Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Atomabsorptionsspektroskopi för att mäta intracellulära Zinkpooler i däggdjurs celler

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

Odlade primära eller etablerade cellinjer används ofta för att ta itu med grundläggande biologiska och mekanistiska frågor som en initial metod innan du använder djur modeller. Detta protokoll beskriver hur man förbereder hela cell extrakt och subcellulära fraktioner för studier av zink (Zn) och andra spår ämnen med atomabsorptionsspektroskopi.

Abstract

Över gångs metaller är essentiella mikronäringsämnen för organismer men kan vara giftiga för celler vid höga koncentrationer genom att konkurrera med fysiologiska metaller i proteiner och generera Redox stress. Sjukdoms tillstånd som leder till metall utarmning eller ackumulering är kausala smittämnen av olika mänskliga sjukdomar. Några exempel är anemi, acrodermatitis enteropathica, och Wilsons och Menkes ' sjukdomar. Det är därför viktigt att kunna mäta nivåerna och transporten av över gångs metaller i biologiska prover med hög känslighet och noggrannhet för att under lätta forskning om hur dessa faktorer bidrar till normala fysiologiska funktioner och Toxicitet. Zink (Zn), till exempel, är en kofaktor i många däggdjurs proteiner, deltar i signalering händelser, och är en sekundär bud bärare i celler. I överskott, Zn är giftigt och kan hämma absorptionen av andra metaller, medan i underskott, det kan leda till en mängd potentiellt dödliga förhållanden.

Grafit ugnen atomabsorptionsspektroskopi (GF-AAS) ger en mycket känslig och effektiv metod för bestämning av Zn och andra över gångs metaller koncentrationer i olika biologiska prover. Elektrotermisk atomisering via GF-AAS kvantifierar metaller genom att Atomisera små mängder prover för efterföljande selektiv absorptionsanalys med hjälp av våglängd av excitation av elementet av intresse. Inom gränserna för den linearitet av Beer-Lambert lag, är absorbansen av ljus av metallen direkt proportionell mot koncentrationen av analyten. Jämfört med andra metoder för bestämning av Zn-halt detekterar GF-AAS både fri och komplex Zn i proteiner och möjligen i små intracellulära molekyler med hög känslighet i små prov volymer. Dessutom är GF-AAS också mer lättillgängligt än induktivt kopplad plasmasspektrometri (ICP-MS) eller synkrotronbaserad röntgenfluorescens. I denna metod beskrivs den systematiska prov beredningen av olika odlade cellinjer för analyser i en GF-AAS. Variationer i detta spår element jämfördes i både hela celllysat och subcellulära fraktioner av prolifererande och differentierade celler som bevis på principen.

Introduction

Över gången och tung metaller, såsom Zn, Cu, mn, och FE, finns naturligt i miljön i både näringsämnen i livsmedel och föroreningar. Alla levande organismer kräver olika mängder av dessa mikronäringsämnen; exponering för höga halter är emellertid skadlig för organismer. Metall förvärv är främst genom kosten, men metaller kan också inhaleras eller absorberas genom huden1,2,3,4,5. Det är viktigt att notera att närvaron av metaller i atmosfäriska partiklar ökar och har till stor del för knippas med hälso risker. På grund av antropogena aktiviteter har ökade nivåer av tung metaller såsom AG, as, CD, CR, Hg, ni, Fe och PB upptäckts i atmosfäriska partiklar, regn vatten och jord6,7. Dessa metaller har potential att konkurrera med essentiella fysiologiska spår ämnen, särskilt Zn och FE, och de inducerar toxiska effekter genom att inaktivera grundläggande enzymer för biologiska processer.

Spår elementet Zn är redoxneutral och fungerar som en Lewis-syra i biologiska reaktioner, vilket gör den till en grundläggande kofaktor som är nödvändig för protein vikning och katalytisk aktivitet i över 10% av däggdjurs proteiner8,9, och 10; Därför är det viktigt för olika fysiologiska funktioner8,11. Men liksom många spår ämnen, det finns en känslig balans mellan dessa metaller som underlättar normal fysiologisk funktion och orsakar toxicitet. Hos däggdjur, Zn brister leda till anemi, tillväxthämning, hypogonadism, hud avvikelser, diarré, alopeci, smak rubbningar, kronisk inflammation, och nedsatt immun försvar och neurologiska funktioner11,12, 13,14,15,16,17,18. I överskott är Zn cytotoxiskt och försämrar absorptionen av andra essentiella metaller som koppar19,20,21.

Dessutom, vissa metaller som Cu och FE har potential att delta i skadliga reaktioner. Produktion av reaktiva syreradikaler (ros) via Fenton kemi kan störa monteringen av järn svavel kluster proteiner och ändra lipidmetabolismen22,23,24. För att förhindra denna skada, celler utnyttja metall-bindande Chaperones och transportörer för att förhindra toxiska effekter. Utan tvekan, metall homeostas måste vara hårt kontrollerad för att säkerställa att specifika cell typer upprätthålla korrekt nivåer av metaller. Av denna anledning finns det ett betydande behov av att avancera tekniker för noggrann mätning av spår metaller i biologiska prover. Vid utveckling och mogna organismer finns det ett Differentiellt biologiskt behov av spår ämnen på cell nivå, vid olika utvecklingsstadier, och under normala och patologiska förhållanden. Därför är exakt bestämning av vävnad och systemisk metall nivåer krävs för att förstå organismers metall homeostas.

Grafit ugnen atomabsorptionsspektrometri (GF-AAS) är en mycket känslig teknik som används för små prov volymer, vilket gör den idealisk för att mäta över gången och tung metaller som finns i biologiska och miljömässiga prover25,26 , den 27 , 28. på grund av den höga känsligheten hos tekniken har det visat sig lämpligt att studera de fina transport egenskaperna hos na+/K+-ATPas och gastric H+/K+-ATPas med Xenopus oocyter som modell system29. I GF-AAS absorberar de atomiserade elementen i ett prov en våglängd av strålning som avges av en ljus källa som innehåller metall av intresse, med den absorberade strålningen proportionell mot koncentrationen av elementet. Elementär elektronisk excitation sker vid absorption av ultraviolett eller synlig strålning i en kvantiserad process som är unik för varje kemiskt grundämne. I en enda elektron process innebär absorptionen av en fotonen en elektron som rör sig från en lägre energi nivå till högre nivå inom Atomen och GF-AAS bestämmer mängden fotoner som absorberas av provet, vilket står i proportion till antalet strålabsorberande element som är atomiserade i grafit röret.

Selektiviteten i denna teknik bygger på den elektroniska strukturen av atomerna, där varje element har en specifik absorption/emission spektrallinje. När det gäller Zn är absorbansvåglängderna 213,9 nm och kan skilja sig exakt från andra metaller. Sammantaget kan GF-AAS användas för att kvantifiera Zn med adekvata detektions gränser (LOD) och hög känslighet och selektivitet25. Förändringarna i absorberad våglängd är integrerade och presenteras som toppar av energiabsorption vid specifika och isolerade våg längder. Koncentrationen av Zn i ett givet prov beräknas vanligen utifrån en standard kurva över kända koncentrationer enligt Beer-Lambert-lagen, i vilken absorbansen är direkt proportionell mot koncentrationen av Zn i provet. Men att tillämpa Beer-Lambert ekvationen till GF-AAS analyser uppvisar också vissa komplikationer. Till exempel kan variationer i atomisering och/eller icke-homogena koncentrationer av proverna påverka metall mätningar.

Den metall atomisering som krävs för GF AAS spår elementär analys består av tre grundläggande steg. Det första steget är desolvation, där vätskan lösnings medlet är avdunsta; lämnar torra föreningar efter ugnen når en temperatur på cirka 100 ° c. Sedan, föreningarna förångas genom att värma dem från 800 till 1 400 ° c (beroende på elementet som skall analyseras) och bli en gas. Slutligen, föreningarna i det gasformiga tillståndet är atomiserade med temperaturer som sträcker sig från 1 500 till 2 500 ° c. Som diskuterats ovan, ökande koncentrationer av en metall av intresse kommer att göra proportionella ökningar på absorptionen upptäcks av GF-AAS, men ugnen minskar det dynamiska omfånget av analys, vilket är den arbets område av koncentrationer som kan bestäms av instrumentet. Således kräver tekniken låga koncentrationer och en noggrann bestämning av det dynamiska omfånget av metoden genom att bestämma LOD och gräns för linearitet (LOL) av Beer-Lambert lag. LOD är den minsta mängd som krävs för att ett ämne ska kunna detekteras, definierat som tre gånger standard avvikelsen för Zn i matrisen. Den LOL är den maximala koncentrationen som kan detekteras med hjälp av Beer-Lambert lag.

I detta arbete beskriver vi en standard metod för att analysera halterna av Zn i hela cell extrakt, cytoplasmatiska och nukleära fraktioner, och i att proliferera och differentiera odlade celler (figur 1). Vi anpassade den snabba isoleringen av nuklei-protokoll till olika cellulära system för att förhindra metall förlust under prov beredning. De cellulära modeller som används var primära myoblaster härrör från mus satellit celler, murina neuroblastom celler (N2A eller Neuro2A), murina 3T3 L1 adipocyter, en mänsklig icke-tumorigenic bröst epitelial cellinjen (MCF10A), och epitelial madin-Darby hundnjure ( MDCK)-cellerna. Dessa celler bildades från olika linjer och är bra modeller för att undersöka härstamning specifika variationer av metall nivåer in vitro.

Primära myoblaster som härrör från mus satellit celler utgör en väl lämpad in vitro -modell för att undersöka skelett muskel differentiering. Proliferation av dessa celler är snabb när odlade under höga serum förhållanden. Differentiering i den muskulösa härstamning framkallas därefter av låga serum villkorar30. Den murina neuroblastom (N2A) etablerade cellinjen härstammar från mus neurala Crest. Dessa celler presenterar neuronala och amöbiska stamcells morfologi. Vid differentiering stimulans, den N2A celler presentera flera egenskaper av nerv celler, såsom neurofilament. N2A celler används för att undersöka Alzheimers sjukdom, neurit utväxt, och neurotoxicitet31,32,33. Den 3T3-L1 murina pre-adipocyter etablerade cellinjen används ofta för att undersöka de metabola och fysiologiska förändringar i samband med adipogenesis. Dessa celler presentera en fibroblast-liknande morfologi, men en gång stimuleras för differentiering, de presenterar enzymatisk aktivering i samband med lipid syntes och triglycerider ackumulering. Detta kan observeras som morfologiska förändringar för att producera cytoplasmatiska lipiddroppar34,35. MCF10A är en icke-tumör bröst epitelial cellinjen härrör från en premenopausala kvinna med bröst Fibrocystisk sjukdom36. Det har använts flitigt för biokemiska, molekyl ära och cellulära studier relaterade till bröstcancercarcinogenes såsom proliferation, cell migration, och invasion. Den Madin-Darby hundnjure (MDCK) epitelial cellinjen har i stor utsträckning använts för att undersöka egenskaper och molekyl ära händelser i samband med inrättandet av epitelial fenotyp. När de når sammanflödet, blir dessa celler polariserade och etablera cell-cell sammanväxningar, egenskaper hos däggdjurs epitelial vävnader37.

För att testa förmågan hos AAS att mäta nivåerna av Zn i däggdjurs celler, analyserade vi hela och subcellulära fraktioner (Cytosol och kärna) av dessa fem cellinjer. AAS mätningar visade olika koncentrationer av Zn i dessa cell typer. Koncentrationerna var lägre i prolifererande och differentierande primära myoblaster (4 till 7 nmol/mg protein) och högre i de fyra etablerade cellinjerna (allt från 20 till 40 nmol/mg protein). En liten icke-signifikant ökning av Zn-nivåer upptäcktes för att differentiera primära myoblaster och neuroblastom celler jämfört med prolifererande celler. Motsatt effekt upptäcktes i differentierade adipocyter. Men, prolifererande 3T3-L1 celler uppvisade högre koncentrationer av metallen jämfört med differentierade celler. Viktigt, i dessa tre cellinjer, subcellulär fraktionering visade att Zn är differentially distribueras i cytosolen och kärnan enligt metaboliska tillstånd av dessa celler. Till exempel, i prolifererande myoblaster, N2A celler, och 3T3-L1 pre-adipocyter, en majoritet av metallen är lokaliserad till kärnan. Vid induktion av differentiering med hjälp av specifika cell behandlingar, Zn lokaliserad till cytosolen i dessa tre cell typer. Intressant, båda epitelial cellinjer visade högre nivåer av Zn under proliferation jämfört med när når sammanflödet, där en karakteristisk tight enskiktslager bildades. I prolifererande epitelceller, bröst cellen linje MCF10A hade en lika Zn fördelning mellan Cytosol och kärna, medan i njurederiverade cellinjen, de flesta av metallen var placerad i kärnan. I dessa två cell typer, när cellerna nådde sammanflödet, var Zn huvudsakligen placerad till cytosolen. Dessa resultat visar att GF-AAS är en mycket känslig och noggrann teknik för att utföra elementär analys i lågavkastande prover. GF-AAS i kombination med subcellulär fraktionering och kan anpassas för att undersöka nivåerna av spår metall element i olika cellinjer och vävnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. däggdjurs cells odling

  1. Allmänna överväganden
    1. Följ aseptiska metoder för däggdjurs cell kultur tidigare granskat38.
    2. Behåll alla cellinjer i en befuktad 5% CO2 inkubator vid 37 ° c. Cell odlings förhållandena varierar för varje cell typ. Det är viktigt att upprätthålla lämpliga odlings förhållanden för varje cellinjen som används, eftersom variationer av dessa procedurer kommer att leda till avvikande fenotyper och fel i cell kulturen.
    3. Se till att bekant skap med cell raden av intresse och följ protokollen för varje cell typ som valts för specifika experiment (se några exempel nedan).
  2. Allmänt förfarande för trypsinization och överföring av anhängare celler
    1. Ta bort cell odlings mediet från odlings plattan genom aspiration.
    2. Tvätta cellerna varsamt med PBS utan kalcium och magnesium (5 mL per 10 cm2 odlings yta). Tillsätt tvätt lösningen på sidan av plattan för att undvika att separera cellmonolayer; snurra plattan för att maximera täckningen av lösningen. För epitelceller, är det nödvändigt att Inkubera cellerna i 10 till 15 min i inkubator vid 37 ° c i PBS för att under lätta dissociation av celler i följande steg.
    3. Ta bort tvätt lösningen genom aspiration.
    4. Tillsätt tillräckligt med dissociationreagens (0,25% trypsin) till plattan (cirka 0,7 mL per 10 cm2). Snurra plattan försiktigt för att få fullständig täckning av cellmonolayer.
    5. Inkubera kulturen i rums temperatur i 2 till 5 minuter. Den faktiska inkubations tiden varierar med den cell linje som används, när det gäller epitelceller rekommenderas att Inkubera i 10 till 15 min i inkubator vid 37 ° c. Observera cellerna under Mikroskop för cell avlossning.
    6. När de flesta av cellerna har lossnat, återvinna cell SUS pensionen i 5 mL av pre-värmde plätering eller odlings substrat (se nedan för några exempel). Separera cell klumpar mekaniskt genom att Pipettera över cellmonolayer flera gånger.
    7. Överför cell SUS pensionen till ett 15 mL koniskt rör och centrifugera dem på 1 000 x g i 2 till 5 min. Centrifugeringshastigheten och-tiden varierar beroende på cell typen. Ta bort mediet genom mild aspiration, vara noga med att inte röra cellpelleten. Omsuspendera cellpelleten i 5 till 10 mL av det lämpliga förvärmda odlings mediet och ta bort ett prov för att räkna med en hemocytometern eller en automatisk cell räknare.
    8. Utnyttja lämplig volym av cell SUS pensionen till utsäde den rekommenderade densiteten för varje specifik cellinjen (se nedan för några exempel). Komplettera med tillräcklig volym av odlings medier beroende på storleken på kulturen skålen och placera cellerna tillbaka in i inkubator.
  3. Primära myoblaster som härrör från mus satellit celler
    1. Före start, Förbered kollagen-belagda plattor för primär myoblast tillväxt. En lösning som innehåller 0,02% kollagen och 0,05 M ättiksyra i avjoniserat vatten måste steriliseras genom filtrering med en steril filter enhet på 0,22 μm. Inkubera odlings plattorna med kollagen lösningen över natten vid 37 ° c.
    2. Nästa dag, aspirera kollagen lösningen, låt plattorna lufttorka i det sterila skåpet och förvara vid 4 ° c till användning.
      Anmärkning: de minimala volymerna av kollagen är: för 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Frö primära myoblaster vid 1 x 104 celler/cm2 i 55 cm2 kollagen-belagda kultur tallrikar. Spridningen Media är Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM)/Ham s F12 näringsämne blandning kultur media som innehåller 20% Foster nötkreatur serum (FBS), 25 ng/mL av rekombinant grundläggande fibroblastisk tillväxtfaktor (FGF), och 100 U/mL av penicillin/streptomycin.
      Obs: proliferating och lager celler bör bibehållas under 50% av sammanlänkning. Cell kontakt inducerar engagemang av cellerna för att Myogenic differentiering och försämrar tillväxtförmågan hos kulturen.
    4. För att differentiera de primära myoblaster, låt cellerna att nå 80% till 100% sammanlänkning, som normalt sker efter 48 h av plätering. Sedan, ändra till differentiering media (DMEM, 2% Horse serum, 1% insulin, transferrin, selen ett tillägg, och 100 U/mL av penicillin/streptomycin). Uppdatera media dagligen tills skörden.
  4. Murina neuroblastom (N2A)
    1. Platta N2A celler med en densitet av 2 x 104 celler/cm2 i tillväxtmedia, innehåll Ande en blandning av reducerat serum/DMEM innehåll ande hög glukos och L-glutamin (1:1, v:v), komplettera med 10% FBS och 100 U/ml av penicillin/streptomycin. Bibehålla beståndet kultur under 50% sammanlänkning.
    2. Inducera differentiering av N2A celler när konfluens nådde 25% till 40%. Byt till differentierings medier som innehåller en blandning av reducerad-serum medium/DMEM, 1% FBS och 20 μM retinoinsyra i 7 till 10 dagar. Uppdatera media varannan dag tills cell skörd.
      Obs: som N2A celler differentierar, vissa celler blir runda, lossnar lätt, och kan genomgå apoptos. Var försiktig när aspirera och lägga till odlings mediet till plattorna.
  5. 3T3 L1 murina pre-adipocyter
    1. Underhålla mus 3T3/L1 celler i DMEM med hög glukos, kompletteras med 10% FBS och 100 U/mL av penicillin/streptomycin. Den adipogena processen är beroende av sammanflödet av cellerna; Därför, låt inte beståndet kulturen växa över 50% sammanflödet, som högre confluence kommer att försämra förmågan hos cellerna att differentiera.
    2. Platta cellerna vid 2 x 104 celler/cm2. Vid denna densitet, cellerna kommer att nå sammanflödet i 3 dagar.
    3. Framkalla adipogena differentiering två dagar efter cellerna når 100% confluency. Induktions mediet består av DMEM innehåll ande 10% FBS, 10 μg/mL insulin, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methyxanthine, 1 μM dexametason och 10 μM troglitazone.
    4. Byt ut induktions mediet efter 48 h inkubation till differentierings medier (DMEM innehåll ande 10% FBS, och 5 μg/mL insulin). Uppdatera media varannan dag tills skörden. Representativa prover av fullständig differentiering samlas normalt mellan 7 och 10 dagar efter adipogen induktion.
      Obs: som adipogenesis fortskrider, cellerna blir runda och tenderar att lossna lätt. Var försiktig när aspirera och lägga till odlings mediet till plattorna.
  6. MCF10A-celler
    1. Platta MCF10A-celler i DMEM/F12 (1:1, v:v), kompletterade med 5% FBS, 100 U/mL penicillin/streptomycin, 0,5 μg/mL Hydro kortison, 10 μg/mL insulin och 20 ng/mL Epidermal tillväxtfaktor (EGF). Rekommenderad seeddensitet är 1 x 105 celler/cm2. Under dessa förhållanden, cellerna kommer att nå 100% konfluens inom 4 dagar. Uppdatera media var 2 till 3 dagar tills skörden.
      Obs: MCF10A-celler är svåra att lossa. Det rekommenderas att Inkubera cellerna i 10 till 15 min vid 37 ° c i PBS utan kalcium med 0,5 mM EDTA före trypsinization.
  7. Madin-Darby Hundarnas njure celler (MDCK)
    1. Plate MDCK-celler i DMEM kompletterade med 10% FBS och 100 U/mL penicillin/streptomycin. Rekommenderad seeddensitet är 1 x 105 celler/cm2, där cellerna kommer att nå 100% konfluens inom 3 dagar. Uppdatera media var 2 dagar tills skörden.
      Anm: MDCK-celler är svåra att lossa. Det rekommenderas att Inkubera cellerna i 5 till 10 min vid 37 ° c i PBS utan kalcium och magnesium före trypsinization. För att förhindra cell klumpar inte agitera plattorna genom att slå eller skaka kolven i väntan på cellerna att lossna.

2. beredning av prover från däggdjurs celler för AAS: hela cellen och subcellulär fraktionering

  1. Kultur cellerna av intresse i 55 cm2 plattor. Användningen av mindre odlings plattor kan ge prover med halter av metaller under detektions gränserna för GF-AAS.
  2. Hela cell extrakt
    1. Aspirera odlings mediet med hjälp av en vakuum fälla. Var noga med att ta bort alla spår av media. Skölj cellerna från de önskade tids punkterna eller odlings förhållandena tre gånger med iskalla PBS fria från kalcium och magnesium.
    2. Skrapa omedelbart cellerna från plattan med en ny cell skrapa av plast i 1 mL PBS utan kalcium och magnesium. Överför provet till ett 1,5 mL mikrocentrifugerör och Centrifugera i 2 min vid 2 000 x g och aspirera supernatanten. Protokollet kan pausas här. Förvara pelletproverna vid-20 ° c eller gå vidare till steg 2,4.
  3. Subcellulär fraktionering
    1. Aspirera odlings mediet med hjälp av en vakuum fälla. Var noga med att ta bort alla spår av media. Skölj cellerna från de önskade tids punkterna eller odlings förhållandena tre gånger med iskalla PBS fria från kalcium och magnesium. Skrapa cellerna från plattan med 1 mL iskall PBS utan kalcium och magnesium.
    2. Överför proverna till ett 1,5 mL mikrocentrifugerör och fortsätt på isen. Centrifugera i 10 s vid 10 000 x g. Fortsätt snabbt isolera kärnor om metall analys av cytoplasmatiska och nukleära fraktioner önskas. Detta förfarande kommer att minimera den potentiella förlusten av metaller på grund av cell utvinning39, 40.
    3. Avlägsna supernatanten genom aspiration och omsuspendera cellpelleten i 400 μL iskalla PBS-fria från kalcium och magnesium, innehåll ande 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), ett icke-joniskt rengörings medel. Överför 100 μL till ett nytt mikrocentrifugerör och betrakta det som hela cell provet. Denna alikvot motsvarar 25% av provet.
    4. Isolera kärnor genom att Pipettera cell SUS pensionen 5 till 10 gånger på isen med en P1000 mikropipettspets. Nuklei isolering av epitelceller kräver en koncentration av 0,5% NP-40. Uppnå cell dissociation genom att passera cell SUS pensionen genom en 26 3/4 G nål 10 till 15 gånger, följt av 10 till 15 passager genom en 30 1/2 G nål.
      Anmärkning: kontrol lera nuklei integritet genom ljusmikroskopi med en 40x mål.
    5. Centrifugera den kvarvarande celllysat SUS pensionen (300 μL) i 10 s vid 10 000 x g. Supernatanten kommer att innehålla cytosoliskt-fraktionen. Överför 300 μL till ett nytt mikrocentrifugerör.
    6. Skölj pelleten som innehåller kärn fraktionen i 500 μL PBS utan kalcium och magnesium, innehåll ande 0,1% NP-40 och centrifugera sedan i 10 s vid 10 000 x g. Avlägsna supernatanten och omsuspendera pelleten som innehåller Atom kärnor i 100 μL av samma lösning.
      Obs: protokollet kan pausas här. Proverna kan förvaras vid-20 ° c.
  4. Lyse cellerna genom tre ultraljudsbehandling cykler (30 s på/30 s av, vid 50 kHz, 200 W) för 5 min. kvantifiera total protein halt i provet av Bradford41.
  5. Utför kvalitets kontroll av fraktionernas renhet av Western blot med hjälp av anti kroppar som är specifika för antingen kärn kraften (histoner, kromatin-ombyggda, nukleära mat ris proteiner) eller cytosoliska fraktioner (β-tubulin, β-aktin) (figur 2).
    Obs: Använd inte ultraljudsonikatorer med en metall spets. Dessa kan förorena provet med metaller.

3. Zn-innehållsanalys av hela cellen och subcellulära fraktioner av däggdjurs cell kulturer med atomabsorptionsspektroskopi

  1. Mineralisera cell odlings proven (hela cell-eller kärn krafts fraktioner) genom syra nedbrytning med en lika stor volym koncentrerad HNO3 -spårmetallsort (varning) för 1 h vid 80 ° c och därefter över natten vid 20 ° c.
  2. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 30% av reaktions volymen av H2O2. Ta prov volymen till 500 μL med 18 MΩ renat vatten.
    Obs: HNO3 hantering bör göras med kemikalie skydds glasögon, ett ansikte sköld för stänk skydd, handskar, och en godkänd ånga andnings skydd om adekvat ventilation (rök huva) inte är tillgänglig. Protokollet kan pausas här. Proverna kan förvaras vid rums temperatur (RT).
  3. Förbered standardlösningar och experimentella prover för Zn mätningar av AAS utrustad med en grafit ugn.
    1. Använd 2% (v/v) HNO3 lösning i avjoniserat vatten, som kommer från samma parti som används för standard kurvan som blind lösning för kalibrering genomgående. Använd analytiska kvalitets standarder spädda i 18 MΩ renat vatten.
    2. Bered en standard på 1 000 ppb av Zn från en kommersiellt tillgänglig 1 000 ppm Zn-lagerlösning med 2% (v/v) HNO3 -lösning i avjoniserat vatten. Förbered arbets standardlösningar från 100 ppb-standarden genom att späda den till 5, 8, 10, 15, 20 och 25 ppb direkt med 2% (v/v) HNO3 -lösning i avjoniserat vatten. Förbered Zn-standarderna och Tom rummen med en 0,1% (1 g/L) mg (nr3)2 Matrix modifier.
      Anmärkning: LOD av Zn är 0,01 ppb (μg/L). Genom att öka koncentrationen av standarderna fastställdes gränsen för linjäritet för Zn till 20 ppb (figur 3).
    3. Mät standard och prover under samma optimerade förhållanden: flödes hastighet för införande av 250 mL/min, insprutnings temperatur på 20 ° c och GF-temperatur på 1 800 ° c.
      Obs: GF-temperaturen ökades till 2450 ° c för rensnings steg, före injektionen av ett nytt prov eller en standard.
    4. Optimera lampan (C-HCL) till en ström av 20 A, våglängd på 213,9 nm, och slits av 0,7 nm.
    5. Mät de mineraliserade proverna med standard kurvan för Zn för bestämning av metallhalten. Eftersom små volymer mäts kan proverna avdunsta om mätningarna tar långa tids perioder. Därför rekommenderas att man lägger till vatten i proverna. Späd proverna med 18 MΩ renat vatten som behandlats med 0,01% HNO3 (analytisk grad) om de erhållna uppgifterna ligger utanför lod.
      Anmärkning: typiskt, proverna späds till en volym av 500 μL, placeras i den automatiserade autosampler av AAS som skall mätas direkt efter standard kurvan är fastställd. Den erforderliga volymen bör bestämmas av användaren och bör överväga slutliga beräkningar av koncentrationer. Efter behandling av Zn bestämningar av AAS av ett komplett experiment i ett försök rekommenderas. Om mätningarna pausar kan det leda till stora experimentella variationer och inkonsekvenser.
  4. Omvandla ppb mätningar till molarity som erhålls från Zn mätt via AAS. Överväg massan av Zn (65,39 AMU). Dividera mängden ppb erhålls genom AAS av 63 390 000. I celler är koncentrationerna i Zn allt från enheter av pmol till μmol.
    1. Dividera koncentrationen av Zn (pmol eller μmol) med den ursprungliga massan av protein i provet som bestämts av Bradford (steg 2,4). Denna beräkning kommer att göra den mängd metall (pmol eller μmol Zn) som ingår per mg protein i provet.
      Obs: det är viktigt att beakta de utspädnings faktorer som används under metallbestämningarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi testade förmågan hos GF-AAS att detektera minut nivåer av Zn i däggdjurs celler (figur 1). Således odlade vi primära myoblaster som härrör från mus satellit celler, och den etablerade cellinjer N2A (neuroblastom härledd), 3T3 L1 (adipocyter), MCF10A (bröstepitel), och MDCK celler (hund njure epitel). Först isolerade vi hela cellen, cytosolic, och nukleära fraktioner av alla dessa cell typer och utvärderade renhet fraktioner av västra blot (figur 2). Representativ immunodetektion av kromatin ombyggda Brg1 och tubulin som markörer för nukleära och cytosoliska fraktioner, respektive, visat lämpligheten av subcellulära fraktionering protokoll som beskrivs i avsnitt 2,3 att utföra elementär analys (figur 2). Hela cellen och subcellulära fraktioner för bereddes som beskrivits ovan för GF-AAS analyser, och kalibrering av utrustningen utfördes för att ge en typisk linjär standard kurva (figur 3).

Figur 4 visar representativa ljusmikroskopi bilder av prolifererande och differentierad eller konflytande enskiktslager av varje cell typ, och motsvarande Zn nivåer för dessa. Viktigt var att alla cellinjer som analyserades i denna studie visade Zn-koncentrationer i nM-intervallet. Däremot upptäcktes en differentierad fördelning av metallen. Differentierade primära myotubes uppvisade högre halter av Zn än prolifererande celler (figur 4a). Särskilt var mycket av Jon ligger till den nukleära fraktionen i både prolifererande och differentiera myoblaster. En liknande subcellulär distribution av Zn upptäcktes i den härledda cellinjen för neuroblastom N2A (figur 4b). Emellertid, mätningar visade att N2A celler hade Zn nivåer en storleksordning högre än primära myoblaster. Å andra sidan uppvisade den etablerade 3T3-L1 cellinjen högre nivåer av Zn när pre-adipocyter var prolifererande än när de induceras för att differentiera och bilda mogna adipocyter som ackumulerar lipider (figur 4c).

Vi har också mätt Zn innehåll i två olika etablerade epiteliala cellinjer: den MCF10A som härrör från mänskliga bröst körtel (figur 4D) och hunden njure-härledda mdck (figur 4e) celler. Intressant, i båda fallen, högre nivåer av Zn i prolifererande celler än i konflytande enskiktslager upptäcktes. Emellertid, de epitelceller som härrör från bröst körtel visade metall nivåer som var 2-faldigt högre än i njur cellerna. MCF10A celler visade lika nivåer av Zn mellan cytosoliska och nukleära fraktioner i prolifererande celler. En gång MCF10A celler når sammanflödet, en 40% minskning av hela cellen Zn nivåer upptäcktes, och metallen konstaterades vara mest koncentrerad i cytosoliskt fraktion (figur 4D). Omvänt uppvisade prolifererande mdck-celler högre halter av Zn i kärn fraktionen, jämfört med cytosoliskt-fraktionen, men när mdck-cellerna nådde sammanflödet upptäcktes en minskning av Zn i hela celler, med majoriteten av denna över gångs metall observerades i cytosoliskt-fraktionen (figur 4e).

Figure 1
Figur 1: representativt flödes schema för elementära (Zn) analyser av däggdjurs odlade celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: validering av renhets graden hos fraktioner erhållna genom snabb isolering av nuklei-protokollet 39 , 40. representativ Western blot från att differentiera primär myoblaster som visar renheten hos subcellulära fraktioner. Den kromatin ombyggda enzymet Brg1 användes för att identifiera den nukleära fraktionen, och tubulin användes för att identifiera cytosoliskt fraktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kalibrerings kurva för Zn-standarder. Representativ standard kurva för Zn fastställd av GF-AAS. GF-AAS kalibrerades med de standardiserade Zn-lösningarna utspädda vid följande koncentrationer: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 och 30 ppb. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: zinkhalter i olika däggdjurs odlade celler. Representativa lätta mikrografer och Zn-innehåll i helcellsextrakt och cytosoliska och nukleära fraktioner. Data representerar medelvärdet av tre oberoende biologiska replikat ± SEM. (a) murina primär myoblaster sprider och differentierar i 2 dagar. B) murina neuroblastom N2A cellinjen före och efter induktion för att differentiera genom behandling med retinoinsyra. (C) murina 3T3-L1 pre-adipocyter och 6 dagar efter differentiering. D) pre-konflytande och konflytande enskiktslager av den mänskliga bröst epitelcelllinjen MCF10A. Epre-konflytande och konflytande enskiktslager av njurepitelial cellinjen mdck. Data representerar genomsnittet av tre oberoende experiment ± SE. Students t-test visar signifikans, * p ≤ 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Atomabsorptionsspektroskopi är en mycket känslig metod för bestämning av Zn i små volym/Mass biologiska prover. Den beskrivna optimeringen av Zn-mätningen gör tillämpningen av denna metod enkel och garanterar idealiska analytiska förhållanden. Här, med hjälp av GF-AAS, bestämde vi koncentrationen av Zn i hela celler, och i cytosoliskt och nukleära fraktioner, från olika cellinjer. Resultaten visar att denna teknik gör jämförbar med den som erhålls genom fluorescerande sonder och ICP-MS. Till exempel visade flera fluorescerande sonder labila mitokondriella Zn nivåer i intervallet 0,1 till 300 PM, nivåer i Golgi var under pikomolär sortiment, och endoplasmatiska Retikulum varierade från 800 till 5 000 pM42, som är förenliga med nivåer detekteras i cytosoliska fraktioner. Dessutom visade Zn-responsiv fluorophore fluozin-3 ansamling av labila Zn i små cytosoliska vesikler i MCF10A och i C2C12-cellerna43,44, som också överensstämmer med Zn kvantifierade i cytoplasman. Dessutom visade Zn-analyser av ICP-MS som utfördes av vår grupp att hela cell nivåer Zn för att differentiera primära myotubes45 liknar dem som erhållits i denna rapport av GF-AAS. Dessutom, exempel på Zn bestämningar i C6 råtta gliom celler med hjälp av AAS och zinquin-E46 har också gjort liknande intervall till de som observerats i neuroblastom N2A celler som används här.

Hittills har olika tekniker utvecklats för att detektera Zn i celler. Men, GF-AAS är fortfarande en noggrann och mycket känslig teknik som inte bara gör det möjligt att upptäcka gratis Zn, men det mäter också den metall komplex och bunden till proteiner och potentiellt till små molekyler. Vår grupp visade nyligen att mätningar utförda med cell-permeabel fluorescerande sond (som har en hög affinitet för att binda gratis Zn2 +) direkt korrelerade med de nivåer av Zn upptäcks av GF-AAS i prolifererande och differentiera myoblaster 43de resultat som erhålls genom dessa sonder får dock inte vara representativa för koncentrationer av hela cell eller protein bundet Zn. Dessutom, eftersom ZN existerar som en icke-Redox aktiva arter och som divalenta katjon, under fysiologiska förhållanden, dess upptäckt i cellulära system förblev en utmaning. Nya Zn Imaging tekniker har blivit tillgängliga, såsom den State-of-the-art Synchrotron-baserade röntgen fluorescens mikroskopi, radio isotoper, och laser ablation induktivt kopplad plasma masspektrometri (LA-ICP-MS). Tyvärr kräver vissa av dessa tekniker resurser otillgängliga för vetenskaps samfundet29,42,47,48,49,50.

Studier har visat att ICP-MS är en mer exakt teknik än AAS, eftersom relativa standard avvikelse värden har visats vara lägre i ICP-MS-bestämningar för metaller som Zn. Den troliga förklaringen till denna effekt är att ICP-MS i sig kan eliminera kemiska interferenser, eftersom de operativa argontemperaturerna sträcker sig från 5 000 till 10 000 ° c. Vissa kemiska bindningar kan upprätthållas vid 3 000 ° c, som är i intervallet för AAS drift. Dessa obligationer kommer att vara helt störd vid över 6 000 ° c. Därför, dessa höga temperaturer uppnås i plasma tillstånd av ICP-MS kan eliminera kemiska interferenser, vilket leder till bättre detektions gränser51. Dessutom kräver ICP-MS större volymprover jämfört med GF-AAS, eftersom de senare kan fungera med volymer under 100 μL, vilket är betydligt mindre än andra spektroskopiska metoder såsom AAS, ICP-OES eller ICP-MS. Med tanke på de små volymerna som är involverade i metoden är GF-AAS den idealiska tekniken för bestämning av Zn-koncentrationen i biologiska prover, främst om analysen involverar subcellulära fraktioner, metall detektioner i renade proteiner eller små variationer i cellulära metallhalten på grund av mutationer i transportörer eller metallbindande proteiner29,52. Dessutom är känsligheten hos GF-AAS-systemet för att bestämma spår och Ultra-trace koncentrationer (PG/mL till ng/mL) en annan fördel.

Viktiga överväganden bör göras för att säkerställa tillförlitligheten av GF-AAS data. Dessa inkluderar adekvat kalibrering, integritet grafit röret, och val av lämplig matris modifierare för elektrotermisk atomisering. Matrismodifierare är kemiska element som läggs till i provet, vilket påverkar de termiska processer som sker i sprejflaska. Dessa modifierare minimerar förlusten av analyt vid pyrolys och bidrar till avlägsnande av mat ris komponenter. Sammantaget kan modifierare ändra provmatrisen för att avdunsta mat ris komponenterna vid lägre temperaturer och kan fungera som analytstabilisatorer. Utöver dessa överväganden är det viktigt att utföra lämplig optimering av stegen för atomizer temperatur program.

Två huvudsakliga överväganden bör tas, inklusive 1) fastställa optimal pyrolys temperatur, som hänvisar till den maximala temperaturen vid atomisering steg där ingen analyt förlust uppstår, och som möjliggör en maximal absorbans av analyten med minimal Bakgrund. Man bör också överväga 2) att fastställa den optimala atomisering temperatur, som hänvisar till den lägsta temperatur vid vilken analyten är helt avdunsta och registreras som en reproducerbar signal eller topp. En av nack delarna med GF-AAS analyser är elementets interferens, där en grundlig optimering och standardisering är avgörande för noggranna mätningar. Men hittills, GF-AAS representerar ett viktigt verktyg i vetenskaplig forskning för att upptäcka metall joner i olika biologiska prover. Framtida tillämpningar av Zn (och andra metaller) detektions metoder av GF-AAS kommer att omfatta mätning av halterna av metaller i organ och vävnader som erhållits från djur modeller eller patientbiopsier för att bättre förstå specifika fysiologiska behov av spår ämnen. Sammanfattnings vis är GF-AAS korrekt, känslig, kostnads effektiv och tillgänglig, och denna analytiska teknik kommer att fortsätta att förbättras när tekniska framsteg går framåt för dessa detektions system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av fakulteten Diversity Scholars Award från University of Massachusetts Medical School till T.P.-B. N.N.-T. stöds av SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N stöds av National Science Foundation Grant DBI 0959476. Författarna är tacksamma för Dr Daryl A. Bosco för att tillhandahålla N2A cellinjen och Daniella Cangussu för hennes tekniska support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Tags

Biokemi zink atomabsorptionsspektroskopi proliferation differentiering däggdjurs cells odling subcellulär fraktionering
Atomabsorptionsspektroskopi för att mäta intracellulära Zinkpooler i däggdjurs celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gordon, S. J. V., Xiao, Y.,… More

Gordon, S. J. V., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter