מתכות אלה יש פוטנציאל להתחרות עם אלמנטים פיסיולוגיים חיוניים, במיוחד Zn ו-Fe, והם לגרום להשפעות רעילות על ידי הפעלת אנזימים בסיסיים עבור תהליכים ביולוגיים.

אלמנט המעקב zn הוא הנייטרלי מחדש ומתנהג כחומצת לואיס בתגובות ביולוגיות, מה שהופך אותו לקופקטור בסיסי הנחוץ לקיפול חלבונים ולפעילות קטליטית ביותר מ -10% מהחלבונים המיונקים8,9, . עשר מטרים כתוצאה מכך, חיוני לפונקציות פיזיולוגיות שונות8,11. עם זאת, כמו יסודות קורט רבים, יש איזון עדין בין מתכות אלה הקלה על תפקוד פיזיולוגי נורמלי גרימת רעילות. ביונקים, zn הליקויים להוביל אנמיה, הצמיחה פיגור, hypogonadism, מומים בעור, שלשול, התקרחות, הפרעות טעם, דלקת כרונית, ולקויי פונקציות החיסון הנוירולוגי11,12, 13,14,15,16,17,18. עודף, zn הוא ציטוטוקסיים ופוגע בספיגה של מתכות חיוניות אחרות כגון נחושת19,20,21.

בנוסף, כמה מתכות כמו Cu ו-Fe יש את הפוטנציאל להשתתף בתגובות מזיקות. ייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) דרך פנטון כימיה יכול להפריע הרכבה של הברזל ברזל אשכול חלבונים לשנות את חילוף החומרים של השומנים22,23,24. כדי למנוע נזק זה, תאים לנצל מתכת מחייב המלווים ומובילים כדי למנוע אפקטים רעילים. ללא ספק, הומאוסטזיס מתכת חייב להיות נשלט הדוק כדי להבטיח כי סוגי תאים ספציפיים לשמור על רמות הנכון של מתכות. מסיבה זו, יש צורך משמעותי לקדם טכניקות למדידה מדויקת של מתכות קורט בדגימות ביולוגיות. בפיתוח ואורגניזמים בוגרים קיים צורך ביולוגי משלים ברכיבי מעקב ברמה התאית, בשלבים התפתחותיים שונים ובתנאים נורמליים ופתולוגיים. לכן, קביעת מדויק של רקמות ורמות מתכת מערכתית הוא הכרחי כדי להבין אורגאיהמחלת מתכת הומאוסטזיס.

התנור גרפיט האטום האטומי ספקטרומטריה (GF-AAS) היא טכניקה רגישה מאוד בשימוש עבור כרכים מדגם קטן, מה שהופך אותו אידיאלי כדי למדוד מעבר ומתכות כבדות להציג דגימות ביולוגיות וסביבתיות25,26 , בן 27 , 28. יתר על כן, בשל רגישות גבוהה של הטכניקה, זה הוכח להיות מתאים ללמוד את תכונות התחבורה קנס של Na+/k+-Atpase ואת הקיבה H+/k+-atpase באמצעות xenopus אוציטים כמערכת מודל29. ב GF-AAS, את האלמנטים האטומיים בתוך מדגם לקלוט אורך גל של קרינה הנפלטת על ידי מקור אור המכיל את מתכת הריבית, עם הקרינה נספג ביחס לריכוז של האלמנט. עירור האלקטרוני היסודות מתרחש על קליטת הקרינה אולטרה סגולה או לעין בתהליך כימות ייחודי עבור כל אלמנט כימי. בתהליך אלקטרון בודד, ספיגת הפוטון כרוכה באלקטרון העובר מרמת אנרגיה נמוכה יותר לרמה גבוהה יותר בתוך האטום ו-GF-AAS קובע את כמות הפוטונים שנספג על ידי המדגם, אשר פרופורציונאלית למספר קליטת הקרינה רכיבים האטומיזציה בשפופרת הגרפיט.

הסלקטיביות של טכניקה זו נשענת על המבנה האלקטרוני של האטומים, שבו כל אלמנט יש שורה מסוימת ספיגה/פליטת ספקטרלית. במקרה של Zn, אורך גל ספיגת הוא 213.9 ננומטר והוא יכול להיות מכובד בדיוק ממתכות אחרות. בסך הכל, GF-AAS יכול לשמש לכמת Zn עם גבולות נאותה של זיהוי (לוד) ורגישות גבוהה ובסלקטיביות25. השינויים באורך הגל הנספג משולבים ומוצגים כפסגות ספיגת אנרגיה באורכי גל ספציפיים ומבודדים. ריכוז Zn במדגם נתון מחושב בדרך כלל מתוך עיקול רגיל של ריכוזים ידועים על פי חוק בירה-למברט, שבו ספיגת הספיגה ביחס ישיר לריכוז Zn במדגם. עם זאת, החלת משוואת בירה למברט לניתוח GF-AAS גם מציג כמה סיבוכים. למשל, וריאציות בריכוזים האטומזציה ו/או הלא-הומוגניים של הדגימות יכולות להשפיע על מדידות המתכת.

האטווניזציה מתכת נדרש עבור הניתוח GF AAS מעקב היסודות מורכב משלושה צעדים יסודיים. הצעד הראשון הוא desolvation, שבו הממס הנוזלי מתאדה; השארת תרכובות יבשות לאחר שכבשן מגיע לטמפרטורה של כ-100 ° c. אז, תרכובות מתאדה על ידי חימום אותם מ 800 אל 1,400 ° צ' (בהתאם לאלמנט להיות מנותח) ולהיות גז. לבסוף, התרכובות במצב גזי מאטובות בטמפרטורות הנעות בין 1,500 ל-2,500 ° c. כפי שנדונו לעיל, הגדלת ריכוזים של מתכת עניין יהיה להפוך מגדיל פרופורציונלי על ספיגת שזוהו על ידי GF-AAS, עדיין הכבשן מפחית את טווח דינמי של ניתוח, אשר הוא מגוון העבודה של ריכוזים שיכולים להיות נקבעת על-ידי הכלי. לפיכך, הטכניקה דורשת ריכוזים נמוכים ונחישות זהירה של הטווח הדינמי של השיטה על-ידי קביעת לוד והגבלת יניאריות (LOL) של חוק בירה-למברט. לוד הוא הכמות המינימלית הנדרשת לזיהוי חומר, המוגדר כפי שלושה מסטיית התקן של Zn במטריצה. LOL הוא הריכוז המקסימלי שניתן לזהות באמצעות חוק בירה-למברט.

בעבודה זו, אנו מתארים שיטה סטנדרטית לנתח את רמות Zn בתמציות תאים שלמים, cytoplasmic ושברים גרעיניים, ו בתוך מתרבים ומבדילים תאים מתורבתים (איור 1). התאמתי את הבידוד המהיר של פרוטוקול גרעיני למערכות סלולריות שונות כדי למנוע אובדן מתכת במהלך הכנת המדגם. הדגמים הסלולריים בשימוש היו myoblasts העיקרי נגזר מתאי לווין העכבר, מורנין בתאי נוירובלסטומה (N2A או Neuro2A), מורטין 3T3 L1 adipocytes, קו האפיתל של השד בן האדם (MCF10A), ו אפיתל דין-דארבי כליה הכלליים ( MDCK) תאים. תאים אלה הוקמו מתוך ליננים שונים הם מודלים טובים עבור חקירת וריאציות ספציפיות של השושלת של רמות מתכת מבחנה.

ראשי myoblasts נגזר מתאי לווין העכבר מהווים מתאים היטב מודל מבחנה לחקור בידול שריר השלד. התפשטות של תאים אלה הוא מהיר כאשר מתורבת בתנאי סרום גבוה. הבידול לתוך שושלת השרירים נגרמת לאחר מכן על ידי מצבים סרום נמוך30. נוירובלסטומה ממורין (N2A) הוקמה קו התא נגזר ציצה עצבי העכבר. תאים אלה מציגים מורפולוגיה של תאי גזע. ואמבות עם גירוי בידול, התאים הN2A להציג מספר תכונות של נוירונים, כגון הנוירוסיבים. N2A תאים משמשים כדי לחקור את מחלת האלצהיימר, neurite outgrowth, ו רעילות נוירו31,32,33. 3T3-L1 murine לפני adipocytes הוקמה קו התא משמש בדרך כלל כדי לחקור את השינויים מטבולית ופיסיולוגיים הקשורים adipocytes. תאים אלה להציג פיברוהפיצוץ כמו מורפולוגיה, אבל פעם מגורה עבור בידול, הם מציגים הפעלה אנזימטית הקשורים סינתזה השומנים הצטברות טריגליצרידים. זה יכול להיות נצפה כמו שינויים מורפולוגיים לייצר שומנים cytoplasmic טיפות34,35. MCF10A הוא קו האפיתל של החלב שאינם סרטניים שנגזר אישה טרום בגיל הסרטן עם מחלה פיברופיברוזיס של החלב36. הוא שימש רבות למחקרים ביוכימיים, מולקולריים וסלולאריים הקשורים לסרטן הפטמות, כגון התפשטות, העברת תאים ופלישה. דין-דארבי כליות הכלב (MDCK) הקו התא האפיתל השתמשו בהרחבה כדי לחקור את המאפיינים ואירועים מולקולריים הקשורים להקמת האפיתל פנוטיפים. בהגיעם למפגש, תאים אלה הופכים מקוטניים ומקימים הידקויות תא תא, מאפיינים של רקמות אפיתל מיונקים (37).

כדי לבדוק את היכולת של AAS למדוד את רמות Zn בתאי היונקים, ניתחנו שברים שלמים ו-subcellular (ציטוסול וגרעין) של חמש קווי תאים אלה. מדידות AAS הראה ריכוזים שונים של Zn בסוגי תאים אלה. ריכוזים היו נמוכים יותר בהתרבות ומבדילים העיקרי myoblasts (4 כדי 7 nmol/mg של חלבון) ומעלה בארבעה קווי התא הוקמה (החל מ 20 אל 40 nmol/mg של חלבון). קטן לא משמעותי עלייה ברמות Zn זוהה בהבחנה הראשי myoblasts ובתאי נוירובלסטומה בהשוואה לתאים מתרבים. האפקט המנוגד זוהה adipocytes הבדיל. עם זאת, מתרבים 3T3-L1 תאים הציגו ריכוזים גבוהים יותר של המתכת לעומת תאים הבדיל. וחשוב מכך, בשלושת קווי התאים האלה, שבירה משנית הראתה כי Zn הוא מופץ באופן מהותי בציטוסול ובגרעין לפי מצב חילוף החומרים של תאים אלה. למשל, ב מתרבים myoblasts N2A תאים, ו 3T3-L1 טרום-adipocytes, רוב המתכת היא מקומית לגרעין. עם אינדוקציה של בידול באמצעות טיפולי תאים ספציפיים, Zn מקומי הציטוזול בשלושת סוגי תאים אלה. מעניין, שני קווי האפיתל הראו רמות גבוהות יותר של Zn במהלך התפשטות לעומת כאשר הגיע המפגש, שבו נוצר מונאולייר הדוק מאפיין. בתאי האפיתל מתרבים, קו החלב MCF10A היה התפלגות Zn שווה בין הציטוסול והגרעין, בעוד בתוך קו הכליה-נגזר התאים, רוב המתכת היתה ממוקמת בגרעין. בשני סוגי תאים אלה, כאשר התאים הגיעו למפגש, Zn היה ממוקם בעיקר לציטוסול. תוצאות אלה מוכיחים כי GF-AAS היא טכניקה רגישה מאוד מדויק לביצוע ניתוח אלמנטלים בדגימות תשואה נמוכה. GF-AAS בשילוב עם השבר הסלולר והוא יכול להיות מותאם כדי לחקור את הרמות של מעקב רכיבי מתכת קווי תאים שונים ורקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים ממגלית

