Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Las líneas celulares cultivadas primarias o establecidas se utilizan comúnmente para abordar las cuestiones biológicas y mecanicistas fundamentales como un enfoque inicial antes de usar modelos animales. Este protocolo describe cómo preparar extractos celulares enteros y fracciones subcelulares para estudios de zinc (Zn) y otros oligoelementos con espectroscopía de absorbancia atómica.

Abstract

Los metales de transición son micronutrientes esenciales para los organismos, pero pueden ser tóxicos para las células a altas concentraciones al competir con los metales fisiológicos en las proteínas y generar estrés redox. Las afecciones patológicas que conducen a la depleción o acumulación de metales son agentes causales de diferentes enfermedades humanas. Algunos ejemplos incluyen anemia, Acrodermatitis enteropatica, y las enfermedades de Wilson y Menkes. Por lo tanto, es importante poder medir los niveles y el transporte de metales de transición en muestras biológicas con alta sensibilidad y precisión con el fin de facilitar la investigación explorando cómo estos elementos contribuyen a las funciones fisiológicas normales y Toxicidad. El zinc (Zn), por ejemplo, es un cofactor en muchas proteínas de mamíferos, participa en eventos de señalización, y es un mensajero secundario en las células. En exceso, Zn es tóxico y puede inhibir la absorción de otros metales, mientras que en el déficit, puede conducir a una variedad de condiciones potencialmente letales.

La espectroscopía de absorción atómica del horno de grafito (GF-AAS) proporciona un método altamente sensible y eficaz para determinar la concentración de Zn y otras concentraciones de metales de transición en muestras biológicas diversas. La atomización electrotérmica mediante GF-AAS cuantifica los metales mediante la atomización de pequeños volúmenes de muestras para el posterior análisis selectivo de la absorción mediante la longitud de onda de la excitación del elemento de interés. Dentro de los límites de la linealidad de la ley de la cerveza-Lambert, la absorbancia de la luz por el metal es directamente proporcional a la concentración del analito. En comparación con otros métodos de determinación del contenido de Zn, GF-AAS detecta tanto el Zn en las proteínas libres como los complejados y posiblemente en pequeñas moléculas intracelulares con alta sensibilidad en pequeños volúmenes de muestras. Por otra parte, GF-AAS es también más fácilmente accesible que la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) o fluorescencia de rayos X basada en sincrotrón. En este método, se describe la preparación sistemática de muestras de diferentes líneas celulares cultivadas para análisis en un GF-AAS. Las variaciones en este oligoelemento se compararon tanto en los lisados celulares enteros como en las fracciones subcelulares de células proliferantes y diferenciadas como prueba de principio.

Introduction

La transición y los metales pesados, como Zn, Cu, Mn y fe, se encuentran de forma natural en el medio ambiente, tanto en nutrientes como en alimentos y contaminantes. Todos los organismos vivos requieren diferentes cantidades de estos micronutrientes; sin embargo, la exposición a niveles elevados es perjudicial para los organismos. La adquisición de metal es principalmente a través de la dieta, pero los metales también pueden ser inhalados o absorbidos a través de la piel1,2,3,4,5. Es importante señalar que la presencia de metales en las partículas atmosféricas está aumentando y se ha asociado en gran medida a los riesgos para la salud. Debido a las actividades antropogénicas, se han detectado niveles crecientes de metales pesados como AG, como, CD, CR, Hg, ni, fe y Pb en las partículas atmosféricas, el agua de lluvia y el suelo6,7. Estos metales tienen el potencial de competir con oligoelementos fisiológicos esenciales, particularmente Zn y fe, e inducen efectos tóxicos al inactivar las enzimas fundamentales para los procesos biológicos.

El oligoelemento Zn es redox neutro y se comporta como un ácido Lewis en las reacciones biológicas, lo que lo convierte en un cofactor fundamental necesario para la actividad de plegado y catalítico de proteínas en más del 10% de las proteínas de mamíferos8,9, 10; en consecuencia, es esencial para las diversas funciones fisiológicas8,11. Sin embargo, como muchos oligoelementos, hay un delicado equilibrio entre estos metales facilitando la función fisiológica normal y causando toxicidad. En los mamíferos, las deficiencias de Zn conducen a anemia, retraso del crecimiento, hipogonadismo, anomalías de la piel, diarrea, alopecia, trastornos del gusto, inflamación crónica, y las funciones inmunes y neurológicas deterioradas11,12, 13,14,15,16,17,18. En exceso, el Zn es citotóxico y perjudica la absorción de otros metales esenciales como el cobre19,20,21.

Además, algunos metales como Cu y fe tienen el potencial de participar en reacciones dañinas. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de Fenton química puede interferir con el montaje de proteínas de racimo de azufre de hierro y alterar el metabolismo lipídico22,23,24. Para evitar este daño, las células utilizan chaperones de unión metálica y transportadores para prevenir efectos tóxicos. Sin lugar a dudas, la la homeostasis metálica debe controlarse estrechamente para garantizar que los tipos celulares específicos mantengan los niveles adecuados de metales. Por esta razón, hay una necesidad significativa de avanzar técnicas para la medición precisa de trazas de metales en muestras biológicas. En los organismos en desarrollo y maduros existe una necesidad biológica diferencial para oligoelementos a nivel celular, en diferentes etapas de desarrollo, y en condiciones normales y patológicas. Por lo tanto, la determinación precisa de los niveles de tejido y del metal sistémico es necesaria para entender la homeostasis del metal organismal.

