Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

ويشيع استخدام خطوط الخلايا الاساسيه أو القائمة المستزرعة لمعالجه المسائل البيولوجية والميكانيكية الاساسيه كنهج اولي قبل استخدام النماذج الحيوانية. يصف هذا البروتوكول كيفيه اعداد مقتطفات الخلايا الكاملة والكسور تحت الخلوية لدراسات الزنك (Zn) والعناصر النزره الأخرى مع الطيفية الامتصاص الذري.

Abstract

المعادن الانتقالية هي المغذيات الصغرى الاساسيه للكائنات الحية ولكن يمكن ان تكون سامه للخلايا بتركيزات عاليه من خلال التنافس مع المعادن الفسيولوجية في البروتينات وتوليد إجهاد الاكسده. الحالات المرضية التي تؤدي إلى استنزاف المعادن أو تراكم هي العوامل السببية لمختلف الامراض البشرية. وتشمل بعض الامثله فقر الدم ، والتهاب الجلدي المعوي ، وامراض ويلسون والمنكز. ولذلك من المهم ان تكون قادره علي قياس مستويات ونقل المعادن الانتقالية في العينات البيولوجية مع حساسية عاليه ودقه من أجل تسهيل البحوث استكشاف كيفيه مساهمه هذه العناصر في الوظائف الفسيولوجية العادية السميه. الزنك (Zn) ، علي سبيل المثال ، هو عامل مساعد في العديد من البروتينات الثدييات ، ويشارك في الاحداث الإشارات ، وهو رسول الثانوية في الخلايا. في الزائدة ، الزنك السامة ويمكن ان تمنع امتصاص المعادن الأخرى ، في حين ان في العجز ، فانه يمكن ان يؤدي إلى مجموعه متنوعة من الظروف المميتة المحتملة.

الجرافيت فرن الامتصاص الذري الطيفي (GF-العاص) يوفر طريقه حساسة للغاية وفعاله لتحديد الزنك وغيرها من تركيزات المعادن الانتقالية في العينات البيولوجية المختلفة. الانحلال الكهربي عن طريق GF-العاص ثبت قيمه المعادن عن طريق تفتيت كميات صغيره من العينات لتحليل الامتصاص الانتقائي اللاحق باستخدام الطول الموجي لأثاره عنصر الفائدة. في حدود الخطية من قانون البيره لامبرت ، وامتصاص الضوء من قبل المعدن يتناسب مباشره مع تركيز التحاليل. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لتحديد محتوي الزنك ، GF-العاص يكتشف كل من الزنك الحرة والمعقدة في البروتينات وربما في جزيئات صغيره داخل الخلايا مع حساسية عاليه في وحدات التخزين عينه صغيره. وعلاوة علي ذلك ، فان GF-العاص هو أيضا أكثر سهوله في الوصول اليه من قياس الطيف الكتلي المقترن بشكل محفز أو الاشعه السينية المستندة إلى synchrotron. في هذا الأسلوب ، يتم وصف اعداد عينه منتظمة من مختلف خطوط الخلايا المستزرعة للتحليلات في GF-العاص. تمت مقارنه الاختلافات في هذا العنصر النزره في كل من الخلايا الكاملة والكسور تحت الخلوية من تكاثر والخلايا المتمايزة كدليل علي المبدا.

Introduction

يتم العثور علي الانتقال والمعادن الثقيلة ، مثل الزنك والنحاس والمنغنيز والحديد ، بشكل طبيعي في البيئة في كل من المواد الغذائية والملوثات. وتتطلب جميع الكائنات الحية كميات مختلفه من هذه المغذيات الصغرى ؛ ومع ذلك ، فان التعرض للمستويات العالية يضر بالكائنات الحية. الحصول علي المعادن هو أساسا من خلال النظام الغذائي ، ولكن يمكن أيضا استنشاق المعادن أو امتصاصها من خلال الجلد1،2،3،4،5. ومن المهم ملاحظه ان وجود الفلزات في جزيئات الغلاف الجوي أخذ في الازدياد وارتبط إلى حد كبير بالمخاطر الصحية. وبسبب الانشطه البشرية المنشا ، تم اكتشاف مستويات متزايدة من الفلزات الثقيلة مثل Ag ، مثل الاقراص المدمجة ، والكروم ، والزئبق ، والنيكل ، والحديد ، والرصاص في الجسيمات الجوية ، ومياه الامطار ، والتربة6،7. هذه المعادن لديها القدرة علي المنافسة مع العناصر النزره الفسيولوجية الاساسيه ، وخاصه الزنك والحديد ، وانها تحفز الآثار السامة عن طريق تنشيط الانزيمات الاساسيه للعمليات البيولوجية.

الزنك عنصر التتبع هو الاكسده محايده ويتصرف كحمض لويس في التفاعلات البيولوجية ، مما يجعلها عاملا أساسيا اللازمة للطي البروتين والنشاط الحفاز في أكثر من 10 ٪ من البروتينات الثدييات8،9، 10؛ التالي ، فمن الضروري لمختلف الوظائف الفسيولوجية8،11. ومع ذلك ، مثل العديد من العناصر النزره ، هناك توازن دقيق بين هذه المعادن التي تسهل الوظيفة الفسيولوجية الطبيعية وتسبب سميه. في الثدييات, نقص الزنك يؤدي إلى فقر الدم, تاخر النمو, قصور الغدد التناسلية, تشوات الجلد, الإسهال, ثعلبه, اضطرابات الذوق, التهاب مزمن, وضعف وظائف المناعة والجهاز العصبي11,12, 13،14،15،16،17،18. في الزائدة ، والزنك هو السامة للخلايا ويضعف امتصاص المعادن الاساسيه الأخرى مثل النحاس19،20،21.

بالاضافه إلى ذلك ، بعض المعادن مثل Cu و Fe لديها القدرة علي المشاركة في ردود الفعل الضارة. إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) عن طريق فنتر الكيمياء يمكن ان تتداخل مع الجمعية من الحديد الكبريت البروتينات العنقودية وتغيير استقلاب الدهون22،23،24. لمنع هذا الضرر ، تستخدم الخلايا محرمين ملزمه المعادن والناقلين لمنع الآثار السامة. مما لا شك فيه ، يجب ان يكون التوازن المعدني التحكم باحكام للتاكد من ان أنواع الخلايا المحددة الحفاظ علي مستويات مناسبه من المعادن. ولهذا السبب ، هناك حاجه كبيره إلى النهوض بتقنيات القياس الدقيق للمعادن النزره في العينات البيولوجية. في الكائنات الحية النامية والناضجة هناك حاجه البيولوجية التفاضلية للعناصر النزره علي المستوي الخلوي ، في مراحل النمو المختلفة ، وفي الظروف العادية والمرضية. لذلك ، من الضروري تحديد دقيق لمستويات الانسجه والمعادن الجهازية لفهم التوازن المعدني أسطح.

الجرافيت فرن الامتصاص الذري الطيف (GF-العاص) هو تقنيه حساسة للغاية تستخدم لحجم العينات الصغيرة ، مما يجعلها مثاليه لقياس الانتقال والمعادن الثقيلة الموجودة في العينات البيولوجية والبيئية25،26 , 27 , 28. وعلاوة علي ذلك ، نظرا لحساسية عاليه من هذه التقنية ، وقد ثبت ان تكون مناسبه لدراسة خصائصالنقل الدقيقة من Na +/k +-atpase والمعدة H +/k +-atpase باستخدام xenopus البويضات كنظام نموذجي29. في GF-العاص ، تمتص العناصر المفتتة داخل العينة طولا موجيا من الإشعاع المنبعث من مصدر ضوئي يحتوي علي معدن الفائدة ، مع الإشعاع الممتص المتناسب مع تركيز العنصر. يتم الاثاره الكترونيه العنصرية عند امتصاص الاشعه فوق البنفسجية أو المرئية في عمليه كميه فريدة لكل عنصر كيميائي. وفي عمليه الكترون واحده ، ينطوي امتصاص الفوتون علي الكترون ينتقل من مستوي طاقة اقل إلى مستوي اعلي داخل الذرة ويحدد GF-العاص كميه الفوتونات التي تمتصها العينة ، والتي تتناسب مع عدد امتصاص الإشعاع العناصر صغار في أنبوب الجرافيت.

وتعتمد الانتقائية في هذه التقنية علي البنية الكترونيه للذرات التي يكون فيها لكل عنصر خط طيفي محدد للامتصاص/الانبعاث. في حاله الزنك ، والطول الموجي الامتصاص هو 213.9 نانومتر ويمكن تمييزها بدقه من المعادن الأخرى. عموما ، يمكن استخدام GF-العاص لقياس الزنك مع حدود كافيه من الكشف (اللد) وحساسية عاليه والانتقائية25. تتكامل التغيرات في الطول الموجي الممتص وتقدم كقمم لامتصاص الطاقة عند أطوال موجية محدده ومعزولة. وعاده ما يتم احتساب تركيز الزنك في عينه معينه من منحني قياسي من التركيزات المعروفة وفقا لقانون البيره لامبرت ، الذي الامتصاص يتناسب مباشره مع تركيز الزنك في العينة. ومع ذلك ، فان تطبيق معادله بير لامبرت علي تحليلات GF-العاص يعرض أيضا بعض التعقيدات. فعلي سبيل المثال ، يمكن ان تؤثر التغيرات في الانحلال و/أو التركيزات غير المتجانسة للعينات علي القياسات المعدنية.

الانحلال المعدنية المطلوبة لتحليل عنصري التتبع GF يتكون من ثلاث خطوات أساسيه. الخطوة الاولي هي ديسولفيشن ، حيث تبخرت المذيبات السائلة. ترك المركبات الجافة بعد الفرن يصل إلى درجه حرارة حوالي 100 درجه مئوية. ثم ، يتم تبخير المركبات عن طريق تسخينها من 800 إلى 1,400 درجه مئوية (اعتمادا علي العنصر الذي سيتم تحليله) وتصبح غازا. وأخيرا ، يتم صغار المركبات في الدولة الغازية مع درجات الحرارة التي تتراوح من 1,500 إلى 2,500 درجه مئوية. وكما سبقت مناقشته أعلاه ، فان زيادة تركيزات معدن الفائدة ستجعل الزيادات النسبية في الامتصاص التي يكتشفها الفرنك الغين-العاص ، ومع ذلك فان الفرن يقلل من النطاق الديناميكي للتحليل ، الذي هو نطاق العمل من التركيزات التي يمكن ان تكون يحددها الصك. التالي ، فان هذه التقنية تتطلب تركيزات منخفضه وتحديد دقيق للنطاق الديناميكي للأسلوب عن طريق تحديد اللد والحد من الخطية (LOL) من قانون بير لامبرت. ال اللد هو الحد الأدنى من الكمية المطلوبة ليتم الكشف عن ماده ، وتعريف ثلاثه اضعاف الانحراف المعياري لل Zn في المصفوفة. لول هو الحد الأقصى للتركيز التي يمكن الكشف عنها باستخدام القانون بير لامبرت.

في هذا العمل ، ونحن وصف طريقه قياسيه لتحليل مستويات الزنك في مقتطفات الخلية بأكملها ، سيتوبلازمي والكسور النووية ، وفي تكاثر والتفريق بين الخلايا المستزرعة (الشكل 1). قمنا بتكييف العزلة السريعة لبروتوكول النوى للانظمه الخلوية المختلفة لمنع فقدان المعادن اثناء اعداد العينة. وكانت النماذج الخلوية المستخدمة الاساسيه التي تستمد من الخلايا الأقمار الصناعية الماوس ، وخلايا الورم الاروميه العصبية murine (N2A أو Neuro2A) ، murine 3T3 L1 شحميه ، وهو الإنسان غير tumoriغينيك الثدي خط خليه الظهاريه (MCF10A) ، والكلي البوليسية. MDCK) الخلايا. وقد أنشئت هذه الخلايا من السلالات المختلفة وهي نماذج جيده للتحقيق في النسب اختلافات محدده من مستويات المعادن في المختبر.

وتشكل الأقاليم الاساسيه المشتقة من خلايا الفئران الفضائية نموذجا مناسبا في المختبر للتحقيق في تمايز العضلات الهيكلية. انتشار هذه الخلايا سريع عندما مثقف تحت ظروف المصل عاليه. ثم يتم الحث علي التمايز في السلالة العضلية بسبب انخفاض حالات المصل30. الورم الارومي العصبي murine (N2A) أنشئت خط الخلية المستمدة من قمة الماوس العصبية. هذه الخلايا الحالية العصبية والأميبا الخلايا الجذعية المورفولوجية. علي التحفيز التمايز ، والخلايا N2A تقديم العديد من الخصائص للخلايا العصبية ، مثل الشعيرات العصبية. وتستخدم خلايا N2A للتحقيق في مرض الزهايمر ، ونمو العصب العصبي ، والسمية العصبية31،32،33. و 3T3-L1 murine ما قبل الخلايا الشحمية التي أنشئت خط الخلية يستخدم عاده للتحقيق في التغيرات الايضيه والفسيولوجية المرتبطة اديبوجينيسيس. هذه الخلايا تقديم الليفية مثل المورفولوجية, ولكن مره واحده حفزت للتمييز, انها تقدم التنشيط الانزيميه المرتبطة تخليق الدهون وتراكم الدهون الثلاثية. ويمكن ملاحظه ذلك كتغييرات مورفولوجية لإنتاج قطرات الدهون السيتوبلازمية34،35. MCF10A هو خط الخلايا الظهاريه غير الورم الثديية المستمدة من أمراه قبل سن إلياس مع مرض فيبروكيستيك الثدي36. وقد استخدم علي نطاق واسع للدراسات البيوكيميائية والجزيئية والخلوية المتعلقة بالسرطانات الثديية مثل الانتشار ، وهجره الخلايا ، والغزو. وقد تم استخدام خط الخلايا الظهاريه الكلي البوليسية Madin-داربي (MDCK) علي نطاق واسع للتحقيق في الخصائص والاحداث الجزيئية المرتبطة بإنشاء النمط الظاهري الظهاريه. عند الوصول إلى التقاء ، تصبح هذه الخلايا المستقطبة وإنشاء التصاقات خليه خلوية ، وخصائص الانسجه الظهاريه الثدييات37.

لاختبار قدره العاص لقياس مستويات الزنك في خلايا الثدييات ، حللنا الكسور الكاملة وشبه الخلوية (cytosol والنواة) من هذه الخطوط الخلوية الخمسة. وأظهرت قياسات العاص تركيزات مختلفه من الزنك في هذه الأنواع من الخلايا. وكانت التركيزات اقل في التكاثر والتفريق بين الأقاليم الاوليه (4 إلى 7 nmol/mg من البروتين) واعلي في أربعه خطوط الخلايا الراسخة (تتراوح بين 20 إلى 40 nmol/ملغ من البروتين). تم الكشف عن زيادة صغيره غير هامه في مستويات الزنك في التفريق بين الكريات الاوليه وخلايا الورم الارومي العصبي بالمقارنة مع تكاثر الخلايا. تم الكشف عن التاثير المعاكس في الخلايا الشحمية المتمايزة. ومع ذلك ، فان تكاثر خلايا 3T3-L1 اظهر تركيزات اعلي من المعدن مقارنه بالخلايا المتمايزة. الأهم من ذلك ، في هذه الخطوط الخلوية الثلاثة ، أظهرت التجزئة تحت الخلوية ان الزنك موزع بشكل مختلف في السيتوسيول والنواة وفقا لحاله الأيض لهذه الخلايا. علي سبيل المثال ، في تكاثر المقاطع العضلية ، وخلايا N2A ، و 3T3-L1 قبل الخلايا الشحمية ، يتم ترجمه غالبيه المعدن إلى النواة. عند استقراء التمايز باستخدام العلاجات الخلوية المحددة ، الزنك مترجمه إلى عصارة في هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا. ومن المثير للاهتمام ، أظهرت كل من خطوط الخلايا الظهاريه مستويات اعلي من الزنك اثناء الانتشار مقارنه مع عند التوصل إلى التقاء ، والتي شكلت أحاديه الطبقة الضيقة المميزة. في تكاثر الخلايا الظهاريه ، كان خط الخلية الثديية MCF10A توزيع الزنك علي قدم المساواة بين عصارة ونواه ، بينما في خط الخلايا المشتقة من الكلي ، وكان معظم المعدن الموجود في النواة. في هذين النوعين من الخلايا ، عندما وصلت الخلايا إلى التقاء ، كان الزنك في الغالب التي تقع علي cytosol. وتبين هذه النتائج ان GF-العاص هو تقنيه حساسة للغاية ودقيقه لاجراء تحليل عنصري في عينات منخفضه الغلة. GF-العاص إلى جانب تجزئه تحت الخلوية ويمكن تكييفها للتحقيق في مستويات العناصر المعدنية النزره في خطوط الخلايا المختلفة والانسجه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-ثقافة خلايا الثدييات

  1. اعتبارات عامه
    1. اتبع تقنيات العقيم لثقافة خلايا الثدييات التي تم مراجعتها سابقا38.
    2. الحفاظ علي جميع خطوط الخلية في مرطب 5 ٪ CO2 حاضنه في 37 درجه مئوية. تختلف شروط ثقافة الخلية لكل نوع من أنواع الخلايا. من المهم الحفاظ علي الظروف الثقافية المناسبة لكل خط الخلية المستخدمة ، والاختلافات من هذه الإجراءات سوف تؤدي إلى الظواهر الشاذة وفشل ثقافة الخلية.
    3. تاكد من التعارف مع خط الخلية من الفائدة ، واتبع البروتوكولات المنصوص عليها لكل نوع الخلية المحددة لتجارب معينه (انظر بعض الامثله أدناه).
  2. الإجراءات العامة للترطنه ومرور الخلايا الملتصقة
    1. أزاله وسائل الاعلام الثقافة الخلية من لوحه الثقافة عن طريق الطموح.
    2. اغسل الخلايا بلطف باستخدام الجهاز التلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم (5 مل لكل 10 سم2 مساحة الثقافة). أضافه محلول الغسيل إلى جانب اللوحة لتجنب فصل الخلية أحاديه الطبقة. دوامه لوحه لتعظيم تغطيه الحل. للخلايا الظهاريه ، فمن الضروري احتضان الخلايا لمده 10 إلى 15 دقيقه في الحاضنة في 37 درجه مئوية في الاذاعه التلفزيونية لتسهيل تفكك الخلايا في الخطوات التالية.
    3. أزاله محلول الغسيل عن طريق الطموح.
    4. أضافه ما يكفي من كاشف التفكك (0.25 ٪ التربسين) إلى لوحه (حوالي 0.7 مل لكل 10 سم2). دوامه بلطف لوحه للحصول علي تغطيه كامله من الخلية أحاديه الطبقة.
    5. احتضان الثقافة في درجه حرارة الغرفة لمده 2 إلى 5 دقائق. يختلف وقت الحضانة الفعلية مع خط الخلية المستخدمة ، في حاله الخلايا الظهاريه ينصح لاحتضان لمده 10 إلى 15 دقيقه في الحاضنة في 37 درجه مئوية. مراقبه الخلايا تحت المجهر لمفرزه الخلية.
    6. عندما فصلت معظم الخلايا ، واستعاده تعليق الخلية في 5 مل من الطلاء قبل الحرارة أو متوسط النمو (انظر أدناه لبعض الامثله). الانفصال الميكانيكي للخلايا بواسطة التنضيد علي الخلية أحاديه الطبقة عده مرات.
    7. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي لهم في 1,000 x g لمده 2 إلى 5 دقيقه. تختلف السرعة والوقت طرد استنادا إلى نوع الخلية. أزاله وسائل الاعلام عن طريق الطموح لطيف ، والحرص علي عدم لمس بيليه الخلية. أعاده تعليق بيليه الخلية في 5 إلى 10 مل من متوسط النمو المناسبة ما قبل الحرارة وأزاله عينه للعد باستخدام مقياس الخلايا الدموية أو عداد الخلية التلقائي.
    8. استخدم الحجم المناسب لتعليق الخلية لبذر الكثافة الموصي بها لكل خط خليه محدد (انظر أدناه للحصول علي بعض الامثله). تكمله مع حجم كاف من وسائل الاعلام الثقافة وفقا لحجم الطبق الثقافة ووضع الخلايا مره أخرى في الحاضنة.
  3. المقاطع الاساسيه المشتقة من خلايا الماوس الفضائية
    1. قبل البدء ، واعداد لوحات الكولاجين المغلفة للنمو ميوبلاست الاوليه. ويجب تعقيم محلول يحتوي علي 0.02 ٪ الكولاجين ، و 0.05 M حمض الخليك في الماء منزوع الأيونات عن طريق الترشيح مع جهاز فلتر معقم 0.22 μm. احتضان لوحات الثقافة مع محلول الكولاجين بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
    2. في اليوم التالي ، يستنشق محلول الكولاجين ، والسماح للوحات للهواء الجاف في خزانه معقمه وتخزين في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظه: حجم الحد الأدنى من الكولاجين هي: ل 35 مم = 1 مل ؛ 60 مم = 2 مل ؛ 10 سم = 5 مل.
    3. البذور الاساسيه myoblasts في 1 × 104 خلايا/سم2 في 55 سم2 الكولاجين المغلفة لوحات الثقافة. وسائل الاعلام الانتشار هو النسر تعديل المتوسطة (DMEM)/Ham المغذيات المواد الغذائية الثقافة الخليط F12 التي تحتوي علي 20 ٪ الجنين البقري المصل (ار) ، 25 نانوغرام/مل من المؤتلف الاساسيه عامل النمو الليفية (FGF) ، و 100 U/mL من البنسلين/ستربتومايسين.
      ملاحظه: يجب الحفاظ علي تكاثر وخلايا المخزون تحت 50 ٪ من كونفلوينسي. الاتصال الخلوي يؤدي إلى التزام الخلايا بالتمايز العضلي ويضعف قدرات النمو في الثقافة.
    4. للتمييز بين الأقاليم الاساسيه ، والسماح للخلايا للوصول إلى 80 ٪ إلى 100 ٪ كونفلوينسي ، والذي يحدث عاده بعد 48 h من الطلاء. ثم ، تغيير إلى وسائل الاعلام التمايز (DMEM ، 2 ٪ الحصان المصل ، 1 ٪ الانسولين ، transferrin ، السيلينيوم ملحق ، و 100 U/mL من البنسلين/ستربتوميسين). تحديث وسائل الاعلام يوميا حتى الحصاد.
  4. الورم الارومي العصبي للموين (N2A)
    1. لوحه N2A الخلايا في كثافة 2 × 104 خلايا/سم2 في وسائل الاعلام النمو ، والتي تحتوي علي مزيج من المصل المنخفض متوسط/dmem التي تحتوي علي ارتفاع الجلوكوز و L-الجلوتامين (1:1 ، v:v) ، الملحق مع 10 ٪ وال100 U/mL من البنسلين/ستربتوميسين. الحفاظ علي ثقافة الأسهم تحت 50 ٪ كونفلوينسي.
    2. الحث علي التمايز من خلايا N2A مره واحده كونفلوينسي وصلت إلى 25 ٪ إلى 40 ٪. التغيير إلى وسائل الاعلام التمايز التي تحتوي علي مزيج من المصل المخفض المتوسطة/DMEM ، 1 ٪ من الطراز الأول ، و 20 μM حمض الريتينويك لمده 7 إلى 10 أيام. تحديث الوسائط كل يوم حتى حصاد الخلايا.
      ملاحظه: كما تفرق الخلايا N2A ، تصبح بعض الخلايا المستديرة ، فصل بسهوله ، وقد تخضع لموت المبرمج. كن حذرا عند الشفط وأضافه وسائل الاعلام الثقافة إلى لوحات.
  5. 3T3 L1 murine ما قبل الخلايا الشحمية
    1. الحفاظ علي الماوس 3T3/L1 الخلايا في DMEM مع ارتفاع الجلوكوز ، وتستكمل مع 10 ٪ وال100 U/mL من البنسلين/ستربتومايسين. عمليه اديبوغينيك تعتمد في التقاء الخلايا. لذلك, لا يترك السهم ينمو ثقافة علي 50% كونفلوينسي, بما ان التقاء [هيغر] سيضعف القدرة من الخلايا ان يميز.
    2. لوحه الخلايا في 2 × 104 خلايا/سم2. في هذه الكثافة ، سوف تصل الخلايا إلى التقاء في 3 أيام.
    3. الحث علي التمايز اديبوغينيك بعد يومين من الخلايا تصل إلى 100 ٪ كونفلوينسي. وسائل الاعلام التعريفي يتكون من DMEM التي تحتوي علي 10 ٪ منها ، 10 ميكروغرام/مل الانسولين ، 0.5 mM 3-ايزوبوتيل-1-ميثيكزانيسين ، 1 μM ديكساميثازون ، و 10 μM تروجليزون.
    4. استبدل الوسائط التعريفية بعد الحاضنة 48 h بوسائل الاعلام التفاضلية (DMEM التي تحتوي علي 10% من المحتوي الكتروني ، و 5 ميكروغرام/مل من الانسولين). تحديث وسائل الاعلام كل يوم حتى الحصاد. وعاده ما يتم جمع العينات التمثيلية من التمايز الكامل بين 7 و 10 أيام بعد الحث المستحث.
      ملاحظه: كما تقدم اديبوجينيسيس ، تصبح الخلايا المستديرة وتميل إلى فصل بسهوله. كن حذرا عند الشفط وأضافه وسائل الاعلام الثقافة إلى لوحات.
  6. خلايا MCF10A
    1. لوحه MCF10A الخلايا في DMEM/F12 (1:1 ، v:v) ، تستكمل مع 5 ٪ منها ، 100 U/mL البنسلين/ستربتوميسين ، 0.5 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون ، 10 ميكروغرام/مل الانسولين ، و 20 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة (EGF). كثافة البذر الموصي بها هي 1 × 105 خلايا/سم2. في ظل هذه الظروف ، سوف تصل الخلايا 100 ٪ كونفلوينسي في غضون 4 أيام. تحديث الوسائط كل يومين إلى ثلاثه أيام حتى الحصاد.
      ملاحظه: خلايا MCF10A من الصعب فصل. فمن المستحسن لاحتضان الخلايا لمده 10 إلى 15 دقيقه في 37 درجه مئوية في الخدمات التلفزيونية المجانية من الكالسيوم مع 0.5 mM أدتا قبل التريسينزيشن.
  7. خلايا الكلي البوليسية مادان-داربي (MDCK)
    1. لوحه الخلايا MDCK في DMEM تستكمل مع 10 ٪ و100 U/mL من البنسلين/ستربتوميسين. كثافة البذر الموصي بها هي 1 × 105 خلايا/سم2، حيث ستصل الخلايا 100 ٪ كونفلوينسي في غضون 3 أيام. تحديث الوسائط كل يومين حتى الحصاد.
      ملاحظه: خلايا MDCK من الصعب فصل. فمن المستحسن لاحتضان الخلايا لمده 5 إلى 10 دقيقه في 37 درجه مئوية في الخدمات التلفزيونية المجانية من الكالسيوم والمغنيسيوم قبل التريسيسينايشن. لمنع تكتل الخلايا لا التحريك لوحات عن طريق ضرب أو تهز القارورة اثناء انتظار الخلايا لفصل.

2-اعداد عينه لثقافة الخلايا الثديية لأغراض الزراعة الخلوية: الخلية الكاملة والتجزئة الفرعية

  1. ثقافة الخلايا الفائدة في 55 سم2 لوحات. استخدام لوحات الثقافة الصغيرة قد تسفر عن عينات مع مستويات من المعادن تحت حدود الكشف عن GF-العاص.
  2. استخراج الخلية بالبالكامل
    1. يستنشق وسائل الاعلام الثقافة باستخدام فخ فراغ. تاكد من أزاله كافة اثار الوسائط. شطف الخلايا من النقاط الزمنيه المطلوبة أو ظروف الثقافة ثلاث مرات مع الجليد الباردة تلفزيونيه خاليه من الكالسيوم والمغنيسيوم.
    2. كشط علي الفور الخلايا من لوحه باستخدام مكشطه خليه بلاستيكية جديده في 1 مل من تلفزيوني مجانا من الكالسيوم والمغنيسيوم. نقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL والطرد المركزي لمده 2 دقيقه في 2,000 x g ويستنشق supernatant. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين عينات بيليه في-20 درجه مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة 2.4.
  3. تجزئه الخلايا الفرعية
    1. يستنشق وسائل الاعلام الثقافة باستخدام فخ فراغ. تاكد من أزاله كافة اثار الوسائط. شطف الخلايا من النقاط الزمنيه المطلوبة أو ظروف الثقافة ثلاث مرات مع الجليد الباردة تلفزيونيه خاليه من الكالسيوم والمغنيسيوم. كشط الخلايا من لوحه مع 1 مل من الجليد الباردة تلفزيونيه خاليه من الكالسيوم والمغنيسيوم.
    2. نقل العينات إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL والحفاظ علي الجليد. الطرد المركزي لمده 10 ليالي في 10,000 x g. مواصله العزلة السريعة من نوى إذا كان المطلوب تحليل المعادن من الكسور الخلوية والنووية. هذا الاجراء سوف يقلل من الخسارة المحتملة للمعادن بسبب استخراج الخلية39, 40.
    3. أزاله ماده طافي عن طريق الطموح وأعاده تعليق بيليه الخلية في 400 μl من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة خاليه من الكالسيوم والمغنيسيوم ، التي تحتوي علي 0.1 ٪ nonidet P-40 (NP-40) ، والمنظفات غير الايونيه. نقل 100 μL إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد والنظر فيه كعينه الخلية بأكملها. يمثل هذا النموذج 25% من العينة.
    4. عزل النوى عن طريق وضع تعليق الخلية من 5 إلى 10 مرات علي الجليد باستخدام طرف الماصة المجهرية P1000. العزلة النوى للخلايا الظهاريه يتطلب تركيز 0.5 ٪ NP-40. تحقيق تفكك الخلية عن طريق تمرير تعليق الخلية من خلال ابره 26 3/4 G 10 إلى 15 مرات ، تليها 10 إلى 15 الممرات من خلال ابره 30 1/2 G.
      ملاحظه: تحقق من سلامه النوى بواسطة المجهر الضوئي باستخدام هدف 40x.
    5. الطرد المركزي المتبقية الخلية محلله تعليق (300 μl) ل 10 s في 10,000 x g. وسوف تحتوي علي ماده طافي كسر السيتووليك. نقل 300 μL إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد.
    6. شطف بيليه التي تحتوي علي كسر النووية في 500 μL تلفزيوني مجانا من الكالسيوم والمغنيسيوم ، التي تحتوي علي 0.1 ٪ NP-40 ، ثم أجهزه الطرد المركزي ل 10 s في 10,000 x g. أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه التي تحتوي علي نوى في 100 μl من نفس الحل.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين العينات في-20 درجه مئوية.
  4. Lyse الخلايا بثلاث دورات صوتنه (30 ق علي/30 ق قباله ، في 50 كيلوهرتز ، 200 W) لمده 5 دقائق. تحديد إجمالي محتوي البروتين في العينة بواسطة برادفورد41.
  5. أداء مراقبه الجودة من نقاء الكسور بواسطة لطخه الغربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة اما النووية (histones ، الكروماتين ريموديليرس ، البروتينات مصفوفة النووية) أو الكسور السيتووليك (β-توبين ، β-actin) (الشكل 2).
    ملاحظه: لا تستخدم الاجهزه الصوتية ذات الطرف المعدني. هذه يمكن ان تلوث العينة مع المعادن.

3-تحليل محتوي الزنك للخلايا الكاملة والأجزاء شبه الخلوية من ثقافات خلايا الثدييات بواسطة الطيف الطيفي لامتصاص الذرية

  1. تعدين عينات ثقافة الخلية (الخلية الكاملة أو الكسور النووية) بواسطة الهضم الحمضي باستخدام كميه متساوية من التركيز HNO المعدنية المركزة3 الصف (تحذير) ل 1 ح في 80 درجه مئوية ، ثم بين عشيه وضحيها في 20 درجه مئوية.
  2. وقف رد الفعل عن طريق أضافه 30 ٪ من حجم التفاعل من H2O2. جلب حجم العينة إلى 500 μL مع 18 MΩ المياه النقية.
    ملاحظه: يجب ان يتم التعامل مع HNO3 ارتداء نظارات السلامة الكيميائية ، درع الوجه لحماية البداية ، والقفازات ، والتنفس الصناعي المعتمدة بخار إذا التهوية الكافية (هود الدخان) غير متوفر. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين العينات في درجه حرارة الغرفة (RT).
  3. اعداد الحلول القياسية والعينات التجريبية لقياسات الزنك من قبل العاص مجهزه فرن الجرافيت.
    1. استخدم 2% (v/v) محلول HNO3 في الماء منزوع الأيونات ، قادمه من نفس الدفعة المستخدمة للمنحني القياسي كحل فارغ للمعايرة في جميع انحاء. استخدام معايير الصف التحليلية المخففة في 18 MΩ المياه النقية.
    2. اعداد معيار من 1,000 ppb من الزنك من المتاحة تجاريا 1,000 جزء في المليون الزنك حل الأسهم مع 2 ٪ (v/v) حل HNO3 في الماء منزوع الأيونات. اعداد الحلول القياسية العمل من 100 ppb القياسية عن طريق تمييع إلى 5, 8, 10, 15, 20, و 25 ppb مباشره مع 2% (v/v) حل HNO3 في الماء منزوع الأيونات. اعداد المعايير الزنك وفارغه مع 0.1 ٪ (1 غرام/لتر) ملغ (لا3)2 معدل مصفوفة.
      ملاحظه: اللد من الزنك هو 0.01 ppb (ميكروغرام/لتر). من خلال زيادة تركيز المعايير ، تم تحديد حد الخطية من الزنك ان يكون 20 ppb (الشكل 3).
    3. قياس المعايير والعينات تحت نفس الظروف الأمثل: معدل تدفق مقدمه من 250 mL/min ، درجه حرارة الحقن من 20 درجه مئوية ، ودرجه الحرارة GF من 1,800 درجه مئوية.
      ملاحظه: تم زيادة درجه الحرارة GF إلى 2450 درجه مئوية لخطوات cleanout ، قبل حقن عينه جديده أو القياسية.
    4. تحسين المصباح (C-HCL) إلى تيار من 20 A ، الطول الموجي من 213.9 نانومتر ، وشق من 0.7 نانومتر.
    5. قياس العينات المعدنية باستخدام منحني الزنك القياسية لتحديد محتوي المعادن. بما ان حجوم صغيره يكون قست, العينات يستطيع تبخرت ان القياسات ياخذون فترات طويلة وقت. ولذلك ، فمن المستحسن لأضافه الماء إلى العينات. تمييع العينات مع 18 MΩ تنقيه المياه المعالجة مع 0.01 ٪ HNO3 (الصف التحليلي) إذا كانت البيانات التي تم الحصول عليها خارج اللد.
      ملاحظه: عاده ، يتم تخفيف العينات إلى وحده تخزين 500 μL ، وضعت في التلقائي التلقائية من العاص ليتم قياسها مباشره بعد ان يتم تاسيس المنحني القياسي. وينبغي ان يحدد المستعمل الحجم المطلوب وان ينظر في الحسابات النهائية للتركيزات. الانتهاء من القرارات الزنك بواسطة العاص من تجربه كامله في محاولة واحده ويوصي. قد يؤدي إيقاف القياسات بشكل غير متوقع إلى اختلافات وتباينات تجريبية كبيره.
  4. تحويل القياسات ppb إلى المتعفنة كما تم الحصول عليها من الزنك تقاس عن طريق العاص. النظر في كتله الزنك (65.39 امو). تقسم كميه الأجزاء التي تم الحصول عليها من قبل العاص ب63,390,000. في الخلايا ، تتراوح تركيزات الزنك من وحدات بمول إلى μmol.
    1. يقسم تركيز الزنك (pmol أو μmol) بواسطة الكتلة الاوليه من البروتين في العينة التي يحددها برادفورد (الخطوة 2.4). هذا الحساب سيجعل كميه من المعدن (pmol أو ميكرومول Zn) الواردة في ملغ من البروتين من العينة.
      ملاحظه: من المهم النظر في عوامل التخفيف المستخدمة خلال القرارات المعدنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

اختبرنا قدره GF-العاص للكشف عن مستويات دقيقه من الزنك في خلايا الثدييات (الشكل 1). وهكذا ، فاننا مثقف الاساسيه التي تستمد من خلايا الأقمار الصناعية الماوس ، وخطوط الخلايا القائمة N2A (الورم الارومي العصبي المشتقة) ، 3T3 L1 (الخلايا الشحمية) ، MCF10A (ظهاره الثدي) ، وخلايا MDCK (الكلبة ظهاره الكلي). أولا ، عزلنا الخلية الكاملة ، السيتووليك ، والكسور النووية لجميع أنواع الخلايا هذه وقيموا نقاء الكسور بواسطة لطخه الغربية (الشكل 2). المناعية التمثيلية من الكروماتين ريموديلير Brg1 والأنابيب كعلامات لكسور النووية والخلوية ، علي التوالي ، أظهرت مدي ملاءمة بروتوكول التجزئة سوبسيلولاره الموصوفة في القسم 2.3 لأداء عنصري تحليل (الشكل 2). تم اعداد الخلايا الكاملة والكسور شبه الخلوية كما هو موضح أعلاه لتحليلات GF-العاص ، وتم اجراء معايره المعدات لإنتاج منحني قياسي خطي نموذجي (الشكل 3).

الشكل 4 يظهر الصور المجهرية الخفيفة التمثيلية لتكاثر وتمايز أو متموج أحادي من كل نوع خليه ، ومستويات الزنك المقابلة لهذه. الأهم من ذلك ، أظهرت جميع خطوط الخلايا تحليلها في هذه الدراسة تركيزات الزنك في نطاق nM. ومع ذلك ، تم الكشف عن توزيع تفاضلي للمعدن. وأظهرت myotubes الابتدائية المتمايزة مستويات اعلي من الزنك من تكاثر الخلايا (الشكل 4A). ومن الجدير بالذكر ان معظم الأيونات كانت موجودة في الجزء النووي في كل من تكاثر الأقاليم والتفريق بينها. تم الكشف عن توزيع فرعي مماثل من الزنك في الورم الارومي العصبي المشتقة خط الخلية N2A (الشكل 4B). ومع ذلك ، أظهرت القياسات ان الخلايا N2A كان مستويات الزنك واحد ترتيب من حجم اعلي من الأقاليم الاوليه. من ناحية أخرى ، أظهرت خط الخلية 3T3-L1 مستويات اعلي من الزنك عندما كانت الخلايا ما قبل الأديب تتكاثر من عندما كانت مستحثه لتفريق وتشكيل الخلايا الشحمية الناضجة التي تتراكم الدهون (الشكل 4C).

ونحن أيضا قياس محتوي الزنك في اثنين من خطوط الخلايا الظهاريه الراسخة: MCF10A المستمدة من الغدة الثديية البشرية (الشكل 4D) والخلايا mdck المستمدة من الكلي الكلبة (الشكل4d). ومن المثير للاهتمام ، في كلتا الحالتين ، تم الكشف عن مستويات اعلي من الزنك في تكاثر الخلايا من متموج أحادي الطبقات. ومع ذلك ، أظهرت الخلايا الظهاريه المستمدة من الغدة الثديية مستويات المعادن التي كانت 2 اضعاف اعلي من خلايا الكلي. وأظهرت خلايا MCF10A مستويات متساوية من الزنك بين الكسور السيتووليك والنووية في تكاثر الخلايا. مره واحده MCF10A الخلايا تصل إلى التقاء ، وقد تم الكشف عن انخفاض 40 ٪ في الخلية الكاملة مستويات الزنك ، ووجد ان المعدن الأكثر تركيزا في الجزء السيتووليك (الشكل 4D). وعلي العكس من ذلك ، فان تكاثر خلايا MDCK اظهر مستويات اعلي من الزنك في الكسر النووي ، مقارنه بالكسر السيتووليك ، ولكن عندما وصلت خلايا MDCK إلى التقاء ، تم الكشف عن انخفاض في الزنك في الخلايا الكاملة ، مع غالبيه هذا الانتقال المعدني لوحظ في الجزء السيتووليك (الشكل 4E).

Figure 1
الشكل 1: الرسم البياني التمثيلي للتحليلات العنصرية للخلايا المستزرعة في الثدييات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحقق من نقاء الكسور التي تم الحصول عليها عبر العزل السريع لبروتوكول النوى 39 , 40التمثيل الغربي وصمه عار من التفريق بين الجزيئات الاوليه التي تبين نقاء الكسور تحت الخلوية. واستخدم انزيم الكروماتين ريموديلير Brg1 لتحديد الكسر النووي ، واستخدمت الأنابيب لتحديد الكسر السيتووليك. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: منحني معايره معايير الزنك. منحني القياسية التمثيلية لل Zn التي تحددها GF-العاص. تم معايره GF-العاص مع حلول الزنك القياسية المخففة في التركيزات التالية: 1 ، 3 ، 5 ، 7 ، 10 ، 15 ، 20 ، 25 ، و 30 ppb. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مستويات الزنك في مختلف الخلايا المستزرعة في الثدييات. الرسوم البيانية الخفيفة التمثيلية ومحتوي الزنك في مقتطفات الخلايا الكاملة والكسور الخلوية والنووية. تمثل البيانات متوسط ثلاث نسخ متماثلة البيولوجية مستقله ± SEM. (ا) الأقاليم الاوليه التي تنتشر وتميز لمده يومين. (ب) خط الخلية N2A الخلايا العصبية النخاعية murine قبل وبعد الاستقراء للتمييز بمعالجه حمض الريتينويك. (C) Murine 3T3-L1 قبل الخلايا الشحمية و 6 أيام التمايز بعد. (د) ما قبل متموج و متموج الطبقة الاحاديه من الخلية الظهاريه الثديية البشرية الخط MCF10A. (ه) ما قبل متموج ومتموج أحاديه الطبقة من الخلية الظهاريه الكلي خط mdck. تمثل البيانات متوسط ثلاث تجارب مستقله ± SE. الطالب t-اختبار يظهر اهميه ، * p ≤ 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

القياس الطيفي لامتصاص الذرية هو طريقه حساسة للغاية لتحديد كميه الزنك في العينات البيولوجية الصغيرة الحجم/الكتلة. الأمثل الموصوفة من قياس الزنك يجعل تطبيق هذه الطريقة بسيطه ويضمن الظروف التحليلية المثالية. هنا ، باستخدام GF-العاص ، حددنا تركيز الزنك في خلايا كامله ، وفي الكسور الخلوية والنووية ، من خطوط الخلايا المختلفة. وتبين النتائج ان هذه التقنية تجعل مماثله لتلك التي حصلت عليها المسبارات الفلورية وبرنامج المقارنات الكترونيه-MS. علي سبيل المثال ، أظهرت عده تحقيقات فلورية مستويات الزنك الميتوكوندريا العطوب في نطاق 0.1 إلى 300 م ، وكانت المستويات في golgi تحت نطاق بيكومولار ، وتراوحت الشبكية إندوبلازمي من 800 إلى 5,000 م42، والتي تتسق مع مستويات الكشف عنها في الكسور السيتووليك. وعلاوة علي ذلك ، وأظهرت فلوفينور الزنك المستجيبة fluozin-3 تراكم الزنك عطوب في حويصلات عصاري خلوي الصغيرة في MCF10A وفي خلايا C2C1243،44، والتي هي أيضا متسقة مع الزنك كميا في السيتوبلاسما. وعلاوة علي ذلك ، أظهرت تحليلات الزنك من قبل برنامج المقارنات العامة-MS التي قامت بها مجموعتنا ان مستويات الخلية بأكملها الزنك في التمييز myotubes الابتدائية45 مماثله لتلك التي تم الحصول عليها في هذا التقرير من قبل GF-العاص. الاضافه إلى ذلك ، فان أمثله علي تحديدات الزنك في الخلايا التي تحتوي علي الفئران C6 باستخدام العاص و Zinal-E46 قد قدمت أيضا نطاقات مماثله لتلك التي لوحظت في خلايا N2A ورم الارومي العصبي المستخدمة هنا.

حتى الآن ، تم تطوير تقنيات متنوعة للكشف عن الزنك في الخلايا. ومع ذلك ، لا يزال GF-العاص تقنيه دقيقه وحساسة للغاية التي لا يسمح فقط الكشف عن الزنك الحرة ، ولكن أيضا يقيس المعادن المعقدة وملزمه للبروتينات ويحتمل ان جزيئات صغيره. وأظهرت مجموعتنا مؤخرا ان القياسات التي أجريت مع مسبار الفلورسنت الخلية نفاذيه (التي لديها تقارب عاليه لربط الزنك الحرة2 +) ترتبط ارتباطا مباشرا مع مستويات الزنك المكتشفة من قبل GF-العاص في تكاثر والتفريق بين الأقاليم 43ومع ذلك ، فان النتائج التي حصلت عليها هذه التحقيقات قد لا تكون تمثيليه لخليه كامله أو تركيزات الزنك المرتبطة بالبروتين. وعلاوة علي ذلك ، نظرا لوجود الزنك كانواع غير الاكسده النشطة والموجبة ثنائي التكافؤ ، في ظل الظروف الفسيولوجية ، والكشف عنها في الانظمه الخلوية لا تزال تمثل تحديا. وقد أصبحت تقنيات التصوير بالزنك الجديدة متاحه ، مثل المجهر الشعاعي الضوئي القائم علي الاشعه السينية ، والنظائر المشعة ، والاجتثاث بالليزر بالاقتران بالبلازما الكتلي (LA-برنامج المقارنات الوطنية-MS). وللاسف ، فان بعض هذه التقنيات تتطلب موارد لا يمكن الوصول اليها من قبل المجتمع العلمي29،42،47،48،49،50.

وقد أظهرت الدراسات ان برنامج المقارنات التقليدية-MS هو أسلوب أكثر دقه من العاص ، حيث ان قيم الانحراف المعياري النسبي قد تبين انها اقل في تحديدات البرنامج المقارنة للمعادن مثل الزنك. والتفسير المحتمل لهذا الأثر هو ان برنامج المقارنات المذكورة قادر بصوره جوهريه علي القضاء علي التداخلات الكيميائية ، حيث تتراوح درجات حرارة الارجون العاملة بين 5,000 و 10,000 درجه مئوية. يمكن الحفاظ علي بعض السندات الكيميائية عند 3,000 درجه مئوية ، والتي هي في نطاق عمليه العاص. ستتعطل هذه السندات بالبالكامل عند 6,000 درجه مئوية. ولذلك ، يمكن لهذه الدرجات العالية التي وصلت في حاله البلازما من قبل برنامج المقارنات الوطنية-MS القضاء علي التدخلات الكيميائية ، مما يؤدي إلى تحسين الكشف عن حدود51. الاضافه إلى ذلك ، يتطلب برنامج المقارنات المذكورة عينات أكبر حجما بالمقارنة مع "GF-العاص" ، حيث ان هذه الاخيره قادره علي العمل بكميات تقل عن 100 μL ، وهو اقل بكثير من الأساليب الطيفية الأخرى مثل العاص ، أو برنامج المقارنات العامة. نظرا لصغر حجم المشاركة في هذه الطريقة ، GF-العاص هو الأسلوب المثالي لتحديد تركيز الزنك في العينات البيولوجية ، في المقام الأول إذا كان التحليل ينطوي علي الكسور الخلوية ، والكشف عن المعادن في البروتينات المنقية ، أو الاختلافات الصغيرة في الخلوية المحتوي المعدني بسبب طفرات في ناقلات أو البروتينات ملزمه المعادن29,52. الاضافه إلى ذلك ، فان حساسية نظام GF-العاص لتحديد تركيزات التتبع والتتبع الفائق (pg/mL إلى ng/mL) هي ميزه أخرى.

وينبغي مراعاه الاعتبارات الهامه لضمان موثوقيه البيانات المتعلقة بالفرنك الغين-العاص. وتشمل هذه المعايرة المناسبة ، وسلامه أنبوب الجرافيت ، واختيار معدل مصفوفة مناسبه لالانحلال الحراري الكهربي. مصفوفة المعدلات هي العناصر الكيميائية المضافة إلى العينة ، والتي تؤثر علي العمليات الحرارية التي تجري في رذاذ. هذه المعدلات تقليل فقدان التحلل اثناء الانحلال الحراري والمساهمة في أزاله مكونات مصفوفة. وعموما ، قد تغير المعدلات مصفوفة العينة لتتبخر مكونات المصفوفة عند درجات حرارة اقل وقد تعمل كمثبتات تحليليه. بالاضافه إلى هذه الاعتبارات ، من المهم لأداء الأمثل المناسب للخطوات لبرنامج درجه الحرارة رذاذ.

وينبغي اتخاذ اثنين من الاعتبارات الرئيسية ، بما في ذلك 1) تحديد درجه حرارة الانحلال الحراري الأمثل ، والذي يشير إلى درجه الحرارة القصوى في الخطوة الانحلال الذي لا يحدث فقدان التحليلية ، والذي يسمح امتصاص الحد الأقصى من التحليلية مع الحد الأدنى الخلفيه. وينبغي للمرء ان ينظر أيضا 2) تحديد درجه الحرارة الانحلال الأمثل ، والذي يشير إلى درجه الحرارة الدنيا التي تبخرت بالبالكامل التحليلية وسجلت كاشاره أو ذروه استنساخه. واحده من مساوئ التحليلات GF-العاص هو التدخل العنصر ، الذي الأمثل والتوحيد القياسي ضرورية لقياسات دقيقه. ومع ذلك ، حتى الآن ، GF-العاص يمثل أداه هامه في البحث العلمي للكشف عن أيونات المعادن في العينات البيولوجية المختلفة. التطبيقات المستقبلية من الزنك (وغيرها من المعادن) طرق الكشف عن طريق GF-العاص وسوف تشمل قياس مستويات المعادن في الأعضاء والانسجه التي تم الحصول عليها من النماذج الحيوانية أو الخزعات المريض لفهم أفضل للاحتياجات الفسيولوجية محدده للعناصر النزره. وفي الختام ، فان هذه التقنية التحليلية دقيقه ، وحساسة ، وفعاله من حيث التكلفة ، ويمكن الوصول اليها ، سيستمر هذا الأسلوب في التحسن مع تقدم التطورات التكنولوجية نحو نظم الكشف هذه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وكان هذا العمل مدعوما بجائزه علماء التنوع في الكلية من كليه الطب بجامعه ماساتشوستس إلى T.P.. N.N.. ويدعم من قبل SEP-CONACYT ، منحه 279879. وتدعم المؤسسة الوطنية للعلوم منحه DBI 0959476. ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم للدكتور داريل ا. بوسكو لتزويده بخط الخلية N2A ولدانييل تسوسسو لدعمها التقني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 147 ، الزنك ، الامتصاص الذري الطيفي ، الانتشار ، التمايز ، ثقافة خلايا الثدييات ، التجزئة تحت الخلوية
الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,… More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter