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Biochemistry

포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

배양 된 일차 또는 확립 된 세포 주는 일반적으로 동물 모델을 사용 하기 전에 초기 접근법으로 서 근본적인 생물학적 및 기계적 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 아연 (Zn) 및 원자 흡 광도 분광학이 있는 다른 미 량 원소 연구를 위해 전체 세포 추출 물과 세포 분 획을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

전이 금속은 유기 체에 필수적인 미 량 영양소 이지만 단백질의 생리 금속과 경쟁 하 고 산화 환 원 스트레스를 발생 시켜 높은 농도로 세포에 독성이 있을 수 있습니다. 금속 고갈 또는 축적으로 이끌어 내는 병리학 적 상태는 다른 인간적 인 질병의 인과 대리인입니다. 몇몇 예는 빈혈증, acrodermatitis enteropathica, 및 윌슨의 그리고 Menkes의 질병을 포함 합니다. 따라서 이러한 요소가 정상적인 생리 적 기능에 기여 하는 방법을 탐구 하는 연구를 용이 하 게 하기 위해 높은 민감도와 정확성을 가진 생물학적 시료에서 전이 금속의 수준과 수송을 측정 할 수 있어야 하는 것이 중요 합니다 독성. 아연 (Zn)은 예를 들어 많은 포유류 단백질의 보조 인자이 고, 신호 전달에 관여 하며, 세포에서의 이차 메신저 이다. 과잉에서, Zn은 독성이 며 다른 금속의 흡수를 억제할 수 있으며, 적자 상태에서는 잠재적으로 치명적인 다양 한 조건으로 이어질 수 있습니다.

흑연로 원자 흡수 분 광 법 (GF-AAS)은 다양 한 생물학적 샘플에서 Zn 및 기타 전이 금속 농도를 결정 하는 매우 민감하고 효과적인 방법을 제공 합니다. GF-AAS를 통한 전기 열 분무는 관심 요소의 여기 파장을 사용 하 여 후속 선택적 흡수 분석을 위해 소량의 시료를 분무 하 여 금속을 정량 합니다. 맥주-램버트 법칙의 선형성의 한계 내에서, 금속에의 한 빛의 흡 광도는 분석 물의 농도에 정비례 합니다. Zn 함량을 결정 하는 다른 방법에 비해, GF-AAS는 작은 샘플 용적에서 고감도의 작은 세포내 분자와 단백질의 무료 및 복합 Zn을 모두 검출 합니다. 또한, GF-AAS는 유도 결합 플라즈마 질량 분 광 법 (ICP) 또는 싱크 로트 론 기반 X 선 형광 보다 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 이 방법에서는, GF-AAS에서 분석을 위해 상이한 배양 된 세포 주 들의 체계적인 샘플 준비가 기재 되어 있다. 이 미 량 원소의 변이는 전체 세포 용 해물과 증식 및 분화 된 세포의 소 세포 분 획을 원리의 증거로 서 비교 하였다.

Introduction

아연, Cu, Mn 및 Fe와 같은 전이 및 중 금속은 식품 및 오염 물질의 두 영양소 모두에서 자연적으로 발견 됩니다. 모든 살아있는 유기 체는이 미 량 영양소의 다른 양을 요구 합니다; 그러나, 높은 수준에 노출은 유기 체에 해로운. 금속 수집은 주로 다이어트를 통해, 하지만 금속은 또한 피부를 통해 흡입 또는 흡수 될 수 있다1,2,4,5. 대기 입자에 있는 금속의 존재가 증가 하 고 건강 위험과 크게 연관 되어 있다는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다. 인위적인 활동으로 인하여 Ag와 같은 중 금속의 증가 된 수준, 예컨대 Cd, Cr, Hg, Ni, Fe 및 Pb는 대기 미 립 자 물질, 빗 물 및 토양6에서 검출 되었다. 이러한 금속은 필수 생리 적 미 량 원소, 특히 Zn과 Fe와 경쟁할 가능성이 있으며 생물학적 과정에 대 한 기본 효소를 비활성화 하 여 독성 효과를 유발 합니다.

미 량 원소 Zn은 산화 환 원 중성 이며, 포유류 단백질8,9의 10% 이상에서 단백질 폴딩 및 촉매 활성에 필요한 근본적인 보조 인자를 만드는 생물학적 반응에서 루이스 산으로 서 동작 하며, 10; 따라서 다양 한 생리 기능8,11에 필수적입니다. 그러나, 많은 미 량 원소 처럼, 정상적인 생리 기능을 촉진 하 고 독성을 일으키는 이러한 금속 사이의 섬세 한 균형이 있다. 포유류에서, Zn 결핍은 빈 혈, 성장 지연, hypogonadism, 피부 이상, 설사, 탈모 증, 맛 장애, 만성 염증 및 장애인 면역 및 신경 기능 장애를 야기 한다11,12, 16,17,18. 과량으로, Zn은 세포 독성을 가지 며 구리19,20,21등의 다른 필수 금속의 흡수를 저해 한다.

추가적으로, Cu와 Fe와 같은 몇몇 금속은 유해한 반응에 참여할 가능성이 있습니다. 펜 톤 화학을 통한 반응성 산소 종 (ROS)의 생산은 철 황 클러스터 단백질의 조립을 방해 하 고 지질 대사22,23을변경할 수 있습니다. 이 손상을 방지 하기 위해, 세포는 독성 효과를 방지 하기 위해 금속 결합 샤 페론 및 전송기를 활용 합니다. 의심 할 여 지 없이, 금속 항상성 특정 세포 유형이 금속의 적절 한 수준을 유지 하기 위해 엄격 하 게 제어 해야 합니다. 이러한 이유로 생물학적 시료에서 미 량 금속을 정확 하 게 측정 하기 위한 기술을 발전시키는 데는 상당한 필요성이 있습니다. 발달 하 고 성숙한 유기 체에서 세포 수준, 다른 발달 단계 및 정상 및 병리학 적 조건에서 미 량 원소에 대 한 차등 생물학적 필요성이 존재 합니다. 따라서, 조직 및 전신 금속 레벨의 정밀한 결정은 organismal 금속 항상성 이해에 필요 하다.

흑연로 원자 흡수 분 광 법 (GF-AAS)은 작은 시료 부피에 사용 되는 고감도 기술로 서 생물학적 및 환경적 시료에 존재 하는 전이 및 중 금속을 측정 하는 데 이상적입니다25,26 , 28 , 28. 또한, 기술의 높은 감도로 인해 xenopus 를 사용 하 여 Na +/k+ATPase 및 위 H+/k+-ATPase의 미세한 수송 특성을 연구 하는 데적합 한 것으로 나타났습니다. 모델 시스템으로 서 난 모 세포 (29). GF-AAS에서, 샘플 내의 원자화 된 요소는 관심 있는 금속을 포함 하는 광원에 의해 방출 되는 방사선의 파장을 흡수 하 고, 흡수 된 방사선은 원소의 농도에 비례 합니다. 원소 전자 여기는 각 화학 원소에 대 한 고유 양자화 된 과정에서 자외선 또는 가시 방사선의 흡수에 일어난다. 단일 전자 공정에서, 광자의 흡수는 원자 내에서 더 낮은 에너지 레벨로 이동 하는 전자와 GF-AAS는 샘플에 의해 흡수 되는 광자의 양을 결정 하며,이는 방사선 흡수의 수에 비례 한다 요소는 흑연 튜브에서 원자화.

이 기법의 선택 성은 각 원소에 특정 흡수/방출 스펙트럼 라인이 있는 원자의 전자 구조에 의존 합니다. Zn의 경우, 흡 광도 파장은 213.9 nm이 고, 다른 금속과 정밀 하 게 구별할 수 있다. 전반적으로 GF-AAS는 적절 한 검출 한계 (LOD)와 고감도 및 선택성25를 사용 하 여 Zn을 정량화 하는 데 사용할 수 있습니다. 흡수 된 파장의 변화는 통합 되 고 특정 및 절연 파장에서 에너지 흡수의 피크로 제시 됩니다. 주어진 샘플에서 Zn의 농도는 일반적으로 맥주-램버트 법칙에 따라 알려진 농도의 표준 곡선에서 계산 되며, 여기서 흡 광도는 샘플의 Zn 농도에 정비례 합니다. 그러나 GF-AAS 분석에 맥주 램버트 방정식을 적용 하면 약간의 합병증도 나타납니다. 예를 들어, 샘플의 분무 및/또는 불균일 한 농도의 변동은 금속 측정에 영향을 줄 수 있습니다.

GF AAS 미 량 원소 분석에 필요한 금속 분무는 세 가지 기본 단계로 구성 됩니다. 첫 번째 단계는 액체 용 매가 증발 되는 탈 용 매입니다. 퍼니스 후 건조 화합물을 떠나는 것은 약 100 ° c의 온도에 도달 한다. 이어서, 화합물을 800 내지 1400 ° c에서가 열 하 여 기화 시켜 (분석 하고자 하는 원소에 따라) 기체가 된다. 마지막으로, 기체 상태의 화합물은 1500에서 2500 ° c 까지의 온도 범위에서 원자화 됩니다. 상기 논의 된 바와 같이, 관심 금속의 농도 증가는 GF-AAS에 의해 검출 된 흡수에 비례 증가를 렌더링 하지만, 퍼니스는 분석의 동적 범위를 감소 시킬 수 있는 농도의 작동 범위 기기에 의해 결정 됩니다. 따라서,이 기술은 낮은 농도를 요구 하 고 비어 있는 램버트 법칙의 LOD 및 선형성의 한계를 결정 함으로써 방법의 동적 범위에 대 한 신중한 결정을 필요로 한다. LOD는 물질을 검출할 때 필요한 최소 수량으로, 매트릭스에서 Zn의 표준 편차를 3 배로 정의 합니다. LOL은 맥주 램버트 법을 사용 하 여 검출 될 수 있는 최대 농도 이다.

이 작업에서는 전체 세포 추출 물, 세포질 및 핵 분 획 및 증식 및 분화 배양 세포에서 Zn의 수준을 분석 하는 표준 방법을 설명 합니다 (그림 1). 우리는 샘플 준비 중 금속 손실을 방지 하기 위해 다른 세포 시스템에 핵 프로토콜의 급속 한 격리를 조정 했습니다. 사용 된 셀룰러 모델은 마우스 위성 세포, 뮤 린 신경 모 세포종 세포 (N2A 또는 Neuro2A), 뮤 린 3T3 L1 지방 세포내, 인간 비 종양 유 방 상피 세포 주 (MCF10A) 및 상피 마 딘-다 비 개 신장 ( MDCK) 셀입니다. 이 세포는 다른 계보에서 설립 된 및 시험관에서금속 수준의 계보 특정 변화를 조사 하기 위한 좋은 모델.

마우스 위성 세포에서 유래 된 1 차 myoblasts은 골격 근육 분화를 조사 하기에 적합 한 시험관 내 모델을 구성 합니다. 이러한 세포의 증식은 높은 혈 청 조건 하에서 배양 할 때 빠르다. 근육 혈통으로의 분화는 저 혈 청 조건30에 의해 유도 된다. 뮤 린 신경 모 세포종 (N2A) 확립 된 세포 주는 마우스 뉴 럴 크레스트 로부터 유래 되었다. 이들 세포는 뉴런 및 아메바 줄기 세포 형태학을 제시 한다. 분화 자극 시, N2A 세포는 신경 필 라 멘 트와 같은 뉴런의 여러 성질을 제시 한다. N2A 세포는 알츠하이머병을 조사 하기 위해 사용 되는, 신경 근 성장, 및 신경 독성31,32,33. 3T3-L1 뮤 린 전 지방 세포는 지질 생성과 관련 된 대사 및 생리 적 변화를 조사 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 이들 세포는 섬유 아 세포 유사 형태학을 제시 하지만, 일단 분화에 자극을 주며, 지질 합성과 중성 지방 축적과 관련 된 효소 활성화를 제시 한다. 이는 세포질 지질 방울34,35을 생성 하기 위한 형태학 적 변화로 관찰 될 수 있다. MCF10A는 유 방 섬유 낭 성 질환36을 가진 폐 경전 여성에서 유래한 비 종양 유 방 상피 세포 라인 이다. 이는 증식, 세포 이동 및 침략과 같은 유 방 발암 물질과 관련 된 생화학 적, 분자 및 세포 연구에 널리 사용 되 고 있습니다. 마 딘-다가 개 신장 (MDCK) 상피 세포 주는 광범위 하 게 사용 되어 상피 표현 형의 확립과 관련 된 특성 및 분자 사건을 조사 한다. 합류에 도달 하면,이 세포는 편광 되 고 세포 세포 유착을 확립, 포유류 상피 조직의 특성37.

포유동물 세포에서의 Zn 수준을 측정 하는 AAS의 능력을 시험 하기 위해, 우리는 이들 5 개의 세포 주 들의 전체 및 세포 분 획 (사이토 졸 및 핵)을 분석 하였다. AAS 측정은 이러한 세포 유형에 서 Zn의 상이한 농도를 보여주었다. 농도는 4 개의 확립 된 세포 주 (단백질의 20에서 40 nmol/mg에 이르기까지)에서 증가 하 고 1 차적인 myob(4~7nmol/mg 단백질)의 분화에서 더 낮다. 아연 수준에서 작은 비 중요 한 증가는 세포 증식에 비교 될 때 일차 myoblasts 및 신경 모 세포종 세포를 차별화에서 검출 되었다. 분화 된 지방 세포에서 반대 효과가 검출 되었다. 그러나 3T3-L1 세포 증식은 분화 된 세포에 비해 금속의 높은 농도를 나타내 었 다. 중요 하 게도, 이러한 3 개의 세포 주에서, 세포 분별은 Zn이 이들 세포의 대사 상태에 따라 사이토 졸 및 핵에 차별적으로 분포 되어 있음을 보여주었다. 예를 들어, 증식에 있어서, N2A 세포 및 3T3-L1 사전 지방 세포, 금속의 대다수는 핵에 국한 된다. 특정 세포 처리를 사용 하 여 분화의 유도 시, 아연은이 세 가지 세포 유형에 서 사이토 졸에 국한. 흥미롭게도, 둘 다 상피 세포 라인은 특성 꽉 단층 형성 된 합류에 도달 했을 때에 비해 증식 시 Zn의 높은 수준을 보였다. 상피 세포 증식에서, 유 방 세포 주는 사이토 졸과 핵 사이에 동등한 Zn 분포를 MCF10A, 신장 유래 세포 주는 대부분의 금속이 핵에 위치 하였다. 이 두 세포 유형에 서, 세포가 합류에 도달 하면, Zn은 주로 사이토 졸에 위치 하였다. 이러한 결과는 GF-AAS가 저 수율 샘플에서 원소 분석을 수행 하기 위한 매우 민감하고 정확한 기술 이라는 것을 보여줍니다. GF-AAS는 세포 분 획과 결합 하 고 다른 세포 주 및 조직에서 미 량 금속 원소의 레벨을 조사 하도록 조정할 수 있습니다.

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Protocol

1. 포유류 세포 배양

  1. 일반 고려 사항
    1. 포유류 세포 배양에 대 한 무 균 기술에 따라 이전에 검토38.
    2. 37 ° c에서가 습 된 5% CO2 인큐베이터에서 모든 세포 주를 유지 한다. 세포 배양 조건은 각 세포 유형에 따라 달라 집니다. 사용 된 각 세포 주의 적절 한 배양 조건을 유지 하는 것이 중요 하며, 이러한 절차의 변화로 인해 세포 배양의 변종 표현 형과 실패로 이어질 것입니다.
    3. 관심 있는 셀 라인과 친분을 유지 하 고 특정 실험을 위해 선택한 각 셀 유형에 제공 된 프로토콜을 따르십시오 (아래 몇 가지 예 참조).
  2. 부착 세포의 trypsinization 및 전달에 대 한 일반 절차
    1. 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡 인에 의해 제거 한다.
    2. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS를 사용 하 여 세포를 부드럽게 씻으 세요 (10cm 당 5 mL의 배양 표면적). 플레이트의 측면에 세척 용액을 추가 하 여 세포 단층을 분리 하지 마십시오. 용액의 커버리지를 최대화 하기 위해 플레이트를 소용돌이. 상피 세포의 경우, 다음 단계에서 세포의 해리를 촉진 하기 위해 PBS에서 37 ° c에서 배양 기에서 10 ~ 15 분 동안 세포를 배양 할 필요가 있다.
    3. 흡 인에 의해 세척 용액을 제거 한다.
    4. 플레이트에 충분 한 해리 시 약 (0.25% 트립 신)을 추가 하십시오 (10cm 당약 0.7 mL). 플레이트를 부드럽게 스 월 하 여 세포 단층의 완벽 한 커버리지를 얻으십시오.
    5. 실 온에서 2 ~ 5 분간 배양 합니다. 실제 배양 시간은 사용 되는 세포 라인에 따라 다르지만, 상피 세포의 경우에는 37 ° c에서 인큐베이터에서 10 ~ 15 분 동안 배양 하는 것이 권장 된다. 세포 분리를 위한 현미경의 밑에 세포를 관찰 하십시오.
    6. 대부분의 세포가 분리 되었을 때, 미리 데워 진 도금 또는 성장 배지의 5 mL에 있는 세포 현 탁 액을 회복 합니다 (몇 가지 예는 아래 참조). 세포 단층을 여러 번 피 펫 팅 하 여 기계적으로 해리 된 세포 덩어리.
    7. 15 mL 원추형 튜브로 세포 현 탁 액을 전송 하 고 2 ~ 5 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리기. 원심 분리 속도와 시간은 세포 유형에 따라 달라 집니다. 세포 펠 릿을 만지지 않도록 조심 하면서 부드러운 포부로 미디어를 제거 하십시오. 적절 하 게 미리 데워 진 성장 배지의 5 내지 10ml에서 세포 펠 렛을 소생 하 고, 혈 세포 계 또는 자동 세포 카운터를 이용 하 여 카운팅 하기 위한 샘플을 제거 한다.
    8. 세포 현 탁 액의 적절 한 부피를 활용 하 여 각 특정 세포 라인에 대 한 권장 밀도를 시드합니다 (몇 가지 예는 아래 참조). 배양 접시의 크기에 따라 배양 배지를 적절 한 부피로 보충 하 고 세포를 인큐베이터에 다시 배치 한다.
  3. 마우스 위성 셀에서 파생 된 1 차 myoblasts
    1. 시작 하기 전에, 1 차 묘 블 라스트 성장을 위한 콜라겐 코팅 플레이트를 준비 하십시오. 0.02% 콜라겐을 함유 하는 용액 및 탈 이온 수 중의 0.05 M 아세트산은 0.22 µm 멸 균 필터 장치로 여과 하 여 멸 균 해야 합니다. 37 ° c에서 밤새 콜라겐 용액으로 배양 플레이트를 배양 하였다.
    2. 다음날, 콜라겐 용액을 흡 인 하 고, 플레이트를 멸 균 캐비닛에 공기 건조 시켜 사용 하기 전까지 4°c에서 보관 하십시오.
      참고: 콜라겐의 최소 볼륨은 다음과 같습니다: 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10cm = 5 mL
    3. 종자 1 차 myoblasts x 104 셀/2cm 2 에서 55 콜라겐 코팅 배양 접시. 상기 증식 배지는 Dulbecco의 변성 독수리 배지 (DMEM)/햄의 F12 영양 혼합 배양 배지를 포함 하 여 20%의 태아 소 혈 청 (FBS), 25 ng/mL의 재조합 염기 성 섬유 성장 인자 (FGF) 및 100의 페니실린/streptomycin.
      참고: 증식 및 주식 세포는 콘 유창의 50% 미만으로 유지 되어야 합니다. 세포 접촉은 myogenic 분화에 세포의 투입을 유도 하 고 배양의 성장 능력을 손상 시킵니다.
    4. 기본 myoblasts을 차별화 하기 위해, 세포가 도금의 48 h 후에 일반적으로 발생 하는 80%의 약 100%에 도달 할 수 있습니다. 그런 다음 분화 배지 (DMEM, 2% 말 혈 청, 1% 인슐린, 트랜스 페 린, 셀레늄 보충 및 페니실린/streptomycin의 100)로 변경 하십시오. 수확 할 때까지 매일 미디어를 새로 고칩니다.
  4. 뮤 린 신경 모 세포종 (N2A)
    1. N2A 세포를 성장 매체에 2 x 104 세포/2cm2 의 농도로 플레이트 하 고, 고 혈당 및 L-글루타민 (1:1, v:v)을 함유 하는 감소 된 혈 청 중간/DMEM의 혼합물을 함유 하 고, 10% FBS 및 100의 페니실린/streptomycin를 보충 한다. 재고 배양을 50% 미만으로 유지 합니다.
    2. N2A 세포의 분화를 유도 한 후에는 25 ~ 40%에 도달 합니다. 감소 된 혈 청 배지/DMEM의 혼합물을 함유 하는 분화 매체로의 변화, 1% FBS 및 7 ~ 10 일 동안 20 µ M 레 틴 산. 세포 수확까지 매일 미디어를 새로 고칩니다.
      참고: N2A 세포가 분화 함에 따라 일부 세포는 둥글게 되어 쉽게 분리 되며 아 폽 토시 스를 겪을 수 있습니다. 흡 기 및 플레이트에 배양 배지를 추가 할 때 주의 하십시오.
  5. 3T3 L1 뮤 린 지방 세포 전
    1. 10% FBS 및 100의 페니실린/streptomycin로 보충 된 높은 포도 당과 함께 DMEM에 마우스 3T3/L1 세포를 유지 하십시오. 지방 형성 과정은 세포의 합류에 의존; 따라서, 더 높은 합류는 분화 하는 세포의 능력을 손상 시킬 것 이기 때문에 주식 문화가 50% 이상 성장 하 게 하지 마십시오.
    2. 셀을 2 x 104 셀 /cm2로 플레이트 합니다. 이 밀도에서, 세포는 3 일에 합류에 도달 합니다.
    3. 세포가 100% confluency 하 게 도달한 후 2 일 후에 지질 분화를 유도 합니다. 유도 매체는 10% FBS, 10 μ g/m l 인슐린, 0.5 mM 3-이 소부 틸 methyxanthine, 1 DMEM의 덱 사 메타 손과 10 μ m troglitazone을 포함 하는 것으로 구성 된다.
    4. 48 시간 후에 유도 매체를 대체 하 여 분화 배지 (DMEM를 포함 하는 10% FBS와 5 μ g/m l 인슐린)를 배양 한다. 수확 할 때까지 매일 미디어를 새로 고칩니다. 완전 분화의 대표적인 샘플은 일반적으로 지질 유도 후 7 및 10 일 사이에 수집 된다.
      참고: 지방 형성이 진행 됨에 따라 세포가 둥글게 되어 쉽게 분리 되는 경향이 있습니다. 흡 기 및 플레이트에 배양 배지를 추가 할 때 주의 하십시오.
  6. MCF10A 세포
    1. DMEM 1:1, v:v)에서 5% FBS, 100 MCF10A 페니실린/streptomycin 0.5 µ/g 인슐린 및 20 ng/m l의 표 피 성장 인자 (EGF)로 보충 된 세포를 플레이트. 권장 시 딩 밀도는 1 x 105 셀/cm2입니다. 이러한 조건에서 세포는 4 일 이내에 100%의 유창 함에 도달 할 것입니다. 수확 할 때까지 매 2 ~ 3 일 마다 미디어를 새로 고칩니다.
      참고: MCF10A 셀은 분리 하기가 어렵습니다. Trypsinization 전에 0.5 mM EDTA를 사용 하 여 칼슘이 없는 PBS에서 37 ° c에서 10 ~ 15 분 동안 세포를 배양 하는 것이 좋습니다.
  7. 마 딘-다 위 신장 세포 (MDCK)
    1. DMEM에서 MDCK 세포를 10% FBS 및 페니실린/streptomycin의 100을 보충 했습니다. 권장 파 종 밀도는 세포가 3 일 이내에 약 100%에 도달 하는 1 x 105 세포/cm2입니다. 수확 할 때까지 매 2 일 마다 미디어를 새로 고칩니다.
      참고: MDCK 셀은 분리 하기가 어렵습니다. Trypsinization에 칼슘과 마그네슘을 함유 하지 않은 PBS에서 37 ° c에서 5 ~ 10 분 동안 세포를 배양 하는 것이 좋습니다. 세포 응집을 방지 하기 위해 세포가 분리 되기를 기다리는 동안 플라스 크를 쳐서 흔들어 플레이트를 교 교 하지 마십시오.

2. 포유동물 세포 배양 시료 준비 AAS: 전체 세포 및 세포 분별

  1. 55에 관심 있는 세포를 배양 하는2 접시. 더 작은 배양 플레이트의 사용은 GF-AAS의 검출 한계 하에서 금속의 수준으로 샘플을 산출 할 수 있습니다.
  2. 전체 세포 추출 물
    1. 진공 트랩을 이용 하 여 배양 배지를 흡 기 한다. 미디어의 모든 흔적을 제거 해야 합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 얼음 차가운 PBS로 원하는 시간 또는 배양 조건에서 3 회 세포를 세 번 헹 구 십시오.
    2. 새로운 플라스틱 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 플레이트에서 세포를 즉시 긁어 내어 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 1 mL에. 샘플을 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 전달 하 고 2000 x g 에서 2 분 동안 원심 분리 하 고 상층 액을 흡입 합니다. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. -20°c에서 펠 릿 샘플을 저장 하거나 2.4 단계로 진행 합니다.
  3. 세포 분별
    1. 진공 트랩을 이용 하 여 배양 배지를 흡 기 한다. 미디어의 모든 흔적을 제거 해야 합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 얼음 차가운 PBS로 원하는 시간 또는 배양 조건에서 3 회 세포를 세 번 헹 구 십시오. 칼슘과 마그네슘이 없는 얼음 차가운 PBS 1 mL로 플레이트에서 세포를 긁어 냅니다.
    2. 샘플을 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮겨 얼음을 보관 하십시오. 1만 x g에서 10 초 동안 원심 분리기. 세포질 및 핵 분 획의 금속 분석이 필요한 경우 핵의 급속 한 분리를 계속 합니다. 이 절차는 세포 추출39, 40에의 한 금속의 잠재적 손실을 최소화 한다.
    3. 400 μ l의 세포를 흡 인 및 소생 시켜 서 상층 액을 제거 하 고, 0.1% 비-40 (NP-40)을 함유 하는 칼슘 및 마그네슘을 포함 하는 얼음 차가운 PBS가 아닌 이온 성 세제 이다. 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 100 μ l를 전달 하 고 전체 세포 샘플로 고려 하십시오. 이 샘플의 25%를 나타냅니다.
    4. P1000 마이크로 피 펫 팁으로 얼음에 세포 서 스 펜 션을 5 ~ 10 회 피 펫 팅 하 여 핵을 분리 합니다. 상피 세포의 핵 분리는 0.5% NP-40의 농도가 필요 합니다. 세포 현 탁 액을 26 ¾ G 바늘을 통해 10 ~ 15 회 통과 시켜 세포 해리를 달성 하 고, 30 ½ 바늘을 통해 10 ~ 15 통로를 통과 시켰다.
      주: 40x 대물 렌즈를 사용 하 여 광 현미경으로 핵 완전성을 확인 하십시오.
    5. 1만 x g에서 10 초 동안 남은 세포 용 해물 현 탁 액 (300 μ l)을 원심 분리기. 상기 상층 액은 사이토 솔 릭 분 획 물을 함유 한다. 300 μ l을 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
    6. PBS 500 μ l에서 핵 분 획을 함유 하는 펠 렛을 0.1% NP-40을 함유 하는 칼슘 및 마그네슘과 함께 헹 구 고, 1만 x g에서 10 초 동안 원심 분리기. 상기 상층 액을 제거 하 고 동일한 용액의 100 μ l에 핵을 함유한 펠 렛을 소생 시켰다.
      참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 샘플은-20°c에서 보관할 수 있습니다.
  4. 3 개의 초음파 사이클 (30son/30soff, 50 kHz, 200 W)으로 세포를 분해 하 여 5 분간 41 시료의 총 단백질 함량을 정량화 합니다.
  5. 핵 (히 돌, 염색 질 remodelers, 핵 기질 단백질) 또는 시 토 졸 분 획에 특이 적인 항 체를 이용한 웨스턴 블랏에의 한 분 획 물의 순도에 대 한 품질 관리를 수행 한다 (도 2).
    참고: 금속 팁과 함께 sonicators를 사용 하지 마십시오. 이들은 금속으로 샘플을 오염 시킬 수 있습니다.

3. 원자 흡 광도 분 광 법에의 한 포유류 세포 배양 물의 전체 세포 및 세포의 소 각 부분에 대 한 Zn 함량 분석

  1. 80 ° c에서 1 시간 동안 동량의 HNO3 미 량 금속 (주의)을 사용 하 여 산 소화에 의해 세포 배양 시료 (전체 세포 또는 핵 분 획)를 광물 화 한 다음 20°c에서 밤새 한다.
  2. H2의 반응 부피의 30%를 첨가 하 여 반응을 중지한다. 시료 부피를 18 m ω의 정제 수로 500 μ l로 가져 오십시오.
    참고: HNO3 취급은 화학 안전 안경, 스플래시 보호를 위한 얼굴 방패, 장갑을 착용 하 고 적절 한 환기 (흄 후드)를 사용할 수 없는 경우 승인 된 증기 호흡기를 사용 해야 합니다. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 샘플은 실 온 (RT)에서 보관할 수 있습니다.
  3. 흑연로를 장착 한 AAS에의 한 Zn 측정을 위한 표준 솔루션과 실험 시료를 준비 합니다.
    1. 표준 곡선에 사용 된 것과 동일한 일괄 처리를 통해 전체 교정을 위한 빈 솔루션으로 제공 되는, 탈 이온 수에 2%의 HNO3 솔루션을 사용 합니다. 18 m ω 정제 수에 희석 된 분석 등급 표준을 사용 합니다.
    2. 탈 이온 수에서 2% HNO3 용액을 사용 하 여 시판 되는 1000 ppm zn 재고 용액 으로부터 1000 Ppb의 zn을 제조 한다. 5, 8, 10, 15, 20 및 25 ppb를 탈 이온 수에 2% HNO3 용액으로 직접 희석 하 여 100 ppb 표준에서 작동 하는 표준 솔루션을 준비 합니다. Zn 표준 및 블랭크를 0.1% (1g/l)2 매트릭스 한정자로 준비 합니다.
      참고: Zn의 LOD는 0.01 ppb (µ/g)입니다. 표준의 농도를 증가 시켜 Zn의 선형성의 한계를 20 ppb로 판정 하였다 (도 3).
    3. 동일한 최적화 된 조건에서 표준 및 샘플 측정: 250 mL/min의 도입 유량, 20°c의 사출 온도 및 GF 온도 1800 ° c.
      주: GF 온도는 새로운 샘플 또는 표준의 주입 전에 청소 단계를 위해 2450 ° c로 증가 되었다.
    4. 램프 (C-HCL)를 20a의 전류, 213.9 nm의 파장 및 0.7 nm의 슬릿으로 최적화 합니다.
    5. 금속 함량을 결정 하기 위해 Zn 표준 곡선을 사용 하 여 광물 화 된 샘플을 측정 합니다. 작은 부피를 측정 하면, 측정 시간이 오래 걸릴 경우 샘플이 증발 할 수 있습니다. 따라서 샘플에 물을 추가 하는 것이 좋습니다. 얻어진 데이터가 LOD를 벗어난 경우, 0.01% HNO3 (분석 학년)으로 처리 된 18 m ω 정제 수로 샘플을 희석 하십시오.
      참고: 일반적으로 샘플은 500 µ L의 부피로 희석 되어 표준 곡선이 확립 된 직후에 AAS의 자동 오토 샘플러에 배치 됩니다. 필요한 볼륨은 사용자가 결정 해야 하며 농도의 최종 계산을 고려해 야 합니다. 한 번의 시도로 전체 실험의 AAS에의 한 Zn 결정을 마무리 하는 것이 좋습니다. 측정을 일시 중지 하면 큰 실험적 변화와 불일치가 발생할 수 있습니다.
  4. AAS를 통해 측정 된 Zn에서 얻은 것과 같이 ppb 측정을 몰 농도로 변환 합니다. 아연의 질량을 고려 (65.39 amu). AAS에 의해 얻어진 ppb의 양을 6339만으로 나눕니다. 세포에서 Zn 농도는 pmol 단위에서 µmol에 이르기까지 다양 합니다.
    1. 아연 (pmol 또는 µmol)에 의해 결정 된 샘플의 단백질의 초기 질량을 브래드 퍼 드 (단계 2.4)의 농도로 나눈다. 이 계산은 샘플의 단백질의 mg 당 포함 된 금속 (pmol 또는 µmol Zn)의 양을 렌더링 한다.
      참고: 금속 측정 중에 사용 되는 희석 계수를 고려 하는 것이 중요 합니다.

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Representative Results

우리는 포유류 세포에 있는 Zn의 분 수준을 검출 하는 GF-AAS의 능력을 시험 했습니다 (그림 1). 따라서, 우리는 마우스 위성 세포 로부터 유래 된 1 차 myoblasts (신경 모 세포종 유래), 3T3 L1 (지방 세포), MCF10A 및 MDCK 세포 (개 신장 상피)를 배양 하였다. 먼저, 이러한 모든 세포 유형의 전체 세포, 사이토 솔 릭 및 핵 분 획을 분리 하 고 웨스턴 블랏으로 분 획 물의 순도를 평가 하였다 (도 2). 핵 및 시 토 졸 분 획의 마커로 서의 크로마 틴 하청업 Brg1 및 투뷜의 대표적인 면역 검출은, 각각의 원소를 수행 하는 2.3 섹션에 기재 된 부 세포 분별 프로토콜의 적합성을 입증 분석 (그림 2). 전체 세포 및 소 세포 분 획을 GF-AAS 분석을 위해 전술한 바와 같이 제조 하 고, 장비의 교정을 실시 하 여 일반적인 선형 표준 곡선을 얻었다 (도 3).

도 4 는 각 세포 타입의 증식 및 분화 또는 confluent 단층의 대표적인 광 현미경 이미지 및 이들에 상응 하는 Zn 수준을 보여준다. 중요 하 게는, 본 연구에서 분석 된 모든 세포 주는 nM 범위의 Zn 농도를 보여주었다. 그러나, 금속의 미분 분포가 검출 되었다. 분화 된 1 차 근 관은 증식 세포 보다 더 높은 수준의 Zn을 나타내 었 다 (도 4a). 특히, 이온의 대부분은 확산 및 분화 myoblasts 모두에서 핵 분 획에 위치 했다. 유사 세포 내 Zn의 분포를 신경 모 세포종 유래 세포 라인 N2A에서 검출 하였다 (도 4b). 그러나, 측정은 N2A 세포가 1 차 myoblasts 보다는 크기의 1 개 순서 Zn 수준을가지고 있다는 것을 보여주었습니다. 한편, 확립 된 3T3-L1 세포 주는 지질이 축적 되는 지방 세포를 분화 및 형성 하는 것이 유도 되었을 때 보다 지방 세포가 증식 하였을 때 더 높은 수준의 Zn을 나타내 었 다 (도 4c).

우리는 또한 두 개의 다른 확립 된 상피 세포 라인에서 아연 함량을 측정: 인간의 유선에서 파생 된 MCF10A (그림 4d) 그리고 개 신장 유래 mdck (그림 4e) 세포. 흥미롭게도, 두 경우 모두에서, confluent 단층 보다 증식 세포에서 Zn의 높은 수준이 검출 되었다. 그러나, 유선에서 유래한 상피 세포는 신장 세포 보다 2 배 높은 금속 수준을 보였다. MCF10A 세포는 증식 세포에서 사이토 솔 릭과 핵 분 획 사이의 Zn의 동등한 수준을 보여주었다. 일단 MCF10A 세포가 합류에 도달 하면, 전체 세포의 40% 감소는 Zn 수치가 검출 되 고, 금속은 사이토 졸 분 획에서 가장 농축 된 것으로 밝혀졌다 (도 4d). 반대로, MDCK 세포를 증식 하는 것은 사이토 솔 릭 분 획에 비해 핵 분 획에서 더 높은 수준의 Zn을 나타내 었으 나, MDCK 세포가 합류에 도달 했을 때, 전체 세포에서 Zn의 감소는이 전이 금속의 대다수와 함께 검출 되었다 시 토 졸 분 획에서 관찰 된다 (도 4e).

Figure 1
그림 1: 포유류 배양 세포의 원소 (Zn) 분석을 위한 대표적인 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 핵 프로토콜의 급속 한 격리를 통해 얻은 분 획의 순도 검증 39 , 40. 대표적인 웨스턴 블랏이 1 차 myoblasts을 차별화 시켜 서 세포 분 획의 순도를 나타낸 것 이다. 핵 분 획을 동정 하기 위하여 염색 질 하청업 효소 Brg1를 사용 하였으며, 투 불 린은 사이토 졸 분 획을 동정 하기 위해 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Zn 표준의 보정 곡선 GF-AAS에 의해 결정 되는 Zn에 대 한 대표적인 표준 곡선. GF-AAS는 1, 3, 5, 7, 10, 15 및 30 ppb의 농도로 희석 된 표준 Zn 용액으로 보정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
도 4: 상이한 포유동물 배양 세포에서의 아연 농도. 전체 세포 추출 물 및 시 토 졸 및 핵 분 획에서 대표적인 광 현미경 및 Zn 함량. 데이터는 3 개의 독립적인 생물학적 복제 ± SEM의 평균을 나타낸다. (A) 1 차 myoblasts는2 일 동안 증식 하 고 분화 합니다. (B) 레 틴 산 처리에 의해 분화 하는 유도 전후 세포 라인 N2A 뮤 린 신경 모 세포종. (C) 뮤 린의 3T3-L1 전 지방 세포 및 6 일간의 포스트 분화. (D) 인간 유 방 상피 세포 라인 MCF10A의 사전 confluent 및 confluent 단층. (E) 신장 상피 세포 라인 mdck의 사전 confluent 및 confluent 단층. 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 평균을 나타내고 ± SE. 학생 t 검정은 유의 0.05 성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

원자 흡 광도 분광학은 소량의/대량 생물학 견본에 있는 Zn 정량화를 위한 높게 과민 한 방법입니다. Zn 측정의 최적화는이 방법을 간단 하 게 적용 하 고 이상적인 분석 조건을 보장 합니다. 여기에서 GF-AAS를 사용 하 여, 우리는 다양 한 세포 주 로부터, 세포 및 핵 분 획에서, 그리고 전체 셀에서 Zn의 농도를 결정 했다. 결과는이 기술이 형광 프로브 및 ICP에 의해 얻어진 것과 비교 하 여 렌더링 한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 여러 형광 프로브는 0.1 ~ 300 pM 범위의 불안정 한 미토 콘 드리 아 Zn 수준을 보여 주었고, 골 지의 수치가 피코 몰 범위 아래에 있었고, 소포체는 800에서 5000 pM42에 이르기까지 수준과 일치 합니다. 사이토 졸 분 획에서 검출. 더욱이, zn-반응성 형광 단-3은 MCF10A 및 C2C12 43 세포에서의 작은 세포 소 낭에서 불안정 한 zn의 축적을 나타내 었으 며,이는 또한 세포질에서의 zn 정량과 일치 하는 44 이다. 더욱이, 우리 그룹에 의해 수행 ICP-MS에의 한 분석은 전체 세포 수준 Zn 1 차 myotubes45 을 차별화 하는 것을 보여주었다는 GF-AAS에 의해이 보고서에서 얻은 것과 유사 하다. 또한, AAS 및 Z인-E46 을 사용 하 여 C6 쥐의 glioma 세포에서의 Zn 결정의 예는 여기에서 사용 된 신경 모 세포종 N2A 세포에서 관찰 되는 것과 유사한 범위를 렌더링 하기도 하였다.

지금까지 세포에서 Zn을 검출 하기 위해 다양 한 기술이 개발 되었습니다. 그러나 GF-AAS는 무료 Zn의 검출을 가능 하 게 하는 정확 하 고 매우 민감한 기술 이지만, 금속 복합체를 측정 하 고 단백질과 잠재적으로 작은 분자에 결합 합니다. 우리 그룹은 최근 세포 투과성 형광 프로브 (무료 Zn2 +를 결합 하는 높은 친화도를가지고 있음)와 직접 연관 된 ZN-AAS가 증식 및 분화 에 의해 검출 된 아연의 수준과 상호 관련 된 측정을 보여주었다 43. 그러나, 이들 프로브에 의해 얻어진 결과는 전체 세포 또는 단백질 결합 Zn 농도를 대표 하지 않을 수 있다. 더욱이, Zn은 비 산화 환 원 활성 종과 2가 양이온으로 존재 하기 때문에, 생리 적 조건 하에서, 세포 시스템에서의 검출은 여전히 과제로 남아 있다. 새로운 Zn 이미징 기술은 최첨단 싱크 로트 론 기반 X 선 형광 현미경, 방사성 동위 원소 및 레이저 절제 유도 결합 플라즈마 질량 분 광 법 (라-ICP)과 같은 다양 한 기술을 사용할 수 있게 되었습니다. 불행 하 게도 이러한 기술 중 일부는 과학 커뮤니티29,42,47,48,49,50에 액세스할 수 없는 리소스를 필요로 합니다.

연구에 따르면, 상대적 표준 편차 값이 Zn과 같은 금속에 대 한 ICP 측정에서 낮은 것으로 나타났습니다. 이 효과에 대 한 가능한 설명은, 작동 아르곤 온도가 5000에서 1만 ° c로 범위 이기 때문에 ICP-MS가 화학적 간섭을 근본적으로 제거할 수 있다는 것입니다. 몇몇 화학 결합은 AAS 가동을 위한 범위에 있는 3000 ° c에서 유지 될 수 있습니다. 이 채권은 6000 ° c 이상에서 완전히 중단 됩니다. 따라서, ICP에 의해 플라즈마 상태에 도달한 이러한 높은 온도는 화학적 간섭을 제거 하 여 더 나은 검출 한계51을 이끌어 냅니다. 또한, 후자는 100 μ l 이하의 부피로 작동 할 수 있으므로,이는 AAS, ICP 또는 ICP와 같은 다른 분 광 방법 보다 훨씬 적은 양의 샘플을 필요로 합니다. 방법에 관련 된 작은 볼륨을 감안할 때, GF-AAS는 주로 분석에 서브 세포 분 획, 정제 된 단백질의 금속 검출 또는 셀룰러의 작은 변이를 포함 하는 경우 생물학적 샘플에서 Zn 농도를 결정 하는 이상적인 기술입니다. 전송기 또는 금속 결합 단백질29,52의 돌연변이로 인 한 금속 함유량. 또한 트레이스 및 미 량 농도 (pg/mL ~ ng/mL)를 결정 하는 GF-AAS 시스템의 감도가 또 다른 장점입니다.

GF-AAS 데이터의 신뢰성을 보장 하기 위해 중요 한 고려 사항을 고려해 야 합니다. 여기에는 적절 한 교정, 흑연 튜브의 무결성 및 전기 열 분무에 적합 한 매트릭스 개 질 제 선택이 포함 됩니다. 매트릭스 수정자는 샘플에 추가 되는 화학 원소로 서 분무기에서 일어나는 열 공정에 영향을 줍니다. 이러한 수정자는 열 분해 중에 분석 물의 손실을 최소화 하 고 매트릭스 구성 요소의 제거에 기여 합니다. 전반적으로, 수정자는 더 낮은 온도에서 매트릭스 성분을 증발 시키기 위해 샘플 매트릭스를 변경 하 고 분석 물 안정제로 작동할 수 있습니다. 이러한 고려 사항 외에도, 분무기 온도 프로그램에 대 한 단계의 적절 한 최적화를 수행 하는 것이 중요 합니다.

1) 최적의 열 분해 온도를 설정 하는 것을 포함 한 두 가지 주요 고려 사항을 취해야 하며,이는 분석 물 손실이 발생 하지 않는 원자화 단계에서 최대 온도를 말하며, 분석 물의 최대 흡 광도를 최소한으로 허용 합니다. 배경. 또한 2) 분석 물이 완전히 증발 되 고 재현 가능한 신호 또는 피크로 기록 되는 최소 온도를 의미 하는 최적의 분무 온도를 확립 하는 것을 고려해 야 합니다. GF-AAS 분석의 단점 중 하나는 정확한 측정을 위해 철저 한 최적화와 표준화가 필수적인 요소 간섭입니다. 그러나, 지금까지 GF-AAS는 다양 한 생물학적 샘플에서 금속 이온을 검출 하는 과학적 연구에서 중요 한 도구를 나타냅니다. GF-AAS에의 한 Zn (및 기타 금속) 검출 방법의 향후 응용 분야에는 미 량 원소에 대 한 특정 생리 적 요구를 더 잘 이해 하기 위해 동물 모델 또는 환자 생 검에서 얻은 장기 및 조직에서의 금속의 수준을 측정 하는 것이 포함 됩니다. 결론적으로 GF-AAS는 정확 하 고 민감하고 비용 효율적 이며 접근이 가능 하며 이러한 분석 기법은 이러한 탐지 시스템에 대 한 기술 발전이 앞으로 나아갈 때 지속적으로 개선 될 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 T.P.에 매사추세츠의과 대학에서 교수진 다양성 학자 상을 지원 했다. N.N.. 는 SEP CONACYT, 보조금 279879에 의해 지원 됩니다. J. g. N은 국립 과학 재단 보조금 DBI 0959476에 의해 지원 됩니다. 저자는 N2A 셀 라인을 제공 하기 위한 닥터 다 릴 a. 보스코와 그녀의 기술 지원에 대 한 다니엘 라 창 Ussu에 감사 드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

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생화학 문제 147 아연 원자 흡 광도 분광학 증식 분화 포유류 세포 배양 세포 분별
포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학
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Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

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