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Biochemistry

原子吸纳光谱测量哺乳动物细胞细胞内锌池

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

培养的原生细胞系或已建立的细胞系通常用于在使用动物模型之前解决基本的生物和机械问题, 作为初步方法。该方案介绍了如何利用原子吸收光谱制备用于锌 (Zn) 和其他微量元素研究的全细胞提取物和亚细胞组分。

Abstract

过渡金属是生物体必不可少的微量营养素, 但通过与蛋白质中的生理金属竞争并产生氧化还原应力, 可能对高浓度细胞有毒。导致金属枯竭或积累的病理条件是不同人类疾病的因果因素。一些例子包括贫血, 肠道炎, 威尔逊和门克斯的疾病。因此, 重要的是能够以高灵敏度和高精度测量生物样品中过渡金属的水平和迁移, 以便利研究探索这些元素如何有助于正常的生理功能和毒性。例如, 锌 (Zn) 是许多哺乳动物蛋白质中的辅因子, 参与信号事件, 是细胞中的二次信使。锌过量, 有毒, 可以抑制其他金属的吸收, 而在赤字中, 它可以导致各种潜在的致命条件。

石墨炉原子吸收光谱 (GF-AAS) 为测定不同生物样品中的锌和其他过渡金属浓度提供了一种高度敏感和有效的方法。通过 GF-AAS 进行电热雾化, 通过雾化少量样品对金属进行量化, 以便随后使用感兴趣元素的激发波长进行选择性吸收分析。在啤酒-兰伯特定律的线性范围内, 金属对光的吸收与分析物的浓度成正比。与其他测定锌含量的方法相比, GF-AAS 检测蛋白质中的游离锌和复合锌, 并可能检测出小样本量中灵敏度高的小细胞内分子中的游离锌。此外, 与电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 或基于同步 x 射线荧光相比, GF-AAS 也更容易获得。在该方法中, 描述了在 GF-AAS 中对不同培养细胞系进行系统样品制备的方法。比较了该微量元素在增殖和分化细胞的全细胞裂解物和细胞下组分中的变化, 以证明其原理。

Introduction

过渡和重金属, 如锌、铜、锰和铁, 在食物和污染物的营养物质中都是天然存在的。所有生物都需要不同数量的这些微量营养素;然而, 暴露在高水平是有害的生物。金属采集主要是通过饮食, 但金属也可以通过皮肤吸入或吸收 1,2,3, 4,5。必须指出, 大气颗粒中金属的存在正在增加, 在很大程度上与健康风险有关。由于人为活动, 在大气颗粒物、雨水和土壤6、7中检测到银、砷、镉、铬、汞、镍、铁和铅等重金属含量的增加。这些金属有可能与基本的生理微量元素竞争, 特别是锌和铁, 它们通过使生物过程中的基本酶失活而产生毒性效应。

微量元素锌是氧化还原中性的, 在生物反应中表现为刘易斯酸, 这使得它成为超过10% 的哺乳动物蛋白 8, 9 的蛋白质折叠和催化活性所必需的基本辅因子。10;因此, 它是必要的, 为不同的生理功能8,11。然而, 像许多微量元素一样, 这些金属之间存在着微妙的平衡, 促进了正常的生理功能并产生毒性。在哺乳动物中, 锌缺乏症会导致贫血、发育迟缓、性腺功能低下、皮肤异常、腹泻、脱发、味觉障碍、慢性炎症以及免疫和神经功能受损11、12、 13,14,15,16,17,18。锌过量, 具有细胞毒性, 会损害铜19、20、21 等其他基本金属的吸收。

此外, 铜、铁等一些金属有可能参与有害反应。通过芬顿化学生产活性氧 (ros) 会干扰铁硫簇蛋白的组装, 改变 22, 23,24的脂质代谢.为了防止这种损害, 细胞利用金属结合的伴侣和转运体来防止毒性的影响。毫无疑问, 必须严格控制金属的稳态, 以确保特定的细胞类型保持适当水平的金属。因此, 非常需要改进准确测量生物样品中微量金属的技术。在发育中的生物体和成熟的生物体中, 在细胞水平、不同的发育阶段以及正常和病理条件下对微量元素的生物需求存在差异。因此, 精确测定组织和全身金属水平是必要的, 以了解组织金属的稳态。

石墨炉原子吸收光谱法 (gf-aas) 是一种高度敏感的技术, 用于小样本量, 使其成为测量生物和环境样品中存在的过渡和重金属的理想选择25,26,27,28. 此外, 由于该技术的灵敏度高, 已被证明适合于研究钠++ atpase 和胃 h+/k +-atpase的优良输运特性。卵母细胞作为模型系统29。在 GF-AAS 中, 样品中的雾化元素吸收含有感兴趣金属的光源发出的辐射波长, 吸收的辐射与元素的浓度成正比。元素电子激发是在吸收紫外线或可见光辐射时进行的, 过程对每个化学元素来说都是独一无二的。在单个电子过程中, 光子的吸收涉及一个电子从较低的能级移动到原子内的较高能级, 而 GF-AAS 决定了样品吸收的光子的数量, 这与辐射吸收的数量成正比元素在石墨管中雾化。

这种技术的选择性依赖于原子的电子结构, 其中每个元素都有一个特定的吸收/发射谱线。在锌的情况下, 吸收波长为23.9 纳米, 可以与其他金属精确区分。总体而言, GF-AAS 可用于量化具有足够的检测极限 (LOD) 和高灵敏度和选择性25的锌。吸收波长的变化是积分的, 并表现为特定波长和孤立波长的能量吸收峰。根据啤酒-兰伯特定律, 在给定样品中锌的浓度通常是根据已知浓度的标准曲线计算的, 在该曲线中, 吸收率与样品中锌的浓度成正比。然而, 将啤酒-兰伯特方程应用于 GF-AAS 分析也存在一些复杂问题。例如, 样品的雾化和/或非均质浓度的变化会影响金属测量。

GF AAS 痕量元素分析所需的金属雾化由三个基本步骤组成。第一步是脱盐, 液体溶剂被蒸发;在熔炉达到约100°c 的温度后留下干燥的化合物。然后, 化合物通过加热从800到 1, 400°c (取决于要分析的元素) 蒸发, 并成为气体。最后, 在气态的化合物被雾化的温度范围从1500到 2, 500°c。如上所述, 感兴趣的金属的浓度的增加将使 GF-AAS 检测到的吸收成比例增加, 但熔炉减少了动态分析范围, 即可以是浓度的工作范围。由仪器确定。因此, 该技术需要低浓度和通过确定啤酒-兰伯特定律的 LOD 和线性极限 (LOL) 来仔细确定该方法的动态范围。LOD 是检测物质所需的最小数量, 定义为矩阵中锌标准偏差的三倍。LOL 是使用啤酒-兰伯特定律可以检测到的最大浓度。

在这项工作中, 我们描述了一个标准的方法来分析锌在整个细胞提取物, 细胞质和核分裂, 以及在增殖和分化培养细胞中的水平 (图 1)。我们将原子核协议的快速隔离调整到不同的细胞系统中, 以防止样品制备过程中的金属损失。所使用的细胞模型有来自小鼠卫星细胞的原代成肌细胞、小鼠神经母细胞 (N2A 或 Neuro2A)、小鼠 3T3 L1 脂肪细胞、人类非致瘤乳房上皮细胞 (MCF10A) 和马丁-达比犬肾上皮 (单元格。这些细胞是从不同的谱系建立的, 是研究体外金属水平的谱系特异性变化的良好模型。

从小鼠卫星细胞中提取的原代成肌细胞构成了一个非常适合的体外模型来研究骨骼肌的分化。在高血清条件下培养时, 这些细胞的增殖速度很快。然后, 低血清条件30导致分化为肌肉谱系.小鼠神经母细胞瘤 (N2A) 建立细胞系来源于小鼠神经冠。这些细胞呈现神经元和阿米巴状干细胞形态。在分化刺激时, N2A 细胞呈现神经元的几个特性, 如神经丝。N2a 细胞用于调查阿尔茨海默氏症、神经元生长和神经毒性31, 32,33。3T3-l1 小鼠脂肪细胞前建立的细胞系通常用于研究与脂肪生成相关的代谢和生理变化。这些细胞呈现成纤维细胞样的形态, 但一旦刺激分化, 它们就会呈现与脂质合成和甘油三酯积累相关的酶激活。这可以观察到形态的变化, 产生细胞质脂滴 34,35。MCF10A 是一种非肿瘤乳腺上皮细胞系, 来源于绝经前患有乳腺纤维囊性疾病的妇女 36.它已被广泛用于与乳腺癌有关的生化、分子和细胞研究, 如增殖、细胞迁移和侵袭。马丁-达比犬肾 (MDCK) 上皮细胞系已被广泛用于研究与建立上皮表型相关的性质和分子事件。到达融合后, 这些细胞变得极化, 并建立细胞粘连, 哺乳动物上皮组织的特点 37.

为了测试 AAS 测量哺乳动物细胞中锌含量的能力, 我们分析了这五个细胞系的整体和亚细胞分数 (细胞溶胶和细胞核)。AAS 测量显示, 在这些细胞类型中, 锌的浓度不同。在增殖和分化原代成肌细胞中, 浓度较低 (4 至 7 nmomg/mg), 在4个已建立的细胞系 (蛋白质含量从20到 40 nmomg/mg 不等) 中浓度较高。与增殖细胞相比, 在鉴别原代成肌细胞和神经母细胞瘤细胞时, 锌水平有少量不显著的增加。在分化的脂肪细胞中检测到相反的效果。然而, 增殖的3T3-l1 细胞表现出更高的浓度的金属相比分化的细胞。重要的是, 在这三个细胞系中, 亚细胞分馏表明, 根据细胞的代谢状态, 锌在细胞溶胶和细胞核中分布不同。例如, 在增殖成肌细胞、N2A 细胞和3T3-l1 前脂肪细胞中, 大部分金属被定位到细胞核。在使用特定细胞处理诱导分化时, 锌在这三种细胞类型中定位到细胞溶胶。有趣的是, 与达到融合时相比, 两个上皮细胞系在增殖过程中的锌含量都较高, 在融合处形成了一种特征紧密的单层。在增殖的上皮细胞中, 乳腺细胞系 MCF10A 在细胞溶胶和细胞核之间具有相等的锌分布, 而在肾源性细胞系中, 大部分金属位于细胞核内。在这两种细胞类型中, 当细胞到达汇合处时, 锌主要位于细胞溶胶上。这些结果表明, GF-AAS 是一种在低产量样品中进行元素分析的高度敏感和准确的技术。GF-AAS 与亚细胞分馏相结合, 可用于研究不同细胞系和组织中微量元素的水平。

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Protocol

1. 哺乳动物细胞培养

  1. 一般考虑因素
    1. 遵循无菌技术的哺乳动物细胞培养先前回顾了38。
    2. 在37°c 的加湿 5% co2 孵化器中保持所有细胞系。细胞培养条件因细胞类型而异。重要的是要为所使用的每一个细胞系保持适当的培养条件, 因为这些程序的变化会导致异常的表型和细胞培养的失败。
    3. 确保熟悉感兴趣的细胞系, 并遵循为特定实验选择的每个细胞类型提供的协议 (请参阅下面的一些示例)。
  2. 胰蛋白酶化和粘附细胞通过的一般程序
    1. 通过抽吸将细胞培养介质从培养板上去除。
    2. 使用无钙和镁的 PBS 轻轻清洗细胞 (每10厘米2培养表面积5毫升)。将洗涤液添加到板的一侧, 以避免分离细胞单层;旋转板, 以最大限度地覆盖解决方案。对于上皮细胞, 有必要在 PBS 的37°c 孵化器中孵育细胞 10至15分钟, 以促进细胞在以下步骤中的分离。
    3. 通过抽吸去除洗涤液。
    4. 在板材中加入足够的离解试剂 (0.25% 胰蛋白酶) (约每10厘米20.7 ml)。轻轻旋转板, 以获得细胞单层的完整覆盖。
    5. 在室温下培养 2 ~ 5分钟。实际孵育时间随所使用的细胞系而变化, 在上皮细胞的情况下, 建议在37°c 的孵化器中孵育10至15分钟。观察显微镜下的细胞脱离。
    6. 当大多数细胞分离时, 在预热电镀或生长介质的5毫升中恢复细胞悬浮液 (一些例子见下文)。通过多次在细胞单层上移液, 机械地分离细胞团块。
    7. 将细胞悬浮液转移到15毫升的锥形管, 并以 1, 000 x克的速度离心2至5分钟。离心速度和时间因细胞类型而异。通过温和的抽吸去除培养基, 小心不要接触细胞颗粒。在适当的预热培养基的5至10毫升中重新注入细胞颗粒, 并删除使用血细胞计或自动细胞计数器进行计数的样品。
    8. 利用适当体积的细胞悬浮液, 为每个特定的细胞系播种推荐的密度 (一些例子见下文)。根据培养皿的大小补充足够数量的培养基, 并将细胞放回孵化器。
  3. 从小鼠卫星细胞中提取的原代成肌细胞
    1. 开始之前, 准备胶原蛋白涂层板的原代成肌细胞生长。含有0.02% 胶原蛋白和 0.05 m 醋酸的溶液必须用0.22μm 无菌过滤装置过滤。在37°c 条件下用胶原蛋白溶液隔夜培育培养板。
    2. 第二天, 吸入胶原蛋白溶液, 让板材在无菌机柜中风干, 并在4°c 下储存, 直到使用。
      注: 胶原蛋白的最小体积为:35 毫米 = 1 毫升;60毫米 = 2 毫升;10厘米 = 5 毫升。
    3. 种子原生成肌细胞在 1 x 10 4 cellschmscm 2在 55 cm 2 胶原蛋白涂层培养板.增殖培养基为 Dulbecco 的改性鹰培养基 (DMEM)/ham 的 F12 营养混合培养基, 其中含有20% 的胎儿牛血清 (FBS)、25 ngml 的重组碱性成纤维细胞生长因子 (FGF) 和 100 uml 的青霉素/链霉素。
      注: 增殖和库存细胞应保持在50% 的汇流度以下。细胞接触诱导细胞对肌原分化的承诺, 并损害培养的生长能力。
    4. 为了区分原代成肌细胞, 允许细胞达到80% 至100% 的融合, 这通常发生在镀48小时后。然后, 转化为分化培养基 (DMEM、2% 马血清、1% 胰岛素、转铁蛋白、硒 a 补充剂和青霉素/链霉素 100 uml)。每天刷新媒体, 直到收获。
  4. 小鼠神经母细胞瘤 (N2A)
    1. 在生长介质中密度为 2 x10 4 cellscm 2 的板材 N2A 细胞, 含有含有高葡萄糖和 l-谷氨酰胺 (1: 1, v: v) 的降低血清培养基/dmem 的混合物, 用 10% fbs 和 100 U/piplyin 补充.保持库存文化在50% 以下融合。
    2. 一旦融合达到 25% ~ 40%, N2A 细胞的分化就会产生。改为含有还原血液------------------------------------------------------------------------------------------------------------每隔一天刷新一次介质, 直到细胞收获。
      注: 当 N2A 细胞分化时, 一些细胞会变得圆形, 容易分离, 并可能发生凋亡。吸气时要小心, 并将培养基添加到盘子中。
  5. 3T3 L1 小鼠脂肪前细胞
    1. 在高糖的 DMEM 中保持小鼠的 3t l1 细胞, 辅以10% 的 FBS 和 100 U/青霉素。脂肪生成过程依赖于细胞的融合;因此, 不要让种群培养生长超过50% 的融合, 因为较高的融合会损害细胞的分化能力。
    2. 将细胞排在 2 x10 4 cells/cm 2 处.在这个密度下, 细胞将在3天内到达融合。
    3. 在细胞达到100% 融合两天后, 诱导脂肪分化。感应介质由含有 10% FBS、10μgml 胰岛素、0.5 mm 3-异丁基-1-甲基黄酮、1μm 地塞米松和 10μm troglidzone 组成。
    4. 在48小时孵育分化培养基 (DMEM 含有 10% FBS 和5Μg/ml 胰岛素) 后, 更换诱导培养基。每隔一天刷新一次媒体, 直到收获。完全分化的代表性样本通常在脂原诱导后7至10天内采集。
      注意: 随着脂肪生成的进展, 细胞变得圆形, 并倾向于分离容易。吸气时要小心, 并将培养基添加到盘子中。
  6. MCF10A 电池
    1. DMEM/F12 中的平板 MCF10A 电池 (1:1, v: v), 辅以 5% FBS、100 U/ml penicillin/streptomycin、0.5Μgml 氢化可的松、10μgml 胰岛素和 20 ngml 表皮生长因子 (EGF)。推荐的播种密度为 1 x 10 5 cellslsscm 2.在这种情况下, 细胞将在4天内达到100% 的融合。每2至3天刷新一次介质, 直到收获。
      注: MCF10A 单元格难以分离。建议在胰蛋白酶化前, 在无钙的 PBS 中, 用 0.5 mM EDTA 在37°c 下孵育细胞10至15分钟。
  7. Madin-Darby 犬肾细胞 (MDCK)
    1. DMEM 中的平板 MDCK 细胞富含10% 的 FBS 和 100 U/Penicilin/streptomin。推荐的播种密度为 1 x 10 5 cellslscm 2, 细胞将在3天内达到100% 的融合.每2天刷新一次媒体, 直到收获。
      注: MDCK 单元格难以分离。建议在胰蛋白酶化之前, 在无钙和镁的 PBS 中, 在37°c 下孵育细胞 5 ~ 10分钟。为了防止细胞聚集, 在等待细胞分离的同时, 不要通过撞击或晃动烧瓶来搅动盘子。

2. 哺乳动物细胞培养样品制备 aas: 全细胞和亚细胞分馏

  1. 培养55厘米2板的感兴趣的细胞。使用较小的培养板可能会产生在 GF-AAS 检测极限下具有金属含量的样品。
  2. 全细胞提取物
    1. 使用真空陷阱吸收培养基。请务必删除媒体的所有痕迹。用不含钙和镁的冰凉 PBS 将细胞从所需的时间点或培养条件中冲洗三次。
    2. 立即刮出的细胞从板使用一个新的塑料细胞刮刀在1毫升的 PBS 没有钙和镁。将样品转移到 1.5 mL 的微离心管和离心机中, 以 2, 000 x 克的速度进行 2分钟, 并吸入上清液。协议可以在这里暂停。将颗粒样品储存在-20°c 或继续执行步骤2.4。
  3. 亚细胞分馏
    1. 使用真空陷阱吸收培养基。请务必删除媒体的所有痕迹。用不含钙和镁的冰凉 PBS 将细胞从所需的时间点或培养条件中冲洗三次。用1毫升的冰凉 PBS 将细胞从盘子里刮下来, 不含钙和镁。
    2. 将样品转移到 1.5 mL 的微离心管中, 并保持在冰上。以 10, 000 x g 的速度离心10秒。如果需要对细胞质和核馏分进行金属分析, 则继续快速分离细胞核。此过程将最大限度地减少细胞提取 39、40可能造成的金属损失。
    3. 通过吸入去除上清液, 并在400μl 的无钙和镁的冰凉 PBS 中重新悬浮细胞颗粒, 其中含有0.1% 的非理想 P-40 (NP-40), 一种非离子洗涤剂。将100μl 转移到新的微离心管中, 并将其视为整个细胞样品。这个信息代表了样本的25%。
    4. 用 P1000 微移液器尖端在冰上移液5至 10次, 分离细胞核。上皮细胞的核分离需要0.5% 的 NP-40 浓度。通过 26 G 针通过 26 g 针通过细胞悬浮液10至 15次, 然后通过 30 ~ 5 G 针通过10至15个通道, 实现细胞离解。
      注: 使用40x 目标, 通过光学显微镜验证原子核的完整性。
    5. 以 10, 000 x g 的速度将剩余的细胞裂解液悬浮液 (300μl) 离心10秒。上清液中含有细胞质部分。将300μl 转移到新的微离心管。
    6. 在不含钙和镁的 500μl PBS 中冲洗含有核分数的颗粒, 其中含有0.1% 的 NP-40, 然后以 10, 000 x g 的速度离心10次。取出上清液, 重新悬浮含有相同溶液100Μl 的含有细胞核的颗粒。
      注: 协议可以在此处暂停。样品可以存储在-20°c。
  4. 将细胞冷却三个超声循环 (30秒关闭, 50千赫, 200 W) 5分钟. 由 Bradford41定量样品中的总蛋白质含量。
  5. 使用针对核 (组蛋白、染色质重模剂、核基质蛋白) 或细胞质组分 (β-管蛋白、β-肌动蛋白) 的抗体对西方印迹的组分纯度进行质量控制 (图 2)。
    注: 请勿使用带金属尖端的声纳器。这些会污染样品与金属。

3. 原子吸收光谱法分析哺乳动物细胞培养过程中整个细胞和亚细胞分数的锌含量

  1. 在80°c 下, 用相同体积的浓缩 HNO 3 痕量金属等级 (小心) 将细胞培养样品 (整个细胞或核馏分) 在80°c 下进行矿化, 时间为1小时。
  2. 加入 H2o2 反应体积的 30%, 停止反应.用 18 MΩ纯净水将样品体积增加到500Μl。
    注: HNO3 处理应佩戴化学安全眼镜、防溅面罩、手套和经批准的蒸汽呼吸器 (如果没有足够的通风 (通风罩)。协议可以在这里暂停。样品可在室温下 (RT) 存储。
  3. 为配备石墨炉的 AAS 测量锌准备标准溶液和实验样品。
    1. 在去离子水中使用 2% (v/ v) hno 3 溶液, 该溶液来自标准曲线使用的同一批, 与空白溶液在整个过程中进行校准。使用在 18 MΩ纯净水中稀释的分析等级标准。
    2. 从商业上可获得的 1, 000 ppb 锌库存溶液中准备 1, 000 ppb 的锌标准, 并在去离子水中使用 2% (v/v)HNO 3溶液。用 2% (v/v) hno 3 溶液直接稀释至5、8、10、15、20和 25 ppb, 从 100 ppb标准中制备工作标准解决方案。用 0.1% (1 gl) mg (NO 3) 2 矩阵修饰符准备锌标准和空白.
      注: 锌的 LOD 为 0.01 ppb (μgl)。通过增加标准的浓度, 确定了锌的线性极限为 20 ppb (图 3)。
    3. 在相同的优化条件下测量标准和样品: 引入 250 mL/min 的流速, 20°c 的注射温度, 1, 800°c 的 GF 温度。
      注: 在注入新样品或标准之前, GF 温度提高到 2450, 用于清洗步骤。
    4. 将灯 (C-HCL) 优化为 20 A 的电流, 波长为23.9 纳米, 裂隙为 0.7 nm。
    5. 使用锌标准曲线测量矿化样品, 以确定金属含量。当测量小体积时, 如果测量需要很长时间, 样品就会蒸发。因此, 建议将水添加到样品中。如果获得的数据超出 LOD范围, 则用 0.01% hno 3 (分析级) 处理的 18 mω纯净水稀释样品。
      注: 通常情况下, 样品被稀释到500Μl 的体积, 放置在 AAS 的自动自动采样器中, 以便在标准曲线建立后立即进行测量。所需的体积应由用户确定, 并应考虑浓度的最终计算。建议一次尝试用一个完整的实验的 AAS 完成锌的测定。暂停测量可能会导致较大的实验变化和不一致。
  4. 将 ppb 测量值转换为通过 AAS 测量的锌获得的摩尔度。以锌的质量 (65, 39 阿穆) 为例。将 AAS 获得的 ppb 金额除以 639, 000。在细胞中, 锌的浓度范围从 pmol 单位到μmol 单位。
    1. 将锌 (pmol 或μmol) 的浓度除以布拉德福德测定的样品中的初始蛋白质质量 (步骤 2.4)。此计算将使每毫克蛋白质中含有的金属 (pmol 或μmol Zn) 量。
      注: 重要的是要考虑在金属测定过程中使用的稀释系数。

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Representative Results

我们测试了 GF-AAS 检测哺乳动物细胞中锌的微小水平的能力 (图 1)。因此, 我们培养了来自小鼠卫星细胞的原代成肌细胞, 以及已建立的细胞系 N2A (神经母细胞瘤)、3T3 L1 (脂肪细胞)、MCF10A (乳腺上皮) 和 MDCK 细胞 (狗肾上皮)。首先, 我们分离了所有这些细胞类型的整个细胞、细胞质和核组分, 并通过西方印迹评估了这些组分的纯度 (图 2)。有代表性的免疫检测染色质重塑剂 Brg1 和管蛋白分别作为核和细胞分裂的标志物, 证明了第2.3 节所述的亚细胞分馏协议的适宜性来执行元素分析 (图 2)。如上所述, 为 GF-AAS 分析制备了整个细胞和亚细胞分数, 并对设备进行了校准, 以得出典型的线性标准曲线 (图 3)。

图 4显示了每种细胞类型的增殖和分化或融合单层的代表性光显微镜图像, 以及这些细胞的相应锌水平。重要的是, 在这项研究中分析的所有细胞系都显示锌浓度在 nM 范围内。然而, 检测到金属的差异分布。分化的原代肌瘤的锌含量高于增殖细胞 (图 4a)。值得注意的是, 大部分离子位于增殖和分化成肌细胞的核部分。在神经母细胞瘤衍生细胞系 N2A 中检测到类似的锌亚细胞分布 (图 4B)。然而, 测量显示, N2A 细胞的锌含量比原代成肌细胞高一个数量级。另一方面, 在脂肪前细胞增殖时, 已建立的3T3-l1 细胞系显示出更高水平的锌, 而不是诱导分化并形成积累脂质的成熟脂肪细胞时 (图 4C)。

我们还测量了两种不同的已建立的上皮细胞系中的锌含量: 来自人类乳腺 (图 4D) 和狗肾衍生 Mdck (图 4D) 的 mcf10a 细胞。有趣的是, 在这两种情况下, 在增殖细胞中检测到的锌含量都高于融合单层细胞中的锌含量。然而, 从乳腺获得的上皮细胞显示出的金属水平比肾脏细胞高2倍。MCF10A 细胞在增殖细胞中的细胞质和核分裂之间的锌含量相等。一旦 MCF10A 细胞达到融合, 检测到整个细胞锌水平下降 40%, 发现金属最集中在细胞质部分 (图 4D)。相反, 增殖的 MDCK 细胞在核分数中的锌含量高于细胞质部分, 但当 MDCK 细胞达到汇合点时, 检测到整个细胞中的锌含量下降, 其中大部分是这种过渡金属观察到的细胞质部分 (图 4e)。

Figure 1
图 1: 哺乳动物培养细胞元素 (zn) 分析的代表性流程图.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 通过快速分离原子核协议获得的分数纯度的验证39,40. 代表性的西方印迹, 从区分原代成肌细胞显示的纯细胞分数。用染色质重组酶 Brg1 鉴定核组分, 用管蛋白鉴定细胞质组分。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 锌标准的校准曲线.用 GF-AAS 确定的锌的代表性标准曲线。GF-AAS 采用以下浓度稀释的标准锌溶液进行校准: 1、3、5、7、10、15、20、25和 30 ppb。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 不同哺乳动物培养细胞中的锌含量.在整个细胞提取物和细胞质和核组分中具有代表性的光镜和锌含量。数据代表了三个独立的生物复制± SEM (a) 小鼠原代成肌细胞增殖和分化2天的平均值。(B) 小鼠神经母细胞瘤 N2A 细胞系诱导前后通过维甲酸治疗进行鉴别。(C) 小鼠3T3-l1 前脂肪细胞和分化后6天。(D) 人乳腺上皮细胞系 MCF10A 的融合前和融合单层。(E) 肾上皮细胞系 MDCK 的前融合和融合单层。数据代表了三个独立实验的平均值± se. 学生的t-测试显示意义, * p ≤0.05。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

原子吸收光谱是一种对小体积/质量生物样品进行锌定量的高度敏感的方法。所描述的锌测量优化使该方法的应用简单, 保证了理想的分析条件。在这里, 我们使用 GF-AAS 确定了锌在整个细胞中的浓度, 以及在来自不同细胞系的细胞质和核分裂中的浓度。结果表明, 该技术与荧光探针和 ICP-MS 的工艺具有相当的效果。例如, 几个荧光探针显示, 线粒体锌含量在0.1 至 300 Ppm 之间, Golgi 的含量低于 picomolar范围, 内质网的含量在800到 5000 pm42 之间, 这与水平一致在细胞质部分中检测到。此外, zn 反应荧光体氟锌3在 mcf10a 和 c2c12 细胞43、44的小细胞质囊中显示了不稳定的锌积累, 这也与细胞质中的锌定量一致。此外, 本组通过 ICP-MS 进行的 Zn 分析表明, 全细胞水平锌在鉴别原代肌管45方面与 GF-AAS 在本报告中获得的相似。此外, 利用 AAS 和 Zinquin-E46在 c6 大鼠胶质瘤细胞中测定锌的例子也与在这里使用的神经母细胞瘤 N2A 细胞中观察到的范围相似。

到目前为止, 已经开发出了多种技术来检测细胞中的锌。然而, GF-AAS 仍然是一种精确且高度敏感的技术, 它不仅可以检测游离锌, 还可以测量与蛋白质和潜在的小分子结合的金属。我们的小组最近显示, 用细胞渗透性荧光探针 (具有高亲和力, 结合游离锌2 +) 进行的测量与 gf-aas 在增殖和分化成肌细胞中检测到的锌水平直接相关43. 然而, 这些探针获得的结果可能不能代表整个细胞或蛋白质结合锌的浓度。此外, 由于锌作为非氧化还原活性物种和二价阳离子存在, 在生理条件下, 在细胞系统中检测到锌仍然是一个挑战。新的锌成像技术已经可用, 例如最先进的同步 x 射线荧光显微镜、放射性同位素和激光烧蚀诱导耦合等离子体质谱 (LA-ICP-MS)。不幸的是, 其中一些技术需要科学界无法获得的资源 29、42、47、48、49、50.

研究表明, ICP-MS 是一种比 AAS 更精确的技术, 因为在对锌等金属的 ICP-MS 测定中, 相对标准偏差值被证明较低。这种效应的可能解释是, ICP-MS 本质上能够消除化学干扰, 因为工作氩的温度范围为 5, 000 至 10, 000°c。有些化学键可以保持在 3, 000°c, 这在 AAS 操作的范围内。这些债券将在6000°c 以上完全中断。因此, ICP-MS 在等离子体状态下达到的这些高温可以消除化学干扰, 从而获得更好的检测极限51。此外, 与 GF-AAS 相比, ICP-MS 需要更大的体积样品, 因为后者能够在100μl 以下的体积下工作, 这大大低于其他光谱方法, 如 AAS、ICP-OES 或 ICP-MS。考虑到该方法所涉及的体积较小, GF-AAS 是确定生物样品中锌浓度的理想技术, 主要是如果分析涉及亚细胞组分、纯化蛋白质中的金属检测或细胞的微小变化金属含量由于突变的转运蛋白或金属结合蛋白 29, 52.此外, GF-AAS 系统对确定痕量和超痕量浓度 (pg/mL 至 Ng/ml) 的敏感性也是另一个优势。

应考虑重要因素, 以确保 GF-AAS 数据的可靠性。其中包括适当的校准、石墨管的完整性以及选择合适的电热雾化矩阵改性剂。矩阵改性剂是添加到样品中的化学元素, 它影响雾化器中发生的热过程。这些改性剂最大限度地减少了热解过程中分析物的损失, 并有助于去除基质成分。总体而言, 改性剂可能会改变样品基质, 以便在较低的温度下蒸发基件, 并可用作分析物稳定剂。除了这些考虑因素外, 还必须对雾化器温度程序的步骤进行充分的优化。

应考虑两个主要因素, 包括: 1) 确定最佳热解温度, 即在雾化步骤中不发生分析物损失的最高温度, 并允许以最小的方式最大限度地提高分析物的吸收率。背景。还应该考虑建立最佳雾化温度, 即分析物完全蒸发并记录为可重现信号或峰值的最低温度。GF-AAS 分析的缺点之一是元素干扰, 因此对精确测量进行彻底的优化和标准化是必不可少的。然而, 迄今为止, GF-AAS 是科学研究中检测各种生物样本中金属离子的重要工具。GF-AAS 在锌 (和其他金属) 检测方法的未来应用将包括测量从动物模型或患者活检中获得的器官和组织中的金属含量, 以更好地了解对微量元素的具体生理需求。总之, GF-AAS 是准确、敏感、具有成本效益和可访问性的, 随着这些检测系统技术的进步, 这种分析技术将继续得到改进。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了麻省大学医学院到 t. p. b. 的教师多样性学者奖的支持。N.-T。由 SEP-CONACYT 支持, 赠款279879。J. g. n 由国家科学基金会赠款 DBI 0959476 提供支持。提交人感谢 Daryl A. Bosco 博士提供 N2A 细胞系, 并感谢 Danella Cangussu 的技术支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

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Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

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