  1. שיקולים כלליים
    1. בצע את הטכניקות אספטי עבור תרבות התא היונקים בעבר נבדקו38.
    2. שמור על כל קווי התא בתוך מחולל לחות 5%2 חממה ב 37 ° c. תנאי תרבות התא משתנים עבור כל סוג תא. חשוב לשמור על תנאי התרבות המתאימים עבור כל קו תא בשימוש, כמו וריאציות של הליכים אלה יוביל לפנוטיפים חריגה וכישלון של תרבות התא.
    3. הקפד על היכרות עם קו הריבית הסלולרי ובצע את הפרוטוקולים המסופקים עבור כל סוג תא שנבחר עבור ניסויים ספציפיים (ראה מספר דוגמאות להלן).
  2. הליך כללי לטריסיזציה ולהעברת תאים מחסיד
    1. הסר את המדיה של תרבות התא מלוח התרבות על ידי השאיפה.
    2. לשטוף את התאים בעדינות באמצעות PBS ללא סידן ומגנזיום (5 מ"ל לכל 10 ס מ2 שטח התרבות שטח). להוסיף את הפתרון לשטוף לצד של הלוח כדי למנוע ניתוק מונאולייר התא; מערבולת את הצלחת להגדיל את הכיסוי של הפתרון. עבור תאים אפיתל, יש צורך לפשט את התאים עבור 10 עד 15 דקות בחממה ב 37 ° c ב-PBS כדי להקל על הדיסוציאציה של תאים בשלבים הבאים.
    3. הסר את פתרון הכביסה על ידי השאיפה.
    4. להוסיף מספיק מגיב דיסוציאציה (0.25% טריפסין) לצלחת (כ 0.7 מ"ל לכל 10 ס"מ2). מערבולת בעדינות את הצלחת לקבל כיסוי מלא של התא מונאולייר.
    5. דגירה את התרבות בטמפרטורת החדר עבור 2 עד 5 דקות. זמן הדגירה בפועל משתנה עם קו התאים בשימוש, במקרה של תאים אפיתל מומלץ לדגירה עבור 10 עד 15 דקות בחממה ב 37 ° c. צפו בתאים שמתחת למיקרוסקופ. לניתוק תאים
    6. כאשר רוב התאים התנתק, לשחזר את ההשעיה התא ב 5 מ ל של הציפוי טרום מחומם או גידול בינוני (ראה להלן עבור כמה דוגמאות). מכנית הנתק את גושי התא על ידי ליטוף על מונאולייר התא מספר פעמים.
    7. העבר את ההשעיה התא ל 15 מ"ל שפופרת חרוט ו צנטריפוגה אותם ב 1,000 x g עבור 2 כדי 5 דקות. המהירות והשעה הצנטריפוגה משתנות בהתאם לסוג התא. להסיר את התקשורת על ידי שאיפה עדינה, להיזהר לא לגעת את הגלולה התא. השהה מחדש את הגלולה בתוך 5 עד 10 מ ל של בינונית הצמיחה המתאימה טרום הגדילה ולהסיר מדגם לספירה באמצעות הומוציטוטומטר או מונה תאים אוטומטי.
    8. לנצל את הנפח המתאים של השעיית התא כדי לזרע את הצפיפות המומלצת עבור כל קו תא מסוים (ראה להלן כמה דוגמאות). תוספת עם נפח הולם של התקשורת התרבותית בהתאם לגודל של צלחת התרבות ולמקם את התאים בחזרה לתוך החממה.
  3. מקוצר ראשי הנגזר מתאי לווין של העכבר
    1. לפני תחילת, להכין לוחות קולגן מצופה לצמיחה הראשי myoblast חוז. פתרון המכיל 0.02% קולגן, ו 0.05 חומצה אצטית M במים מיועמים חייב להיות מעוקר על ידי סינון עם התקן מסנן סטרילי 0.22 יקרומטר. מודטה את לוחיות התרבות עם פתרון הקולגן לילה ב 37 ° c.
    2. ביום שלמחרת, מייבשים את תמיסת הקולגן, מאפשרים ללוחות להתייבש בארון הסטרילי ולחנות ב -4 ° c עד השימוש.
      הערה: הכרכים המינימליים של הקולגן הם: עבור 35 מ"מ = 1 mL; 60 מ"מ = 2 מ ל; 10 ס מ = 5 מ ל
    3. זרעים ראשי הזרע ב 1 x 104 תאים/cm2 ב 55 ס מ2 לוחיות התרבות מצופה קולגן. התקשורת התפשטות היא מדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)/Ham של מדיה מזון F12 התערובת המכילה 20% סרום בפרה העובר (FBS), 25 ng/mL של גורם צמיחה רקומביננטי basic fibroblastic (FBS), ו 100 U/mL של פניצילין/סטרפטומיצין.
      הערה: מתרבים ותאי מניות צריך להישמר תחת 50% של השטף. מגע התא מעורר את המחויבות של התאים כדי ליצור בידול ופוגע ביכולות הצמיחה של התרבות.
    4. להבדיל את myoblasts לאפשר את התאים כדי להגיע 80% כדי 100% השטף, אשר מתרחשת בדרך כלל אחרי 48 h של ציפוי. לאחר מכן, שנה לבידול מדיה (DMEM, 2% סרום סוסים, 1% אינסולין, העברת, סלניום מוסף, ו 100 U/mL של פניצילין/סטרפטומיצין). רענן את המדיה מדי יום עד למסיק.
  4. נוירובלסטומה (N2A)
    1. צלחת N2A תאים בצפיפות של 2 x 104 תאים/cm2 במדיית גדילה, המכיל תערובת של בינוני סרום מופחת/dmem כיל גלוקוז גבוה ו-גלוטמין (1:1, v:v), תוספת עם 10% Fbs ו 100 U/mL של פניצילין/סטרפטומיצין. שמור על תרבות המניה תחת 50% שליטה.
    2. לגרום הבידול של תאים N2A פעם אחת הגיע 25% כדי 40%. שינוי מדיה בידול המכיל תערובת של סרום מופחת בינונית/DMEM 1% FBS, ו 20 החומצה הרטינואית של μM עבור 7 עד 10 ימים. לרענן את המדיה כל יום אחר עד לקציר התאים.
      הערה: כמו תאים N2A להבדיל, תאים מסוימים הופכים עגול, מתנתק בקלות, ועלול לעבור אפופטוזיס. היזהרו כאשר מיישים ומוסיפים את מדיית התרבות ללוחות.
  5. 3T3 L1 מורנה לפני-אדיפוציטים
    1. לשמור על העכבר 3T3/L1 תאים ב DMEM עם גלוקוז גבוה, שיושלם עם 10% FBS ו 100 U/mL של פניצילין/סטרפטומיצין. התהליך האדיפוגני תלוי במפגש התאים; לכן, לא נותנים לתרבות המניה לצמוח מעל 50% שליטה, כמו המפגש הגבוה יפגע ביכולת של התאים כדי להבדיל.
    2. צלחת התאים ב 2 x 104 תאים/cm2. בצפיפות זו, התאים יגיעו למפגש בעוד 3 ימים.
    3. לגרום בידול ליומיים לאחר התאים להגיע 100% השטף. מדיה אינדוקציה מורכב מזיכרון המכיל 10% FBS, 10 μg/mL אינסולין, 0.5 מ"מ 3-isobutyl וטיל-1-מתיונין, 1 μM dexamethone, ו 10 μM troglitazone.
    4. להחליף את התקשורת אינדוקציה לאחר 48 h דגירה לבידול מדיה (DMEM המכיל 10% FBS, ו 5 μg/mL אינסולין). . לרענן את המדיה כל יומיים עד הקציר דוגמאות מייצגים של בידול מלא נאספים בדרך כלל בין 7 ו 10 ימים לאחר אינדוקציה אדיפוגניים.
      הערה: כאשר אדיפוגנזה מתקדמת, התאים הופכים עגולים ונוטים להתנתק בקלות. היזהרו כאשר מיישים ומוסיפים את מדיית התרבות ללוחות.
  6. תאים MCF10A
    1. צלחת MCF10A תאים ב-DMEM/F12 (1:1, v:v), שיושלם עם 5% FBS, 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 0.5 μg/mL הידרוקורטיזון, 10 μg/mL אינסולין, ו 20 ng/mL מקדם גידול באפידרמיס (EGF). צפיפות הזריעה המומלצת היא 1 x 105 תאים/cm2. בתנאים אלה, התאים יגיעו ל100% שליטה בתוך 4 ימים. רענן את המדיה כל 2 עד 3 ימים עד לקציר.
      הערה: MCF10A תאים קשים לניתוק. מומלץ לאדמת את התאים במשך 10 עד 15 דקות ב 37 ° c ב-PBS ללא סידן עם 0.5 mM EDTA לפני טריסיזציה.
  7. דין-דארבי בתאי כליה כלבים (MDCK)
    1. לוחית MDCK תאים ב Dמאמ בתוספת עם 10% FBS ו 100 U/mL של פניצילין/סטרפטומיצין. צפיפות הזריעה המומלצת היא 1 x 105 תאים/cm2, כאשר התאים יגיעו 100% שליטה בתוך 3 ימים. לרענן את המדיה כל יומיים עד הקציר.
      הערה: בתאי MDCK קשה להתנתק. מומלץ להקלקות את התאים במשך 5 עד 10 דקות ב-37 ° c ב-PBS ללא סידן ומגנזיום לפני טריסיזציה. כדי למנוע כדוריות התאים לא מתפרעים את הצלחות על ידי להכות או לטלטל את הבקבוקון תוך כדי המתנה התאים להתנתק.

2. הכנה לדוגמא של תרבות תא מממית למען AAS: תא שלם ומשבר משנה

  1. תרבות תאי העניין ב55 ס מ2 צלחות. השימוש בלוחות התרבות הקטנים עשוי להניב דגימות עם רמות של מתכות תחת מגבלות הזיהוי של GF-AAS.
  2. תמצית תא שלמה
    1. לשאוב את התקשורת מהתרבות. באמצעות מלכודת ואקום הקפד להסיר את כל העקבות של מדיה. לשטוף את התאים מנקודות הזמן הרצויות או תנאים התרבות שלוש פעמים עם PBS קר קרח ללא סידן ומגנזיום.
    2. מיד לגרד את התאים מהצלחת באמצעות מגרד תא פלסטיק חדש 1 מ ל של PBS חינם של סידן ומגנזיום. העבר את המדגם לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב 2,000 x g ומכה את הסופרנטאנט. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. לחנות דגימות של כליית-20 ° c או להמשיך לשלב 2.4.
  3. שבירה תת-תאית
    1. לשאוב את התקשורת מהתרבות. באמצעות מלכודת ואקום הקפד להסיר את כל העקבות של מדיה. לשטוף את התאים מנקודות הזמן הרצויות או תנאים התרבות שלוש פעמים עם PBS קר קרח ללא סידן ומגנזיום. מגרדים את התאים מהצלחת עם 1 מ ל של PBS קר קרח חינם של סידן ומגנזיום.
    2. העבר את הדגימות לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ושמור על קרח. צנטריפוגה עבור 10 s ב 10,000 x g. המשך בידוד מהיר של גרעינים אם ניתוח מתכת של cytoplasmic ושברים גרעיניים הוא הרצוי. הליך זה יהיה למזער את אובדן פוטנציאלי של מתכות בשל חילוץ התא39, 40.
    3. הסר את supernatant על ידי השאיפה ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב 400 μL של PBS קר קרח חינם של סידן ומגנזיום, המכיל 0.1% Nonidet P-40 (NP-40), כביסה לא יונית. העבר 100 μL אל צינור מיקרוצנטריפוגה חדש ולשקול אותו כמדגם התא כולו. הדגם מייצג 25% מהדוגמה.
    4. לבודד גרעינים על ידי ליטוף ההשעיה התא 5 כדי 10 פעמים על הקרח עם טיפ P1000 מיקרופיפטה. גרעינים בידוד של תאים אפיתל דורש ריכוז של 0.5% NP-40. השג את הדיסוציאציה התא על ידי העברת ההשעיה התא דרך מחט 26 3/4 G 10 כדי 15 פעמים, ואחריו 10 כדי 15 מעברים דרך מחט G 30 1/2.
      הערה: בדוק את שלמות הגרעין על ידי מיקרוסקופ אור באמצעות מטרת 40x.
    5. צנטריפוגה את שארית התא לפני ההשעיה (300 μL) עבור 10 s ב 10,000 x g. . הסופרנטאנט יכיל את השבר הציטוסולסי העבר את ה300 μL לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה.
    6. לשטוף את הגלולה המכילה את השבר הגרעיני ב 500 μL PBS חינם של סידן ומגנזיום, המכיל 0.1% NP-40, ולאחר מכן צנטריפוגה 10 s ב 10,000 x g. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה המכילה את הגרעינים ב-100 μL של אותו פתרון.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן דגימות ב-20 ° c.
  4. Lyse את התאים על ידי שלושה sonication מחזורים (30 s על/30 s off, ב 50 kHz, 200 W) עבור 5 דקות. לכמת את תכולת החלבון הכולל במדגם על ידי ברדפורד41.
  5. לבצע בקרת איכות של טוהר השברים על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים עבור או גרעיני (histones, כרומטין, חלבונים מטריצה גרעינית) או שברים ציטוסולג (β-טובולין, β-actin) (איור 2).
    הערה: אין להשתמש בsonicators עם עצת מתכת. אלה יכולים לזהם את המדגם עם מתכות.

3. בדיקת תוכן של תאים שלמים ושברים תת-סלולאריים של תרביות תאים בעלי ספיגה אטומית

  1. מינרליזציה של דגימות התרבות התא (תא שלם או שברים גרעיניים) על ידי עיכול חומצה באמצעות נפח שווה של HNO3 סימן מתכת מרוכז בכיתה (זהירות) עבור 1 h ב 80 ° c, ולאחר מכן לילה ב 20 ° c.
  2. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 30% של נפח התגובה של H2O2. הביאו את נפח המדגם ל 500 μL עם 18 מים מטוהרים MΩ.
    הערה: HNO3 טיפול צריך להיעשות ללבוש משקפיים בטיחות כימית, מגן פנים להגנה התזה, כפפות, ו אדי מאושר מסכת אם אוורור הולם (מאדים) אינו זמין. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. הכינו פתרונות סטנדרטיים ודוגמאות נסיוניות למדידות Zn על ידי AAS המצויד בכבשן גרפיט.
    1. השתמש 2% (v/v) HNO3 פתרון במים מיוהים, מגיע האצווה זהה המשמש את העקומה הרגילה כפתרון ריק לכיול ברחבי. השתמש בתקני כיתה אנליטית מדולל ב 18 MΩ מים מטוהרים.
    2. להכין תקן של 1,000 ppb של Zn מ מסחרית זמין 1,000 דפי מניות לדקה Zn הפתרון עם 2% (v/v) HNO3 פתרון במים מוכי. הכנת פתרונות סטנדרטיים עבודה מתקן 100 ppb על ידי דילול אותו 5, 8, 10, 15, 20, ו 25 ppb ישירות עם 2% (v/v) HNO3 פתרון במים מאוהים. הכן את תקני Zn ואת הריק עם 0.1% (1 g/L) Mg (NO3)2 מטריצת מטריצה.
      הערה: לוד של Zn הוא 0.01 ppb (μg/L). על ידי הגברת הריכוז של הסטנדרטים, הגבול של יניאריות של Zn נקבע להיות 20 ppb (איור 3).
    3. מדידת תקן ודוגמאות תחת אותם תנאים ממוטבים: שיעור זרימה של הקדמה של 250 mL/min, טמפרטורת ההזרקה של 20 ° c, ו-GF טמפרטורה של 1,800 ° c.
      הערה: טמפרטורת GF הוגדלה ל-2450 ° c עבור מדרגות ניקוי, לפני ההזרקה של דגם חדש או סטנדרטי.
    4. למטב את המנורה (C-HCL) לזרם של 20 A, אורך הגל של 213.9 ננומטר, וחתך של 0.7 ננומטר.
    5. מדדו את הדגימות המינרליזציה באמצעות עקומת Zn כדי לקבוע תוכן מתכת. ככל שכמויות קטנות נמדדות, הדגימות יכולות להתאדות אם המדידות ממשך פרקי זמן ארוכים. לכן, מומלץ להוסיף מים לדגימות. לדלל את הדגימות עם 18 MΩ מים מטוהרים שטופלו עם 0.01% HNO3 (כיתה אנליטית) אם הנתונים שהושגו הוא מעבר ללוד.
      הערה: בדרך כלל, דגימות מדולמות לנפח של 500 μL, להציב את הדגם האוטומטי האוטומטי של AAS להיות נמדד מיד לאחר הקמת עקומת רגיל. אמצעי האחסון הנדרש ייקבע על-ידי המשתמש ועליו לשקול חישובים סופיים של ריכוזים. מומלץ לסיים את הדטרמיניזם של Zn על ידי AAS של ניסוי מלא בניסיון אחד. השהיית המידות עלולה להוביל לווריאציות נסיוניות גדולות ולחוסר עקביות.
  4. המר את מדידות ppb כדי מולד כפי שהושג מ-Zn נמדד באמצעות AAS. שקול את המסה של Zn (65.39 אמו). לחלק את כמות ppb שהושג על ידי AAS על ידי 63,390,000. בתאים, ריכוזים של Zn נע בין יחידות של pmol כדי μמול.
    1. לחלק את הריכוז של Zn (pmol או μa) על ידי המסה הראשונית של החלבון במדגם שנקבע על ידי ברדפורד (שלב 2.4). חישוב זה יהיה להפוך את כמות המתכת (pmol או μto Zn) הכלול עבור mg של חלבון של המדגם.
      הערה: חשוב לשקול את גורמי הדילול שנוצלו במהלך הדטרמיניזם המתכתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בדקנו את היכולת של GF-AAS כדי לזהות רמות דקה של Zn בתאי היונקים (איור 1). לכן, אנו מתורבתים העיקרי myoblasts נגזר מתאי לווין העכבר, ואת קווי התא הוקמה N2A (נוירובלסטומה הנגזרת), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (אפיתל השד), ו MDCK תאים (אפיתל כליה הכלב). ראשית, בודדנו את כל התאים, ציטוסולג ושברים גרעיניים של כל סוגי התאים האלה והעריכו את טוהר השברים באבן החשופה המערבית (איור 2). חיסוני הנציג של remodeler Brg1 כרומטין וטובולין כסמנים של שברים גרעיניים ו ציטוסולקות, בהתאמה, הפגינו התאמה של פרוטוקול השבר הדו הסלולרי המתואר בסעיף 2.3 לבצע את היסודות (איור 2). תא שלם ושברים תת-סלולריים הוכנו כמתואר לעיל עבור מנתח GF-AAS, וכיול של הציוד בוצע כדי להניב עקומת אופייני רגיל ליניארי (איור 3).

איור 4 מציג תמונות מיקרוסקופ אור מייצג של מתרבים והבדיל או conolאיירס של כל סוג תא, ואת רמות zn המקביל עבור אלה. חשוב מכל, כל קווי התא שנותחו במחקר זה הראו ריכוזי Zn בטווח nM. עם זאת, זוהתה התפלגות דיפרנציאלית של המתכת. הובחנות הראשי מיוגטים הציגו רמות גבוהות יותר של Zn מאשר תאים מתרבים (איור 4A). בעיקר, הרבה של יון היה ממוקם שבר גרעיני בשני מתרבים ומבדילים. התפלגות דומה subcellular של Zn זוהה בתוך שורת נוירובלסטומה הנגזרת התא N2A (איור 4B). עם זאת, מדידות הראו כי תאים N2A היה Zn רמות אחד סדר גודל גבוה יותר מאשר myoblasts חזיק ראשוני. מצד שני, הוקמה 3T3-L1 קו התא הציגו רמות גבוהות יותר של Zn כאשר הקדם-adipocytes היו מתרבים מאשר כאשר הם המושרה להבדיל וטופס adipocytes בוגרים הצוברים שומנים (איור 4C).

כמו כן, מדדנו תוכן Zn בשני קווי האפיתל הוקמה שונים: MCF10A נגזר בלוטת החלב האנושית (איור 4D) ואת כליה כליות הנגזרת Mdck (איור 4d) תאים. מעניין, בשני המקרים, רמות גבוהות יותר של Zn בתאים מתרבים מאשר בקונאולאיירס confluent זוהו. עם זאת, התאים האפיתל הנובעים בלוטת החלב הראו רמות מתכת כי היו 2-קיפול גבוה יותר של תאי הכליה. MCF10A תאים הראו רמות שוות של Zn בין ציטוסולג ושברים גרעיניים בתאים מתרבים. לאחר MCF10A תאים להגיע למפגש, 40% ירידה ברמות Zn שלמות התא זוהה, ואת המתכת נמצאה מרוכזת ביותר בשבר ציטוסולג (איור 4D). לעומת זאת, תאים מתרבים MDCK הציגו רמות גבוהות יותר של Zn בחלק הגרעיני, לעומת השבר cytosolic, אבל כאשר התאים MDCK הגיעו למפגש, ירידה של Zn בתאים שלמים זוהה, עם רוב מתכת מעבר זה נצפתה בשבר ציטוסולג (איור 4E).

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה מייצג לניתוח היסודות (Zn) של תאים בעלי מחשב תרבותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ואלידציה של טוהר השברים המתקבלים באמצעות הבידוד המהיר של פרוטוקול הגרעין 39 , 40. הנציג המערבי בכתם מבדילים הראשי myoblasts ראה את הטוהר של שברים תת תאיים. Remodeler האנזים כרומטין Brg1 שימש כדי לזהות את השבר הגרעיני, ו טובולין שימש כדי לזהות את השבר cytosolic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עקומת כיול של התקנים Zn. עקומת התקן הנציג של Zn נקבע על ידי GF-AAS. GF-AAS היה מכויל עם פתרונות Zn סטנדרטיים מדולל בריכוזים הבאים: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, ו 30 ppb. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: רמות האבץ בתאים שונים של היונקים השונים. מיקרוגרפים מייצגים אור ותוכן Zn בתמציות תאים שלמות, ציטוסולג ושברים גרעיניים. הנתונים מייצגים את הממוצע של שלושה משכפל ביולוגי בלתי נפרד ± SEM. (א) Murine הראשי מוכן מתרבים ומבדילים עבור 2 ימים. (ב) מורנין נוירובלסטומה N2A קו התא לפני ואחרי אינדוקציה כדי להבדיל על ידי טיפול חומצה retinoic. (ג) מורלין 3T3-L1 pre-אדיפוציטים ו 6 ימים פוסט בידול. (ד) טרום-שוטפת ושוטפת של קו האפיתל של הפטמות האנושי MCF10A. (ה) טרום-שוטפת ומונאולייר של קו האפיתל של הכליה mdck. נתונים מייצגים את הממוצע של שלושה ניסויים עצמאיים ± SE. התלמיד t-test מראה משמעות, * p ≤ 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ספקטרוסקופית בליעה אטומית היא שיטה רגישה ביותר עבור כימות Zn בדגימות ביולוגיות קטנות של נפח/המוני. אופטימיזציה תיאר של Zn מדידה עושה יישום של שיטה זו פשוטה ערבויות תנאים אנליטיים אידיאליים. כאן, באמצעות GF-AAS, קבענו ריכוז של Zn בתאים שלמים, ו ציטוסולג ושברים גרעיניים, מקווי תאים שונים. התוצאות מראות שטכניקה זו מעבדת בדומה לאלה שהושגו באמצעות בדיקה פלואורסצנטית ובאמצעות הקאמרי-MS. למשל, בבדיקות פלורסנט מספר הראו לבנה מיטוכונדריאלי רמות Zn בטווח של 0.1 עד 300 pM, רמות בגולגי היו מתחת לטווח picomolar, ואת הרשתית האנדופלזמית נע בין 800 כדי 5,000 pM42, אשר עקביים עם רמות זוהה בשברים ציטוסולג. יתר על כן, the zn-fluozin התגובה fluorophore -3 הראה הצטברות של יציב משך zn ב ציטוסולריות קטן ושלפוחיות ב MCF10A ו C2C12 תאים43,44, אשר גם עקביים עם כימות zn בציטופלסמה. יתר על כן, מנתח Zn על ידי הקאמרי-MS בביצוע הקבוצה שלנו הראה כי רמות התאים Zn בהבחנה הראשי מיופופרות45 דומים לאלה שהתקבלו בדוח זה על ידי GF-AAS. בנוסף, דוגמאות של הדטרמיניזם Zn ב-C6 בתאי glioma עכברוש באמצעות AAS ו-Zn ב-E46 יש גם שניתנו טווחים דומים אלה שנצפו בתאי N2A נוירובלסטומה המשמשים כאן.

עד כה, טכניקות מגוונות פותחו כדי לזהות Zn בתאים. עם זאת, GF-AAS נשאר טכניקה מדויקת ורגישה מאוד, כי לא רק מאפשר זיהוי של Zn חינם, אבל זה גם מודד את המתכת משלימה ומאוגד חלבונים, פוטנציאל מולקולות קטנות. הקבוצה שלנו לאחרונה הראה כי מדידות שבוצעו עם תא-חדיר בדיקה פלורסנט (שיש לו זיקה גבוהה לאגד חינם Zn2 +) בקורלציה ישירה עם רמות של zn זוהה על ידי GF-AAS ב מתרבים ומבדילים מmyoblasts 43. עם זאת, התוצאות שהתקבלו על ידי הבדיקות האלה לא יכול להיות נציג של התא כולו או ריכוזי חלבון מאוגד Zn. כמו-כן, מאחר שzn קיים כמין פעיל שאינו מהווה חמצון, וכמו הקטיון, בתנאים פיזיולוגיים, הזיהוי שלו במערכות הסלולר נותר אתגר. הרומן Zn טכניקות הדמיה הפכו להיות זמינים, כגון המדינה-of-the-art מיקרוסקופ סינכרוטרון רנטגן, רדיואיזוטופים, ו אבלציה לייזר מצמידים באופן משולב פלזמה מסה ספקטרומטריה (לה-הקאמרי-MS). למרבה הצער, חלק מהשיטות הללו דורשות משאבים נגישים לקהילה המדעית29,42,47,48,49,50.

מחקרים הראו כי הקאמרי הטוב ביותר הוא טכניקה מדויקת יותר מאשר AAS, כמו ערכי סטיית תקן יחסיים הוכחו להיות נמוכים יותר באופן קבוע ב-הקאמרי-MS למתכות כמו Zn. ההסבר הסביר לאפקט זה הוא שהקאמרי הגבוה ביותר מסוגל לסלק הפרעות כימיות, כאשר הטמפרטורות הפעילות של הארגון נעות בין 5,000 ל-10,000 ° c. קשרים כימיים מסוימים ניתן לשמור ב 3,000 ° c, אשר נמצא בטווח עבור הפעולה AAS. איגרות חוב אלה שובשו לחלוטין בלמעלה מ6,000 ° c. לפיכך, הטמפרטורות הגבוהות הללו הגיעו למצב פלזמה באמצעות הקאמרי האוטומטי-MS יכולה למנוע הפרעות כימיות, המובילות למגבלות זיהוי טוב יותר51. בנוסף, א. ב. א-MS דורש דגימות נפח גדול יותר לעומת GF-AAS, כמו האחרון הוא מסוגל לפעול עם אמצעי אחסון תחת 100 μL, אשר משמעותית פחות מאשר שיטות ספקטרוסקופיות אחרות כגון AAS, הקאמרי המקביל, או הקאמרי-MS. בהינתן הכרכים הקטנים המעורבים בשיטה, GF-AAS היא הטכניקה האידיאלית כדי לקבוע ריכוז Zn בדגימות ביולוגיות, בעיקר אם הניתוח כרוך שברים subcellular, בדיקת מתכת בחלבונים מטוהרים, או וריאציות קטנות בסלולר תוכן מתכת בשל מוטציות ב מובילי או מתכת מחייב חלבונים29,52. בנוסף, את הרגישות של מערכת GF-AAS כדי לקבוע מעקב ו-ultra-מעקב ריכוזי (pg/mL כדי ng/mL) הוא יתרון נוסף.

יש לנקוט שיקולים חשובים כדי להבטיח אמינות של נתוני GF-AAS. אלה כוללים כיול נאותה, שלמות של שפופרת גרפיט, ומבחר של משנה מטריצה מתאימה עבור האטומיות אלקטרוטרזציה. מכפילי מטריקס הם רכיבים כימיים הנוספים למדגם, המשפיעים על התהליכים התרמיים המתרחשים ב-atomizer. מכפילי אלה למזער את ההפסד של האנליטה במהלך פירוליזה ולתרום להסרת רכיבי מטריקס. באופן כללי, המשנים משתנים עשויים לשנות את מטריצת המדגם כדי לאדות את רכיבי המטריצה בטמפרטורות נמוכות יותר ועשויים לפעול כמייצאת מייצבים. בנוסף לשיקולים אלה, חשוב לבצע אופטימיזציה נאותה של השלבים עבור תוכנית הטמפרטורה האטומים.

יש לנקוט בשני שיקולים עיקריים, כולל 1) הקמת טמפרטורת פירוליזה אופטימלית, המתייחסת לטמפרטורה המרבית בשלב הatomization שבה לא מתרחשת הפסד אנליט, והיא מאפשרת ספיגה מקסימלית של האנליטה עם מינימום רקע. יש לשקול גם 2) הקמת הטמפרטורה האטוביזציה האופטימלית, המתייחסת לטמפרטורה המינימלית שבה האנליטה התאדו במלואה ונרשמה כאות או כשיא. אחד החסרונות של מנתח GF-AAS הוא הפרעה אלמנט, שעבורו אופטימיזציה וסטנדרטיזציה יסודית חיוניים למדידות מדויקות. עם זאת, עד כה, GF-AAS מייצג כלי חשוב במחקר מדעי כדי לזהות את יוני מתכת בדגימות ביולוגיות מגוונות. יישומים עתידיים של Zn (ומתכות אחרות) איתור שיטות על ידי GF-AAS יכלול מדידת רמות של מתכות איברים ורקמות המתקבלים מדגמי בעלי חיים או ביופסיות החולה כדי להבין טוב יותר הצרכים הפיזיולוגיים ספציפיים עבור אלמנטים קורט. לסיכום, GF-AAS הוא מדויק, רגיש, חסכוני ונגיש, וטכניקה אנליטית זו תמשיך להשתפר כהתקדמות טכנולוגית מתקדמת קדימה למערכות איתור אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו היתה נתמכת על ידי פרס מגוון הפקולטה מאוניברסיטת מסצ בית הספר לרפואה ט-B. N.N.-טי. נתמך על ידי ספ-CONACYT, גרנט 279879. J. G. N נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע המענק DBI 0959476. המחברים אסירי תודה לד ר דריל א. בוסקו לאספקת הקו הN2A לדניאלה Cangussu לתמיכה הטכנית שלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Tags

ביוכימיה גיליון 147 אבץ ספקטרוסקופיית בליעה אטומית הפצה בידול תרבית תאים מיונקים התפשטות תת-תאית
ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,… More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter