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Biochemistry

Spectroscopie d’absorbance atomique pour mesurer les pools de zinc intracellulaire dans les cellules de mammifères

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Les lignées cellulaires primaires ou établies sont couramment utilisées pour aborder les questions biologiques et mécanistiques fondamentales comme une approche initiale avant d’utiliser des modèles animaux. Ce protocole décrit comment préparer des extraits de cellules entières et des fractions subcellulaires pour des études de zinc (Zn) et d’autres oligo-éléments avec spectroscopie d’absorbance atomique.

Abstract

Les métaux de transition sont des micronutriments essentiels pour les organismes, mais peuvent être toxiques pour les cellules à fortes concentrations en rivalisant avec les métaux physiologiques dans les protéines et en générant un stress redox. Les conditions pathologiques qui conduisent à l’épuisement ou à l’accumulation de métaux sont des agents causaux de différentes maladies humaines. Quelques exemples incluent l’anémie, l’Acrodermatite Enteropathica, et les maladies de Wilson et de Menkes. Il est donc important de pouvoir mesurer les niveaux et le transport des métaux de transition dans des échantillons biologiques avec une sensibilité et une précision élevées afin de faciliter la recherche explorant comment ces éléments contribuent aux fonctions physiologiques normales et toxicité. Le zinc (Zn), par exemple, est un cofacteur dans de nombreuses protéines de mammifères, participe à des événements de signalisation, et est un messager secondaire dans les cellules. En excès, le Zn est toxique et peut inhiber l’absorption d’autres métaux, tandis que dans le déficit, il peut conduire à une variété de conditions potentiellement létales.

La spectroscopie d’absorption atomique du four à graphite (GF-AAS) fournit une méthode très sensible et efficace pour déterminer les concentrations de Zn et d’autres métaux de transition dans divers échantillons biologiques. L’atomisation électrothermique via GF-AAS quantifie les métaux en atomisant de petits volumes d’échantillons pour une analyse d’absorption sélective subséquente en utilisant la longueur d’onde d’excitation de l’élément d’intérêt. Dans les limites de la linéarité de la loi Beer-Lambert, l’absorbance de la lumière par le métal est directement proportionnelle à la concentration de l’analyte. Par rapport à d’autres méthodes de détermination de la teneur en Zn, GF-AAS détecte le Zn libre et complexé dans les protéines et peut-être dans de petites molécules intracellulaires avec une sensibilité élevée dans les petits volumes d’échantillons. De plus, le GF-AAS est aussi plus facilement accessible que la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) ou la fluorescence des rayons X à base de synchrotron. Dans cette méthode, on décrit la préparation systématique de l’échantillon de différentes lignées cellulaires cultivées pour les analyses dans un GF-AAS. Les variations de cet oligo-élément ont été comparées dans les lysats cellulaires entiers et les fractions subcellulaires des cellules proliférantes et différenciées comme preuve de principe.

Introduction

La transition et les métaux lourds, tels que le Zn, le Cu, le mn et le Fe, se retrouvent naturellement dans l’environnement dans les nutriments des aliments et des polluants. Tous les organismes vivants exigent des quantités différentes de ces micronutriments; Cependant, l’exposition à des niveaux élevés est délétère pour les organismes. L’acquisition de métaux est principalement par le biais de l’alimentation, mais les métaux peuvent également être inhalés ou absorbées par la peau1,2,3,4,5. Il est important de noter que la présence de métaux dans les particules atmosphériques augmente et a été largement associée à des risques pour la santé. En raison d’activités anthropiques, des niveaux accrus de métaux lourds tels que AG, As, CD, CR, Hg, ni, Fe et Pb ont été détectés dans les matières particulaires atmosphériques, l’eau de pluie et le sol6,7. Ces métaux ont le potentiel de rivaliser avec les oligo-éléments physiologiques essentiels, en particulier le Zn et le Fe, et ils induisent des effets toxiques en inactivant les enzymes fondamentales pour les processus biologiques.

L’oligo-élément Zn est neutre redox et se comporte comme un acide de Lewis dans les réactions biologiques, ce qui en fait un cofacteur fondamental nécessaire pour le pliage des protéines et l’activité catalytique dans plus de 10% des protéines de mammifères8,9, le 10; par conséquent, il est essentiel pour diverses fonctions physiologiques8,11. Cependant, comme de nombreux oligo-éléments, il y a un équilibre délicat entre ces métaux facilitant la fonction physiologique normale et causant la toxicité. Chez les mammifères, les carences en Zn conduisent à l’anémie, au retard de croissance, à l’hypogonadisme, aux anomalies cutanées, à la diarrhée, à l’alopécie, aux troubles du goût, à l’inflammation chronique et aux fonctions immunitaires et neurologiques altérées11,12, 13,14,15,16,17,18. En excès, le Zn est cytotoxique et altère l’absorption d’autres métaux essentiels tels que le cuivre19,20,21.

En outre, certains métaux comme Cu et Fe ont le potentiel de participer à des réactions nocives. La production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) par l’intermédiaire de la chimie de Fenton peut interférer avec l’assemblage des protéines de grappe de soufre de fer et altérer le métabolisme lipidique22,23,24. Pour éviter ces dommages, les cellules utilisent des chaperons et des transporteurs à reliure métallique pour prévenir les effets toxiques. Sans aucun doute, l’homéostasie du métal doit être étroitement contrôlée pour s’assurer que les types de cellules spécifiques maintiennent des niveaux appropriés de métaux. Pour cette raison, il est important de faire progresser les techniques de mesure précise des métaux-traces dans les échantillons biologiques. Dans les organismes en développement et matures, il existe un besoin biologique différentiel pour les oligo-éléments au niveau cellulaire, à différents stades de développement, et dans des conditions normales et pathologiques. Par conséquent, une détermination précise des niveaux de tissu et de métal systémique est nécessaire pour comprendre l’homéostasie du métal organismique.

