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Biochemistry

哺乳類細胞内の細胞内亜鉛プールを測定するための原子吸光度分光法

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/59519
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero
* These authors contributed equally

Summary

培養一次または確立された細胞株は、動物モデルを使用する前に初期のアプローチとして、基本的な生物学的および機械的な質問に対処するために一般的に使用される。このプロトコルは、亜鉛 (Zn) および原子吸光度分光法を有するその他の微量元素の研究のために全細胞抽出物を調製し、細胞内フラクションを準備する方法を説明する。

Abstract

遷移金属は、生物にとって不可欠な微量栄養素ですが、タンパク質中の生理的金属と競合し、酸化還元ストレスを発生させることにより、高濃度の細胞に対して毒性を及ぼします。金属の枯渇または蓄積につながる病的状態は、異なるヒト疾患の因果作用物質である。いくつかの例は、貧血、acrodermatitis enteropathica、ウィルソンとメンケスの病気が含まれています。したがって、これらの要素がどのように正常な生理的機能に寄与するかを探究する研究を容易にするためには、生体試料中の遷移金属のレベルと輸送を高感度かつ正確に測定できることが重要である。毒性。亜鉛 (Zn) は、例えば、多くの哺乳動物タンパク質における補因子であり、シグナル伝達事象に関与し、そして細胞における二次的なメッセンジャーである。過剰には、Zn は有毒であり、他の金属の吸収を阻害することができますが、赤字では、潜在的に致命的な条件の様々につながることができます。

グラファイト炉原子吸光分析 (GF-AAS) は、多様な生物学的試料中の Zn およびその他の遷移金属濃度を決定するための非常に高感度かつ有効の方法を提供します。電熱は、対象の要素の励起波長を使用して、その後の選択的吸収解析のために少量のサンプルを微粒化することにより、GF AAS を使用して微粒化を行います。ビール-ランバート法の線形性の範囲内では、金属による光の吸光度は、検体の濃度に正比例する。Zn 含有量を決定する他の方法と比較して、GF-AAS は、タンパク質および場合によっては小さなサンプル量で高感度の小さな細胞内分子で、遊離および複合体化 Zn の両方を検出します。さらに、GF-AAS は、誘導結合プラズマ質量分析 (ICP-MS) またはシンクロトロンベースの X 線蛍光よりも容易にアクセスできます。この方法では、GF-AAS での分析のための異なる培養細胞株の系統的サンプル調製物が記載されている。この微量元素の変動は、原則の証明として、細胞溶解物および増殖した細胞の細胞内フラクションの両方において比較された。

Introduction

そのような Zn、Cu、Mn、および Fe などの移行および重金属は、食品および汚染物質の両方の栄養素の環境で自然に見出されます。すべての生物は、これらの微量栄養素の異なる量を必要とします。しかし、高レベルへの暴露は、生物に有害である。金属の捕捉は主に食事を介して行いますが、金属はまた、皮膚1、2、3、4、5を介して吸入または吸収することができます。大気中の粒子の金属の存在が増加していることに注意することが重要であり、主に健康上のリスクに関連付けられています。人為的な活動のために、Ag などの重金属の増加レベル、Cd、Cr、Hg、Ni、Fe および Pb が大気粒子状物質、雨水、および土壌6,7で検出されています。これらの金属は、本質的な生理的微量元素、特に Zn と Fe と競合する可能性があり、生物学的プロセスのための基礎的な酵素を不活化することによって毒性作用を誘発する。

微量元素 Zn は、酸化還元中性であり、生物学的反応においてルイス酸として動作し、それが哺乳動物タンパク質8、9 の 10% 以上でのタンパク質のフォールディングおよび触媒活性に必要な基礎的な補因子となる。10;その結果、多様な生理機能8,11に必須である。しかし、多くの微量元素と同様に、これらの金属の間には繊細なバランスがあり、正常な生理的機能を促進し、毒性を引き起こします。哺乳動物において、Zn 欠乏症は、貧血、成長遅滞、性腺機能低下、皮膚異常、下痢、脱毛、味覚障害、慢性炎症、および免疫・神経機能障害を引き起こす11、12、 13、14、15、16、17、18。過剰には、Zn は細胞毒性であり、銅19、20、21などの他の必須金属の吸収を損なう。

さらに、Cu や Fe などの一部の金属は、有害な反応に関与する可能性があります。フェントン化学を介した活性酸素種 (ROS) の生成は、鉄硫黄クラスタータンパク質のアセンブリを妨害し、脂質代謝を変化させる22、23、24。この損傷を防ぐために、細胞は金属結合のシャペロンとトランスポーターを利用して毒性作用を防ぎます。特定のセルタイプが適切なレベルの金属を維持できるように、金属の恒常性を厳密に制御する必要があります。このため、生体試料中の微量金属を正確に測定するための技術を進歩させることが重要である。発達し成熟した生物においては、細胞レベルでの微量元素のための生物学的必要性の相違、異なる発達段階における、および正常および病的状態に存在する。したがって、組織と全身の金属レベルの正確な決定は、有機体金属の恒常性を理解する必要があります。

グラファイト炉原子吸光分析 (GF-AAS) は、少量のサンプル容量に使用される高感度な技術で、生物学および環境試料中に存在する遷移および重金属を測定するのに理想的です。25、26,27,さらに、技術の高感度のために、アフリカツメガエルを使用して Na+/K+-ATPase および胃 H+/K+-ATPase の微細な輸送特性を研究するために適切であることが示されている。モデルシステム29としての卵母細胞。GF AAS では、サンプル内の微粒化された要素は対象の金属を含む光源から放出される放射線の波長を吸収し、吸収された輻射は要素の濃度に比例します。元素電子励起は、各化学元素に固有の量子化されたプロセスで、紫外線または可視放射の吸収によって起こります。単一の電子プロセスにおいて、光子の吸収は、低エネルギーレベルから原子内のより高いレベルへ移動する電子を含み、GF AAS は、試料によって吸収される光子の量を決定し、これは放射線吸収の数に比例するグラファイトチューブで微粒化された元素。

この技術の選択性は、各要素が特定の吸収/発光スペクトル線を有する原子の電子構造に依存する。Zn の場合、吸光度波長は 213.9 nm であり、他の金属と正確に区別することができます。全体として、GF AAS は、検出の十分な限界 (LOD) と高い感度と選択性25で Zn を定量化するために使用することができます。吸収した波長の変化は統合され、特定の、孤立した波長のエネルギー吸収のピークとして示される。所与の試料における Zn の濃度は、通常、ビール−ランバート法に従って既知濃度の標準曲線から計算され、その中で、吸光度は試料中の Zn の濃度に正比例する。しかし、ビール・ランバート方程式を GF-AAS 分析に適用することは、いくつかの合併症も示します。たとえば、サンプルの微粒化および/または均質でない濃度の変動は、金属測定に影響を与える可能性があります。

GF AAS に必要な金属微粒化微量元素分析は、3つの基本的なステップで構成されています。最初のステップは、液体溶媒が蒸発している desolvation、です。乾燥した化合物は、炉が約100° c の温度に達した後に残します。次いで、これらの化合物を800から1400° c (分析対象元素に応じて) に加熱することによって気化させ、気体となる。最後に、気体状態の化合物は、1500から2500° c の範囲の温度で微粒化されます。上で議論したように、目的の金属の濃度を高めることは、GF AAS によって検出された吸収に比例した増加をレンダリングしますが、炉は分析のダイナミックレンジを減少させます, これは、することができる濃度の作業範囲である装置によって決定される。したがって、この技術は、ビール-ランバート法の直線性の LOD と限界 (笑) を決定することによって、低濃度および方法のダイナミックレンジを慎重に決定することを必要とする。LOD は、検出される物質に必要な最小量で、マトリックス中の Zn の3倍の標準偏差として定義されます。LOL は、ビール・ランバート法を使用して検出することができる最大濃度です。

本研究では、細胞全体の抽出物中の Zn 濃度、細胞質および核の画分、増殖および分化培養細胞における亜鉛レベルを分析する標準的な方法について述べる (図 1)。我々は、試料調製時の金属損失を防止するために、異なる細胞系に核プロトコルの迅速な単離を適応させた。使用された細胞モデルは、マウス衛星細胞、ネズミ神経芽細胞腫細胞 (N2A または Neuro2A)、ネズミ 3T3 L1 脂肪細胞、ヒト非腫瘍化乳房上皮細胞株 (MCF10A)、および上皮 Madin-ダービーイヌ腎臓 (MDCK) 細胞。これらの細胞は、異なる系統から確立され、インビトロでの金属レベルの系統特異的変動を調査するための良好なモデルである。

マウスの衛星細胞から派生した一次芽細胞は、骨格筋の分化を調査するのに適したインビトロモデルを構成しています。これらの細胞の増殖は、高血清条件下で培養すると高速である。筋肉系統への分化は、その後、低血清条件30によって誘発される。ネズミ神経芽細胞腫 (N2A) 確立された細胞株は、マウスニューラルクレストに由来した。これらの細胞は神経およびアメーバ様幹細胞の形態を示す。分化刺激の際、N2A 細胞は、neurofilaments などのニューロンのいくつかの特性を示す。N2A 細胞は、アルツハイマー病、神経突起伸長、および神経毒性31、32、33を調査するために使用されます。3T3 − L1 マウス前脂肪細胞を樹立した細胞株は、脂肪生成に関連する代謝および生理的変化を調査するために一般的に用いられる。これらの細胞は、線維芽細胞様の形態を提示するが、分化のために一度刺激したが、脂質合成およびトリグリセリド蓄積に関連する酵素活性化を提示する。これは、細胞質脂質液滴34、35を産生するための形態学的変化として観察することができる。MCF10A は、乳腺 fibrocystic 疾患36の閉経前女性に由来する非腫瘍乳腺上皮細胞株である。これは、増殖、細胞遊走、浸潤などの乳腺発癌に関連する生化学、分子、細胞学の研究に広く使用されてきました。Madin-ダービー犬の腎臓 (MDCK) 上皮細胞株は、広く上皮表現型の確立に関連する特性および分子イベントを調査するために使用されています。合流に達すると、これらの細胞は分極して、細胞細胞癒着を確立し、哺乳動物上皮組織37の特性を得る。

哺乳動物細胞における Zn 濃度を測定するための AAS 能力を試験するために、これら5つの細胞株の全体および細胞内フラクション (セルゾルおよび核) を分析しました。AAS の測定はこれらの細胞のタイプで Zn の異なった集中を示した。濃度は、1次筋芽細胞の増殖および分化において低かった (4 〜 7 nmol/タンパク質)、そして4つの確立された細胞株 (20 〜 40 nmol/mg のタンパク質の範囲) で高い。増殖細胞と比較した場合、Zn レベルの小さな非有意な増加が、原発性筋芽細胞および神経芽腫を分化することで検出された。この反対の効果は分化した脂肪細胞において検出された。しかし、3T3 − L1 細胞の増殖は、分化した細胞と比較してより高い濃度の金属を呈した。重要なことに、これらの3つの細胞株において、細胞内分画は、Zn がこれらのセルの代謝状態に応じて基質および核内で差動的に分布していることを示した。例えば増殖性筋芽細胞において、N2A セル、および3T3 − L1 前脂肪細胞は、大部分の金属が核に局在する。特定の細胞処置を使用して分化の誘導に際して、これらの3つの細胞型において質ゾルに局在する Zn。興味深いことに、両方の上皮細胞株は、増殖中に高いレベルの Zn を示したが、合流の際には、特徴的なタイト単層を形成した。増殖性の上皮細胞において、乳腺細胞株 MCF10A は、細胞質と核の間に等しい Zn 分布を有し、一方、腎臓由来セルラインでは、ほとんどの金属が核内に位置していた。これらの2つの細胞型では、細胞がコンフルエントに達したとき、Zn は主として質基質に位置していた。これらの結果は、GF AAS が低収量サンプルで元素分析を行うための非常に高感度で正確な技術であることを示しています。GF-AAS は、細胞内分別と相まって、異なる細胞株および組織の微量金属元素のレベルを調査するために適応することができます。

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Protocol

1. 哺乳類の細胞培養

  1. 一般的な考慮事項
    1. 以前に確認された哺乳動物細胞培養の無菌技術に従って38.
    2. 37° c の加湿された 5% co2 インキュベーター内のすべてのセルラインを維持します。細胞培養条件は、細胞の種類ごとに異なります。これらの手順のバリエーションが異常な表現型と細胞培養の失敗につながるとして、使用される各細胞株の適切な培養条件を維持することが重要です。
    3. 関心のある細胞株との知人を確保し、特定の実験のために選択された各細胞タイプのために提供されたプロトコルに従ってください (以下のいくつかの例を参照してください)。
  2. 接着細胞のトリプシン処理および通過のための一般的な手順
    1. 培養プレートからの細胞培養培地を吸引により除去する。
    2. カルシウムとマグネシウム (10 cm2 培養表面積あたり 5 mL) のない PBS を使用して、細胞をやさしく洗ってください。セル単層をデタッチしないように、プレートの側面に洗浄液を追加します。ソリューションのカバレッジを最大化するためにプレートを旋回します。上皮細胞の場合、以下のステップで細胞の解離を促進するために、PBS 中の37° c のインキュベーター内で10〜15分間細胞をインキュベートする必要があります。
    3. 吸引により洗浄液を除去する。
    4. 十分な解離試薬 (0.25% トリプシン) をプレートに添加します (10 cm2 あたり約 0.7 mL)。細胞単層の完全なカバレッジを得るために、プレートを静かに旋回させる。
    5. 培養液を室温で 2 ~ 5 分間インキュベートします。実際のインキュベーション時間は、使用する細胞株によって異なり、上皮細胞の場合には、37° c でインキュベーター内で10〜15分間インキュベートすることが推奨される。細胞剥離のために顕微鏡下の細胞を観察してください。
    6. 大部分の細胞が剥離したとき、予温められためっきまたは増殖培地の5ml 中で細胞懸濁液を回収する (いくつかの例については下記参照)。細胞単層を数回にわたってピペッティングすることによって細胞集塊を機械的に解離させる。
    7. 細胞懸濁液を 15 mL の円錐形のチューブに移し、1000 x gで 2 ~ 5 分間遠心分離します。遠心分離の速度および時間は、細胞タイプに基づいて変化する。優しく吸引してメディアを取り出し、細胞ペレットに触れないように注意してください。細胞ペレットを適切な予温めた成長培地の5〜10ml に再懸濁し、血球計数器または自動細胞カウンターを用いて計数するための試料を除去する。
    8. 細胞懸濁液の適切な体積を利用して、各特異的細胞株について推奨密度をシードします (いくつかの例については後述します)。培養皿のサイズに応じて培養培地の十分な量を補給し、細胞をインキュベーターに戻す。
  3. マウスの衛星細胞から派生した主な筋芽
    1. 開始する前に、一次筋芽細胞成長のためのコラーゲンコーティングプレートを調製する。0.02% のコラーゲンを含有する溶液を、脱イオン水中の 0.05 M 酢酸と、0.22 μ m の無菌フィルタ装置で濾過して滅菌しなければならない。コラーゲン溶液で培養プレートを一晩37° c でインキュベートします。
    2. 翌日、コラーゲン溶液を吸引し、滅菌キャビネット内でプレートを空気乾燥させ、使用まで4° c で保存する。
      注: コラーゲンの最小量は、35 mm = 1 mL です。60ミリメートル = 2 ミリリットル;10 cm = 5 mL である。
    3. シードプライマリ筋芽細胞は、1 x 104セル/cm2 で55センチメートル2のコラーゲンコーティング培養プレート。増殖培地は、20% のウシ胎児血清 (FBS)、25 ng/mL の組換え塩基性 fibroblastic 成長因子 (FGF)、および 100 U/mL のペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグルミディアム (DMEM)/Ham の F12 栄養素混合培養メディアです。
      注: 増殖およびストック細胞は、コンフルエントの 50% の下で維持されるべきです。細胞接触は、筋に分化し、培養の成長能力を損なう細胞のコミットメントを誘導する。
    4. 一次筋芽細胞を区別するために、通常は 48 h のめっきの後に生じる 80% 〜 100% のコンフルエントに到達することを可能にする。その後、分化培地 (DMEM、2% ウマ血清、1% インスリン、トランスフェリン、セレン A サプリメント、および 100 U/mL のペニシリン/ストレプトマイシン) に変更する。収穫まで毎日メディアをリフレッシュしてください。
  4. ネズミ神経芽細胞腫 (N2A)
    1. プレート N2A は、増殖培地において 2 x 106 細胞 /cm2 の密度で細胞を含有し、高グルコースおよび L-グルタミン (1:1、v:v) を含有する還元-血清中/DMEM の混合物を含む、10% FBS および 100 U/mL のペニシリン/ストレプトマイシンを添加した。50% コンフルエントの下で株式の文化を維持します。
    2. 1回コンフルエント 25% に達した N2A 細胞の分化を誘導します 40%.還元血清培地/DMEM、1% FBS、および20μ m レチノイン酸を 7 ~ 10 日間混合した分化培地への変更。セルの収穫まで1日おきにメディアを更新します。
      注: N2A 細胞が分化するにつれて、一部の細胞は丸くなり、容易に剥離し、アポトーシスを起こすことがある。プレートに培養メディアを吸引して追加するときは注意してください。
  5. 3T3 L1 マウス前脂肪細胞
    1. 高グルコースを有する DMEM 中にマウス 3T3/L1 細胞を維持し、10% FBS および 100 U/mL のペニシリン/ストレプトマイシンを添加した。及びプロセスは、細胞の合流に依存しています;したがって、より高い合流度は、分化する細胞の能力を損なうであろうとして、50% コンフルエントの上に株の文化を成長させてはいけません。
    2. 細胞を 2 x 104細胞/cm2 でプレートする。この密度では、細胞は3日で合流に達する。
    3. 細胞が 100% のコンフルエントに達してから2日後に及び分化を誘導する。誘導培地は、10% FBS、10μ g/mL インスリン、0.5 mM 3-メチルイソブチルキサンチン-1-methyxanthine、1μ m デキサメタゾン、および10μ m トログリタゾンを含有する DMEM からなる。
    4. 48の後に誘導培地を分化培地 (10% FBS を含む DMEM、および5μ g/mL インスリン) へのインキュベーションに交換してください。収穫まで一日おきにメディアを更新します。完全分化の代表的なサンプルは、通常、及び誘導後7〜10日の間に収集される。
      注: 脂肪生成が進行するにつれて、細胞は丸くなり、容易にデタッチする傾向があります。プレートに培養メディアを吸引して追加するときは注意してください。
  6. MCF10A 細胞
    1. プレート MCF10A 細胞は DMEM/F12 (1:1, v:v) で、5% FBS、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、0.5 μ g/mL ヒドロコルチゾン、10μ g/ml インスリン、および 20 ng/ml の表皮成長因子 (EGF) を添加した。推奨される播種密度は 1 x 105セル/cm2 です。これらの条件下で、細胞は4日以内に 100% コンフルエントに達する。収穫まで2〜3日ごとにメディアをリフレッシュしてください。
      注: MCF10A 細胞は剥離が困難です。トリプシン処理の前に 0.5 mM EDTA のカルシウムを含まない PBS で37° c で 10 ~ 15 分間細胞をインキュベートすることをお勧めします。
  7. Madin-ダービー犬の腎臓細胞 (MDCK)
    1. 10% FBS および 100 U/mL のペニシリン/ストレプトマイシンを添加した DMEM 中のプレート MDCK 細胞。推奨される播種密度は 1 x 105細胞/cm2 であり、細胞は3日以内に 100% コンフルエントに達する。収穫まで2日ごとにメディアをリフレッシュします。
      注: MDCK 細胞は剥離が困難です。トリプシン処理前にカルシウムとマグネシウムのない PBS で37° c で5〜10分間細胞をインキュベートすることをお勧めします。セルの束を防ぐには、セルがデタッチするのを待つ間にフラスコを叩いたり振ったりしてプレートを攪拌ないようにします。

2. 哺乳類細胞培養試料調製物: 全細胞と細胞内分別

  1. 552プレートに関心のある細胞を培養する。小さい培養プレートを使用すると、GF AAS の検出限界の下で、金属レベルのサンプルが得られることがあります。
  2. 全細胞抽出物
    1. 真空トラップを使用して培養培地を吸引します。メディアのすべての痕跡を削除してください。氷冷 PBS でカルシウムとマグネシウムを含まない3回、目的の時点または培養条件から細胞をすすぎます。
    2. すぐにカルシウムとマグネシウムを含まない PBS 1 mL で新しいプラスチックセルスクレーパーを使用して、プレートから細胞を掻き取る。1.5 mL マイクロ遠心チューブにサンプルを移し、2000 x gで2分間遠心分離し、上清を吸引します。プロトコルはここで一時停止することができます。ペレットサンプルを-20 ° c で保管するか、ステップ2.4 に進みます。
  3. 細胞内分別
    1. 真空トラップを使用して培養培地を吸引します。メディアのすべての痕跡を削除してください。氷冷 PBS でカルシウムとマグネシウムを含まない3回、目的の時点または培養条件から細胞をすすぎます。1 mL の氷冷 PBS を使用してプレートから細胞を削り、カルシウムとマグネシウムを含まない。
    2. 1.5 mL マイクロ遠心チューブにサンプルを移し、氷上で維持してください。1万 x gで 10 s の遠心分離を行います。細胞質および核の一部分の金属の分析が望まれれば核の急速な分離を続けなさい。この手順は、細胞抽出39, 40による金属の潜在的な損失を最小限に抑えることができます。
    3. 吸引によって上清を除去し、400μ l のカルシウムおよびマグネシウムを含まない再懸濁で細胞ペレットを取り出し、0.1% Nonidet P-40 (NP-40)、非イオン性洗剤を含有する。100μ l を新しいマイクロ遠心チューブに移し、細胞試料全体として検討してください。このアリコートは、サンプルの 25% を表します。
    4. P1000 マイクロピペットチップを使用して、氷の上で細胞懸濁液を 5 ~ 10 回ピペット操作して、核を分離します。上皮細胞の核分離は 0.5% の NP-40 の濃度を必要とします。26 3/4 G 針を通して細胞懸濁液を10〜15回通過させることによって細胞解離を達成し、次いで 30 1/2 G 針を通して10〜15継代を行う。
      注:40 倍の目標を使用して、光顕微鏡による核の完全性を確認してください。
    5. 残りの細胞ライセート懸濁液 (300 μ l) を 1万 x gで10秒間遠心します。上清には細胞質画分が含まれます。300μ l を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
    6. 500μ l で核画分を含有するペレットを、カルシウムとマグネシウムを含まない PBS で洗浄し、0.1% NP-40 を含有し、次いで 1万 x gで 10 s の遠心分離を行う。上清を除去し、同じ溶液の100μ l 中の核を含むペレットを再懸濁する。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは-20 ° c. で貯えることができる。
  4. 溶解は、3つの超音波処理サイクル (30 s on/30 s オフ、50 kHz、200 W) で5分間細胞を測定します。ブラッドフォード41によってサンプルの総蛋白質の内容を定量化しなさい。
  5. 核 (ヒストン、クロマチン皆様、核マトリックスタンパク質) または細胞ゾル画分 (βチューブリン、β-アクチン) のいずれかに特異的な抗体を使用して、ウエスタンブロットによる画分の純度の品質管理を行います (図 2)。
    注: 金属チップには sonicators を使用しないでください。これらは、金属でサンプルを汚染することができます。

3. Zn 含有量分析-原子吸光度分光法による哺乳類細胞培養物の細胞内画分

  1. ミネラライズの細胞培養サンプル (全細胞または核画分) を、80° c で1時間、20° c で HNO3トレース金属グレード (注意) の等しい体積を使用して酸分解によって抽出します。
  2. H2 の反応量の 30% を加えて反応を停止させる。18 m ωの精製水でサンプル容量を500μ l にしてください。
    注: HNO3の取り扱いは、適切な換気 (ヒュームフード) が利用できない場合は、化学安全眼鏡、スプラッシュ保護用のフェースシールド、手袋、および承認された蒸気呼吸器を着用して行う必要があります。プロトコルはここで一時停止することができます。試料は室温 (RT) で保存することができる。
  3. グラファイト炉を搭載した AAS によって Zn 測定のための標準ソリューションと実験サンプルを準備します。
    1. 脱イオン水に 2%(v/v) HNO3溶液を使用し、標準曲線と同じバッチから、校正用のブランク溶液として使用します。18 m ωの精製水で希釈した分析等級基準を使用してください。
    2. イオン交換水中の 2%(v/v) HNO3溶液で市販の 1000 ppm zn ストック溶液から 1000 Ppb の亜鉛を調製します。100 ppb 規格の作業標準液を、2%(v/v) HNO3溶液で直接5、8、10、15、20、および 25 ppb に希釈して調製します。Zn 規格とブランクを 0.1% (1g/L) Mg (NO3)2マトリクス修飾子で準備します。
      注: Zn の LOD は 0.01 ppb (μ g/L) です。基準の濃度を増加させることによって、Zn の直線性の限界は 20 ppb と判定された (図 3)。
    3. 最適化された同じ条件の下で測定標準およびサンプル: 250 mL/min の導入の流れ率、20° c の注入の温度および1800° c の GF の温度。
      注: 新しいサンプルまたは標準を注入する前に、洗浄指図ステップで GF 温度を2450° c に引き上げました。
    4. ランプ (C-HCL) を 20 A の電流、213.9 nm の波長、0.7 nm のスリットに最適化します。
    5. 金属含有量を決定するために、Zn 標準曲線を使用して、鉱化サンプルを測定します。小さい容積が測定されると同時に、測定が長い期間を取る場合サンプルは蒸発できる。したがって、サンプルに水を加えることをお勧めします。得られたデータが LOD を超えている場合、18 m ωの精製水で 0.01% の HNO3 (分析グレード) でサンプルを希釈します。
      注: 典型的には、サンプルは、500μ l の容量に希釈され、標準曲線が確立された直後に測定される AAS の自動オートサンプラーに置かれる。必要な量は、ユーザーによって決定されるべきであり、濃度の最終的な計算を考慮する必要があります.1つの試みの完全な実験の AAS による Zn の決定を終えることは推薦される。測定値を一時停止すると、実験のばらつきが大きくなり、不整合が生じます。
  4. モル濃度を介して測定された Zn から取得した ppb の測定値を、AAS に変換します。Zn (65.39 amu) の質量を考慮する。AAS によって得られた ppb の量を6339万で割ります。細胞では、Zn 濃度は pmol の単位からモルの範囲である。
    1. Zn (pmol またはモル) の濃度を、ブラッドフォードによって決定されたサンプル中のタンパク質の初期質量で割ります (ステップ 2.4)。この計算は、サンプルのタンパク質の mg あたりに含まれる金属 (pmol またはモル Zn) の量をレンダリングします。
      注: 金属の決定の間に利用される希釈係数を考慮することは重要です。

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Representative Results

我々は、哺乳動物細胞における Zn の微小レベルを検出するために GF-AAS の能力を試験しました (図 1)。そこで、マウス衛星細胞由来の一次筋芽細胞を培養し、確立された菌体線 N2A (神経芽細胞腫)、3T3 L1 (脂肪細胞)、MCF10A (乳上皮)、MDCK 細胞 (イヌ腎上皮) を抽出まず、これらの細胞の全ての細胞の全てを分離し、その分画や核の一部分を、ウェスタンブロットで純度を評価しました (図 2)。核および細胞質画分のマーカーとしてのクロマチン remodeler Brg1 およびチューブリンの代表的な免疫検出法は、それぞれ、元素を実行するためにセクション2.3 に記載された細胞内分別プロトコルの適合性を実証した分析 (図 2)。上記のようにして全セルおよび細胞内画分が、GF-AAS 分析のために調製され、装置の較正が典型的な線形標準曲線をもたらすために行われた (図 3)。

図 4は、各細胞タイプの増殖性および分化またはコンフルエントな単層の代表的光顕微鏡像を示し、これらに対応する Zn レベルを示す。重要なことに、この研究で分析された全ての細胞株は、nM 範囲の Zn 濃度を示した。しかし、金属の微分分布が検出された。分化した一次ままは増殖細胞よりも Zn の高いレベルを示した (図 4a)。顕著に、イオンの大部分は、筋芽細胞の増殖および分化の両方において核分画に位置していた。Zn の同様の細胞内分布が、神経芽腫由来細胞株 N2A で検出された (図 4b)。しかし、測定値は、N2A 細胞が1桁よりも高い Zn レベルを有することを示した。その一方で、確立された3T3 − L1 細胞株は、前脂肪細胞が増殖したときよりも高濃度の Zn を示し、脂質を蓄積する成熟脂肪細胞を形成したときよりも高いレベルを示した (図 4c)。

我々はまた、2つの確立された上皮細胞株である Zn 含量を測定した: ヒト乳腺由来の MCF10A (図 4d) およびイヌ腎臓由来 MDCK (図 4e) 細胞。興味深いことに、どちらの場合にも、コンフルエントな単層に比べて増殖細胞における Zn のより高いレベルが検出された。しかしながら、乳腺に由来する上皮細胞は、腎臓細胞のそれより2倍高かった金属レベルを示した。MCF10A 細胞は増殖性細胞において原子質と核画分の間で Zn の等しいレベルを示した。ひとたび MCF10A 細胞が合流すると、細胞全体の Zn レベルが 40% 減少して検出されたが、その金属は最も質の高い部分に濃縮されていることがわかった (図 4d)。反対に、増殖している MDCK 細胞が、細胞質分率と比較して、核分画中の Zn のより高いレベルを示したが、MDCK が合流すると、細胞全体における Zn の減少が検出されたが、この遷移金属の大部分は、細胞質画分で観察される (図 4e)。

Figure 1
図 1: 哺乳動物培養細胞の元素 (Zn) 分析の代表的なフローチャート。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 原子核プロトコルの急速な単離によって得られたフラクションの純度の検証39,40. 主要な筋芽細胞からの代表的なウェスタンブロットは、細胞内フラクションの純度を示します。クロマチン remodeler 酵素 Brg1 を使用して核画分を同定し、チューブリンを使用して細胞質画分を同定した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: Zn 規格の較正曲線GF-AAS によって決定される Zn のための代表的な標準曲線。GF AAS は、以下の濃度で希釈した標準の Zn 溶液で較正されました: 1、3、5、7、10、15、20、25、および 30 ppb。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 異なる哺乳動物培養細胞における亜鉛レベル。全体の細胞抽出物および質質および核の一部分の代表的な軽い顕微鏡写真そして Zn の内容。データは、3つの独立した生物学的反復の平均を表す± SEM. (A) 2 日間増殖して分化するネズミの初代筋芽細胞。(B) マウス神経芽細胞腫 N2A の前後に細胞株をレチノイン酸処理により分化させる。(C) マウス3T3 − L1 前脂肪細胞と6日後の分化。(D) ヒト乳腺上皮細胞株 MCF10A の前集密およびコンフルエント単層。(E) 前コンフルエントおよび腎上皮細胞株 MDCK のコンフルエントな単層。データは、3回の独立した実験の平均± SE を表す。スチューデントのt検定は有意性を示します, * p ≤ 0.05.この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

原子吸光度分光法は、小容量/質量の生物学的サンプルにおける Zn 定量の高感度な方法です。Zn の測定の記述された最適化はこの方法の適用を簡単にし、理想的な分析条件を保証する。ここでは、GF AAS を使用して、細胞全体の Zn の濃度、および細胞質と核画分を、異なるセルラインから決定しました。結果は、この技術は、蛍光プローブおよび ICP-MS によって得られるものに匹敵するレンダリングであることを示しています。例えば、いくつかの蛍光プローブは、0.1 ~ 300 pM の範囲で不安定なミトコンドリア・ Zn 濃度を示し、ゴルジ体のレベルは picomolar の範囲を下回っており、小胞体は800から 5000 pM42まで及んでおり、これはレベルと一致している細胞質画分で検出されます。さらに、zn 応答性蛍光色素 FluoZin は、MCF10A および C2C12 細胞43、44における微小細胞質ベシクルに不安定な zn の蓄積を示し、これはまた、色素分子において定量化された Zn と一致している。さらに、我々のグループによって実施される ICP-MS による Zn 分析は、分化原発性まま45における全細胞レベル Zn が、GF AAS によってこの報告で得られたものと類似していることを示した。さらに、AAS と Zinquin-E46を使用した C6 ラットグリオーマ細胞における Zn 決定の例は、ここで使用される神経芽細胞腫 N2A 細胞に見られるものにも同様の範囲をレンダリングした。

現在までに、細胞中の Zn を検出するための多様な技術が開発されている。しかし、GF-AAS は、自由な Zn の検出を可能にするだけでなく、タンパク質に結合され、そして潜在的に小分子になる金属を測定し、正確で高感度な技術のままです。私たちのグループは、最近、細胞透過性蛍光プローブ (これは、遊離 Zn2 +を結合するために高い親和性を持っている) で行われた測定は、増殖性および分化芽細胞で、GF-AAS によって検出される Zn のレベルと直接相関していることを示した43しかし、これらのプローブによって得られた結果は、全細胞またはタンパク質結合型 Zn 濃度を代表するものではない可能性がある。さらに、Zn は非酸化還元活性種と二価カチオンとして存在するため、生理的条件下では、細胞系におけるその検出は困難なままであった。最先端のシンクロトロンベースの X 線蛍光顕微鏡、放射性同位元素、およびレーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析 (LA-ICP-MS) などの新規の Zn イメージング技術が利用可能になりました。残念ながら、これらの技術のいくつかは、科学コミュニティ29、42、47、48、49、50にアクセスできないリソースを必要とします。

研究によると、ICP-MS は、Zn のような金属の ICP-MS の決定において相対的な標準偏差の値が低いことが示されているため、AAS よりも精密であることがわかっています。この効果のための可能性のある説明は、ICP-MS は、動作アルゴン温度が5000から1万° c までの範囲で、化学的干渉を除去することが本質的に可能であるということです。いくつかの化学結合は、AAS 操作の範囲である3000° c で維持することができます。これらの債券は6000° c 以上で完全に破壊される。従って、ICP − MS によってプラズマ状態で到達したこれらの高温は、化学的干渉を排除することができ、より良好な検出限界51につながる。さらに、ICP-MS は100μ l 以下のボリュームで動作可能であり、これは AAS、ICP-OES、ICP-MS などの他の分光法よりも大幅に少ないため、GF-AAS と比較して、より大きな容積のサンプルが必要になります。この方法に関連する少量の場合、GF-AAS は、主として細胞内フラクション、精製タンパク質の金属検出、または細胞内の小さな変化を含む、生物学的サンプル中の Zn 濃度を決定する理想的な手法です。トランスポーターまたは金属結合タンパク質29,52の変異に起因する金属含量。さらに、微量および超微量濃度を決定するための GF-AAS システムの感度 (pg/mL から ng/mL) はもう1つの利点です。

GF AAS データの信頼性を確保するには、重要な考慮事項が必要です。これらには、適切な較正、グラファイトチューブの完全性、電熱微粒化のための適切なマトリックス改質の選択が含まれます。マトリックス修飾子は、サンプルに添加される化学元素で、アトマイザーで行われる熱プロセスに影響を与えます。これらの修飾子は、熱分解時の分析物の損失を最小限に抑え、マトリックス成分の除去に寄与する。全体として、修飾子は、より低い温度でマトリックス成分を蒸発させるためにサンプルマトリックスを変更し、検体安定剤として働くことができます。これらの考慮事項に加えて、アトマイザー温度プログラムのためのステップの適切な最適化を行うことが重要である。

2つの主な考慮事項は、1) 最適な熱分解温度の確立、検体消失が発生しない微粒化工程での最高温度を示すこと、および分析対象物の最大吸光度を最小にすることを含む。背景。また、2) 最適な噴霧温度を確立し、検体が完全に蒸発して再現性のある信号またはピークとして記録される最低温度を示すことも考慮すべきである。GF AAS 分析の欠点の1つは要素の干渉であり、正確な測定には徹底した最適化と標準化が不可欠です。しかし、現在までに、GF-AAS は、多様な生物学的試料中の金属イオンを検出するための科学研究における重要ツールを表しています。今後の Zn (およびその他の金属) 検出方法の応用としては、動物モデルや患者の生検から得られた器官や組織の金属レベルを測定し、微量元素の生理的ニーズをよりよく理解することが含まれる。結論として、GF AAS は、正確で高感度で、費用対効果が高く、アクセス可能であり、この分析手法は、技術の進歩がこれらの検出システムを前進させるにつれて改善し続けます。

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Disclosures

作者は何も開示することはありません。

Acknowledgments

この作品は、マサチューセッツ医科大学からトイレットペーパーへの教員ダイバーシティ・奨学生賞によってサポートされました.N.N.-T.9月-国家、グラント279879によってサポートされています。J. g. N は、国立科学財団グラント DBI 0959476 によってサポートされています.著者は、N2A 細胞株を提供し、彼女の技術サポートのためにダニエラ Cangussu に、ダリル・ A ・ボスコ博士に感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

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生化学、問題147、亜鉛、原子吸光度分析、増殖、分化、哺乳類細胞培養、下細胞内分別
哺乳類細胞内の細胞内亜鉛プールを測定するための原子吸光度分光法
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