Summary
이 프로토콜은 시험관 내 표면 분석법을 사용하여 미세 소관의 무, 고대비, 고속 이미징을 위한 표준 형광 현미경에 간섭 반사 현미경 을 구현하기 위한 가이드입니다.
Abstract
표면 근처의 정제된 생체 분자를 시각화하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 검사법은 일반적으로 사용되는 방법이지만 형광 라벨링이 필요하며 분자의 활동을 방해 할 수 있다는 단점이 있습니다. 또한, 광 표백 및 광 손상이 우려된다. 미세소관의 경우, 우리는 TIRF와 유사한 품질의 이미지가 간섭 반사 현미경 검사법 (IRM)을 사용하여 얻을 수 있음을 발견했습니다. 이것은 IRM이 시험관에서 큰 생체 분자 및 올리고머의 역학을 구상하기 위한 일반적인 기술일지도 모른다는 것을 건의합니다. 이 백서에서는 형광 현미경이 단순히 IRM 이미지를 얻기 위해 수정될 수 있는 방법을 보여줍니다. IRM은 차동 간섭 대비 현미경 또는 간섭 산란 현미경 검사법과 같은 다른 조영기술보다 더 쉽고 상당히 저렴합니다. 그것은 또한 암시야 현미경 검사법 보다는 표면 결점 및 해결책 불순물에 보다 적게 영향을 받기 쉽습니다. IRM을 사용하여, 이 백서에 설명된 이미지 분석 소프트웨어와 함께, 시야와 프레임 속도는 카메라에 의해서만 제한된다; sCMOS 카메라와 광시야피소 미세소관 길이를 10Hz 대역폭으로 최대 20nm의 정밀도로 측정할 수 있습니다.
Introduction
미세소관의 라벨없는 이미징은 이미지에서 대비를 생성하기 위해 tubulin의 형광 라벨링의 필요성을 우회하기 때문에 흥미 롭습니다. 형광 라벨링에는 여러 가지 단점이 있습니다: 단백질 농도가 1이고 광표백 및 광손상이 관찰 시간을 제한하면 불가능합니다. 비디오 강화 차동 간섭 조영법(DIC) 및 다크필드 현미경 검사법 2,3,4,5를포함하여 라벨이 없는 미세소관을 이미지화하는 데 몇 가지 기술이 사용되어 왔다. 최근에는 간섭경산법(iSCAT) 6,회전-비차질산란현미경(ROCS)7 및 공간광 간섭 현미경(SLIM)8도사용되고 있다. 이 모든 기술은 미세소관을 이미징할 수 있으며 미세소관 역학을 연구하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 그러나 각각에는 고유한 제한이 있습니다. DIC에서 대비는 미세소관과 노마르스키 프리즘 축 사이의 각도에 따라 달라집니다. 암시야에서는 불순물이나 표면 결함으로 인해 산란된 빛에 의해 미세소관 신호가 저하됩니다. iSCAT는 특별한 감도(단일 단백질까지)를 나타내고 ROCS는 시료 깊숙이 미세소관을 심층적으로 이미지화할 수 있지만, 두 방법 모두 기술적으로 까다로운 레이저 스캐너를 필요로 합니다.
이 프로토콜은 간섭 반사 현미경 검사법(IRM)9,10이 마이크로소튜브의 무표지 이미징을 위한 대체 기술로 설정할 수 있는 방법을 보여줍니다. IRM은 표준 형광 현미경에 저렴한 50/50 미러만 추가해야 하므로 구현하기 쉽습니다. 여기에 설명된 소프트웨어와 함께 사용하면 IRM은 고대비 미세소관 이미지를 생성하고, 큰 시야를 고속으로 이미지화할 수 있으며, 한 번 정렬이 필요하며 형광 이미징과 같은 다른 기술과 쉽게 결합될 수 있습니다.
Protocol
1. 현미경 수정 및 대물 렌즈
- 적절한 필터 큐브를 사용하여 형광 현미경의 필터 휠에 50/50미러를 삽입합니다(그림 1). 반사 방지 코팅이 가능한 경우가 많듯이 50/50 미러를 조심스럽게 처리하십시오.
참고 : 우리는 현미경의 빈 필터 큐브에 50/50 거울을 사용했다. 50/50 미러는 이색 거울이 있는 곳에 삽입됩니다. - 높은 배율/높은 NA 오일 목표를 사용하십시오.
참고: 이 프로토콜에서는 100x/1.3 NA 목표를 사용했습니다.
2. 표면에 미세 소를 부착하는 챔버 준비
- 깨끗한 현미경 슬라이드와 22mm x 22mm 커버슬립(직립 현미경용) 또는 22mm x 22mm 및 18mm x 18mm 커버슬립(반전된 현미경용). 필요에 따라 서피스를 수정합니다. 예를 들어, 알칼리성 세제를 사용하여 커버슬립을 청소한 다음 11시 사이에 증류수 세척을 한 후 100% 에탄올을 세척합니다.
- 면도날과 다른 현미경 슬라이드를 가장자리로 사용하여 플라스틱 파라핀 필름의 폭 3mm 스트립(재료 표참조)을 자른다.
- 깨끗한 22 x 22mm 커버 슬립에 플라스틱 파라핀 필름 스트립 2개를 3mm 간격으로 놓습니다. 그런 다음 18mm x 18mm 커버슬립을 배치하여 채널을 형성합니다. 직립 현미경을 사용하는 경우, 깨끗한 현미경 슬라이드 위에 스트립을 놓고 덮개를 위에 놓습니다.
- 파라핀 필름이 밀폐된 채널을 형성하기 위해 10-30s동안 100°C에서 열 블록에 커버슬립(또는 슬라이드)을 놓습니다.
- 파이펫을 사용하여 관류에 의해 항체의 50 μg/mL(브링클리 버퍼 1980(BRB80))에서 의 흐름. 10 분 동안 배양하십시오.
참고 : 우리는 표면에 로다민 표지 된 미세 관 씨앗을 결합하기 위해 항 로다민 항체를 사용합니다. 또는, 아비딘은 비오틴 라벨이 붙은 미세소관 씨앗을 결합하거나 생체 용 금 입자에 결합하는 데 사용할 수 있습니다. 단순히 용액 (즉, 비 동적 분석법)에서 tubulin의 부재에서 미세 소관을 보기 위해, 항 -tubulin 항체가 사용될 수 있습니다. - BRB80 버퍼로 5회 세척하십시오. 0.22 μm 필터를 사용하여 솔루션을 필터링하는 것이 좋습니다.
- BRB80에서 1% 폴록사머 407(삼중 블록 공중합체)에서 유동하여 비특이적 결합에 대한 표면을 차단한다. 10 분 동안 배양하십시오.
- BRB80 버퍼로 5회 세척하십시오.
- 견본은 현미경에 놓일 준비가 되었습니다. 시료가 마르지 않도록 채널 끝에 BRB80 버퍼 2방울을 넣고 필요할 때 보충하십시오.
3. 현미경 정렬
- 현미경 단계에 견본을 놓습니다. 에피 조명 광원을 켭니다.
- 샘플 표면에 초점을 맞춥니다. 광학 경로 내의 광학 에서 빛의 백 반사로 인해 목표가 위아래로 이동함에 따라 여러 표면을 관찰할 수 있습니다. 샘플 표면을 찾는 좋은 방법은 파라핀 필름 가장자리에 초점을 맞추는 것입니다. 지표면이 발견되면 시야를 챔버의 중심으로 설정합니다.
- 필드 다이어프램을 반쯤 닫고 조정 나사를 사용하여 시야의 가운데에 있습니다. 정렬되면 다이어프램을 다시 엽니다.
참고: 나사 조정은 3-6개월마다 또는 트러블슈팅 할 때 산발적으로 만 수행하면 됩니다. - 버트 랜드 렌즈에서 슬라이드하여 목표의 출구 동공 (역초점 평면)을 볼 수 있습니다.
- 조리개 다이어프램(AD)을 목표의 출구 동점 가장자리 너머로 닫습니다.
- 조정 나사를 사용하여 AD의 중앙에 출구 동공을 사용합니다. AD를 열고 가장자리를 출구 동공의 가장자리와 일치시켜 다시 확인합니다.
참고: 이 조정은 산발적으로 수행하면 됩니다. - 조리개 다이어프램을 목표의 NA의 약 2/3로 설정합니다. 조리개 다이어프램을 최적화하기 위한 자세한 절차는 7절을 참조하십시오.
4. 이미징 안정화 된 미세 소관 또는 40 nm 금 입자
참고 : 안정화 된 미세 소관 및 금 나노 입자는 좋은 제어 샘플역할을합니다. IRM 성능을 평가하고 최적의 조리개 다이어프램 개구부(섹션 7)를 설정하는 데 도움이 되는 첫 번째 단계로 표면 부착 된 미세 소관 또는 금 나노 입자를 이미지화하는 것이 좋습니다.
- 카메라의 노출 시간을 10ms로 설정하고 조명을 조정하여 카메라 다이나믹 레인지를 거의 포화시로 설정합니다.
- BRB804,12,13 (또는 40 nm 금 입자)에서 10 μL의 guanylyl-(알파, 베타)-메틸렌 이포스포네이트(GMPCCP)-또는 탁솔 안정화 미세소관에서 피펫을 사용하여 신선한 시료 및 모니터에 투과하여 표면을 이미징하여 바인딩합니다. 10-20개의 마이크로소관이 시야 내에 결합되면 BRB80으로 샘플을 2x 세척합니다.
참고 : 잘 정렬 된 현미경으로, 미세 소관은 배경 빼기없이 볼 수 있어야합니다. - 10초 동안 1초 지연 기간(10ms 노출시)으로 시간 경과를 설정하여 10개의 이미지를 수집합니다.
- 배경 이미지를 수집합니다. 이렇게 하려면 스테이지 컨트롤러 또는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 스테이지 를 이동하여 채널 긴 축을 따라 100개의 이미지를 획득합니다(즉, 100fps @ 10ms 노출에 가까운 스트리밍).
참고: 배경은 100개의 이미지의 중앙값입니다. 중앙값을 취하면 조명 프로파일과 광학의 먼지와 같은 기타 고정 된 피쳐가 보존되고 다른 모든 것이 필터링됩니다. 스테이지가 이동되고 궁극적으로 배경 이미지가 저하될 때 축 위치가 변경되기 때문에 샘플에 기울기가 없어야 합니다. 기울기를 피할 수없는 경우, 다른 방법은 씨앗을 흐르기 전에 평균 배경 이미지를 획득하는 것입니다. - 이미지를 처리하고 분석하려면 6단계로 이동하십시오.
5. 이미징 미세 관 역학
- 브레인 튜불린을 사용한 미세소관 역학의 경우 샘플 히터 온도를 37°C로 설정합니다.
- BRB8011에서 GMPCCP 안정화 된 미세 투과 종자의 10 μL의 흐름은 신선한 샘플에 피펫을 사용하여 관류에 의해 표면을 라이브로 이미징하여 표면에 결합하는 모니터링 (즉, 스트리밍 동안). 10-20 개의 씨앗이 시야와 결합되면 BRB80으로 2x 채널 부피를 사용하여 샘플을 씻어 내세요 (BRB80은 37 °C 또는 적어도 실온에서 미리 따뜻해져야합니다).
참고 : 잘 정렬 된 현미경으로, 씨앗은 배경 빼기없이 볼 수 있어야합니다. - 중합 혼합의 흐름 (7.5 μM 비 표지 된 tubulin + 1 mM guanosine 트리포스페이트 (GTP) + 1 mM Dithiothreitol (DTT) BRB80 완충체). 미세소관 성장을 측정하려면 수집 소프트웨어를 사용하여 시간 경과를 설정하여 5초마다(초당 0.2프레임(fps))의 이미지를 15분 동안 수집합니다.
- 대비를 높이려면 각 시점에서 1개 대신 10개의 이미지를 획득하고 평균화합니다. 미세소관 수축의 경우 시간 지연 시간을 0으로 설정하고 노출 시간을 10ms로 설정하여 100fps의 이미지를 수집합니다(사용된 카메라에 따라 더 작은 관심 영역에서는 더 높은 fps가 가능합니다).
- 4.4단계에서와 같이 배경 이미지를 획득합니다.
6. 이미지 처리 및 분석
참고 : 분석을 위해,이 프로토콜은 피지14를 사용하지만 독자는 그녀가 적합하다고 판단하는 모든 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수 있습니다.
- 저장된 배경 이미지를 엽니다.
- 이미지 > 스택 > Z 프로젝트 > 중앙값을사용하여 중앙값 이미지(예: 배경)를 계산합니다.
- 파일 >열기를 사용하여 스택으로 마이크로 튜튜역학 비온 (비 동적 미세 소관에 대해 동일)을 엽니 다.
- 프로세스 > 이미지 계산기를사용하여 스택에서 배경 이미지를 뺍니다. "32비트(부동) 결과" 옵션을 확인하십시오.
- 동적 미세 소관의 경우, 라인 도구를 사용하여 관심있는 미세 관을 따라 선을 그리고 "t"를 눌러 관심 있는 관리자 영역에 추가합니다. 관심 있는 모든 미세소관에 대해 반복하십시오.
- 동적 미세 소관의 경우 다중 Kymo 매크로(보조파일1)를 실행합니다. 매크로는 ROI 관리자의 모든 미세 소관에 대한 비디오 및 kymograph를 생성합니다. 모든 미세소관은 고유 식별자를 얻을 것이다.
- 동적 미세 소관의 경우 Kymo-Analysis 매크로(보충파일2)를 실행하고 그 단계를 수행하여 미세소관의 성장률과 수축 속도를 측정합니다.
7. 조리개 다이어프램 크기
참고: IRM을 사용하여 미세소관의 고대비 이미지를 획득하기 위한 중요한 요소는 조명 수치 조리개(INA) 올바르게10,15를설정하는 것입니다. INA는 AD의 크기에 의해 제어되는 목표의 출구 동공에서 들어오는 조명 빔의 크기를 변경하여 변경할 수 있습니다 (AD는 목표의 출구 동공 (역초점 평면)와 접합평면에 위치 , 그림1):
DAD가 조리개 다이어프램의 직경인 경우, f목표는 목표의 초점 거리이고 Dep는 목표의 출구 동공 직경입니다. 일반적으로 AD는 형광 이미징을 위해 완전히 열려 있으므로 INA는 목표의 NA와같습니다. 형광 현미경에서 AD 스케일은 직경을 나타내지 않으므로 INA를 계산할 수 없습니다. 목표의 도움으로 AD 크기를 보정할 수 있습니다. 그러나 AD 크기가 가장 높은 대비를 생성하는 크기로 고정되므로 필요하지 않습니다.
- 표면에 붙어 있는 형광표지된 안정된 미세소관의 샘플을 준비합니다(단계 4.1-4.2).
참고 : 우리는 tetramethylrhodamine 표시 된 마이크로 튜브16을 사용 (예 : 550 nm, Em : 580 nm). - 현미경 초점 손잡이를 사용하여 현미경 초점 손잡이를 사용하여 현미경을 입력하고 형광으로 이미징하십시오 (미세 소관이 라벨이 지정되지 않은 경우 IRM15 또는 DIC5로이미지 화).
- 카메라 소프트웨어를 사용하여 카메라 노출을 10ms로 설정합니다.
참고 : 이 노출은 임의적이며 100 ms의 노출도 작동합니다. - AD를 가장 작은 개구부로 닫습니다. 조명을 조정하여 카메라의 다이나믹 레인지를 거의 포화상태 또는 가능한 최대로 포화시합니다.
참고: 일반적으로 수집 소프트웨어에서 제공하는 조회 테이블을 참조하십시오. - 10개 이상의 미세소관을 포함하는 시야의 10개 이미지(매초 스트리밍 또는 이미지 촬영)를 수집합니다.
- 4.4단계에서와 같이 배경 이미지를 획득합니다.
- AD의 크기를 변경하고 전체 AD 개방 범위에 대해 7.5-7.6 단계를 반복합니다(닫힌 것부터 출구 동공 크기, 그림2까지). AD 크기가 변경될 때마다 7.4단계와 일치하도록 조명 강도를 조정합니다.
- 획득한 모든 뷰 필드에 대해 프로세스 > 이미지 계산기를 사용하여 해당 배경을 빼고 드롭다운 메뉴에서 "빼기"를 선택합니다. "32비트(플로트) 결과" 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 이미지 > 스택 > Z 프로젝트 >평균을 사용하여 결과 이미지를 평균합니다.
- 미세소관 신호의 평균 강도(미세소관의 강도에서 배경의 강도를 뺀)로 정의된 미세소관의 신호 대 배경 잡음 비(SBR)를 배경의 표준 편차로 나눈값() 그림3).
- 모든 개구크기에 대해 미세소관의 평균 SBR을 계산하여 최적의 AD 크기(즉, 최적 INA)를 결정하고 AD 크기를가장 높은 SBR을 생성하는 것으로 설정합니다(그림 2). 유사한 콘트라스트15를생성하는 다양한 AD 크기가 있을 수 있습니다.
Representative Results
위에서 언급한 바와 같이, 잘 정렬된 현미경으로, 미세소관은배경 감산 없이 볼 수 있어야 한다(그림 4A). 배경을 빼면 (그림4B)미세관의 대비를 향상시킵니다 (그림4C). 대비를 더욱 향상시키기 위해, 평균화 또는 푸리에 필터링 또는 둘 다의 조합을 사용할 수 있다(도4D, F,E). 그림 4G의 선 스캔은 이미지 품질의 점진적 개선을 보여줍니다. 각 처리 단계에서 배경 잡음이 줄어듭니다.
타임랩스 영화에서 생성된 미세소관 역학의 키모그래프의 예는 그림5에 나와 있습니다. 동영상은 0.2fps(느림) 및 100fps(빠름)의 두 가지 프레임 속도로 획득되었습니다. 전자는 성장 속도를 측정하는 데 적합하며 후자는 성장 속도보다 더 빠른 크기의 순서인 수축 속도를 측정하는 데 더 적합합니다.
금 나노 입자가 현미경을 설정하는 데 사용되는 경우 예제 이미지는 그림6에 나와 있습니다. 금 나노입자는 표면에 수동적으로 부착하였다. 40 nm 입자를 권장하는 동안, 그것은 또한 이미지 할 수있다 20 nm 입자, 아직 낮은 대비에서.
그림 1. IRM의 개략적 표현. (A) 광원의 에피 조명은 50/50 미러에 도달하기 전에 조리개 다이어프램을 통과합니다. 조리개 다이어프램은 빔 폭을 설정하여 조명 NA를 설정합니다. 50/50 미러는 샘플을 비추기 위해 목표에 대한 조명을 부분적으로 반사합니다. 샘플에서 반사된 빛이 수집된 다음 카메라 칩(튜브 렌즈)에 투사되어 이미지를 생성하는 데 방해가 됩니다. 이미지 대비는 유리/물 인터페이스(I1)에서 반사되는 빛과 물/미세소관 인터페이스(I2)에서 반사되는 빛 사이의 간섭의 결과입니다. 미세소관/표면 거리(h)에 따라 I1과 I2 사이의 광학 경로 차이로 인해 건설적인(밝은 신호) 또는 파괴적인(어두운 신호) 또는 그 사이에 있는 모든 것이 발생합니다. 예를 들어, 600 nm의 파장을 가진 빛이 이미징에 사용되는 경우 미세 관 높이가 약 100 nm씩 변할 때 대비가 어둡고 밝은 사이로 전환됩니다. 별표는 컨쥬게이트 평면을 나타냅니다(15에서 수정). (B) 50/50 미러 설치의 예. 적합한 필터 큐브가 열리고 이색 거울이 일반적으로 있는 곳에 미러가 삽입되었습니다. 거울은 제조업체 지침에 따라 지향되었습니다. 그런 다음 큐브를 현미경으로 다시 삽입한 필터 휠에 삽입하였다(도시되지 않음). 설치하는 동안 장갑을 사용했고 거울은 가장자리만 유지했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 최적의 조리개 다이어프램 설정. (A) 동일한 시야각이 배경 빼기 없이 다른 조리개 다이어프램 개구부에서 이미지화되었습니다. 시각적으로, 조리개 다이어프램의 크기가 고원에 도달하고 나중에 저하되기 시작할 때까지 대비가 증가했습니다. 이것은 (B) 배경 빼진 이미지의 SBR 측정에 의해 확인되었다. 오류 막대는 표준 편차입니다. 스케일 바는 500 μm (AD) 및 3 μm (마이크로 소관)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 신호 대 배경 잡음 비율 측정. 미세소관은 관심 있는 부위에서 분리되었다. 관심 있는 각 영역은 배경으로부터 미세관을 분리하도록 임계값화되었다. 평균 미세소관 신호는 미세소관을 가로지르는 라인 스캔으로부터 수득되었다. 스캔 라인 폭은 미세소관 길이와 동일하게 설정되었습니다. 이렇게 하면 스캔의 모든 지점은 해당 지점에 평행한 미세관 축을 따라 모든 픽셀의 신호의 평균입니다. 배경 노이즈는 임계값 아래의 모든 픽셀의 표준 편차입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 이미지 처리. 원시 이미지(A)를획득한 후, 배경(B)을 빼서 미세관 대비를 향상시키기 위해 (C)를 빼하였다. 대비를 더욱 개선하기 위해 이미지는 평균(D) 또는 푸리에 필터링(E) 또는 둘 다(F)였다. (A)의 파선 빨간색 선으로 위치가 표시된 선 스캔(G)은 (A)에서 (F)로의 다양한 이미지와 일치하는 색상이다. 아래쪽 모서리의 숫자는 전체 시야에 대해 측정된 평균 SB입니다. 스케일 바는 5 μm(15에서수정)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. kymographs의 예. (A) 0.2fps에서 획득한 타임랩스 영화에서 생성된 미세소관 역학의 Kymograph 예. (B) 100fps에서 획득한 영화에서 생성된 수축 이벤트의 예를 묘사한 Kymograph. 파선은 씨앗을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. IRM으로 이미지화된 금 나노입자의 예. 20 및 40 nm 크기의 금 나노입자를 표면에 수동적으로 부착하였다. 10개의 이미지를 획득했습니다. 배경 빼기 후, 이미지는 대비를 향상시키기 위해 평균화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 적외선 이미지의 미세소관 길이 추적 정밀도. 안정화된 미세소관(즉, 고정 길이)은 100fps에서 200x를 이미지화한 다음 대비를 향상시키기 위해 평균 10fps로 조정되었습니다. 다음으로, 미세소관의 길이는 피에스타17 추적 소프트웨어를 사용하여 측정되었다. 모든 미세소관에 대해 평균 길이 및 표준 편차는 도면에 도시된 바와 같이 계산되었다(파선은 평균 및 단색 적색선이 표준 편차를 나타내고, 길이 = 3971±20 nm를 나타낸다. 전체 추적 정밀도는 모든 추적 된 미세 소관의 표준 편차의 평균이었다 (n = 6 마이크로 스터블 x 20 데이터 포인트 = 120 데이터 포인트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 미세소관 역학의 이미징 및 측정을 위한 IRM의 성공적인 사용을 입증했습니다. 이미지 대비에 가장 큰 영향을 미치기 때문에 조명 수치 조리개를 올바르게 설정하려면 주의해야 합니다. 또한 높은 NA 목표치에 비해 높은 NA 목표치에 비해 높은 광 수집 전력을 가지므로 높은 수치 조리개(NA) 목표를 사용하는 것이 고해상도/고대비 이미지를 얻는 데 중요합니다. 표면과 솔루션이 더 깨끗할수록 먼지가 표면에 부착되고 이미지에 노이즈와 같은 얼룩이 추가되면서 노이즈가 낮아집니다. 배경 이미지의 수집은 조명 불균질성, 정적 노이즈 및 표면 불규칙성을 제거할 뿐만 아니라 중요합니다.
권장되는 수정사항은 조명 경로에 긴 패스 필터(>600 nm)를 도입하는 것입니다. 백색 광원의 스펙트럼은 전형적으로 미세관을 손상시킬 수 있는 UV에 있는 파장을 포함합니다. 또한 IRM에 긴 파장을 사용하면 IRM과 형광을 결합할 때 유용합니다(예: 미세소관 역학에 대한 미세소관 관련 단백질(MAPs)의 효과를 연구할 때). 소모된 시간 동안 이미징할 때 샘플 드리프트(특히 광축을 따라)는 배경 평면에서 이미지 평면의 편차로 인해 이미지 대비가 감소합니다. 현대 현미경은 종종 안정화 메커니즘 (예를 들어, 완벽한 초점 (니콘), 명확한 초점.2 (자이스), IX3-ZDC2 (올림푸스))를 갖추고 있습니다. 대체 솔루션은 수동 또는 능동18 또는 드리프트 19,20,21에대한 보정을 통해 설정을 열적으로 안정화시키는 것입니다. 마지막으로, 미세소관 대비는 필드 다이어프램의 크기를 감소시킴으로써 증가될 수 있다(70% 개방은 증가하는 대비와 시야 크기 사이의 균형이기 때문에 좋은 선택이다)15.
IRM은 화상 진찰 microtubules를 위해 적당하지만 단 하나 단백질을 검출하기 위하여 충분히 과민하지 않습니다. 이러한 적용을 위해, iSCAT는 더 적합한 기술이다. 마찬가지로 형광 및 iSCAT는 10nm 미만의 추적 정밀도가 필요한 경우에 더 적합합니다. IRM의 경우 그림7과 같이 측정된 길이 추적 정밀도는 ~20 nm입니다.
표면 검사에 IRM의 사용은 미세 소관을 넘어 갈 수 있습니다; 예를 들어, 분자 모터는 금 나노 입자로 라벨을 붙이고 미세 소관과 상호 작용할 때 추적 할 수 있습니다. 또한 반사 간섭 대비 현미경 검사법(RICM)22로 알려진 보다 진보된 형태의 IRM은 원칙적으로 미세소관 대비를 더욱 향상시키고 더 높은 추적 정밀도를 얻기 위해 사용될 수 있다.
Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 프로토콜에 대한 비판적 독서와 의견에 대한 안나 루크니아크와 음웨이 쿠오 에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
References
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
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