La spectrométrie d’absorption atomique du four à graphite (GF-AAS) est une technique très sensible utilisée pour les petits volumes d’échantillons, ce qui le rend idéal pour mesurer la transition et les métaux lourds présents dans les échantillons biologiques et environnementaux25,26 , 27 la plupart des , 28. en outre, en raison de la sensibilité élevée de la technique, il a été démontré qu’il était approprié pour étudier les propriétés de transport fines de Na+/K+-ATPase et gastrique H+/K+-ATPase utilisant Xenopus les ovocytes comme système modèle29. Dans GF-AAS, les éléments atomisés dans un échantillon absorbent une longueur d’onde de rayonnement émise par une source lumineuse contenant le métal d’intérêt, avec le rayonnement absorbé proportionnel à la concentration de l’élément. L’excitation électronique élémentaire se déroule lors de l’absorption de rayonnement ultraviolet ou visible dans un processus quantifié unique pour chaque élément chimique. Dans un processus d’électron unique, l’absorption d’un photon implique un électron passant d’un niveau d’énergie inférieur à un niveau supérieur dans l’atome et GF-AAS détermine la quantité de photons absorbé par l’échantillon, qui est proportionnelle au nombre de radiations absorbantes éléments atomisés dans le tube de graphite.

La sélectivité de cette technique repose sur la structure électronique des atomes, dans laquelle chaque élément a une ligne spectrale d’absorption/émission spécifique. Dans le cas du Zn, la longueur d’onde d’absorbance est 213,9 nm et peut être précisément distinguée des autres métaux. Dans l’ensemble, GF-AAS peut être utilisé pour quantifier le Zn avec des limites de détection adéquates (LOD) et une sensibilité et une sélectivité élevées25. Les changements dans la longueur d’onde absorbée sont intégrés et présentés comme des pics d’absorption d’énergie à des longueurs d’onde spécifiques et isolées. La concentration du Zn dans un échantillon donné est généralement calculée à partir d’une courbe standard de concentrations connues selon la loi Beer-Lambert, dans laquelle l’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de Zn dans l’échantillon. Cependant, l’application de l’équation de Beer-Lambert aux analyses GF-AAS présente également quelques complications. Par exemple, les variations de l’atomisation et/ou des concentrations non homogènes des échantillons peuvent affecter les mesures du métal.

L’atomisation métallique requise pour l’analyse élémentaire de la trace de GF AAS se compose de trois étapes fondamentales. La première étape est la desolvation, où le solvant liquide est évaporé; laissant des composés secs après que le four atteigne une température d’environ 100 ° c. Ensuite, les composés sont vaporisés en les chauffant de 800 à 1 400 ° c (selon l’élément à analyser) et devenir un gaz. Enfin, les composés à l’état gazeux sont atomisés avec des températures allant de 1 500 à 2 500 ° c. Comme on l’a vu plus haut, les concentrations croissantes d’un métal d’intérêt rendraient les augmentations proportionnelles sur l’absorption détectée par le GF-AAS, mais le four réduit la gamme dynamique d’analyse, qui est la plage de travail des concentrations qui peuvent être déterminée par l’instrument. Ainsi, la technique exige de faibles concentrations et une détermination minutieuse de la gamme dynamique de la méthode en déterminant le LOD et la limite de linéarité (LOL) de la loi Beer-Lambert. Le LOD est la quantité minimale requise pour une substance à détecter, définie comme trois fois l’écart-type de Zn dans la matrice. Le LOL est la concentration maximale qui peut être détectée en utilisant la Loi de Beer-Lambert.

Dans ce travail, nous décrivons une méthode standard pour analyser les niveaux de Zn dans les extraits de cellules entières, les fractions cytoplasmiques et nucléaires, et dans les cellules cultivées proliférantes et différentiantes (figure 1). Nous avons adapté l’isolement rapide du protocole de noyaux à différents systèmes cellulaires pour éviter la perte de métal lors de la préparation de l’échantillon. Les modèles cellulaires utilisés étaient des myoblastes primaires dérivées de cellules de souris satellites, de cellules murines de neurones (n2a ou Neuro2a), de murin 3t3 L1 adipocytes, d’une lignée de cellules épithéliales non tumorigènes du sein (MCF10A) et d’un rein de chien épithélial Madin-Darby ( MDCK). Ces cellules ont été établies à partir de lignées différentes et sont de bons modèles pour étudier les variations spécifiques de la lignée des niveaux de métal in vitro.

Les myoblastes primaires dérivées des cellules satellites de souris constituent un modèle in vitro bien adapté pour étudier la différenciation musculaire squelettique. La prolifération de ces cellules est rapide lorsqu’elle est cultivée dans des conditions sériques élevées. La différenciation dans la lignée musculaire est ensuite induite par de faibles conditions sériques30. Le neuroblastome murin (N2A) a établi la lignée cellulaire a été dérivé de la crête neuronale de la souris. Ces cellules présentent une morphologie neuronale et amoeboïde des cellules souches. Lors du stimulus de différenciation, les cellules N2A présentent plusieurs propriétés des neurones, comme les neurofilaments. Les cellules n2a sont utilisées pour enquêter sur la maladie d’Alzheimer, l’outgrowth neurites et la neurotoxicité31,32,33. Les pré-adipocytes de la souris 3T3-L1 ont établi la lignée cellulaire est couramment utilisé pour étudier les changements métaboliques et physiologiques associés à l’adipogenèse. Ces cellules présentent une morphologie de fibroblastes, mais une fois stimulées pour la différenciation, elles présentent une activation enzymatique associée à la synthèse lipidique et à l’accumulation de triglycérides. Cela peut être observé comme des changements morphologiques pour produire des gouttelettes lipidiques cytoplasmiques34,35. MCF10A est une lignée de cellules épithéliales mammaires non tumorales dérivée d’une femme préménopausale atteinte de la maladie fibrokystique mammaire36. Il a été largement utilisé pour les études biochimiques, moléculaires et cellulaires liées à la carcinogenèse mammaire comme la prolifération, la migration cellulaire et l’invasion. La lignée de cellules épithéliales du rein canin de Madin-Darby (MDCK) a été largement utilisée pour étudier les propriétés et les événements moléculaires associés à l’établissement du phénotype épithélial. Après avoir atteint la confluence, ces cellules deviennent polarisées et établissent des adhérences cellulaires, caractéristiques des tissus épithéliaux de mammifères37.

Pour tester la capacité des AAS à mesurer les concentrations de Zn dans les cellules de mammifères, nous avons analysé des fractions entières et subcellulaires (cytosol et noyau) de ces cinq lignées cellulaires. Les mesures AAS ont montré différentes concentrations de Zn dans ces types de cellules. Les concentrations étaient plus faibles dans les myoblastes primaires proliférantes et différant (4 à 7 nmol/mg de protéine) et plus élevées dans les quatre lignées cellulaires établies (variant de 20 à 40 nmol/mg de protéine). Une petite augmentation non significative des concentrations de Zn a été détectée dans la différenciation des myoblastes primaires et des cellules neuroblatomes par rapport aux cellules proliférantes. L’effet inverse a été détecté dans les adipocytes différenciés. Cependant, la prolifération des cellules 3T3-L1 a montré des concentrations plus élevées du métal par rapport aux cellules différenciées. Il est important de noter que, dans ces trois lignées cellulaires, le fractionnement subcellulaire a montré que le Zn est distribué de façon différenciée dans le cytosol et le noyau en fonction de l’état métabolique de ces cellules. Par exemple, dans les myoblastes proliférantes, les cellules N2A et les pré-adipocytes 3T3-L1, une majorité du métal est localisée dans le noyau. Lors de l’induction de la différenciation à l’aide de traitements cellulaires spécifiques, Zn localisé au cytosol dans ces trois types de cellules. Fait intéressant, les deux lignées cellulaires épithéliales ont montré des niveaux plus élevés de Zn pendant la prolifération par rapport au moment d’atteindre la confluence, dans laquelle une monocouche étroite caractéristique a été formée. Dans les cellules épithéliales proliférantes, la lignée de cellules mammaires MCF10A avait une distribution de Zn égale entre le cytosol et le noyau, tandis que dans la lignée cellulaire dérivée du rein, la plupart des métaux étaient localisés dans le noyau. Dans ces deux types de cellules, lorsque les cellules atteignent la confluence, le Zn est principalement localisé au cytosol. Ces résultats démontrent que GF-AAS est une technique très sensible et précise pour effectuer des analyses élémentaires dans des échantillons à faible rendement. GF-AAS couplé avec fractionnement subcellulaire et peut être adapté pour étudier les niveaux d’oligo-éléments métalliques dans différentes lignées cellulaires et tissus.

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Protocol

1. culture cellulaire de mammifères

  1. Considérations générales
    1. Suivre les techniques aseptiques pour la culture de cellules de mammifères examinées précédemment38.
    2. Maintenir toutes les lignées cellulaires dans un incubateur humidifié à 5% CO2 à 37 ° c. Les conditions de culture cellulaire varient pour chaque type de cellule. Il est important de maintenir des conditions de culture appropriées pour chaque lignée cellulaire utilisée, car les variations de ces procédures mèneront à des phénotypes aberrants et à une défaillance de la culture cellulaire.
    3. Assurez la connaissance de la ligne d’intérêt cellulaire et suivez les protocoles fournis pour chaque type de cellule sélectionné pour des expériences spécifiques (voir quelques exemples ci-dessous).
  2. Procédure générale de trypsinisation et de transmission des cellules adhérentes
    1. Retirer les milieux de culture cellulaire de la plaque de culture par aspiration.
    2. Lavez doucement les cellules à l’aide de PBS sans calcium ni magnésium (5 mL par surface de culture de 10 cm2 ). Ajouter la solution de lavage sur le côté de la plaque pour éviter de détacher la monocouche de la cellule; la plaque pour maximiser la couverture de la solution. Pour les cellules épithéliales, il est nécessaire d’incuber les cellules pendant 10 à 15 min dans l’incubateur à 37 ° c dans le PBS pour faciliter la dissociation des cellules dans les étapes suivantes.
    3. Retirer la solution de lavage par aspiration.
    4. Ajouter suffisamment de réactif de dissociation (0,25% de trypsine) à la plaque (environ 0,7 mL par 10 cm2). Agiter doucement la plaque pour obtenir une couverture complète de la monocouche cellulaire.
    5. Incuber la culture à température ambiante pendant 2 à 5 min. Le temps d’incubation réel varie en fonction de la lignée cellulaire utilisée, dans le cas des cellules épithéliales est recommandé d’incuber pendant 10 à 15 min dans l’incubateur à 37 ° c. Observez les cellules sous le microscope pour le détachement de cellules.
    6. Lorsque la plupart des cellules se sont détachées, récupérez la suspension cellulaire dans 5 mL du placage préchauffé ou du milieu de croissance (voir ci-dessous pour quelques exemples). Dissociez mécaniquement les amas cellulaires par pipetage sur la monocouche cellulaire plusieurs fois.
    7. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et la centrifuger à 1 000 x g pendant 2 à 5 min. La vitesse de centrifugation et le temps varient en fonction du type de cellule. Retirez le support par aspiration douce, en veillant à ne pas toucher le culot de la cellule. Résuspendez le culot cellulaire dans 5 à 10 mL du milieu de croissance préchauffé approprié et enlevez un échantillon pour le comptage à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
    8. Utiliser le volume approprié de la suspension cellulaire pour ensemencer la densité recommandée pour chaque lignée cellulaire spécifique (voir ci-dessous pour quelques exemples). Supplément avec le volume adéquat de milieux de culture en fonction de la taille du plat de culture et de placer les cellules de nouveau dans l’incubateur.
  3. Myoblastes primaires dérivées de cellules satellites de souris
    1. Avant de commencer, préparez des plaques enrobées de collagène pour la croissance primaire de myoblastes. Une solution contenant 0,02% de collagène, et l’acide 0,05 M acétique dans l’eau désionisée doivent être stérilisés par filtration avec un filtre stérile de 0,22 μM. Incuber les plaques de culture avec la solution de collagène pendant la nuit à 37 ° c.
    2. Le lendemain, aspirer la solution de collagène, laisser sécher les assiettes à l’air dans l’armoire stérile et conserver à 4 ° c jusqu’à l’utilisation.
      NOTE: les volumes minimaux de collagène sont: pour 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Myoblastes primaires de semence à 1 x 104 cellules/cm2 en 55 cm2 plaques de culture enrobées de collagène. Les milieux de prolifération sont les milieux de culture du mélange nutritif de l’aigle (DMEM)/Ham de Dulbecco modifié, contenant 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 25 ng/mL de facteur de croissance fibroblastique de base recombinant (FGF) et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine.
      Remarque: les cellules proliférantes et de stock doivent être maintenues sous 50% de la confluence. Le contact cellulaire induit l’engagement des cellules à la différenciation myogénique et altère les capacités de croissance de la culture.
    4. Pour différencier les myoblastes primaires, permettre aux cellules d’atteindre 80% à 100% de Confluences, ce qui se produit normalement après 48 h de placage. Ensuite, changez pour les médias de différenciation (DMEM, 2% sérum de cheval, 1% d’insuline, transferrine, sélénium un supplément, et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine). Actualisez les médias quotidiennement jusqu’à la récolte.
  4. Neuroblastome de murine (N2A)
    1. Plaque N2A cellules à une densité de 2 x 104 cellules/cm2 dans les milieux de croissance, contenant un mélange de milieu à sérum réduit/DMEM contenant un taux élevé de glucose et de L-glutamine (1:1, v:v), Supplément avec 10% de FBS et 100 U/ml de pénicilline/streptomycine. Maintenir la culture du stock sous 50% de confluences.
    2. Induire la différenciation des cellules N2A une fois que la confluence a atteint 25% à 40%. Modification des milieux de différenciation contenant un mélange de milieu/DMEM à sérum réduit, de 1% de FBS et d’acide rétinoïque de 20 μM pendant 7 à 10 jours. Rafraîchissez les médias tous les deux jours jusqu’à la récolte des cellules.
      Remarque: comme les cellules N2A se différencient, certaines cellules deviennent rondes, se détachent facilement et peuvent subir une apoptose. Soyez prudent lorsque vous aspirer et ajouter les milieux de culture aux plaques.
  5. 3T3 L1 pré-adipocytes murins
    1. Maintenir les cellules 3T3/L1 de la souris dans le DMEM avec un glucose élevé, additionnée de 10% de FBS et de 100 U/mL de pénicilline/streptomycine. Le processus adipogénique dépend de la confluence des cellules; par conséquent, ne laissez pas la culture du stock croître plus de 50% de Confluences, car une confluence plus élevée nuira à la capacité des cellules à se différencier.
    2. Plaque les cellules à 2 x 104 cellules/cm2. A cette densité, les cellules atteindront la confluence en 3 jours.
    3. Induire une différenciation adipogénique deux jours après que les cellules atteignent 100% de confluences. Les milieux d’induction se composent de DMEM contenant 10% de FBS, 10 μg/mL d’insuline, 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthyxanthine, 1 μM de dexaméthasone et 10 μM de troglitazone.
    4. Remplacer le support d’induction après une incubation de 48 h à des milieux de différenciation (DMEM contenant 10% de FBS et 5 μg/mL d’insuline). Rafraîchissez les médias tous les deux jours jusqu’à la récolte. Des échantillons représentatifs de différenciation complète sont normalement recueillis entre 7 et 10 jours après l’induction adipogénique.
      Remarque: au fur et à mesure que l’adipogenèse progresse, les cellules deviennent rondes et tendent à se détacher facilement. Soyez prudent lorsque vous aspirer et ajouter les milieux de culture aux plaques.
  6. Cellules MCF10A
    1. Les cellules de la plaque MCF10A dans le DMEM/F12 (1:1, v:v), complétées par 5% de FBS, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 0,5 μg/mL d’hydrocortisone, 10 μg/mL d’insuline et 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF). La densité de semis recommandée est de 1 x 105 cellules/cm2. Dans ces conditions, les cellules atteindront 100% de Confluences dans les 4 jours. Rafraîchissez le support tous les 2 à 3 jours jusqu’à la récolte.
      Remarque: les cellules MCF10A sont difficiles à détacher. Il est recommandé d’incuber les cellules pendant 10 à 15 min à 37 ° c dans du PBS sans calcium avec 0,5 mM d’EDTA avant la trypsinisation.
  7. Cellules rénales canines Madin-Darby (MDCK)
    1. Les cellules de la plaque MDCK dans le DMEM ont été complétées par 10% de FBS et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine. La densité de semis recommandée est de 1 x 105 cellules/cm2, où les cellules atteindront 100% de Confluences dans les 3 jours. Rafraîchissez le support tous les 2 jours jusqu’à la récolte.
      Remarque: les cellules MDCK sont difficiles à détacher. Il est recommandé d’incuber les cellules pendant 5 à 10 min à 37 ° c dans du PBS exempt de calcium et de magnésium avant la trypsinisation. Pour éviter l’agglutination des cellules, ne pas agiter les plaques en frappant ou en secouant le flacon en attendant que les cellules se détachent.

2. préparation de l’échantillon de culture cellulaire de mammifères pour AAS: fractionnement de cellules entières et subcellulaires

  1. Culture les cellules d’intérêt dans 55 cm2 assiettes. L’utilisation de plaques de culture plus petites peut produire des échantillons avec des niveaux de métaux sous les limites de détection du GF-AAS.
  2. Extrait de cellule entière
    1. Aspirer les milieux de culture à l’aide d’un piège à vide. Veillez à supprimer toutes les traces de média. Rincer les cellules des points de temps ou des conditions de culture souhaités trois fois avec du PBS glacé et exempt de calcium et de magnésium.
    2. Grattez immédiatement les cellules de la plaque à l’aide d’un nouveau grattoir de cellules en plastique dans 1 mL de PBS exempt de calcium et de magnésium. Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger pendant 2 min à 2 000 x g et aspirer le surnageant. Le protocole peut être suspendu ici. Conserver les échantillons de pellets à-20 ° c ou passer à l’étape 2,4.
  3. Fractionnement subcellulaire
    1. Aspirer les milieux de culture à l’aide d’un piège à vide. Veillez à supprimer toutes les traces de média. Rincer les cellules des points de temps ou des conditions de culture souhaités trois fois avec du PBS glacé et exempt de calcium et de magnésium. Grattez les cellules de la plaque avec 1 mL de PBS glacé à froid exempt de calcium et de magnésium.
    2. Transférer les échantillons dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et conserver sur la glace. Centrifuger pendant 10 s à 10 000 x g. Continuer l’isolement rapide des noyaux si l’analyse des métaux des fractions cytoplasmiques et nucléaires est souhaitée. Cette procédure minimisera la perte potentielle de métaux due à l’extraction des cellules39, 40.
    3. Retirer le surnageant par aspiration et Resuspendre le culot cellulaire dans 400 μL de PBS de glace froide exempt de calcium et de magnésium, contenant 0,1% de Nonidet P-40 (NP-40), un détergent non ionique. Transférer 100 μL dans un nouveau tube à microcentrifugation et le considérer comme l’échantillon de la cellule entière. Cette aliquote représente 25% de l’échantillon.
    4. Isoler les noyaux en pipetant la suspension cellulaire 5 à 10 fois sur la glace avec une pointe de micropipette P1000. L’isolement des noyaux des cellules épithéliales nécessite une concentration de 0,5% NP-40. Réaliser la dissociation cellulaire en passant la suspension cellulaire par une aiguille de 26 3/4 G 10 à 15 fois, suivie de 10 à 15 passages par une aiguille 30 1/2 G.
      Remarque: Vérifiez l’intégrité des noyaux par microscopie photonique à l’aide d’un objectif 40x.
    5. Centrifuger la suspension de lysat cellulaire restante (300 μL) pendant 10 s à 10 000 x g. Le surnageant contiendra la fraction cytosolique. Transférer le 300 μL dans un nouveau tube à microcentrifugation.
    6. Rincer le culot contenant la fraction nucléaire dans 500 μL de PBS exempt de calcium et de magnésium, contenant 0,1% de NP-40, puis centrifuger pendant 10 s à 10 000 x g. Retirer le surnageant et Resuspendre le culot contenant les noyaux dans 100 μL de la même solution.
      Remarque: le protocole peut être suspendu ici. Les échantillons peuvent être stockés à-20 ° c.
  4. Lyse les cellules par trois cycles de sonication (30 s on/30 s off, à 50 kHz, 200 W) pendant 5 min. quantifier la teneur totale en protéines dans l’échantillon par Bradford41.
  5. Effectuer un contrôle de la qualité de la pureté des fractions par Blot occidental en utilisant des anticorps spécifiques pour le nucléaire (histones, remodeleurs de chromatine, protéines de matrice nucléaire) ou des fractions cytosoliques (β-tubuline, β-actine) (figure 2).
    Remarque: n’utilisez pas de sonicateur avec un embout métallique. Ceux-ci peuvent contaminer l’échantillon avec des métaux.

3. analyse de la teneur en Zn de la cellule entière et des fractions subcellulaires des cultures cellulaires de mammifères par spectroscopie d’absorbance atomique

  1. Minéralisez les échantillons de culture cellulaire (cellules entières ou fractions nucléaires) par digestion acide à l’aide d’un volume égal de grade de métal de trace concentré HNO3 (attention) pendant 1 h à 80 ° c, puis nuit à 20 ° c.
  2. Arrêter la réaction en ajoutant 30% du volume de réaction de H2O2. Porter le volume de l’échantillon à 500 μL avec de l’eau purifiée de 18 MΩ.
    Remarque: la manipulation du HNO3 doit être effectuée avec des lunettes de sécurité chimiques, un bouclier facial pour la protection contre les éclaboussures, des gants et un respirateur de vapeur approuvé si une ventilation adéquate (hotte) n’est pas disponible. Le protocole peut être suspendu ici. Les échantillons peuvent être stockés à température ambiante (RT).
  3. Préparez des solutions standard et des échantillons expérimentaux pour les mesures de Zn par AAS équipées d’un four à graphite.
    1. Utilisez 2% (v/v) HNO3 solution dans l’eau désionisée, provenant du même lot utilisé pour la courbe standard que la solution vide pour l’étalonnage dans l’ensemble. Utiliser des étalons de qualité analytique dilués dans de l’eau purifiée de 18 MΩ.
    2. Préparer une norme de 1 000 ppb de Zn à partir d’une solution de stock de Zn de 1 000 ppm disponible dans le commerce avec une solution HNO3 à 2% (v/v) dans de l’eau désionisée. Préparer des solutions standard de travail à partir de la norme 100 ppb en le diluant à 5, 8, 10, 15, 20 et 25 ppb directement avec 2% (v/v) HNO3 solution dans l’eau désionisée. Préparez les étalons de Zn et le blanc avec un modificateur matriciel de 0,1% (1 g/L) mg (NO3)2 .
      NOTE: la LOD de Zn est de 0,01 ppb (μg/L). En augmentant la concentration des étalons, on a déterminé que la limite de linéarité du Zn était de 20 ppb (figure 3).
    3. Mesurer la norme et les échantillons dans les mêmes conditions optimisées: débit d’introduction de 250 mL/min, température d’injection de 20 ° c et température GF de 1 800 ° c.
      Remarque: la température du GF a été augmentée à 2450 ° c pour les étapes de nettoyage, avant l’injection d’un nouvel échantillon ou d’une norme.
    4. Optimiser la lampe (C-HCL) à un courant de 20 A, longueur d’onde de 213,9 nm, et fente de 0,7 nm.
    5. Mesurez les échantillons minéralisés à l’aide de la courbe standard Zn pour déterminer la teneur en métal. Comme les petits volumes sont mesurés, les échantillons peuvent s’évaporer si les mesures prennent de longues périodes de temps. Par conséquent, il est recommandé d’ajouter de l’eau aux échantillons. Diluer les échantillons avec de l’eau purifiée de 18 MΩ traitée avec 0,01% HNO3 (qualité analytique) si les données obtenues dépassent la LOD.
      NOTE: typiquement, les échantillons sont dilués à un volume de 500 μL, placé dans l’autoéchantillonneur automatisé de l’AAS à mesurer juste après que la courbe standard soit établie. Le volume requis doit être déterminé par l’utilisateur et doit tenir compte des calculs finaux des concentrations. La finition des déterminations de Zn par AAS d’une expérience complète en une seule tentative est recommandée. La suspension des mesures peut entraîner de grandes variations expérimentales et des incohérences.
  4. Convertissez les mesures ppb en molarité obtenues à partir de Zn mesurés par AAS. Considérez la masse de Zn (65,39 AMU). Diviser la quantité de ppb obtenue par AAS par 63 390 000. Dans les cellules, les concentrations de Zn varient d’unités de pmol à μmol.
    1. Diviser la concentration de Zn (pmol ou μmol) par la masse initiale de protéine dans l’échantillon déterminé par Bradford (étape 2,4). Ce calcul rendra la quantité de métal (pmol ou μmol Zn) contenue par mg de protéine de l’échantillon.
      Remarque: il est important de tenir compte des facteurs de dilution utilisés lors des déterminations de métaux.

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Representative Results

Nous avons testé la capacité du GF-AAS de détecter des niveaux de Zn dans les cellules de mammifères (figure 1). Ainsi, nous avons cultivé des myoblastes primaires dérivées de cellules satellites de souris, et les lignées cellulaires établies N2A (dérivé de neuroblastome), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (épithélium mammaire), et cellules de MDCK (épithélium de rein de chien). Premièrement, nous avons isolé des fractions cellulaires entières, cytosoliques et nucléaires de tous ces types de cellules et évalué la pureté des fractions par Blot occidental (figure 2). L’immunodétection représentative du remodeleur de la chromatine Brg1 et de la tubuline en tant que marqueurs de fractions nucléaires et cytosoliques, respectivement, a démontré la pertinence du protocole de fractionnement subcellulaire décrit dans la section 2,3 pour effectuer la analyse (figure 2). Des fractions cellulaires et subcellulaires entières ont été préparées comme décrit ci-dessus pour les analyses GF-AAS, et l’étalonnage de l’équipement a été effectué pour produire une courbe standard linéaire typique (figure 3).

La figure 4 montre des images de microscopie photonique représentative de monocouches proliférantes et différenciées ou confluentes de chaque type de cellule, et les niveaux correspondants de Zn pour ceux-ci. Il est important de noter que toutes les lignées cellulaires analysées dans cette étude ont montré des concentrations de Zn dans la gamme nM. Cependant, une distribution différentielle du métal a été détectée. Les myotubes primaires différenciés présentaient des teneurs plus élevées en Zn que les cellules proliférantes (figure 4a). En particulier, une grande partie de l’ion était localisée à la fraction nucléaire dans les myoblastes proliférantes et différant. Une distribution subcellulaire similaire de Zn a été détectée dans la lignée cellulaire dérivée du neuroblastome N2A (figure 4b). Cependant, les mesures ont montré que les cellules N2A avaient des concentrations de Zn d’un ordre de grandeur supérieure aux myoblastes primaires. D’autre part, la lignée cellulaire 3T3-L1 établie présentait des niveaux plus élevés de Zn lorsque les préadipocytes proliféraient que lorsqu’ils étaient induits pour différencier et former des adipocytes matures qui accumulent des lipides (figure 4C).

Nous avons également mesuré la teneur en Zn dans deux lignées cellulaires épithéliales différentes: le MCF10A dérivé de la glande mammaire humaine (figure 4D) et des cellules MDCK (figure 4e) dérivées de rein de chien. Fait intéressant, dans les deux cas, des niveaux plus élevés de Zn dans les cellules proliférantes que dans les monocouches confluentes ont été détectés. Cependant, les cellules épithéliales dérivées de la glande mammaire ont montré des niveaux de métal qui étaient 2 fois plus élevés que ceux des cellules rénales. Les cellules MCF10A ont montré des niveaux égaux de Zn entre les fractions cytosoliques et nucléaires dans les cellules proliférantes. Une fois que les cellules de MCF10A atteignent la confluence, une diminution de 40% des concentrations de Zn dans les cellules entières a été détectée, et le métal s’est révélé le plus concentré dans la fraction cytosolique (figure 4D). Inversement, les cellules de MDCK proliférantes présentaient des niveaux plus élevés de Zn dans la fraction nucléaire, comparativement à la fraction cytosolique, mais lorsque les cellules du MDCK atteignaient la confluence, une diminution du Zn dans les cellules entières a été détectée, la majorité de ce métal de transition observée dans la fraction cytosolique (figure 4e).

Figure 1
Figure 1: organigramme représentatif des analyses élémentaires (Zn) des cellules cultivées de mammifères. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: validation de la pureté des fractions obtenues par l’isolement rapide du protocole de nucléi 39 , 40la tache occidentale représentative des myoblastes primaires différant montrant la pureté des fractions subcellulaires. L’enzyme de remodeler de la chromatine Brg1 a été utilisée pour identifier la fraction nucléaire, et la tubuline a été utilisée pour identifier la fraction cytosolique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: courbe d’étalonnage des étalons de Zn. Courbe standard représentative pour Zn déterminée par GF-AAS. Le GF-AAS a été calibré avec les solutions standard de Zn diluées aux concentrations suivantes: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 et 30 ppb. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: concentrations de zinc dans différentes cellules cultivées de mammifères. Micrographies représentatives de la lumière et teneur en Zn dans les extraits cellulaires entiers et les fractions cytosoliques et nucléaires. Les données représentent la moyenne de trois réplicats biologiques indépendants ± SEM. (A) murine myoblastes primaires proliférant et différant pendant 2 jours. Bla lignée cellulaire de murine neuroblastome n2a avant et après l’induction pour se différencier par un traitement à l’acide rétinoïque. (C) murine 3T3-L1 pré-adipocytes et 6 jours après différenciation. (D) monocouche pré-confluente et confluente de la lignée de cellules épithéliales mammaires humaines MCF10A. Emonocouche pré-confluente et confluente de la lignée des cellules épithéliales du rein MDCK. Les données représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ± SE. le test tde Student montre une signification, * p ≤ 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La spectroscopie d’absorbance atomique est une méthode très sensible pour la quantification du Zn dans les petits échantillons biologiques de volume/masse. L’optimisation décrite de la mesure de Zn rend l’application de cette méthode simple et garantit des conditions analytiques idéales. Ici, en utilisant GF-AAS, nous avons déterminé la concentration de Zn dans les cellules entières, et dans les fractions cytosoliques et nucléaires, à partir de différentes lignées cellulaires. Les résultats montrent que cette technique rend comparable à celles obtenues par les sondes fluorescentes et le ICP-MS. Par exemple, plusieurs sondes fluorescentes ont montré des concentrations de Zn mitochondriales labiles dans la fourchette de 0,1 à 300 pM, les niveaux dans le Golgi étaient inférieurs à la plage picomolaire, et le réticulum endoplasmique variait de 800 à 5 000 pM42, qui sont compatibles avec les niveaux détectées dans les fractions cytosoliques. De plus, le fluorophore à réactif Zn fluozin-3 a montré une accumulation de Zn labiles dans de petites vésicules cytosoliques en MCF10A et dans les cellules C2C1243,44, qui sont également compatibles avec le Zn quantifié dans le cytoplasme. De plus, les analyses de Zn par ICP-MS effectuées par notre groupe ont montré que les concentrations cellulaires entières de Zn dans les myotubes primaires différenciants45 sont semblables à celles obtenues dans ce rapport par GF-AAS. En outre, des exemples de déterminations de Zn dans des cellules de gliome de rat C6 en utilisant AAS et Zinquin-E46 ont également rendu des gammes semblables à celles observées dans les cellules de neuroblastome n2a utilisées ici.

À ce jour, diverses techniques ont été développées pour détecter le Zn dans les cellules. Cependant, GF-AAS reste une technique précise et très sensible qui permet non seulement de détecter le Zn libre, mais aussi de mesurer le métal complexé et lié aux protéines et potentiellement aux petites molécules. Notre groupe a récemment montré que les mesures effectuées avec une sonde fluorescente perméable à la cellule (qui a une forte affinité pour lier le Zn libre2 +) sont directement corrélées avec les concentrations de Zn détectées par GF-AAS dans les myoblastes proliférantes et différenciantes 43cependant, les résultats obtenus par ces sondes peuvent ne pas être représentatifs des concentrations de Zn de cellules entières ou de protéines. De plus, comme le Zn existe en tant qu’espèce active non redox et comme cation divalente, dans des conditions physiologiques, sa détection dans les systèmes cellulaires est restée un défi. De nouvelles techniques d’imagerie au Zn sont devenues disponibles, telles que la microscopie à fluorescence à rayons X à l’état de l’art, les radioisotopes et la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif par ablation laser (LA-ICP-MS). Malheureusement, certaines de ces techniques exigent des ressources inaccessibles à la communauté scientifique29,42,47,48,49,50.

Des études ont montré que le ICP-MS est une technique plus précise que l’AAS, car les valeurs d’écart-type relatifs ont été montrées plus faibles dans les déterminations ICP-MS pour les métaux comme le Zn. L’explication probable de cet effet est que le ICP-MS est intrinsèquement capable d’éliminer les interférences chimiques, car les températures de fonctionnement de l’argon varient de 5 000 à 10 000 ° c. Quelques liaisons chimiques peuvent être maintenues à 3 000 ° c, qui est dans la gamme pour le fonctionnement d’AAS. Ces liaisons seront complètement perturbées au-dessus de 6 000 ° c. Par conséquent, ces hautes températures atteintes dans l’État plasmatique par ICP-MS peuvent éliminer les interférences chimiques, conduisant à de meilleures limites de détection51. De plus, le pic-SM exige des échantillons de volume plus importants comparativement à la GF-AAS, car ce dernier est capable de fonctionner avec des volumes inférieurs à 100 μL, ce qui est significativement inférieur à d’autres méthodes spectroscopiques telles que AAS, ICP-OES ou ICP-MS. Étant donné les petits volumes impliqués dans la méthode, GF-AAS est la technique idéale pour déterminer la concentration de Zn dans les échantillons biologiques, principalement si l’analyse implique des fractions subcellulaires, des détections de métaux dans des protéines purifiées ou de petites variations dans les cellules cellulaires teneur en métal due à des mutations dans les transporteurs ou les protéines liant les métaux29,52. En outre, la sensibilité du système GF-AAS pour déterminer les concentrations de traces et d’ultra-traces (pg/mL à ng/mL) est un autre avantage.

Des considérations importantes doivent être prises pour assurer la fiabilité des données du GF-AAS. Ceux-ci incluent l’étalonnage adéquat, l’intégrité du tube de graphite, et la sélection du modificateur de matrice approprié pour l’atomisation électrothermique. Les modificateurs de matrice sont des éléments chimiques ajoutés à l’échantillon, qui affectent les processus thermiques qui se déroulent dans l’atomiseur. Ces modificateurs minimisent la perte d’analyte pendant la pyrolyse et contribuent à l’élimination des composants de la matrice. Dans l’ensemble, les modificateurs peuvent changer la matrice de l’échantillon pour évaborer les composants de la matrice à des températures plus basses et peuvent fonctionner comme stabilisateurs d’analyte. En plus de ces considérations, il est important d’effectuer une optimisation adéquate des étapes pour le programme de température de l’atomiseur.

Deux considérations principales devraient être prises, dont 1) établissant la température de pyrolyse optimale, qui se rapporte à la température maximale à l’étape d’atomisation à laquelle aucune perte d’analyte ne se produit, et qui permet une absorbance maximale de l’analyte avec un minimum milieu. On devrait également considérer 2) établir la température d’atomisation optimale, qui se rapporte à la température minimale à laquelle l’analyte est complètement évaporé et enregistré comme un signal reproductible ou un pic. L’un des inconvénients des analyses GF-AAS est l’interférence des éléments, pour laquelle une optimisation et une normalisation approfondies sont indispensables pour des mesures précises. Cependant, à ce jour, GF-AAS représente un outil important dans la recherche scientifique pour détecter les ions métalliques dans divers échantillons biologiques. Les applications futures des méthodes de détection de Zn (et d’autres métaux) par GF-AAS comprendront la mesure des niveaux de métaux dans les organes et les tissus obtenus à partir de modèles animaux ou de biopsies de patients pour mieux comprendre les besoins physiologiques spécifiques des oligo-éléments. En conclusion, GF-AAS est précis, sensible, rentable et accessible, et cette technique analytique continuera à s’améliorer à mesure que les progrès technologiques avancera pour ces systèmes de détection.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été appuyé par le prix de la faculté de la diversité des chercheurs de l’Université de Massachusetts Medical School à la TP-B. N. T. est soutenue par SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N est appuyé par la National Science Foundation Grant DBI 0959476. Les auteurs sont reconnaissants au Dr Daryl A. Bosco d’avoir fourni la lignée cellulaire N2A et à Daniella Cangussu pour son soutien technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

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