La espectrometría de absorción atómica del horno de grafito (GF-AAS) es una técnica altamente sensible utilizada para pequeños volúmenes de muestras, por lo que es ideal para medir la transición y metales pesados presentes en muestras biológicas y medioambientales25,26 , 27 , 28. por otra parte, debido a la alta sensibilidad de la técnica, se ha demostrado que es adecuada para el estudio de las propiedades de transporte fino de na+/k+-ATPasa yH+/k-ATPasa gástrica ovocitos como un sistema modelo29. En GF-AAS, los elementos atomizados dentro de una muestra absorben una longitud de onda de la radiación emitida por una fuente de luz que contiene el metal de interés, con la radiación absorbida proporcional a la concentración del elemento. La excitación electrónica elemental tiene lugar tras la absorción de la radiación ultravioleta o visible en un proceso cuantizado único para cada elemento químico. En un solo proceso de electrones, la absorción de un fotones implica un electrón que se mueve desde un nivel de energía más bajo al nivel más alto dentro del átomo y GF-AAS determina la cantidad de fotómetros absorbidos por la muestra, que es proporcional al número de radiación que absorbe elementos atomizados en el tubo de grafito.

La selectividad de esta técnica se basa en la estructura electrónica de los átomos, en el que cada elemento tiene una línea espectral de absorción/emisión específica. En el caso de Zn, la longitud de onda de absorbancia es de 213,9 NM y se puede distinguir con precisión de otros metales. En general, GF-AAS se puede utilizar para cuantificar Zn con límites adecuados de detección (LOD) y alta sensibilidad y selectividad25. Los cambios en la longitud de onda absorbida se integran y se presentan como picos de absorción de energía en longitudes de onda específicas y aisladas. La concentración del Zn en una muestra determinada se calcula generalmente a partir de una curva estándar de concentraciones conocidas según la ley cerveza-Lambert, en la que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de Zn en la muestra. Sin embargo, aplicar la ecuación de Beer-Lambert a los análisis de GF-AAS también presenta algunas complicaciones. Por ejemplo, las variaciones en la atomización y/o concentraciones no homogéneas de las muestras pueden afectar las mediciones de metal.

La atomización metálica necesaria para el análisis elemental de trazas GF AAS consta de tres pasos fundamentales. El primer paso es la desolvación, donde se evada el disolvente líquido; dejando compuestos secos después de que el horno alcanza una temperatura de alrededor de 100 ° c. Luego, los compuestos se vaporizan calentándolos de 800 a 1.400 ° c (dependiendo del elemento a analizar) y convertirse en un gas. Finalmente, los compuestos en estado gaseoso se atomizan con temperaturas que oscilan entre 1.500 y 2.500 ° c. Como se discutió anteriormente, el aumento de las concentraciones de un metal de interés representará aumentos proporcionales en la absorción detectada por el GF-AAS, sin embargo, el horno reduce el rango dinámico de análisis, que es el rango de trabajo de las concentraciones que se pueden determinado por el instrumento. Por lo tanto, la técnica requiere bajas concentraciones y una cuidadosa determinación del rango dinámico del método mediante la determinación del LOD y el límite de linealidad (LOL) de la ley Beer-Lambert. El LOD es la cantidad mínima requerida para detectar una sustancia, definida como tres veces la desviación estándar de Zn en la matriz. El LOL es la concentración máxima que se puede detectar utilizando la ley de cerveza-Lambert.

En este trabajo, describimos un método estándar para analizar los niveles de Zn en extractos celulares enteros, fracciones citoplásmicas y nucleares, y en células cultivadas proliferantes y diferenciadoras (figura 1). Adaptamos el rápido aislamiento del Protocolo de núcleos a diferentes sistemas celulares para evitar la pérdida de metal durante la preparación de la muestra. Los modelos celulares utilizados fueron myoblastos primarios derivados de las células del satélite del ratón, células del neuroblastoma murino (N2A o Neuro2A), murino 3T3 L1 adipocitos, una línea de células epiteliales de mama no tumorigénica humana (MCF10A), y el riñón canino de Madin-Darby epitelial ( MDCK). Estas células se establecieron a partir de diferentes linajes y son buenos modelos para investigar variaciones específicas del linaje de los niveles de metal in vitro.

Las mioblastos primarias derivadas de las células satélite del ratón constituyen un modelo in vitro muy adecuado para investigar la diferenciación del músculo esquelético. La proliferación de estas células es rápida cuando se cultiva en condiciones séricas elevadas. La diferenciación en el linaje muscular se induce entonces por las condiciones séricas bajas30. El neuroblastoma murino (N2A) estableció la línea celular se derivó de la cresta neural del ratón. Estas células presentan morfología neuronal y de células madre amoeboides. Al estímulo de diferenciación, las células N2A presentan varias propiedades de las neuronas, como los neurofilamentos. N2A células se utilizan para investigar la enfermedad de Alzheimer, neurita outgrowth, y neurotoxicidad31,32,33. El 3T3-L1 murino pre-adipocitos establecido línea celular se utiliza comúnmente para investigar los cambios metabólicos y fisiológicos asociados con la adipogénesis. Estas células presentan una morfología de fibroblastos, pero una vez estimuladas para la diferenciación, presentan activación enzimática asociada con la síntesis de lípidos y la acumulación de triglicéridos. Esto se puede observar como cambios morfológicos para producir gotas de lípidos citoplásmicos34,35. MCF10A es una línea de células epiteliales mamarias no tumorales derivada de una mujer premenopáusica con enfermedad fibroquística mamaria36. Ha sido ampliamente utilizado para los estudios bioquímicos, moleculares, y celulares relacionados con la carcinogénesis mamaria como la proliferación, migración celular, y la invasión. La línea celular epitelial del riñón de Madin-Darby (MDCK) se ha utilizado extensivamente para investigar las propiedades y los eventos moleculares asociados con el establecimiento del fenotipo epitelial. Al llegar a la confluencia, estas células se polarizan y establecen adherencias de células celulares, características de los tejidos epiteliales de mamíferos37.

Para probar la capacidad de AAS para medir los niveles de Zn en células de mamíferos, analizamos fracciones enteras y subcelulares (citosol y núcleo) de estas cinco líneas celulares. Las mediciones de AAS mostraron diferentes concentraciones de Zn en estos tipos de células. Las concentraciones fueron menores en la proliferación y diferenciación de las mioblastos primarias (4 a 7 nmol/mg de proteína) y superiores en las cuatro líneas celulares establecidas (que oscilan entre 20 y 40 nmol/mg de proteína). Se detectó un pequeño aumento no significativo en los niveles de Zn en la diferenciación de las células mioblastos primarias y del neuroblastoma en comparación con las células proliferantes. El efecto opuesto se detectó en adipocitos diferenciados. Sin embargo, proliferando células 3T3-L1 mostraron concentraciones más altas del metal en comparación con las células diferenciadas. Es importante destacar que, en estas tres líneas celulares, el fraccionamiento subcelular demostró que Zn se distribuye de forma diferencial en el citosol y el núcleo de acuerdo con el estado metabólico de estas células. Por ejemplo, en mioblastos proliferantes, células N2A y preadipocitos 3T3-L1, la mayoría del metal se localiza en el núcleo. Tras la inducción de la diferenciación utilizando tratamientos celulares específicos, Zn localizada en el citosol en estos tres tipos de células. Curiosamente, ambas líneas celulares epiteliales mostraron niveles más altos de Zn durante la proliferación en comparación con al alcanzar la confluencia, en el que se formó una monocapa ajustada característica. En las células epiteliales proliferantes, la línea de células mamarias MCF10A tenía una distribución de Zn igual entre el citosol y el núcleo, mientras que en la línea celular derivada del riñón, la mayor parte del metal se encontraba en el núcleo. En estos dos tipos celulares, cuando las células alcanzaron la confluencia, Zn se encontraba predominantemente en el citosol. Estos resultados demuestran que GF-AAS es una técnica altamente sensible y precisa para realizar análisis elementales en muestras de bajo rendimiento. GF-AAS junto con fraccionamiento subcelular y puede ser adaptado para investigar los niveles de oligoelementos metálicos en diferentes líneas celulares y tejidos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cultivo celular de mamíferos

  1. Consideraciones generales
    1. Siga las técnicas asépticas para el cultivo celular de mamíferos previamente revisados38.
    2. Mantener todas las líneas celulares en una incubadora de 5% CO2 humidificada a 37 ° c. Las condiciones de cultivo celular varían para cada tipo de célula. Es importante mantener las condiciones de cultivo apropiadas para cada línea celular utilizada, ya que las variaciones de estos procedimientos conduciarán a fenotipos aberrantes y al fracaso del cultivo celular.
    3. Asegure el conocimiento con la línea celular de interés, y siga los protocolos proporcionados para cada tipo de célula seleccionada para los experimentos específicos (vea algunos ejemplos abajo).
  2. Procedimiento general para la tripsinización y el paso de las células adherentes
    1. Retire el medio de cultivo celular de la placa de cultivo por aspiración.
    2. Lavar las células suavemente utilizando PBS sin calcio y magnesio (5 mL por cada 10 cm2 área de superficie de cultivo). Agregue la solución de lavado al costado de la placa para evitar separar la monocapa celular; remolino la placa para maximizar la cobertura de la solución. Para las células epiteliales, es necesario incubar las células durante 10 a 15 min en la incubadora a 37 ° c en PBS para facilitar la disociación de las células en los siguientes pasos.
    3. Retire la solución de lavado por aspiración.
    4. Añadir suficiente reactivo de disociación (0,25% de tripsina) a la placa (aproximadamente 0,7 mL por 10 cm2). Gire suavemente la placa para obtener una cobertura completa de la monocapa celular.
    5. Incubar la cultura a temperatura ambiente durante 2 a 5 min. El tiempo de incubación real varía con la línea celular utilizada, en el caso de las células epiteliales se recomienda incubar durante 10 a 15 min en la incubadora a 37 ° c. Observe las células bajo el microscopio para el desprendimiento de células.
    6. Cuando la mayoría de las células se han desprendido, recuperar la suspensión celular en 5 mL del recubrimiento pre-calentado o medio de crecimiento (ver más abajo para algunos ejemplos). Disociar mecánicamente los grumos de las células pipeteando sobre la monocapa celular varias veces.
    7. Transfiera la suspensión de la célula a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue a 1.000 x g durante 2 a 5 min. La velocidad de centrifugación y el tiempo varían en función del tipo de célula. Retire los medios por aspiración suave, teniendo cuidado de no tocar el pellet de la célula. Resuspenda el pellet de células en 5 a 10 mL del medio de crecimiento pre-calentado adecuado y extraiga una muestra para contar con un hemociómetro o un contador de células automático.
    8. Utilice el volumen adecuado de la suspensión celular para sembrar la densidad recomendada para cada línea celular específica (vea a continuación algunos ejemplos). Complementar con el volumen adecuado de medios de cultivo de acuerdo con el tamaño del plato de cultivo y colocar las células de nuevo en la incubadora.
  3. Myoblastos primarios derivado de las células satélite del ratón
    1. Antes de comenzar, Prepare placas recubiertas de colágeno para el crecimiento primario de myoblast. Una solución que contiene 0,02% de colágeno y 0,05 M de ácido acético en agua desionizada debe esterilizarse mediante filtración con un dispositivo de filtro estéril de 0,22 μm. Incubar las placas de cultivo con la solución de colágeno durante la noche a 37 ° c.
    2. Al día siguiente, aspirar la solución de colágeno, dejar secar las placas en el gabinete estéril y almacenar a 4 ° c hasta su uso.
      Nota: los volúmenes mínimos de colágeno son: para 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Semillas de mioblastos primarios a 1 x 104 células/cm2 en 55 cm2 placas de cultivo recubiertas de colágeno. Los medios de proliferación son el medio de cultivo de la mezcla de nutrientes F12 de Dulbecco (DMEM)/Ham, que contiene un 20% de suero bovino fetal (FBS), 25 ng/mL de factor de crecimiento fibroblástico básico recombinante (FGF) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina.
      Nota: las células proliferantes y de stock deben mantenerse por debajo del 50% de la confluencia. El contacto celular induce el compromiso de las células a la diferenciación miogénica y perjudica las capacidades de crecimiento de la cultura.
    4. Para diferenciar las mioblastos primarias, permita que las células alcancen el 80% a 100% de confluencia, que normalmente ocurre después de 48 h de chapado. Luego, cambiar a medios de diferenciación (DMEM, 2% suero de caballo, 1% de insulina, transferrina, selenio un suplemento, y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina). Refresque los medios diariamente hasta la cosecha.
  4. Neuroblastoma murino (N2A)
    1. Placa N2A células a una densidad de 2 x 104 células/cm2 en medios de crecimiento, que contiene una mezcla de medio suero reducido/DMEM que contiene alta glucosa y L-glutamina (1:1, v:v), suplemento con 10% FBS y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Mantener la cultura bursátil bajo 50% confluencia.
    2. Inducir la diferenciación de células N2A una vez confluencia alcanzó 25% a 40%. Cambio a los medios de diferenciación que contengan una mezcla de medio suero reducido/DMEM, 1% de FBS y 20 μM de ácido retinoico durante 7 a 10 días. Refresque los medios cada otro día hasta la cosecha celular.
      Nota: como las células N2A diferencian, algunas células se vuelven redondas, se separan fácilmente, y pueden someterse a la apoptosis. Tenga cuidado al aspirar y agregar el medio de cultivo a las placas.
  5. 3T3 L1 murinos pre-adipocitos
    1. Mantener el ratón 3T3/L1 células en DMEM con alta glucosa, complementado con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina/streptomicina. El proceso adipogénico depende de la confluencia de las células; por lo tanto, no deje que la cultura de la acción crezca más de 50% confluencia, como mayor confluencia perjudicará la capacidad de las células para diferenciar.
    2. Placas de las células a 2 x 104 células/cm2. A esta densidad, las células llegarán a la confluencia en 3 días.
    3. Inducir la diferenciación adipogénica dos días después de que las células alcancen el 100% de la confluencia. Los medios de inducción consisten en DMEM que contiene 10% de FBS, 10 μg/mL de insulina, 0,5 mM 3-isobutilo-1-metixantina, 1 μM de dexametasona y 10 μM de troglitazona.
    4. Reemplace los medios de inducción después de la incubación de 48 h a los medios de diferenciación (DMEM que contiene 10% de FBS y 5 μg/mL de insulina). Refresque los medios cada otro día hasta la cosecha. Muestras representativas de la diferenciación total se recogen normalmente entre 7 y 10 días después de la inducción adipogénica.
      Nota: a medida que la adipogénesis progresa, las células se vuelven redondas y tienden a desprenderse fácilmente. Tenga cuidado al aspirar y agregar el medio de cultivo a las placas.
  6. MCF10A celdas
    1. Placas MCF10A células en DMEM/F12 (1:1, v:v), complementadas con 5% de FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 10 μg/mL de insulina y 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF). La densidad de siembra recomendada es de 1 x 105 células/cm2. En estas condiciones, las células alcanzarán un 100% de confluencia en un plazo de 4 días. Refresque los medios cada 2 a 3 días hasta la cosecha.
      Nota: las celdas MCF10A son difíciles de separar. Se recomienda incubar las células durante 10 a 15 min a 37 ° c en PBS libre de calcio con 0,5 mM EDTA antes de la tripsinización.
  7. Células de riñón canina Madin-Darby (MDCK)
    1. Células de placas MDCK en DMEM complementadas con 10% de FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. La densidad de siembra recomendada es de 1 x 105 células/cm2, donde las células alcanzarán un 100% de confluencia en 3 días. Refresque los medios cada 2 días hasta la cosecha.
      Nota: las células MDCK son difíciles de separar. Se recomienda incubar las células durante 5 a 10 min a 37 ° c en PBS libre de calcio y magnesio antes de la tripsinización. Para evitar la aglomeración de células, no agitar las placas golpeando o sacudiendo el matraz mientras espera a que las células se separen.

2. preparación de muestras de cultivo celular de mamíferos para AAS: fraccionamiento de células enteras y subcelulares

  1. Cultivo de las células de interés en 55 cm2 placas. El uso de placas de cultivo más pequeñas puede producir muestras con niveles de metales bajo los límites de detección del GF-AAS.
  2. Extracto de células enteras
    1. Aspiran los medios de cultivo utilizando una trampa de vacío. Asegúrese de eliminar todos los rastros de los medios. Enjuague las células de los puntos de tiempo deseados o las condiciones de cultivo tres veces con PBS helada y libre de calcio y magnesio.
    2. Raspe inmediatamente las células de la placa utilizando un nuevo raspador de células plásticas en 1 mL de PBS libre de calcio y magnesio. Transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugar durante 2 min a 2.000 x g y aspirar el sobrenadante. El protocolo se puede pausar aquí. Almacene muestras de pellets a-20 ° c o proceda al paso 2,4.
  3. Fraccionamiento subcelular
    1. Aspiran los medios de cultivo utilizando una trampa de vacío. Asegúrese de eliminar todos los rastros de los medios. Enjuague las células de los puntos de tiempo deseados o las condiciones de cultivo tres veces con PBS helada y libre de calcio y magnesio. Raspe las células de la placa con 1 mL de PBS helada y libre de calcio y magnesio.
    2. Transfiera las muestras a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y manténgase en hielo. Centrifugar por 10 s a 10.000 x g. Continuar el aislamiento rápido de los núcleos si se desea el análisis de metales de fracciones citoplásmicas y nucleares. Este procedimiento minimizará la pérdida potencial de metales debido a la extracción de células39, 40.
    3. Retirar el sobrenadante aspirando y resuspender el pellet de células en 400 μL de PBS helado libre de calcio y magnesio, conteniendo 0,1% de Nonidet P-40 (NP-40), un detergente no iónico. Transfiera 100 μL a un nuevo tubo de microcentrífuga y Considéralo como toda la muestra de células. Esta alícuota representa el 25% de la muestra.
    4. Aísle los núcleos pipeteando la suspensión de la célula de 5 a 10 veces en el hielo con una punta de Micropipetas P1000. El aislamiento de los núcleos de las células epiteliales requiere una concentración de 0,5% NP-40. Logre la disociación celular pasando la suspensión celular a través de una aguja de 26 3/4 G 10 a 15 veces, seguida de 10 a 15 pasajes a través de una aguja de 30 1/2 G.
      Nota: Verifique la integridad de los núcleos mediante microscopía de luz utilizando un objetivo de 40x.
    5. Centrifugar la suspensión de lisado celular restante (300 μL) durante 10 s a 10.000 x g. El sobrenadante contendrá la fracción citosólica. Transfiera los 300 μL a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    6. Enjuagar el pellet que contiene la fracción nuclear en 500 μL de PBS libre de calcio y magnesio, conteniendo 0,1% NP-40, luego centrifugar durante 10 s a 10.000 x g. Extraer el sobrenadante y resuspender el pellet que contiene los núcleos en 100 μL de la misma solución.
      Nota: el protocolo se puede pausar aquí. Las muestras se pueden almacenar a-20 ° c.
  4. Lyse las células por tres ciclos de sonicación (30 s on/30 s apagado, a 50 kHz, 200 W) durante 5 min. cuantificar el contenido total de proteínas en la muestra por Bradford41.
  5. Realizar el control de calidad de la pureza de las fracciones por Western Blot utilizando anticuerpos específicos para la nuclear (histonas, remodeladores de cromatina, proteínas de matriz nuclear) o fracciones citosólicas (β-tubulina, β-actina) (figura 2).
    Nota: no utilice sonicadores con una punta metálica. Estos pueden contaminar la muestra con metales.

3. análisis del contenido de Zn de fracciones celulares y subcelulares de cultivos celulares de mamíferos por espectroscopía de absorbancia atómica

  1. Mineralizar las muestras de cultivo celular (fracciones celulares o nucleares enteras) por digestión ácida utilizando un volumen igual de concentrado de HNO3 de grado de metal (PRECAUCIÓN) para 1 h a 80 ° c, luego durante la noche a 20 ° c.
  2. Detenga la reacción añadiendo un 30% del volumen de reacción de H2O2. Lleve el volumen de la muestra a 500 μL con agua purificada de 18 MΩ.
    Nota: el manejo de HNO3 debe realizarse con gafas de seguridad químicas, un protector facial para protección contra salpicaduras, guantes y un respirador de vapor aprobado si no se dispone de una ventilación adecuada (campana extractora). El protocolo se puede pausar aquí. Las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente (RT).
  3. Prepare soluciones estándar y muestras experimentales para mediciones de Zn por AAS equipadas con un horno de grafito.
    1. Utilice un 2% (v/v) de HNO3 solución en agua desionizada, procedente del mismo lote utilizado para la curva estándar como la solución en blanco para la calibración en todo. Utilice estándares de grado analítico diluidos en agua purificada de 18 MΩ.
    2. Prepare un estándar de 1.000 ppb de Zn a partir de una solución de stock de 1.000 ppm de Zn disponible comercialmente con una solución de HNO3 de 2% (v/v) en agua desionizada. Prepare soluciones estándar de trabajo a partir del estándar 100 ppb diluyendo a 5, 8, 10, 15, 20 y 25 ppb directamente con una solución de HNO3 de 2% (v/v) en agua desionizada. Prepare los estándares de Zn y el espacio en blanco con un modificador de matriz de 0,1% (1 g/L) mg (NO3)2 .
      Nota: el LOD de Zn es 0,01 ppb (μg/L). Al aumentar la concentración de las normas, se determinó que el límite de linealidad de Zn era de 20 ppb (figura 3).
    3. Mida el estándar y las muestras bajo las mismas condiciones optimizadas: caudal de introducción de 250 mL/min, temperatura de inyección de 20 ° c y temperatura de GF de 1.800 ° c.
      Nota: la temperatura del GF se incrementó a 2450 ° c para los pasos de limpieza, antes de la inyección de una nueva muestra o estándar.
    4. Optimizar la lámpara (C-HCL) a una corriente de 20 A, longitud de onda de 213,9 NM, y hendidura de 0,7 nm.
    5. Mida las muestras mineralizadas utilizando la curva estándar Zn para determinar el contenido metálico. A medida que se miden pequeños volúmenes, las muestras pueden evaporarse si las mediciones toman largos periodos de tiempo. Por lo tanto, se recomienda añadir agua a las muestras. Diluir las muestras con 18 MΩ de agua purificada tratada con 0,01% HNO3 (grado analítico) si los datos obtenidos están más allá del LOD.
      Nota: típicamente, las muestras se diluyen a un volumen de 500 μL, colocado en el muestreador automático del AAS para ser medido justo después de que se establezca la curva estándar. El volumen requerido debe ser determinado por el usuario y debe tener en cuenta los cálculos finales de las concentraciones. Se recomienda terminar las determinaciones de Zn por AAS de un experimento completo en un intento. Pausar las mediciones puede llevar a grandes variaciones experimentales e inconsistencias.
  4. Convierta las mediciones de ppb a la molaridad obtenida de Zn medida a través de AAS. Considere la masa de Zn (65,39 AMU). Divida la cantidad de ppb obtenida por AAS por 63.390.000. En las células, las concentraciones de Zn oscilan entre las unidades de pmol a μmol.
    1. Divida la concentración de Zn (pmol o μmol) por la masa inicial de proteína en la muestra determinada por Bradford (paso 2,4). Este cálculo representará la cantidad de metal (pmol o μmol Zn) contenida por mg de proteína de la muestra.
      Nota: es importante tener en cuenta los factores de dilución utilizados durante las determinaciones metálicas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Probamos la capacidad del GF-AAS para detectar los niveles de los minutos de Zn en las células de mamíferos (figura 1). Así, cultivamos las mioblastos primarias derivadas de las células satélite del ratón, y las líneas celulares establecidas N2A (neuroblastoma derivado), 3T3 L1 (adipocitos), MCF10A (epitelio mamario) y células MDCK (epitelio renal del perro). En primer lugar, aislamos fracciones de células enteras, citosólicas y nucleares de todos estos tipos de células y evaluaron la pureza de las fracciones por Western Blot (figura 2). La inmunodetección representativa del remolino de cromatina Brg1 y la tubulina como marcadores de fracciones nucleares y citosólicas, respectivamente, demostraron la idoneidad del Protocolo de fraccionamiento subcelular descrito en la sección 2,3 para realizar el Análisis (figura 2). Las fracciones celulares y subcelulares enteras se prepararon como se describió anteriormente para los análisis GF-AAS, y la calibración del equipo se realizó para producir una curva estándar lineal típica (figura 3).

La figura 4 muestra imágenes de microscopía de luz representativa de las monocapas proliferantes y diferenciadas o confluentes de cada tipo de célula, y los correspondientes niveles de Zn para estos. Es importante destacar que todas las líneas celulares analizadas en este estudio mostraron concentraciones de Zn en la gama nM. Sin embargo, se detectó una distribución diferencial del metal. Los miotubos primarios diferenciados mostraron niveles más altos de Zn que las células proliferantes (figura 4a). En particular, gran parte del ion se encontraba en la fracción nuclear, tanto en la proliferación como en la diferenciación de las mioblastos. Se detectó una distribución subcelular similar de Zn en la línea celular derivada del neuroblastoma N2A (Figura 4B). Sin embargo, las mediciones mostraron que las células N2A tenían niveles de Zn un orden de magnitud superior a los myoblastos primarios. Por otro lado, la línea celular 3T3-L1 establecida mostraba niveles más altos de Zn cuando los pre-adipocitos estaban proliferando que cuando fueron inducidos a diferenciar y formar adipocitos maduros que acumulan lípidos (figura 4C).

También se midió el contenido de Zn en dos líneas celulares epiteliales establecidas: el MCF10A derivado de la glándula mamaria humana (Figura 4D) y las células MDCK (Figura 4e) derivadas del riñón del perro. Curiosamente, en ambos casos, se detectaron niveles más altos de Zn en células proliferantes que en monocapas de confluentes. Sin embargo, las células epiteliales derivadas de la glándula mamaria mostraron niveles de metal que fueron 2 veces más alto que el de las células renales. Las células MCF10A mostraron niveles iguales de Zn entre las fracciones citosólicas y nucleares en las células proliferantes. Una vez que MCF10A células alcanzan la confluencia, se detectó una disminución del 40% en los niveles de Zn de células enteras, y se descubrió que el metal estaba más concentrado en la fracción citosólica (Figura 4D). Por el contrario, proliferan las células MDCK exhibieron niveles más altos de Zn en la fracción nuclear, en comparación con la fracción citosólica, pero cuando las células MDCK alcanzaron la confluencia, se detectó una disminución de Zn en células enteras, con la mayoría de este metal de transición observados en la fracción citosólica (figura 4E).

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo representativo de los análisis elementales (Zn) de las células cultivadas de mamífero. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: validación de la pureza de las fracciones obtenidas mediante el rápido aislamiento del Protocolo de núcleos 39 , 40. la mancha occidental representativa de la diferenciación de las mioblastos primarios muestra la pureza de las fracciones subcelulares. La enzima remodeladora de cromatina Brg1 se usó para identificar la fracción nuclear, y la tubulina se usó para identificar la fracción citosólica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: curva de calibración de los estándares Zn. Curva estándar representativa para Zn determinada por GF-AAS. El GF-AAS fue calibrado con las soluciones estándar Zn diluidas en las siguientes concentraciones: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 y 30 ppb. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: niveles de zinc en diferentes células cultivadas de mamífero. Micrografías ligeras representativas y contenido de Zn en extractos celulares enteros y fracciones citosólicas y nucleares. Los datos representan la media de tres réplicas biológicas independientes ± SEM. (A) los myoblastos primarios murinos proliferan y diferencian durante 2 días. (B) línea celular murine neuroblastoma N2A antes y después de la inducción para diferenciar por tratamiento con ácido retinoico. (C) murino 3T3-L1 pre-adipocitos y 6 días de diferenciación post. (D) el preconfluido y la monocapa de confluentes de la línea de células epiteliales mamarias humanas MCF10A. (E) monocapa de preconfluido y confluente de la línea de células epiteliales del riñón MDCK. Los datos representan el promedio de tres experimentos independientes ± SE. la prueba tdel estudiante muestra significancia, * p ≤ 0,05. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La espectroscopía de absorbancia atómica es un método altamente sensible para la cuantificación de Zn en muestras biológicas de volumen pequeño/masa. La optimización descrita de la medición de Zn hace que la aplicación de este método sea simple y garantiza condiciones analíticas ideales. Aquí, utilizando GF-AAS, determinamos la concentración de Zn en células enteras, y en fracciones citosólicas y nucleares, de diferentes líneas celulares. Los resultados demuestran que esta técnica es comparable a la obtenida por sondas fluorescentes e ICP-MS. Por ejemplo, varias sondas fluorescentes mostraron niveles de Zn mitocondriales del lábil en el rango de 0,1 a 300 PM, los niveles en el Golgi estaban por debajo de la gama picomolar, y el retículo endoplasmático varió de 800 a 5.000 PM42, que son consistentes con los niveles detectado en las fracciones citosólicas. Por otra parte, el fluoróforo sensible al Zn fluozin-3 mostró acumulación de lábil Zn en pequeñas vesículas citosólicas en MCF10A y en células C2C1243,44, que también son consistentes con el Zn cuantificado en el citoplasma. Por otra parte, los análisis de Zn por ICP-MS realizados por nuestro grupo mostraron que los niveles de célula entera Zn en la diferenciación de los miotubos primarios45 son similares a los obtenidos en este informe por GF-AAS. Además, ejemplos de determinaciones de Zn en células de glioma C6 rata mediante el uso de AAS y Zinquin-E46 también han representado rangos similares a los observados en neuroblastoma N2A células utilizadas aquí.

Hasta la fecha, se han desarrollado diversas técnicas para detectar Zn en las células. Sin embargo, GF-AAS sigue siendo una técnica precisa y altamente sensible que no sólo permite la detección de Zn libre, pero también mide el metal complejado y unido a las proteínas y potencialmente a las moléculas pequeñas. Nuestro grupo demostró recientemente que las mediciones realizadas con sonda fluorescente permeable a las células (que tiene una alta afinidad para unir el Zn2 +libre) se correlacionan directamente con los niveles de Zn detectados por GF-AAS en la proliferación y diferenciación de las mioblastos 43. sin embargo, los resultados obtenidos por estas sondas pueden no ser representativos de concentraciones enteras de células o de Zn ligadas a proteínas. Además, dado que Zn existe como una especie activa no redox y como catión divalente, en condiciones fisiológicas, su detección en los sistemas celulares seguía siendo un desafío. Se han puesto a disposición nuevas técnicas de imagen Zn, como la microscopía de fluorescencia de rayos X basada en Synchrotron de última generación, radioisótopos y espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente por ablación láser (LA-ICP-MS). Desafortunadamente, algunas de estas técnicas requieren recursos inaccesibles para la comunidad científica29,42,47,48,49,50.

Los estudios han demostrado que el ICP-MS es una técnica más precisa que el AAS, ya que se ha demostrado que los valores de desviación estándar relativa son menores en las determinaciones de ICP-MS para metales como Zn. La explicación probable de este efecto es que el ICP-MS es intrínsecamente capaz de eliminar las interferencias químicas, ya que las temperaturas de argón operativas oscilan entre 5.000 y 10.000 ° c. Algunos enlaces químicos se pueden mantener a 3.000 ° c, que está en el rango para la operación de AAS. Estos bonos serán completamente interrumpidas a más de 6.000 ° c. Por lo tanto, estas altas temperaturas alcanzadas en el estado plasmático por ICP-MS pueden eliminar interferencias químicas, lo que conduce a mejores límites de detección51. Además, ICP-MS requiere muestras de mayor volumen en comparación con GF-AAS, ya que este último es capaz de operar con volúmenes de menos de 100 μL, que es significativamente menor que otros métodos espectroscópicos como AAS, ICP-OES, o ICP-MS. Dados los pequeños volúmenes involucrados en el método, GF-AAS es la técnica ideal para determinar la concentración de Zn en muestras biológicas, principalmente si el análisis involucra fracciones subcelulares, detecciones de metales en proteínas purificadas, o pequeñas variaciones en las células celulares contenido metálico debido a mutaciones en transportadores o proteínas de unión metálica29,52. Además, la sensibilidad del sistema GF-AAS para determinar las concentraciones de trazas y ultratrazas (pg/mL a ng/mL) es otra ventaja.

Se deben tener en consideración las consideraciones importantes para garantizar la fiabilidad de los datos del GF-AAS. Estos incluyen la calibración adecuada, la integridad del tubo de grafito y la selección del modificador de matriz adecuado para la atomización electrotérmica. Los modificadores de matriz son elementos químicos añadidos a la muestra, que afectan a los procesos térmicos que se están produciendo en el atomizador. Estos modificadores minimizan la pérdida de analito durante la pirólisis y contribuyen a la eliminación de los componentes de la matriz. En general, los modificadores pueden cambiar la matriz de la muestra para evaporar los componentes de la matriz a temperaturas más bajas y pueden funcionar como estabilizadores de analito. Además de estas consideraciones, es importante realizar una optimización adecuada de los pasos para el programa de temperatura del atomizador.

Se deben tomar dos consideraciones principales, incluyendo 1) establecer la temperatura óptima de la pirólisis, que se refiere a la temperatura máxima en el paso de atomización en la que no se produce pérdida de analito, y que permite una absorbancia máxima del analito con un mínimo formación. También se debe considerar 2) establecer la temperatura de atomización óptima, que se refiere a la temperatura mínima a la que el analito se evada completamente y se registra como una señal reproducible o pico. Una de las desventajas de los análisis GF-AAS es la interferencia de elementos, para lo cual una optimización y estandarización exhaustivas son esenciales para mediciones precisas. Sin embargo, hasta la fecha, GF-AAS representa una herramienta importante en la investigación científica para detectar los iones metálicos en diversas muestras biológicas. Las futuras aplicaciones de los métodos de detección de Zn (y otros metales) de GF-AAS incluirán la medición de los niveles de metales en órganos y tejidos obtenidos a partir de modelos animales o biopsias de pacientes para comprender mejor las necesidades fisiológicas específicas de los oligoelementos. En conclusión, GF-AAS es preciso, sensible, rentable y accesible, y esta técnica analítica continuará mejorando a medida que avancen los avances tecnológicos para estos sistemas de detección.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Premio de académicos de diversidad de la Facultad de la escuela de medicina de la Universidad de Massachusetts a T.P.-B. N.N.-T. es apoyado por SEP-CONACYT, subvención 279879. J. g. N es apoyado por la Fundación Nacional de ciencia Grant DBI 0959476. Los autores están agradecidos al Dr. Daryl a. Bosco por proporcionar la línea celular N2A y a Daniella Cangussu por su apoyo técnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Tags

Bioquímica problema 147 zinc espectroscopía de absorbancia atómica proliferación diferenciación cultivo celular de mamíferos fraccionamiento subcelular
Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,… More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter